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克隆载体与表达载体

克隆载体与表达载体
克隆载体与表达载体

克隆载体

质粒载体总结

λ噬菌体载体

表达载体

克隆载体与表达载体

克隆载体:大多是高拷贝的载体,一般是原核细菌,将需要克隆的基因与克隆载体的质粒相连接,再导入原核细菌内,质粒会在原核细菌内大量复制,形成大量的基因克隆,被克隆的基因不一定会表达,但一定被大量复制。克隆载体只是为了保存基因片段,这样细胞内不会有很多表达的蛋白质而影响别的工作。 克隆载体(Cloning vector ):携带插入外源片段的质粒或噬菌体,从而产生更多物质或蛋白质产物。 (这是为携带”感兴趣的外源DNA实现外源DNA勺无性繁殖或表达有意义的蛋白质所采用的一些DNA分子。) 其中,为使插入的外源 DNA序列可转录、进而翻译成多肽链而设计的克隆载体又称表达载体。 是否含有表达系统元件,即启动子 -- 核糖体结合位点 -- 克隆位点 -- 转录终止信号,这是用来区别克隆载体和表达载体的标志。 表达载体:有的是高拷贝的,有的是低拷贝的,各有各的用处,是一些用于工程生产的细菌,被导入的目标基因会在此类细菌中得到表达,生产出我们需要的产物,导入的基因是由克隆载体产出的。表达载体具有较高的蛋白质表达效率,一般因为具有强的启动子。 表达载体( Expression vectors )就是在克隆载体基本骨架的基础上增加表达元件(如启动子、RBS、终止子等),是目的基因能够表达的载体。如表达载体 pKK223-3 是一个具有典型表达结构的大肠杆菌表达载体。其基本骨架为来自pBR322和pUC的质粒复制起点和氨苄青霉素抗性基因。在表达元件中,有一 个杂合tac强启动子和终止子,在启动子下游有RBS位点(如果利用这个位点,要求与ATG之间间隔5-13bp),其后的多克隆位点可装载要表达的目标基因。 (RBS位点:1974年Shine和Dalgarno首先发现,原核生物,在 mRNAk有核糖体的结合位点,它们是起始密码子AUG和一段位于AUG上游3?10 bp处的由3 —9bp组成的序列。这段序列富含嘌吟核苷酸,刚好与16S rRNA 3,末端的富含嘧啶的序列互补,是核糖体 RNA的识另U与结合位点。根据发现者的名字,命名为 Shine-Dalgarno 序列,简称 S-D 序列。 由于它正好与30S小亚基中的16s rRNA3 '端一部分序列互补,因此 S-D序列也叫做核糖体结合序列。 真核生物存在于真核生物mRNA勺一段序列,其在翻译的起始中有重要作用。加Kozark sequence(GCCACC), Kozak sequence 是用来增强真核基因的翻译效率的。是最优化的ATG环境, 避免 ribosome 出现 leaky scan ) 克隆载体目的在于复制足够多的目标质粒,所以常带有较强的自我复制元件,如复制起始位点等,往往在菌体内存在多拷贝,所以抽质粒会抽出一大堆。但不具备表达元件。而表达质粒有复杂的构成,为的是控制目标蛋白的表达,如各种启动子(T7),调节子(LacZ)等,而且以pET为代表的表达载体在菌体内 都是低拷贝的,防止渗漏表达。 克隆载体只是把你要的基因片段拿到就可以了,不管读码框什么的,但是表达载体是不但要你的目的基因连在上面,而且要表达蛋白,所以就要求你的读码框不能乱了,否则就不能得到你想到的表达产物。 1. 载体即要把一个有用的基因(目的基因——研究或应用基因)通过基因工程手段送到生物细胞(受体细 胞),需要运载工具(交通工具)携带外源基因进入受体细胞,这种运载工具就叫做载体(vector )。2. 载体的分类 按功能分成:( 1)克隆载体 : 都有一个松弛的复制子,能带动外源基因,在宿主细胞中复制扩增。它是用来克隆和扩增DNA片段(基因)的载体。(2)表达载体:具有克隆载体的基本元件(ori,Ampr,Mcs等)还具有转录/翻译所必需的DNA顺序的载体。 按进入受体细胞类型分:( 1 )原核载体( 2)真核载体( 3)穿梭载体( sbuttle vector )指在两种宿 主生物体内复制的载体分子,因而可以运载目的基因(穿梭往返两种生物之间).

常用的克隆载体

第一章 概 论 第二章 基因疫苗工作 原理 第三章 基因疫苗抗原 基因的筛选和克隆 第四章 基因疫苗的构 建 第五章 基因疫苗制备 第六章 基因疫苗免疫方法 第七章 基因疫苗免疫 效果检测 第八章 影响基因疫苗免疫效果的因素 第九章 基因疫苗安全性 第十章 细菌病基因疫苗 第十一章 病毒病基因 疫苗 第十二章 寄生虫病基 因疫苗 第十三章 肿瘤基因疫 苗 第十四章 控制动物生 长性能的基因疫苗 四、常用的克隆载体 克隆载体就是将目的基因导入宿主细胞进行复制,从而获得大量克隆化片段的运载工具,常用的克隆载体种类很多,主要包括质粒、粘粒和噬菌体等。其中,质粒是目前应用最为广泛 的克隆载体。下面简要介绍作为克隆质粒的特性和结构。 (一)质粒特性 质粒是指在染色体外能够独立复制和稳定遗传的一类环状双链 DNA 分子。有的质粒处于染色体外的游离状态,可以随着染色体的复制而复制,并且通过细胞分裂传递到子代。有的质 粒在一定条件下能够可逆地整合到寄主染色体上。 质粒的表示常根据 1976 年提出质粒命名原则,用小写字母 p 代表质粒,在 p 字母后面 用两个大写字母代表发现这一质粒的作者或者实验室名称。例如质粒 pUCl8 ,字母 p 代表质粒, UC 是构建该质粒的研究人员的姓名代号, 18 代表构建的一系列质粒的编号。 质粒广泛地分布于原核生物细胞中,也存在于一些真核细胞中。质粒相对分子质量范围为10 6 -2 @ 10 8 。根据质粒在受体细胞内的数量将质粒分为严紧型质粒和松弛型质粒两种类 型。严紧型质粒在每个细胞只有 1 个至几个拷贝;松弛型质粒在每个细胞中有 10-200 个拷贝。 质粒可以分为三种构型,一种是呈现超螺旋的 SC 构型( scDNA ),一种是开环 DNA ( ocDNA ),另一种是呈线形分子的 L 构型。质粒 DNA 与一般 DNA 分子的理化性质相似,例如溶于水、不溶于乙醇等有机溶剂、能吸收紫外线、可嵌入溴乙锭染料等。实验室常利用这 些理化特性鉴定和纯化质粒。 质粒具有以下几项生物学特性: ? 寄生性:质粒可以在特定的宿主细胞内存在和复制。 ? 稳定性:每种质粒在特定的宿主细胞内保持着一定的拷贝数。 ? 重组性:两种不同的质粒处于同一宿主细胞中或者一种质粒处于一种宿主细胞中,有可能发生质粒与质粒之间或质粒与染色体之间的重组。 ? 不相容性:有相同复制始区的不同质粒不能共存于同一宿主细胞中,其分子基础主要是由于它们在复制功能之间的相互干扰造成的。 ? 传递性:有些质粒在细菌间能够传递,具有传递性的质粒带有一套与传递有关的基 因。

克隆载体表达载体构建详细版

一、稀释引物 1、4℃,15min、13000转离心(先等离心机降温) 2、根据OD值加DD水。 3、静置30min(冰上) 4、准备1.5毫升EP管,并加90ulDD水。 5、向EP管中加10ul引物,震荡离心,-20℃保存。 二、跑MIX检测引物(20ul体系)、 上引物0.8ul 下引物0.8ul Mix 10ul DNA(日本晴)1ul DD水7.4ul 三跑高保真酶(50ul体系) DNAorCDNA 2ul 上引物2ul 下引物2ul 5*buffer 10ul dNTPs 5ul DD水28ul Pfu(最后加)1ul 四胶回收流程 1、在紫外线下切胶,用牙签装入2ml的EP管中。 2、按量加XP2,放在55℃水浴锅中10min,每2min摇匀1次,涡旋,短离。 3、将液体冷却到室温,转移到平衡住中,离心10000转,1min30s,倒掉滤液。 4、加入xp2 300ul,离心10000r,1min30s,倒掉滤液。 5、加入spw700ul,离心10000r,1min,倒掉滤液(重复一次) 6、空转2min,13000r,之后换1.5mlEP管。 7、套上保鲜膜放入37℃烘箱中,30min。 8、加入DD水10ul,静置2min,离心2min,13000r,重复3次,-20℃保存。 五、胶回收产物检测(10ul)体系 上引物0.4ul 下引物0.4ul Mix 5ul 回收产物1ul DD水 3.2ul 六、构建blunt cloning 载体(克隆载体)(4ul 体系) 胶回收产物 3.5ul Blunt cloning 0.5ul 混匀后,PCR:25℃15min 盖子温度50℃

三四章分子克隆载体---答案_完_

第三章分子克隆载体(Molecular cloning vectors) 一、名词解析 1.质粒:质粒是染色体外的遗传因子,能进行自我复制(但依赖于宿主编码的 酶和蛋白质);大多数为超螺旋的双链共价闭合环状DNA分子(covalently closed circle , cccDNA),少数为线性;大小一般为1~200Kb,有的更大。2.质粒拷贝数:质粒拷贝数(plasmid copy numbers)是指细胞中单一质粒的份数 同染色体数之比值,常用质粒数/每染色体来表示。不同的质粒在宿主细胞中的拷贝数不同。 3.质粒的不相容性:两个质粒在同一宿主中不能共存的现象称质粒的不相容 性,它是指在第二个质粒导入后,在不涉及DNA 限制系统时出现的现象。 不相容的质粒一般都利用同一复制系统,从而导致不能共存于同一宿主中。 4.质粒的转移性:质粒具转移性。它是指在自然条件下,很多质粒可以通过称 为细菌接合的作用转移到新宿主内。它需要移动基因 mob ,转移基因 tra ,顺式因子 bom 及其内部的转移缺口位点 nic。 5.穿梭质粒:既能在真核细胞中繁殖又能在原核细胞中繁殖的载体。这类载体 必须既有细菌的复制原点或质粒的复制原点,又含有真核生物的复制原点,还具备酶切位点和合适的筛选指标。它用来转化细菌,又可以用于转化真核细胞。 6.α-互补:α-互补是指 lacZ 基因上缺失近操纵基因区段的突变体与带有完 整的近操纵基因区段的β-半乳糖苷酶(β -galactosidase ,由 1024 个氨基酸组成)阴性的突变体之间实现互补。α-互补是基于在两个不同的缺陷β-半乳糖苷酶之间可实现功能互补而建立的 7.温和噬菌体:既能进入溶菌生命周期又能进入溶源生命周期的噬菌体。 8.溶源性细菌:具有一套完整的噬菌体基因组的细菌叫溶源性细菌。 9.整合:如果噬菌体的DNA是被包容在寄主细菌染色体DNA中,便叫做已整合 的噬菌体DNA。这中细菌提DNA组入细菌染色体DNA的过程,叫做噬菌体DNA 的整合或插入。 10.溶源化:用温和的噬菌体感染细菌培养物使之形成溶源性细菌的过程叫做溶 源化。

基因克隆载体上的各种常用蛋白标签

基因克隆载体上的各种常用蛋白标签 蛋白标签(proteintag)是指利用DNA体外重组技术,与目的蛋白一起融合表达的一种多肽或者蛋白,以便于目的蛋白的表达、检测、示踪和纯化等。随着技术的不断发展,研究人员相继开发出了具有各种不同功能的蛋白标签。目前,这些蛋白标签已在基础研究和商业化产品生产等方面得到了广泛的应用。 美国GeneCopoeia(复能基因)为客户提供50多种蛋白标签,可以满足客户的不同需求,包括各种最新型的标签,如:SNAP-Tag?、Halo Tag?、AviTag?、Sumo等;也提供齐全的各种常用标签,如eGFP、His、Flag等等标签。 以下是部分蛋白标签的特性介绍,更加详细的介绍可在查询产品的结果列表里面看到各种推荐的蛋白标签和载体。 TrxHIS His6是指六个组氨酸残基组成的融合标签,可插入在目的蛋白的C末端或N末端。当某一个标签的使用,一是能构成表位利于纯化和检测;二是构成独特的结构特征(结合配体)利于纯化。组氨酸残基侧链与固态的镍有强烈的吸引力,可用于固定化金属螯合层析(IMAC),对重组蛋白进行分离纯化。使用His-tag有下面优点: 标签的量小,只有~0.84KD,而GST和蛋白A分别为~26KD和~30KD,一般不影响目标蛋白的功能; His标签融合蛋白可以在非离子型表面活性剂存在的条件下或变性条件下纯化,前者在纯化疏水性强的蛋白得到应用,后者在纯化包涵体蛋白时特别有用,用高浓度的变性剂溶解后通过金属螯和去除杂蛋白,使复性不受其它蛋白的干扰,或进行金属螯和亲和层析复性; His标签融合蛋白也被用于蛋白质-蛋白质、蛋白质-DNA相互作用研究; His标签免疫原性相对较低,可将纯化的蛋白直接注射动物进行免疫并制备抗体。 可应用于多种表达系统,纯化的条件温和; 可以和其它的亲和标签一起构建双亲和标签。 Flag标签蛋白 Flag标签蛋白为编码8个氨基酸的亲水性多肽(DYKDDDDK),同时载体中构建的Kozak序列使得带有FLAG的融合蛋白在真核表达系统中表达效率更高。FLAG作为标签蛋白,其融合表达目的蛋白后具有以下优点: FLAG作为融合表达标签,其通常不会与目的蛋白相互作用并且通常不会影响目的蛋白的功能、性质,这样就有利用研究人员对融合蛋白进行下游研究。 融合FLAG的目的蛋白,可以直接通过FLAG进行亲和层析,此层析为非变性纯化,可以纯化有活性的融合蛋白,并且纯化效率高。 FLAG作为标签蛋白,其可以被抗FLAG的抗体识别,这样就方便通过Western Blot、ELISA等方法对含有FLAG的融合蛋白进行检测、鉴定。

常用分子克隆实验方法

常用分子克隆实验方法I 一、植物总DNA的小量提取 方法1:提取吸附法。无须巯基乙醇、氯仿等有毒物质,产物无须Rnase处理。 (1)充分研磨。称取约0.2克植物组织,加入液氮充分研磨3-5min,稍后加约1ml溶液 A,继续研磨至略粘稠的组织匀浆,用大口1ml吸头将所有溶液移至1.5ml离心管 中,55℃水浴30min; (2) 高速离心去杂质。10,000rpm离心5min,取约600ul上清至新1.5ml离心管; (3) 核酸吸附。往上清液中加入1倍的异丙醇,轻轻混匀,再加入总体积1/4已混匀的 溶液B,静置3min; (4) 低速离心沉淀。5000rpm离心1min,轻轻倒掉上清,并用吸水纸轻吸离心管口, 再用移液枪吸走大部分残余液体; (5) 75%乙醇清洗。加入1ml75%乙醇,5000rpm离心30s,轻轻倒掉上清,用吸水纸稍 吸离心管口。重复该步骤一次,再5000rpm离心30s,然后用移液枪吸走管底的残 液,晾干5min; (6) 核酸洗脱。加入约55ul TE(PH8.0)至管底,轻轻重悬硅土,静置3min,10,000rpm 离心1min,用小枪头轻轻吸取出50ul管底溶液,冷藏。 方法2:CTAB法,此为在经典方法基础上,经过摸索改进,提高了得率,减少了污染。 (1)充分研磨。称取约0.2克植物组织,加入液氮充分研磨3-5min,稍后加约1ml CTAB 提取液,继续研磨至略粘稠的组织匀浆,用大口1ml吸头移至1.5ml离心管,65℃ 水浴30-60min。 (2) 氯仿抽提。10,000rpm离心3min,取约600ul上清。加入1倍的氯仿,轻轻混匀, 10,000rpm离心3min,取上清再抽提1遍。 (3) 核酸沉淀。加入预冷的1倍异丙醇或2倍乙醇,轻混匀,6000rpm离心3min,弃 上清。 (4) 清洗沉淀。轻加入1ml 75%乙醇,再吸掉上清,重复一次,倒置于吸水纸或横放于 离心管架上晾干5min。 (5) 溶解DNA。加50ul含Rnase A(约10ug/ml)的TE,常温下放置30min。取约3-5ul 电泳检测后,低温冷藏。

克隆载体与表达载体---—朕已阅

一部分:概念解析 二部分:问题解答 克隆载体:大多是高拷贝的载体,一般是原核细菌,将需要克隆的基因与克隆载体的质粒相连接,再导入原核细菌内,质粒会在原核细菌内大量复制,形成大量的基因克隆,被克隆的基因不一定会表达,但一定被大量复制。克隆载体只是为了保存基因片段,这样细胞内不会有很多表达的蛋白质而影响别的工作。 克隆载体(Cloning vector ):携带插入外源片段的质粒或噬菌体,从而产生更多物质或蛋白质产物。(这是为“携带”感兴趣的外源DNA、实现外源DNA的无性繁殖或表达有意义的蛋白质所采用的一些DNA分子。) 其中,为使插入的外源DNA序列可转录、进而翻译成多肽链而设计的克隆载体又称表达载体。 是否含有表达系统元件,即启动子--核糖体结合位点--克隆位点--转录终止信号,这是用来区别克隆载体和表达载体的标志。 表达载体:有的是高拷贝的,有的是低拷贝的,各有各的用处,是一些用于工程生产的细菌,被导入的目标基因会在此类细菌中得到表达,生产出我们需要的产物,导入的基因是由克隆载体产出的。表达载体具有较高的蛋白质表达效率,一般因为具有强的启动子。 (RBS位点:1974年Shine和Dalgarno首先发现,原核生物,在mRNA上有核糖体的结合位点,它们是起始密码子AUG和一段位于AUG上游3~10 bp处的由3—9bp组成的序列。这段序列富含嘌呤核苷酸,刚好与16S rRNA 3,末端的富含嘧啶的序列互补,是核糖体RNA的识别与结合位点。根据发现者的名字,命名为Shine-Dalgarno序列,简称S-D序列。 由于它正好与30S小亚基中的16s rRNA3’端一部分序列互补,因此S-D序列也叫做核糖体结合序列。 真核生物存在于真核生物mRNA的一段序列,其在翻译的起始中有重要作用。加Kozark sequence(GCCACC), Kozak sequence是用来增强真核基因的翻译效率的。是最优化的ATG环境,避免ribosome出现leaky scan) 克隆载体目的在于复制足够多的目标质粒,所以常带有较强的自我复制元件,如复制起始位点等,往往在菌体内存在多拷贝,所以抽质粒会抽出一大堆。但不具备表达元件。而表达质粒有复杂的构成,为的是控制目标蛋白的表达,如各种启动子(T7),调节子(LacZ)等,而且以pET为代表的表达载体在菌体内都是低拷贝的,防止渗漏表达。 克隆载体只是把你要的基因片段拿到就可以了,不管读码框什么的,但是表达载体是不但要你的目的基因连在上面,而且要表达蛋白,所以就要求你的读码框不能乱了,否则就不能得到你想到的表达产物。 1.载体即要把一个有用的基因(目的基因——研究或应用基因)通过基因工程手段送到生物细胞(受体细胞),需要运载工具(交通工具)携带外源基因进入受体细胞,这种运载工具就叫做载体(vector)。 2. 载体的分类 按功能分成:(1)克隆载体: 都有一个松弛的复制子,能带动外源基因,在宿主细胞中复制扩增。它是用来克隆和扩增DNA片段(基因)的载体。(2)表达载体:具有克隆载体的基本元件(ori,Ampr,Mcs

基因克隆载体上的各种常用蛋白标签

基因克隆载体上的各种常用蛋白标签 集团文件版本号:(M928-T898-M248-WU2669-I2896-DQ586-M1988)

基因克隆载体上的各种常用蛋白标签 蛋白标签(proteintag)是指利用DNA体外重组技术,与目的蛋白一起融合表达的一种多肽或者蛋白,以便于目的蛋白的表达、检测、示踪和纯化等。随着技术的不断发展,研究人员相继开发出了具有各种不同功能的蛋白标签。目前,这些蛋白标签已在基础研究和商业化产品生产等方面得到了广泛的应用。 美国GeneCopoeia(复能基因)为客户提供50多种蛋白标签,可以满足客户的不同需求,包括各种最新型的标签,如:SNAP-Tag?、Halo Tag?、AviTag?、Sumo等;也提供齐全的各种常用标签,如eGFP、His、Flag等等标签。 以下是部分蛋白标签的特性介绍,更加详细的介绍可在查询产品的结果列表里面看到各种推荐的蛋白标签和载体。 TrxHIS His6是指六个组氨酸残基组成的融合标签,可插入在目的蛋白的C 末端或N末端。当某一个标签的使用,一是能构成表位利于纯化和检测;二是构成独特的结构特征(结合配体)利于纯化。组氨酸残基侧链与固态的镍有强烈的吸引力,可用于固定化金属螯合层析(IMAC),对重组蛋白进行分离纯化。使用His-tag有下面优点: 标签的量小,只有~0.84KD,而GST和蛋白A分别为~26KD和~30KD,一般不影响目标蛋白的功能; His标签融合蛋白可以在非离子型表面活性剂存在的条件下或变性条件下纯化,前者在纯化疏水性强的蛋白得到应用,后者在纯化包涵体蛋

白时特别有用,用高浓度的变性剂溶解后通过金属螯和去除杂蛋白,使复性不受其它蛋白的干扰,或进行金属螯和亲和层析复性; His标签融合蛋白也被用于蛋白质-蛋白质、蛋白质-DNA相互作用研究; His标签免疫原性相对较低,可将纯化的蛋白直接注射动物进行免疫并制备抗体。 可应用于多种表达系统,纯化的条件温和; 可以和其它的亲和标签一起构建双亲和标签。 Flag标签蛋白 Flag标签蛋白为编码8个氨基酸的亲水性多肽(DYKDDDDK),同时载体中构建的Kozak序列使得带有FLAG的融合蛋白在真核表达系统中表达效率更高。 FLAG作为标签蛋白,其融合表达目的蛋白后具有以下优点:FLAG作为融合表达标签,其通常不会与目的蛋白相互作用并且通常不会影响目的蛋白的功能、性质,这样就有利用研究人员对融合蛋白进行下游研究。 融合FLAG的目的蛋白,可以直接通过FLAG进行亲和层析,此层析为非变性纯化,可以纯化有活性的融合蛋白,并且纯化效率高。 FLAG作为标签蛋白,其可以被抗FLAG的抗体识别,这样就方便通过Western Blot、ELISA等方法对含有FLAG的融合蛋白进行检测、鉴定。 融合在N端的FLAG,其可以被肠激酶切除(DDDK),从而得到特异的目的蛋白。因此现FLAG标签已广泛的应用于蛋白表达、纯化、鉴定、功能研究及其蛋白相互作用等相关领域。

为什么要先构建克隆载体再用表达载体

为什么要先构建克隆载体再用表达载体 构建克隆载体是大量扩增DNA片段,用以测序、酶切和改造等对DNA实施的后续操作,构建表达载体是大量得到翻译产物——蛋白质。 为什么要先构建克隆载体,再用表达载体,我猜是因为: ①得到大量的DNA,虽然PCR也可以,但PCR扩增有出错率、但你每做一次常规的PCR,而且每次都要重新提DNA和RNA才行,而且,PCR反应的试剂盒又不便宜,用PCR来制备大量DNA有点得不偿失。尽管构建克隆载体也存在操作复杂(相对于PCR),成功率不是极高,而且还要筛选,但一旦你重组成功并转入了大肠杆菌,你就可以保存了,你想什么时候用,摇个菌,就可以制备到大量的DNA。 ②测序需要。你想转表达,你首先得确定你扩增的目的片段是不是你要的,不要以为你设计了个特异性引物,然后跟你mark的长度就可以确定了,这也只是推测,在科学上不严谨。扩增出的基因片段保险起见或者经费允许,要拿去测序,而一般送测的序列都是构建到载体上的序列,克隆载体上一般也都带有测序引物,已确定这就是你要的那条序列。你要写论文必须要给人真凭实据。 先构建克隆载体再构建表达载体并不是一个必须的选择,如果你的扩增PCR目的条带很亮,而且单一性很好,我建议你可以直接克隆进入表达载体。 很多人选择先构建克隆载体,是因为在扩增基因时目的条带模糊,特异性不好,这样将基因连接到克隆载体上就可以便于挑去单克隆进行测序,增加测序的准确度,从而确认自己克隆基因序列的正确性。单纯的PCR产物往往是一些各种PCR片段的混合物,直接送过去测序,往往导致测序信号峰很杂,有时候并不能测出想要的信号序列。同时保存的PCR片段比较容易降解,而构建好克隆载体后形成的质粒是很容易扩增和保存的。 先构建克隆载体,一是为了便于测序,确认克隆序列正确,二是为了便于基因PCR片段的保存。 怎么构建克隆载体和表达载体? 首先根据你的实验需要选择相应的载体。 其次分析你的基因序列以及载体序列上的酶切位点,切记在载体上所选择的酶切位点要和你

分子克隆载体

分子克隆载体(vector) 载体(vector)是指运载外源DNA有效进入受体细胞内的工具。载体同外源DNA在体外重组成DNA 重组分子,在进入受体后形成一个复制子,即形成在细胞内能独自进行自我复制的遗传因子。重组DNA 技术中最常用的载体有质粒、噬菌体λ,柯斯质粒(cosmid)和噬菌体M13。 载体(vector)是指运载外源DNA有效进入受体细胞内的工具。载体同外源DNA在体外重组成DNA重组分子,在进入受体后形成一个复制子,即形成在细胞内能独自进行自我复制的遗传因子。因此,作为载体应该满足以下几方面的要求:①有某种限制酶的一个切点,最好是有许多种限制酶的切点,而且每种酶的切点只有一个;②外源DNA插入后不影响载体在受体细胞中进行自我复制,载体应对受体细胞无害,以及载体能接纳尽可能大的外源DNA片段;③有利于选择的标记基因,可以很方便地知道外源DNA已经插入,以及把接受了载体的受体细胞选出;④具有促进外源DNA表达的调控区。 重组DNA技术中最常用的载体有质粒、噬菌体λ,柯斯质粒(cosmid)和噬菌体M13。它们的受体细胞都是大肠杆菌。这四种载体的大小和结构尽管各不相同,但它们的共同特点是:①都能在大肠杆菌中自主复制,而且能连同所带的外源DNA一起复制;②都很容易同细菌DNA分开并加以纯化;③都有一段DNA对于它们自身在细菌中的增殖不是必需的。因此,外源DNA可以插入这一段DNA中,或是置换这一段DNA而不影响载体的复制。根据这一特点,载体又可分成插入型和置换型两大类。 质粒能通过细菌间的接合由一个细菌向另一个细菌转移,可以独立复制,也可整合到细菌染色体DNA中,随着染色体DNA的复制而复制。 载体可以分为:克隆载体、表达载体及穿梭载体。 1.克隆载体(cloning vector):通常采用从病毒、质粒或高等生物细胞中获取的DNA作为克隆载体,在载体上插入合适大小的外源DNA片段,并注意不能破坏载体的自我复制性质。将重组后的载体引入到宿主细胞中,并在宿主细胞中大量繁殖。常见的载体有质粒,噬菌粒,酵母人工染色体。 对载体的要求一种用作克隆载体的理想质粒一般具备下述特点:①具有松驰型复制子(如ColE1),复制子(replicon)是质粒自我增殖所必不可少的基本条件,并可协助维持使每个细胞含有一定数量的质粒拷贝。②在复制子外存在几个单一的酶切位点(或多克隆位点),以便目的DNA片段插入。③具有插入失活的筛选标记,理想的质粒载体应具有两种抗菌素抗性标志,如氨苄青霉素抗性基因(Amp r)和四环素抗性基因(Tet r)等,以便从

分子克隆之载体构建完整步骤

分子克隆之载体构建完整步骤 一、目的片段的扩增和酶切 PCR反应的基本成分包括:模板DNA(逆转录所得cDNA)、引物、4种脱氧核苷酸(dNTPs)、DNA聚合酶和适宜的缓冲液及水。PCR由变性--退火--延伸三个基本反应步骤构成:①模板DNA的高温变性:模板DNA经加热至95℃左右一定时间后,使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离,使之成为单链,以便它与引物结合,为下轮反应作准备;②模板DNA与引物的低温退火(复性):模板DNA经加热变性成单链后,温度降至55℃左右,引物与模板DNA 单链的互补序列配对结合;③引物的适温延伸:DNA模板--引物结合物在。 准备: A.模板DNA:质粒DNA,逆转录cDNA或挑菌落 B.引物配制: a)存储液100uM:公司合成的引物干粉,13000rpm离心2min,加入管壁 nmol数x10ul的ddH2O振荡充分溶解。 b)工作液10uM:上下游引物存储液各10ul加80ul ddH2O混匀配制100ul 工作液。终浓度200-400nM。 1. PCR反应体系(50ul) Taq酶体系:Thermo 10x buffer (无Mg2+)5ul MgCl2(25mM)5ul dNTP (10mM)1ul 上下游引物工作液1ul 模板cDNA(质粒DNA 不超过100ng)2-4ul Taq DNA聚合酶0.5ul ddH2O 补充至50 ul 注:1. 其他体系如菌落PCR反应20ul按比例调整即可。2. 其他公司Taq酶或2x buffer mix已包含Taq酶、dNTPs时作相应调整。 PCR仪设置反应条件: 95℃ 5min 预变性 循环x30-35: 变性95℃ 30s 退火60℃ 30s (退火温度为引物Tm值-3~5℃) 延伸72℃ 60s (延伸时间根据产物长度:Taq酶效率约1kb/min)72℃ 7 min 补充延伸 4-10℃ 保温 高保真Pfu酶体系(优选):Thermo

克隆载体及其主要功能

.克隆载体及其主要功能 载体是克隆基因的关键组分,载体使重组DNA分子能够在受体细胞中复制。质粒和噬菌体是两种天然的DNA载体。目前,能在不同受体细胞中使用的载体有数百种,其中,可以在大肠杆菌中使用的载体数目最多。 质粒pBR322是一种典型的大肠杆菌克隆载体,它全长仅为4.3kb。pBR322带有两种抗生素抗性基因:b -内酰胺酶基因和四环素抗性基因,前者修饰并消除氨苄青霉素对大肠杆菌的毒性。通常,目的基因插入载体质粒将破坏四环素抗性功能。因此,使用含有氨苄青霉素和四环素的培养基,我们可以鉴别大肠杆菌的转化细胞:带有重组质粒的转化细胞只能在含氨苄青霉素、不含四环素的培养基上生长;另一方面,原受体细胞不能在含有氨苄青霉素和四环素的培养基上生长;而有载体质粒但没有目的基因的转化细胞能在含有氨苄青霉素和四环素的培养基上生长。另外,pBR322是一种松弛型质粒,在培养液中加入氯霉素可以使转化细胞中的质粒拷贝数由通常的15个增至1000-3000个,此间,大肠杆菌的染色体并不复制。 在细菌中,噬菌体载体是另外一类常用的克隆载体。和质粒不同的是,噬菌体载体通过感染过程即转导进入宿主大肠杆菌细胞。通常,作为克隆载体的噬菌体,都经过一定的突变和缺失处理。因此,这类噬菌体进入大肠杆菌细胞之后,并不像一般噬菌体那样在宿主染色体上整合,而是直接进入裂解周期:大量复制噬菌体、裂解宿主细胞,最终在培养基上形成含有大量噬菌体拷贝的噬菌斑。 和质粒载体相比,噬菌体载体能够克隆更长的DNA片断。 3.重组克隆筛选 3.1.抗性基因插入失活筛选法 根据抗生素抗性基因插入失活原理而设计的插入失活法是重组体常用的筛选方法。如非重组的pBR322质粒DNA上的四环素和氨苄青霉素抗性基因都是正常的, 表型为AprTcr。带有这种质粒的受体菌可以在加有四环素和氨苄青霉素的双抗性平板上生长。但是, 如果在该质粒的四环素抗性基因内插入外援片段, 就会造成四环素抗性基因失活, 变成AprTcs, 携带这种质粒的宿主菌可以在氨苄青霉素的平板上生长, 而不能在四环素抗性平板上生长。 3.2. 蓝白斑筛选法 根据抗生素抗性基因插入失活原理而设计的插入失活法需要进行菌落平板的影印复制, 才能够将所需的重组体挑选出来, 大大增加了筛选的工作量。后来, 人们设计了以β-半乳糖苷酶的产生作为颜色筛选标记的载体, 简化了筛选程序, 提高了灵敏度。这类载体系统包括M13噬菌体、pUC质粒系统、pEGM质粒系统。它们的共同特点是载体上携带一段细菌的lacZ基因, 它编码β-半乳糖苷酶的一段146个氨基酸的α-肽, 载体转化的受体菌为lacZΔM15基因型。这样, 载体同宿主通过互补, 具有完整的β-半乳糖苷酶的活性。如果在载体的lacZ基

分子克隆技术

分子克隆技术

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克隆载体
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是用来在生物学寄主和试管间“传送”克隆的序 列的DNA分子 (如从细菌到试管再到植物细 胞)。 其共性有四点: 1. 启动自发复制的能力. 2. 含有遗传标记 (通常是显性的) 供选择。 3. 唯一的限切位点以利于克隆插入的DNA 4. 非必需DNA序列 尽可能少以克隆更大片 段。

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pBR322
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pBR322
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pBR322是4362bp的环状 双链DNA载体,有2个抗 药性基因(四环素和氨 苄青霉素),一个复制 起始点和多个用于克隆 的限制酶切点。当缺失 抗药性基因的大肠杆菌 被pBR322成功地转化 时,它便从该质粒获得 了抗生素抗性。两个抗 生素基因中均含供插入 外源DNA用的不同的单一 酶切位点。一般只选一 个抗生素基因作为插入 外源DNA之用。外源DNA 插入后该抗生素抗性失 活。另一抗生素抗性基 因则作为转化细菌后筛 选阳性克隆之用。

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四个重要位点
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负责质粒复制的rep复制子 (来自 pMB1; (2) 编码Rop 蛋白的rop基因,促进 不稳定的 RNA I – RNA II 复合体转变为 稳定的复合体并起着减少质粒拷贝数的 作用 (来自 pMB1); (3) 编码 beta-内酰胺 酶的bla基因,赋予对氨苄青霉素的抗性 (来自 Tn3转座子); (4) 编码四环素抗性蛋 白的tet基因 (来自 pSC101).

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分子生物学克隆表达常用载体序列

pcDNA3.1载体序列:5428bp GACGGA TCGGGAGA TCTCCCGA TCCCCTA TGGTGCACTCTCAGTACAA TCTGCTCTGA TGCCGCA TAGTTAAGCCAGTA TCTGCTCCCTGCTTGTGTGTTGGAGGTCGCTGAGTAGTGCGCGAG CAAAA TTTAAGCTACAACAAGGCAAGGCTTGACCGACAA TTGCA TGAAGAA TCTGCTTAGGGTTAGGCGTTTTGCGCTGCTTCGCGA TGTACGGGCCAGA TA TACGCGTTGACA TTGA TTA TTG ACTAGTTA TTAA TAGTAA TCAA TTACGGGGTCA TTAGTTCA TAGCCCA TA TA TGGAGTTCCGCGTTACA TAACTTACGGTAAA TGGCCCGCCTGGCTGACCGCCCAACGACCCCCGCCCA TTGACG TCAA TAA TGACGTA TGTTCCCA TAGTAACGCCAA TAGGGACTTTCCA TTGACGTCAA TGGGTGGAGTA TTTACGGTAAACTGCCCACTTGGCAGTACA TCAAGTGTA TCA TA TGCCAAGTACGCC CCCTA TTGACGTCAA TGACGGTAAA TGGCCCGCCTGGCA TTA TGCCCAGTACA TGACCTTA TGGGACTTTCCTACTTGGCAGTACA TCTACGTA TTAGTCA TCGCTA TTACCA TGGTGA TGCGGTT TTGGCAGTACA TCAA TGGGCGTGGA TAGCGGTTTGACTCACGGGGA TTTCCAAGTCTCCACCCCA TTGACGTCAA TGGGAGTTTGTTTTGGCACCAAAA TCAACGGGACTTTCCAAAA TGTCG TAACAACTCCGCCCCA TTGACGCAAA TGGGCGGTAGGCGTGTACGGTGGGAGGTCTA TA TAAGCAGAGCTCTCTGGCTAACTAGAGAACCCACTGCTTACTGGCTTA TCGAAA TTAA TACGACT CACTA 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