HPLC法同时测定维药驱虫斑鸠菊中4个黄酮类成分含量-王加利
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第19卷 第8期 2017 年 8 月
辽宁中医药大学学报
JOURNAL OF LIAONING UNIVERSITY OF TCM
Vol. 19 No. 8 Aug .，
2017
驱虫斑鸠菊Vernonia anthelmintica （L.）Willd，维吾尔药名卡拉孜然，为菊科Compositae 斑鸠菊属一年生草本植物，其药用部位为秋季采挖的成熟瘦果，具有清除异常黏液质、驱虫、消肿、散寒、止痛的功效，用于治疗湿寒性胃痛、肝病及白癜风等症，现
临床多用于对白癜风的治疗[1]
。本品主要生长于新疆的和田、阿克苏及云南西部，国外印度、巴基斯坦
等国亦有栽种[2]
。目前以其为主药研制的单味和复方制剂有注射剂、软膏、擦剂、片剂、丸剂等[3-5]，其中复方驱虫斑鸠菊丸和驱虫斑鸠菊注射液在临床应用广泛，对白癜风的治疗有较好的疗效[6-7]。如上所述，
驱虫斑鸠菊作为治疗白癜风的主要药物，在《中华人
民共和国卫生部药品标准·维吾尔药分册》中却只收载了其性状和显微鉴别项，无含量测定项目，质量标准较低。有研究表明，黄酮类化合物是驱虫斑鸠菊果实的主要活性成分，主要通过促进黑素细胞中优黑素的合成而有效促进黑素合成[8-9]。故本课题组通过提取分离手段从驱虫斑鸠菊果实中分离出了含量较大的4个黄酮类成分，分别为圣草酚、紫铆查耳酮、紫铆素和异鼠李素，并以它们作为驱虫斑鸠菊含量测定的指标性成分，考察7批驱虫斑鸠菊药材中这4个黄酮类成分的含量差异，为完善驱虫斑鸠
HPLC法同时测定维药驱虫斑鸠菊中4个黄酮类成分含量
王加利，袁将，全庆华，姬瑞芳，刘永刚
（北京中医药大学，北京 100102）
摘 要：
目的：建立高效液相色谱法同时测定维药驱虫斑鸠菊中圣草酚、紫铆查耳酮、紫铆素和异鼠李素含量的方法，为完善驱虫斑鸠菊质量标准提供依据。方法：以圣草酚、紫铆查耳酮、紫铆素和异鼠李素为对照品，采用Agilent ZORBAX SB-C 18（4.6 mm×250 mm，5 μm）色谱柱，以乙腈为流动相A，0.2%磷酸水溶液为流动相B，
进行梯度洗脱，检测波长310 nm，流速1.0 mL·min -1
，柱温25 ℃，测定驱虫斑鸠菊药材中这4个黄酮类成分的含量。结果：本法中圣草酚、紫铆查耳酮、紫铆素和异鼠李素的进样量分别在13.44~107.52、30.24~241.92、9.60~76.80、6.25~49.97 ng 范围内与峰面积积分值呈良好线性关系，r 分别为0.9998、0.9999、0.9991、0.9997，平均加样回收率（n =9）在99.70%~100.56%，RSD 小于2.0%。结论：本法简单、快速、重现性好，可为评价驱虫斑鸠菊药材的质量提供依据。
关键词：驱虫斑鸠菊；圣草酚；紫铆查耳酮；紫铆素；异鼠李素；黄酮类化合物；含量测定
中图分类号：284.1 文献标志码：A 文章编号：1673-842X (2017) 08- 0043- 03
收稿日期：2017-02-22
基金项目：国家自然科学基金项目（30901959）；新疆自然基金项目（201318101-5）作者简介：王加利（1992-），女，湖北荆州人，硕士研究生，研究方向：中药物质基础研究。通讯作者：刘永刚（1981-），男，山东临沂人，副教授，硕士研究生导师，研究方向：中药物质基础研究。
Simultaneous Determination of Four Flavonoids in Vernonia Anthelmintica Willd. by HPLC
WANG Jiali，YUAN Jiang，QUAN Qinghua，JI Ruifang，LIU Yonggang
（Beijing University of Chinese Medicine，Beijing 100102，China）
Abstract：Objective ：This study is to establish a method for simultaneous determination of
eriodictyol，butein，butin and isorhamnetin in Vernonia anthelmintica Willd. by HPLC，a kind of Uyghur medicine，which can provide the basis for quality standard of Vernonia anthelmintica Willd. Methods ：Eriodictyol，butein，butin and isorhamnetin were reference substance. The analysis was performed on a ZORBAX SB-C 18 column（4.6 mm×250 mm，5μm）with the mobile phase consisted of mobile phase A（aceto nitrile）and mobile phase B（0.2% phosphoric acid solution）in a programme of gradient elution. The detection wavelength was 310 nm，the flow rate was 1.0 mL·min -1 and the column temperature was 25 ℃. Results ：The linear ranges of eriodictyol，butein，butin and isorhamnetin were 13.44~107.52，30.24~241.92，9.60~76.80，6.25~49.97 ng. The average recovery rates（n =9）for the sample preparation of the markers were in the range of 99.70%~100.56% and RSD was less than 2.0%. Conclusion ：The method is simple，rapid and replicable，which can be used for the quality control of Vernonia anthelmintica Willd.
Keywords：Vernonia anthelmintica Willd.；eriodictyol；butein；butin；isorhamnetin；flavonoids；content determination
DOI：10.13194/j.issn.1673-842x.2017.08.012
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菊药材的质量标准及进一步的研究提供科学依据。
1 仪器、试剂与材料
1.1仪器与试剂
Waters1525型高效液相色谱仪，2489型检测器，Empower色谱工作站（美国Waters公司）；KQ5200DE型数控超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）；BT224S万分之一型电子天平（德国Satorious公司）；BT125D十万分之一型电子天平（德国Satorious公司）。
对照品圣草酚、紫铆查耳酮、紫铆素和异鼠李素均由本实验室提取分离制备得到，HPLC面积归一化法测定纯度均达到98%以上；乙腈和甲醇（色谱纯，美国Fisher公司）；甲醇（分析纯，国药集团化学试剂有限公司）；水为屈臣氏纯净水；其他试剂均为分析纯。
1.2药材
驱虫斑鸠菊药材购自新疆和田市维吾尔医大药房，经新疆维吾尔医学专科木艾塔尔副教授鉴别为菊科植物驱虫斑鸠菊Vernonia anthelmintica Willd.的成熟果实。
2 方法与结果
2.1混合对照品溶液的制备
精密称取圣草酚、紫铆查耳酮、紫铆素和异鼠李素的对照品适量，加甲醇分别制成对照品母液。再分别吸取一定体积的各对照品母液于同一量瓶中，加甲醇定容制成含圣草酚2.69 mg·L-1、紫铆查耳酮6.05 mg·L-1、紫铆素1.92 mg·L-1、异鼠李素
1.25 mg·L-1的混合溶液，置4 ℃冰箱避光保存。
2.2供试品溶液的制备
精密称取驱虫斑鸠菊药材约1 g，置于100 mL圆底烧瓶中，精密加入25 mL甲醇加热回流提取1 h，共3次，合并滤液，用少许甲醇冲洗药材至液体无色，将其与滤液合并，减压浓缩并用甲醇定容于25 mL 量瓶中，摇匀，用0.45 μm微孔滤膜滤过，即得供试品溶液。
2.3色谱条件
色谱柱：Agilent ZORBAX SB-C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流动相：A相为乙腈，B相为0.2%磷酸水溶液，梯度洗脱条件见表1；流速：1.0 mL·min-1；检测波长：310 nm；柱温：25 ℃。该色谱条件下4个黄酮色谱峰峰形较好，且无其它杂质峰干扰。对照品和供试品色谱图见图1。
表1 梯度洗脱的流动相比例
时间（min）流动相A流动相B
020%80%
2530%70%
3535%
65%
注：A.对照品；B.驱虫斑鸠菊样品；1.紫铆素；2.圣草酚；3.异鼠李素；4.紫铆查耳酮。
图1 驱虫斑鸠菊高效液相色谱图
2.4方法学考察
2.4.1 标准曲线绘制
精密吸取“2.1”项下混合对照品溶液5、10、20、30、40 μL，按照“2.3”项下色谱条件进行色谱分析，记录峰面积。以对照品的质量X（ng）为横坐标，色谱峰面积的积分值Y为纵坐标，绘制标准曲线，并进行线性回归，得每个黄酮的回归方程、相关系数以及线性范围。结果见表2。
表2 驱虫斑鸠菊中4个黄酮类成分的线性方程和范围
成分回归方程r值线性范围（ng）圣草酚Y=1798.5X-1587.50.999813.44~107.52
紫铆查耳酮Y=1984.7X-1981.10.999930.24~241.92
紫铆素Y=2313.8X+1422.80.99919.60~76.80
异鼠李素Y=1659.2X-1643.70.9997 6.25~49.97
2.4.2 检测限和定量限
将混合对照品溶液逐步稀释至合适的浓度，进样检测，最低检测限（LOD）取信噪比（S/N）约为3时的进样量，最低定量限（LOQ）取信噪比（S/N）约为10时的进样量。结果表明圣草酚、紫铆查耳酮、紫铆素、异鼠李素的检测限分别为1.32、1.45、0.15、
1.44 ng，定量限分别为
2.33、2.50、0.39、2.49 ng。
2.4.3 精密度试验
精密吸取“2.1”项下制备的混合对照品溶液10 μL，按“2.3”项下色谱条件重复进样6次，测定峰面积并计算圣草酚、紫铆查耳酮、紫铆素和异鼠李素的RSD（n=6）值分别为1.17%、0.83%、1.14%、
1.54%，表明仪器精密度良好。
2.4.4 重复性试验
精密称取同一驱虫斑鸠菊样品粉末6份，每份约1 g，按“2.2”项下方法制备供试品溶液，按“2.3”项下色谱条件分别进样10 μL，记录峰面积，计算圣草酚、紫铆查耳酮、紫铆素和异鼠李素的RSD分别为1.98%、1.17%、1.56%、1.16%，平均含量分别为80.58、194.45、54.39、44.21 μg·g-1，表明该方法重复性良好。
2.4.5 稳定性试验
取“2.4.4”项下其中一个供试品溶液，室温下放置，按“2.3”项下色谱条件每隔2 h测定峰面积，结果圣草酚、紫铆查耳酮、紫铆素和异鼠李素的RSD 分别为0.34%、0.41%、0.33%、1.13%，表明样品在12 h内稳定。
2.4.6 回收率试验
精密称取圣草酚、紫铆查耳酮、紫铆素和异鼠李素含量已知（80.58、194.45、54.39、44.21 μg·g-1）的驱虫斑鸠菊样品9份，每份约0.5 g，分别按 80%、
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100%、120%的比例精密加入各对照品适量，按“2.2”项下方法制备样品溶液，按“2.3”项下色谱条件进样，每次吸取10 μL，记录峰面积，计算平均回收率，结果见表3。
表3 回收率测定结果
对照品
原有量（μg）加入量
（μg）
测得量（μg）回收率（%）平均回收率（%）RSD
（%）圣草酚40.7340.6440.3440.3940.5840.4640.4740.3040.3532.54
32.5432.5440.7040.7040.7048.8248.8248.82
72.55 71.98 73.38 80.93 80.74 81.67 89.49 90.14 88.98 97.79 96.31101.54 99.61 98.67101.25100.41102.09 99.6199.70 1.88 紫铆查耳酮98.2898.0697.3497.4697.9397.6397.5297.2897.4478.62
78.6278.6298.2898.2898.28 117.94 117.94 117.94
176.89174.96177.52 195.2196.17197.56215.45217.23218.04 99.99 97.81101.98 99.45
99.96101.68 99.99101.70102.26100.54 1.46紫铆素27.4927.4327.2327.2627.3927.3127.2127.2727.2521.81
21.8121.8127.2627.2627.2632.7232.7232.72
49.34 49.15 49.43 54.39 54.97 55.02 60.04 60.35 59.88100.18 99.59101.79 99.52
101.17101.65100.34101.10 99.72100.560.88异鼠李素22.3422.3022.1322.1622.2622.2022.1622.1222.1117.72
17.7217.7222.1422.1422.1426.5726.5726.57 40.02 39.82 39.76 44.26 44.55 44.62 49.12 48.88 49.33 99.77 98.87 99.49 99.819
100.68101.26101.47100.72102.45
100.50 1.242.5 含量测定
分别精密称取不同批次驱虫斑鸠菊药材约1 g，
按“2.1”项下制备供试品溶液，按“2.3”项下色谱条件进样，每次吸取10 μL，记录峰面积，按外标法计算样品中圣草酚、紫铆查耳酮、紫铆素和异鼠李素含量，结果见表4。
表4 不同批次含量测定结果（μg·g -1，n =3）批次
圣草酚紫铆查耳酮紫铆素异鼠李素180.58194.4554.3944.21276.02192.6253.9442.9134567平均值
84.8482.8378.9488.5680.7881.79
195.88199.08189.67195.43188.98193.73
56.5855.6756.8951.0953.5854.59
48.0345.8944.6847.0143.1145.12
3 讨论
3.1 提取方式与溶剂的选择
考察了加热回流与超声提取两种方法、甲醇和80%乙醇两种提取溶剂对驱虫斑鸠菊药材中黄酮类
成分提取率的影响，结果发现甲醇加热回流法能提取出较多的样品成分。
3.2 检测波长的选择
考察了254、280、310 nm 波长下的色谱图，结果发现在310 nm 波长下测定驱虫斑鸠菊中黄酮类成分杂质干扰少，灵敏度较高，因此选择310 nm 作为检测波长。
3.3 流动相的选择
本实验用甲醇-磷酸水溶液、乙腈-磷酸水溶液等流动相以不同比例洗脱方式进行色谱条件筛选，结果表明，乙腈-0.2%磷酸水溶液梯度洗脱可使样品达到有效分离，色谱峰峰形较好，未受杂质峰干扰，且保留时间适中。
4
小结
驱虫斑鸠菊是维吾尔医治疗白癜风的常用药，含有黄酮类、倍半萜类、咖啡酰基奎宁酸类等多种化
学成分[10-12]
，其中黄酮类成分为主要有效成分。马
慧军等[8]
研究得出驱虫斑鸠菊黄酮在体外能直接刺激人表皮黑素细胞黑素合成。邓瑞春等[13]研究发现驱虫斑鸠菊黄酮可以增强A375人黑素瘤细胞增殖，提高酪氨酸酶和黑色素合成能力。本实验以前期分离制备得到的圣草酚、紫铆查耳酮、紫铆素和异鼠李素为对照品，应用HPLC 法建立了驱虫斑鸠菊中这4个黄酮类成分的含量测定方法。方法学考察结果表明，本法可以为完善驱虫斑鸠菊质量标准提供依据。含量测定结果表明，在7批驱虫斑鸠菊药材中含量最高的是紫铆查耳酮，这表明从含量上看紫铆查耳酮为驱虫斑鸠菊的主要黄酮类成分，且可能是驱虫斑鸠菊的主要活性成分。同时这7批驱虫斑鸠菊药材中4个黄酮类成分含量有一定的差异，需结合药效进行进一步研究，制定驱虫斑鸠菊真伪和优劣的标准，进一步保证临床用药的安全有效。◆
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