DNA测序技术的发展及其最新进展
DNA测序技术的发展及其最新进展
摘要：自从诺贝尔奖得主桑格于1977年发明了第一代DN测序技术以来，DNA测序技术已经作为重要的实验技术广泛的应用于现代生物学研究当中。经过了几十年的发展，DNA测序技术日臻成熟，并且以单分子测序为特点的第三代测序技术也已经诞生。本文主要就每一代测序技术原理和特点及其最新进展做简要介绍。
关键词：DNA测序技术；第三代DNA测序技术；最新进展
The Development and New Progress of DNA Sequencing
Technology
Abstract: Since Nobel Prize Winner Sanger have founded the first generation of DNA Sequence technology in 1977, DNA sequencing technology has been widely used in modern biological researches as an important experimental. Over decades of year’s development, DNA sequence technology mature gradually and the third generation sequencing technologies characterized by single-molecule sequencing have also emerged. The mechanisms and features of each generation of sequencing technology and their latest progress will be discussed here.
Key Words: DNA Sequence technology ; third generation DNA sequencing ;latest development 1.引言
DNA测序技术是分子生物学研究中最常用的技术,它的出现极大地推动了生物学的发展。自从1953年Watson和Crick发现DNA双螺旋结构后[1]，人类就开始了对DNA序列的探索，在世界各地掀起了DNA测序技术的热潮。1977年Maxam和Gilbert报道了通过化学降解测定DNA序列的方法[2]。同一时期,Sanger发明了双脱氧链终止法[3]。20世纪90年代初出现的荧光自动测序技术将DNA测序带入自动化测序的时代。这些技术统称为第一代DNA测序技术。最近几年发展起来的第二代DNA测序技术则使得DNA测序进入了高通量、低成本的时代。目前,基于单分子读取技术的第三代测序技术已经出现,该技术测定DNA序列更快,并有望进一步降低测序成本,推进相关领域生物学研究。本文主要介绍DNA测序技术的发展历史及不同发展阶段各种主要测序技术的特点，并针对目前新一代DNA测序技术及目前国际DNA测序最新进展做简要综述。
2.第一代测序技术
早在1954年，Whitfeld等就提出了测定多聚核糖核苷酸链的降解法[4]，该方法利用磷酸单酯酶的脱磷酸作用和高碘酸盐的氧化作用从链末端逐一分离寡核糖核苷酸并测定其种类。但由于操作复杂等原因，该方法并没有被广泛应用。在1977年，Sanger等提出了经典的双脱氧核苷酸末端终止测序法[5]。该方法的原理是：由于ddNTP的2′和3′都不含羟基，在DNA合成反应中不能形成磷酸二酯键，因此可以被用来中断DNA合成反应。在4个DNA 合成反应体系中分别加入一定比例的带有放射性同位素标记的某种ddNTP，通过凝胶电泳和放射自显影后，可以根据电泳带的位置确定待测分子的DNA序列。同一年，Gilbert等提出了化学降解法[6]。该方法与Sanger法类似，都是先得到随机长度的DNA链，再通过电泳方法读出序列。二者的不同之处在于，Gilbert法是先用特定的化学试剂标记碱基再用化学方法打断待测序列，而Sanger法是通过ddNTP随机中断合成待测序列。此后，在Sanger 法的基础上，80年代中期出现了以荧光标记代替放射性同位素标记、以荧光信号接收器和计算机信号分析系统代替放射性自显影的自动测序仪[7]。另外，90年代中期出现的毛细管电泳技术使得测序的通量大为提高[8]。除此之外，这一时期还出现了一些其他的测序方法，如焦磷酸测序法[9]、连接酶测序法[10]、杂交测序法[11]等。其中焦磷酸测序法即为后来Roche 公司454技术使用的测序方法，连接酶测序法即为后来ABI公司SOLiD技术使用的测序方法。
3.第二代测序技术
随着人类基因组计划的完成，人们开始进入后基因组时代。科学家逐步测出多种生物的序列，传统的测序技术已经无法满足高通量和高效率的大规模基因组测序，。经过不断的开发和测试，进入21世纪后，以Roche公司的454技术[12,13]、Illumina公司Solexa技术[14-16]和ABI 公司的SOLiD技术[17,18]为标志的第二代测序技术诞生了。与第一代技术相比，第二代测序技术不仅保持了高准确度，而且大大降低了测序成本并极大地提高了测序速度。使用第一代Sanger的测序技术完成的人类基因组计划，花费了30亿美元巨资，用了三年的时间；然而，使用第二代SOLiD的测序技术，完成一个人的基因组测序现在只需要一周左右的时间。第二代测序技术实现了高通量、高效率、高准确度的测序大大降低了测序的成本，DNA测序可以向个人测序发展。第二代测序技术很好应用于单核苷酸多态性（Single Nucleotide Polym -orphism，SNP）的研究，对探索人类的遗传及基因病有极大的意义[19]。
4．第三代测序技术
近期出现的Helicos公司的Heliscope单分子测序仪、Pacific Biosciences公司的SMRT 技术和Oxford Nanopore Technologies公司正在研究的纳米孔单分子技术，被认为是第三代测序技术。与前两代技术相比，他们最大的特点是单分子测序。其中，Heliscope技术和SMRT技术利用荧光信号进行测序，而纳米孔单分子测序技术利用不同碱基产生的电信号进行测序。现介绍如下：
（1）单分子即时DNA测序：简称SMRT，是在4种dNTP的1一磷酸上标记有不同发射光谱的荧光基团，当DNA聚合酶催化dNTP掺入到合成链中时，使用显微镜可以检测到每个掺入dNTP所携带的荧光信号，经计算机分析转化为相应的碱基序列信息。这种荧光标记的dNTP不会影响DNA聚合酶的活性，并且在掺入合成链后其荧光基团与^y-磷酸解离，合成的DNA链和天然的DNA链完全一样[20]。在显微镜即时记录DNA链上的荧光的时候，DNA 链周围的众多游离的荧光标记dNTP形成了非常强大的荧光背景。单分子的荧光探测由一种被称为零级波导(zero mode wave guide)的纳米结构来实现DNA聚合的即时观察和背景荧光干扰的消除[32]。该结构在一片薄金属膜上蚀刻出数以千计直径数十纳米的小孔，并将金属膜附着在透明的支持基质上，由于每个小孔的尺寸低于光的波长，所以当光线从透明的基质侧照射时无法透过小孔，而是在小孔底部形成指数衰减的消逝波，这样创造了一个很小体积的检测空间(zeptoliters，即10。21L)。在这么小的孔内，DNA链周围游离的荧光标记dNTP 有限，而且由于4种荧光标记dNTP非常快速进出于小孔，它们形成的是非常稳定的背景荧光信号。在每个小孔底部固定有一个DNA聚合酶分子，当某一种荧光标记dNTP被掺入到DNA合成链时，其携带的特定荧光会持续一小段时间(荧光光曝)，直到荧光基团被DNA聚合酶切除为止。荧光光曝的荧光颜色揭示了模板上的互补碱基，通过即时监控每个波导孔的荧光光曝，就能连续测定每一个孔内DNA模板的序列，序列读取速度可达到每秒钟十个碱基，能在短短的几分钟内对长片段DNA进行测序。从样本制备到测序完成，所需的时间还不到一天，这对于传染病监控和分子病理学尤为重要。
（2）HeliScope单分子测序：HeliScope单分子测序技术仍然基于合成测序原理[21]，它采用了一种新的荧光类似物和更加灵敏的监测系统，能够直接记录到单个碱基的荧光，从而克服了第二代测序必须用PCR扩增出数千个拷贝以增加信号亮度的缺陷。先将DNA文库的单链片段密集固定排列在平面基板上形成阵列，在每个测序循环中，DNA聚合酶和一种荧光标记dNTP流人，按照模板序列延伸DNA链，阵列中发生了碱基延伸反应的DNA链就会发出荧光，通过CCD记录并转化为相应的碱基序列信息。经过洗涤，延伸了的DNA链上
的荧光物质被切除并被移走，便可以进行下一轮单个碱基的延伸、荧光标记的切除以及图像的获取。HeliScope利用精密的全内反射显微镜技术降低荧光背景的同时，在测序结束后去掉延伸的合成链，将模板重置为最初的单链状态，从相反的方向再进行另一次测序，生成同一模板的第二个序列信息，重复的双向测序可以用于去除缺失错误，显著提高了原始数据准确度。利用HeliScope技术，Harris等[22]对M13病毒全基因组分割而成的280000条DNA 链进行了同步测序和双向测序，并标记出所有的单碱基突变类型。HeliScope技术中每条合成链都是独立操作的，但亦面l临着同聚核苷酸的误读问题，只能寄希望于通过动力学控制DNA聚合酶活性，降低DNA链延伸的速度。在dNTP被洗掉前减少两个连续碱基连接在链上的可能。
（3）基于荧光共振能量转移的即时DNA测序：基于荧光共振能量转移(FRET)的测序技术是在DNA聚合酶上标记有荧光供体，在不同的dNTP上标记不同发射光谱的荧光受体，当掺人合成链时dNTP与DNA聚合酶位置靠近而发生荧光共振能量转移，能量从聚合酶的荧光供体转移到dNTP的荧光受体，供体的荧光强度降低，受体的荧光强度升高，捕捉到的荧光信号被转化为相应的碱基序列信息[23]。此法被认为是HeliScope技术的改进，具有两大优势：首先，游离的dNTP不发光，只有其掺入到新合成的DNA链时才会发光，极大地降低了背景荧光干扰；其次，因为用FRET方法不需要用到持续的高能量的激发光照射，因此也能够极大地减少DNA聚合酶的光损伤作用，进一步延长了测序长度。
（4）纳米孔单分子测序：Stoddart等[24]在一个由生物分子(如α溶血素蛋白)组成的纳米孔内侧分别结合了一个核酸外切酶和一个环式糊精分子，并将其置于一个类似细胞膜结构的脂质双分子层中。当DNA模板进入纳米孔时，孔中的核酸外切酶会“抓住”DNA分子，逐个剪切掉DNA分子的组成碱基，被切掉的单个碱基通过纳米孔时都会与环式糊精分子相互作用，产生一个特异性电流，根据这个电流就能推测出是哪一种碱基通过了纳米孔。每种碱基在通过纳米孔时引起的特异性电流均不同，很容易区分出不同的碱基信号并转化成DNA序列信息。纳米孔测序的优势在于它不需要对DNA进行标记，也就省去了昂贵的荧光试剂和CCD照相机。目前的甲基化研究都需利用重亚硫酸盐处理，将非甲基化胞嘧啶转化为尿嘧啶，使其在后续分析中与甲基化胞嘧啶区分开来。纳米孔技术的另一优势就是能利用特异性电流的微小差异直接读出DNA序列中的甲基化胞嘧啶，不再需要重亚硫酸盐转化，对表观基因组测序的研究人员来说意义非凡。新近，Derrington等[25]列利用耻垢分枝杆菌孔蛋白A 构建了一种纳米孔，其特点是可以将单链DNA的局部双链结构松解，使其顺利通过纳米孔，保证测序过程更加通畅。但是，纳米孔测序仪仍面临两个重要的技术问题：一是如何将核酸
外切酶更好地附着在孔上，确保每次只有一个碱基通过纳米孔，另一个是并行化问题，可能需要开发芯片来确保整个测序过程更快速。
（5）离子流半导体测序：离子流半导体测序技术使用了一种高密度半导体芯片，芯片上布满了小孔，这些小孔就是一个个的测序反应池，其内侧固定了一个DNA聚合酶分子。小孔底部附有能感应pH变化的离子敏感层和离子感受器，当DNA聚合酶在每一个DNA模板链上滑动，合成链中每掺入一个核苷酸，离子敏感层和离子感受器就会检测到释放出的氢离子引起的pH值变化，并将其转化为电信号，进一步翻译为对应的碱基，因此该技术被戏称为“测序的pH计”。与纳米孔技术一样，离子流半导体测序技术也同样不需要标记核苷酸和昂贵的光学探测设备。不久前问世的Ion TorrentPersonal Genome Machine(PGM)测序仪只有微波炉大小，可以在I～2 h内完成100—200个碱基的测序任务。
5.DNA测序技术最新进展
自从DNA测序技术诞生以来，就以迅猛的速度向前发展，并大大推动了生命科学的研究进展。
快速的DNA测序有可能很快成为每个人医疗记录的例行工作的一部分，揭示出过去隐藏在人类基因组30亿个核苷酸碱基中的庞大的信息。来自美国亚利桑纳州立大学生物设计学院单分子生物物理中心的主任Stuart Lindsay刚刚成功地解决了新型纳米孔测序法中的一个主要的绊脚石[26]。Lindsay最新的实验结果证实了其在DNA读值方面取得重大的改进，这一论文发布在《纳米技术》杂志上。
根据Science综述当前的技术状况，纳米孔测序“似乎准备离开实验室”，并且一个基因组1000美元测序成本的梦想有可能近在咫尺，虽然仍然存在一些障碍。
据物理学家组织网12月12日（北京时间）报道，英国研究人员简化了基因组测序的标准流程，首次无需进行文库制备便完成了DNA单分子测序，而且新方法只要很少量的DNA 就能获得序列数据，用量可低至不到1纳克，仅为常规测序方法的500分之一到600分之一。
该研究论文的第一作者、英国威康信托基金会桑格研究所的保罗?库普兰说：“我们用这种方法对病毒和细菌的基因组测序后发现，即使在相对较低的水平，我们也能够确定所检测的是何种有机物，不论样本中是否存在特定的基因或质粒（这对于确定抗生素耐药性很重要），或者其他信息，如对特定DNA碱基的修改等。”他表示，一旦技术得到优化，将在快速、高效地识别医院和其他医疗场所中的细菌和病毒方面具有很大的应用潜力。
这项技术也使得科学家能够对此前无法识别的宏基因组（也称微生物环境基因组）样本
中的生物体进行确认。“为微生物测序，首先需要能够在实验室中培养它们。”论文的主要作者、英国巴布拉汉研究所的塔米尔?钱德拉说，“这不仅耗费时间，而且有时候微生物不生长，为它们的基因组测序极其困难。”他表示，新方法可以直接对微生物测序，短时间内便可确定其身份。
论文的另一主要作者、威康信托基金会桑格研究所的哈罗德?斯维尔德洛说：“我们的技术可以在对所测序列没有任何先验知识、没有特定微生物试剂的条件下，在很短的时间内操作，这是一种很有前途的替代手段，可应用于控制感染等临床需要。”
这项技术也使得科学家能够对此前无法识别的宏基因组（也称微生物环境基因组）样本中的生物体进行确认。因而我们说，英国科学家此番取得的突破，不管是从整个学科研究的方法论层面，还是从临床应用的角度，都提高了基因研究服务于人类的速度[27]。
6.结语
DNA测序技术作为一项重要的技术早已成为生命科学研究的基础支撑技术，广泛的应用于生物学及医学研究。随着科技的发展，相信未来会有更为高效、便捷的DNA测序新技术诞生，DNA测序技术也将会好的应用于造福人类。
[1] Watson J.D., Crick F.H.C. A Structure for Deoxyribose Nucleic Acid. Nature.1953,
171:737-738.
[2] Maxam AM , Gilbert W . A new method for sequencing DNA. Proc Natl Acad Sci USA , 1977 , 74(2) :560-564.
[3] Sanger F ,Nicklen S, Coulson AR . DNA sequencing with chain -terminating inhibitors .
Proc Natl Acad Sci USA , 1977 , 74(12):5463-5467.
[4]Whitfeld, P.R. A method for the determination of nucleotidesequence in polyribonucleotides.
Biochem J, 1954，58(3): p.390-6.
[5]Sanger, F., S. Nicklen, and A.R. Coulson, DNA sequencingwith chain-terminating inhibitors.
Proc Natl Acad Sci U S A,1977，74(12): p. 5463-7.
[6]Maxam, A.M. and W. Gilbert.A new method for sequencingDNA. Proc Natl Acad Sci U S A,
1977，74(2): p. 560-4.
[7]Melamede, R.J..Automatable process for sequencing nucleotide. 1985, US patent.
[8]Heiger, D.N., A.S. Cohen, and B.L. Karger.Separation of DNA restriction fragments by high
performance capillary electrophoresis with low and zero crosslinked polyacrylamide using continuous and pulsed electric fields. J Chromatogr, 1990，516(1): p. 33-48.
[9]Hyman, E.D..A new method of sequencing DNA. Anal Biochem, 1988，174(2): p. 423-36.
[10]Pfeifer, G.P., et al. Genomic sequencing and methylation analysis by ligation mediated PCR.
Science, 1989，246(4931): p. 810-3.
[11]Drmanac, R., et al. Sequencing of megabase plus DNA by hybridization: theory of the method.
Genomics, 1989，4(2): p. 114-28.
[12]Margulies, M., et al.Genome sequencing in microfabricated high-density picolitre reactors.
Nature, 2005，437(7057): p. 376-80.
[13]https://www.sodocs.net/doc/b26801084.html,.
[14]Fedurco, M., et al.BTA, a novel reagent for DNA attachment on glass and efficient generation
of solid-phase amplified DNA colonies. Nucleic Acids Res, 2006，34(3): p. e22.
[15]Turcatti, G., et al. A new class of cleavable fluorescent nucleotides: synthesis and optimization
as reversible terminators for DNA sequencing by synthesis. Nucleic Acids Res, 2008，36(4): p. e25.
[16]https://www.sodocs.net/doc/b26801084.html,.
[17]Shendure, J., et al.Accurate multiplex polony seqan evolved bacterial genome. Science, 2005，
309(1728-32.)
[18]https://www.sodocs.net/doc/b26801084.html,/
[19] Stephan C. S. Next-generation sequencing transforms today’s biology. Nature
Methods .2008,5:16-18
[20] Eid J，Fehr A，Gray J，et a1．Real-time DNA sequencing fromsingle polymerase molecules．Science，2009，323(5910)：133-138．
[21]Levene MJ，Kodach J，Turner SW，et a1．Zero—mode waveguidesfor single-molecule analysis at high concentrations．Science。2003。299(5607)：682-686．
[22]Harris TD，Buzby PR，Babcock H，el a1．Single—molecule DNAsequencing of a viral
genome．Science，2008，320(5872)：106·109．
[23]Schadt EE。Turner S，Kasarskis A．A window into third．generation sequencing．Hum Mol
Genet，2010，19(112)：11227·R240．
[24]Stoddart D，Heron AJ，Mikhailova E，et a1．Single—nueleotidediscrimination in immobilized
DNA oligonueleotides with abiological nanopom．Proc Nat Acad sci U S A，2009，106(19)：7702-7707．
[25]Derrington IM，Buffer TZ，Collins MD，et 81．Nanopore DNAsequencing with MspA．Pmc
Nad Acad SCi U S A，20I0，107(37)：16060-16065．
[26] https://www.sodocs.net/doc/b26801084.html,
[27]科技日报2012-12-13 08:24:00