消化胰酶配制方法

适用于，无师兄、师姐、非细心、单独开展细胞培养的实验者

对一般细胞0.25% 胰酶(胰蛋白酶，Trypsin)

配方：100ml PBS,0.25g胰酶

步骤：1先配100mlPBS(1000mlPBS:8.0gNaCl,3.4785gPO4HNa2·12H2O

/2.9gPO4HNa2 ,0.2gKCl,0.2gPO4H2K溶于1000ml蒸馏水)

2 称胰酶0.25g

3 加入PBS中，低速搅拌〈4h冰浴中,或者4℃过夜

低速搅拌0.5h冰浴中

4 调PH7.4

5 仍在冰浴中

6 过滤，分装，-20℃保存，4℃短期内用完

tip:低速很重要，机械搅拌对酶是一种冲击，如果起沫，

酶就变性了。低温，防止酶失活

对难消化的细胞：在上述配方中，加入0.02g的EDTA(0.02%)

tip:因为EDTA可以络合Ca2+，增加消化效力好帖，顶一个！！！

不过我们用hanks配制胰酶好呀，对我帮组好大呵呵,亲人呀呵呵,亲人呀Thank you!谢谢分享！谢谢。呵呵应该是Ｄ-Ｈａｎｋｓ吧．excellent好是好，不过你的分子式写错了，PO4HNa2应为Na2HPO4，PO4H2K应为KH2PO4。这种错误好像不该出吧。我用的是EBss配的.呵呵，经典提醒。

我的一位大学老师，有机化学，我称之为董，呵呵。

前几天，和前辈聊，他说：你学了那么多学科，还接触过很多实验，应该在科研上很有前途。我说：等我自己积累到一定程度，就能把昨天的东西也发挥上。

董，你的提醒，促使我加强这个意识！！！好！

提醒一点，一定要分装成小瓶！2~3次即用完！不然胰酶失活，你会很麻烦！胰酶是不能用hanks的,应用D-hanks,不能有钙镁离子我们都用PBS配置，然后加EDTA。方法如下：PBS100ml+250mg胰酶+0.02EDTA

消化作用很快，加EDTA对细胞毒性较小。

Transwell实验原理与操作步骤

Transwell实验原理与操作步骤 Trans-这个词根有转移、转运、穿过等意思，well有小室的意思，可以从字面上理解，这是一类有通透性的杯状的装置，根据Corning公司的Transwell说明书中的介绍，可以认为这是一种膜滤器（Membrane filters），也可认为是一种有通透性的支架（permeable supports）。更准确地说，Transwell应该是一种实验技术，这项技术的主要材料是Transwell 小室（Transwell chamber，Transwell insert），其外形为一个可放置在孔板里的小杯子，不同厂家对Transwell会有不同的命名，而不同型号也可有不同形状，不同大小，根据实验需要，可有不同选择。但无论是何种外形，其关键部分都是一致的，那就是杯子底层的一张有通透性的膜，而杯子其余部分的材料与普通的孔板是一样。这层膜带有微孔，孔径大小有0.1－12.0μm，根据不同需要可用不同材料，一般常用的是聚碳酸酯膜（polycarbonate membrane）。 将Transwell小室放入培养板中，小室内称上室，培养板内称下室，上室内盛装上层培养液，下室内盛装下层培养液，上下层培养液以聚碳酸酯膜相隔。我们将细胞种在上室内，由于聚碳酸酯膜有通透性，下层培养液中的成分可以影响到上室内的细胞，从而可以研究下层培养液中的成分对细胞生长、运动等的影响。 应用不同孔径和经过不同处理的聚碳酸酯膜，就可以进行共培养、细胞趋化、细胞迁移、细胞侵袭等多种方面的研究。当然不同细胞其体积不同，具体选择时要考虑到细胞大小。这里主要谈几种大家常用的实验： （1）共培养体系： 小于3.0um孔径条件下，细胞不会迁徙通过，因此，若研究不涉及细胞运动能力，不需要细胞穿过聚碳酸酯膜，则应选择3.0μm以下孔径。常用0.4、3.0μm。我们实验室用的是0.4μm。将细胞A种于上室，细胞B种于下室，可以研究细胞B分泌或代谢产生的物质对细胞A的影响。 （2）趋化性实验： 可用5.0、8.0、12.0μm膜，上室细胞可穿过聚碳酸酯膜进入下室，计数进入下室的细胞量可反映下室成分对上室细胞的趋化能力。 ①细胞B对细胞A的趋化作用：将细胞A种于上室，细胞B种于下室，可以研究细胞B分泌或代谢产生的物质对细胞A的趋化作用。 ②趋化因子对细胞的趋化作用：将细胞种于上室，下室加入某种趋化因子，可研究该趋化因子对细胞的趋化作用。 （3）肿瘤细胞迁移实验： 常用8.0、12.0μm膜，上室种肿瘤细胞，下室加入FBS或某些特定的趋化因子，肿瘤细胞会向营养成分高的下室跑，计数进入下室的细胞量可反映肿瘤细胞的迁移能力。

各种细胞消化分解酶

Hyaluronidase 透明质酸酶 产品编号规格价格 H8030-100 100mg 300.00 说明：透明质酸酶可以随机水解透明质酸、软骨素、硫酸软骨素等的β-N-乙酰己糖胺-[ 1→4]糖苷键。 别名：Hyaluronate 4-glycanohydrolase；H yaluronoglucosaminidase CAS＃：37326-33-3 分子量：约55 kDa (共四个亚基，每个亚基分子量约14 kDa) 外观：白色粉末或絮状冻干物 特性：类型：Type I-S 酶活性：400-1000U/mg S：22-24/25 储存条件：-20℃From Sigma H3506 Application ： Total degradation of proteins during the isolation of DNA and RNA; (it is not necessary to let pronase self-digest prior to use). Total hydrolysis of proteins in research and for technical purposes. Tissue dissociation in conjunction with collagenase and trypsin. Production of glycopeptides from purified glycoproteins. Product Description ：Inhibitors: Complete Protease Inhibitor Cocktail Tablets Optimum pH: 6.0 - 7.5, depending on type of protease activity Specific activity: approx. 7,000 U/g lyophilizate at 40°C with casein as the substrate, pH 7.5. One unit is the enzyme activity that liberates folin-positive amino acids and peptides, corresponding to 1 μmol Tyr in 1 min under assay conditions. Specificity: Mixture of several nonspecific endo- and exoproteases that generally digest proteins down to single amino acids. Resolves carboxylic acids and alcohols. Working concentration: 0.5 - 2 mg/ml Contents ：Lyophilizate, non-sterile Quality ：Contaminants: ≤ 0.002 U DNase/RNase per mg lyophilizate Note: The preparation contains approximately 20% calcium acetate.

(完整版)transwell实验原理与步骤

一、Transwell小室制备 1. 无基质胶Transwell小室制备 ①包被基底膜： 用50 mg/LMatrigel 1:8稀释液包被Transwell小室底部膜的上室面，4 ℃风干。如果需要在下室面铺FN的话，可将200 ul枪头的尖端剪掉,吸取FN均匀涂抹在小室的下面。用胶原（collagen）的话，一般配成0.5 mg/ml，直接用枪吸了涂在膜上。 ②水化基底膜： 吸出培养板中残余液体，每孔加入50ul含10g/LBSA的无血清培养液，37 ℃，30min。另有tianjin_glioma战友提供的方法：在上室的聚碳酸酯膜上加入稀释后的Matrigel (3.9 ug/ul) 60-80 μl (注意体积不可太大，以刚把聚碳酸酯膜浸湿为最好)，置37 ℃30 min 使Matrigel聚合成凝胶。 2. 有基质胶的Transwell小室制备 Chemicon公司的ECM550系列说明书要求，将小室放入培养板中，在上室加入300 μl 预温的无血清培养基，室温下静置15－30 min，使基质胶再水化。再吸去剩余培养液。二、制备细胞悬液 ①制备细胞悬液前可先让细胞撤血清饥饿12－24 h，进一步去除血清的影响。但这一步并不是必须的。 ②消化细胞，终止消化后离心弃去培养液，用PBS洗1－2遍，用含BSA的无血清培养基重悬。调整细胞密度至1-10×105，个人认为不要超过5×105。具体实验时采用密度要自己摸索，因为不同细胞，其侵袭能力是不同的。个人经验，细胞量过多，穿过膜的细胞会过多过快，如果最后用计数法统计结果的话将难以计数；而过少的话，可能还没到检测的时间点，所有的细胞都已穿过，因此最少也要保证在收样的时候，上室内还要有一定量的细胞存在。个人认为，对照组和处理尽量不要分开计数，因为细胞数目的差异会严重影响实验结果。如果需要对细胞预处理而不得不分开计数，那么计数一定要多重复几次，力求准确，尽量保证对照组和处理组细胞密度一致。 三、接种细胞 ①取细胞悬液100－200 μl加入Transwell小室，不同公司的、不同大小的Transwell小室对细胞悬液量有不同要求，请参考说明书。24孔板小室一般200 μl。 ②24孔板下室一般加入500 μl含FBS或趋化因子的培养基，不同的培养板加的量有不同要求，具体请参考说明书。这里要特别注意的是，下层培养液和小室间常会有气泡产生，一旦产生气泡，下层培养液的趋化作用就减弱甚至消失了，在种板的时候要特别留心，一旦出现气泡，要将小室提起，去除气泡，再将小室放进培养板。 ③培养细胞：常规培养12－48 h（主要依癌细胞侵袭能力而定）。时间点的选择除了要考虑到细胞细胞侵袭力外，处理因素对细胞数目的影响也不可忽视。 以我的课题为例，我使用的药物不仅会抑制肿瘤细胞侵袭力，还对细胞增殖有明显抑制。我选择的药物浓度是用MTT筛选出的72 h的IC50。用这个浓度处理细胞，24 h内对细胞增殖并无明显抑制，但24 h后，抑制作用就开始出现了。所以，用这个浓度来做Transwell，处理时间也必须限定在24 h内，否则一旦药物抑制了细胞增殖或者诱导出凋亡，使处理组细胞数目少于对照组，那么就难以肯定穿过膜的细胞比对照组少，究竟是由于侵袭被抑制引起，还是处理后细胞数目本身就比对照组少而引起的了。 时间过长不可以，同样，过短也不行，因为细胞内会有一定量的MMPs储存，短时间内可能侵袭能力不会有太大改变。同时从药物被吸收进去，进而发挥作用，影响MMPs表达，到最后释放到培养基中，还需要一个过程。时间点的选择可尽量长点，也可选择多个时间点研究时间依赖效应，但前提是这个时间范围内细胞数目不能有明显变化。另外，我看到细胞在小室内的形态不是正常培养贴壁的形态，而是圆形的，仍是悬浮时的形态，不过会聚集成团，所以看到细胞不正常贴壁也不要紧张，是正常现象 在培养过程中，膜下会逐渐有少量小气泡产生，这是正常现象，可不予处理，但我遇到过培养一段时间后，膜下出现了大气泡，幸亏及时发现，否则后果将非常严重。因此，个人建议，最好接种细胞后1－2 h把培养板从培养箱里拿出来看看，确信没有大气泡产生。

贴壁细胞的消化方法

贴壁细胞的消化方法介绍 日期：2012-05-11 来源：互联网 标签：贴壁细胞细胞消化方法 相关专题： 摘要: 用得也是非常多。一般浓度在0.02%左右。作用于细胞与间质，对细胞间也有一定作用。注意，它能显著影响pH值，而且在弱碱性条件下才易溶。因此，配制时应调节好酸碱度。它不能被终和。因此，消化下来的细胞要洗一遍。 一、酶消化法。 1、胰酶。这是用得最多的。一般浓度在0.25-0.5%。作用时间根据细胞种类、作用温度等因素而变化很大，从几分钟到几十分钟不等。0.25%的胰酶作用于单层贴壁的细胞，在37度条件下，一般消化1-5分钟就足够了。终止是用血清。主要作用于细胞间。配制时不能用含钙、镁的平衡液，否则影响活性。保存于-20度。 2、胶原酶。这种方法比较少，一般是用原代培养时，从组织消化下细胞。这种方法作用温和，对细胞损伤较小，但是，价格也较贵。中止同样是用血清。 二、离子螯合剂：不破坏细胞表面分子，仅与CAMs螯合，因此，如果检测细胞表面分子的话，尽量，甚至是一定不要用酶消化法。 1、EDTA。用得也是非常多。一般浓度在0.02%左右。作用于细胞与间质，对细胞间也有一定作用。注意，它能显著影响pH值，而且在弱碱性条件下才易溶。因此，配制时应调节好酸碱度。它不能被终和。因此，消化下来的细胞要洗一遍。 2、商品化的无酶消化液。个人的使用经常觉得对细胞的损伤比较大，但是分离成单细胞悬液的能力确实比较强。 三、物理法。直接吹打或用细胞刮子将细胞刮下来。 四、冷冻法。此方法仅能用于细胞传代时。无法使组织上的细胞脱落下来。本方法的原理，我想是因细胞冷冻后收缩，从而从培养瓶上脱落下来。优点是：对细胞损伤小，不需要中止或洗细胞，方便，不需要另外配制消化液。特别适用那些贴壁不是特别紧，又特别娇气的细胞。不足是细胞常成小片脱落。此种方法曾用于因用其它方法传代导致大量细胞死亡操作的间充质干细胞、DC细胞的培养，效果非常满意。具体过程是：1、用较多的4度的PBS洗涤一遍细胞(以6孔板为例，加1.5ml/孔)，2、再加0.5ml 4度的PBS，静置操作台上，很快细胞就小片脱落，3、轻轻吹打，细胞即完全脱落，4、按一定比例传代。 细胞消化难题：

病毒感染细胞实验整体流程和原理

病毒感染细胞实验整体流程及原理 目的基因不能直接整合到大多数真核细胞，常用的手段是将目的基因包装成病毒来感染细胞，从而得到表达满足实验需求。 1、病毒的种类 病毒有很多种，常见的有慢病毒和腺病毒 慢病毒 原理 慢病毒（Lentivirus）是逆转录病毒的一种。构建的siRNA / miRNA慢病毒载体，与化学合成的siRNA 和基于瞬时表达载体构建的普通 siRNA 载体相比，一方面可以扩增替代瞬时表达载体使用，另一方面，Lentivirus-siRNA 克隆经过慢病毒包装系统包装后，可用于感染依靠传统转染试剂难于转染的细胞系如原代细胞、悬浮细胞和处于非分裂状态的细胞，并且在感染后可以整合到受感染细胞的基因组，进行长时间的稳定表达。 特点 1）直接包装成为假病毒颗粒，对分裂和非分裂细胞均有感染作用，适合 RNAi 研究和体内实验中难于转染的细胞 (比如神经元细胞、干细胞或其它原代细胞)。 2）可以通过简单方式，在短时间内获得稳定表达特定基因的多种细胞株。 3）可用于基因敲除、基因治疗和转基因动物研究。 4）无需任何转染试剂，操作简便。 5）可以根据客户需要制备多种标记。 慢病毒包装简要流程： 1）含有目的基因的慢病毒 RNAi 干扰载体的构建和质粒纯化提取。 2）慢病毒载体，包装系统共转染病毒包装细胞293T等。 3）培养 48hrs - 72hrs 左右，收集含有病毒的上清培养液。 4）病毒的纯化和浓缩。 5）分装、- 80 ℃保存。

6）滴度测定目的基因检定，并出具检测报告。 、腺病毒 原理 腺病毒(Adenovirus，Ad)是一种无包膜的线状双链DNA病毒，其复制不依赖于宿主细胞的分裂。有近50个血清型，大多数Ad载体都是基于血清型2和5，通过转基因的方式取代E1和E3基因，降低病毒的复制能力。这些重组病毒仅在高水平表达E1和E3基因的细胞中复制，因此是一种适用于治疗的高效控制系统。 特点 1）几乎可以感染所有类型的细胞 2）可以获得复制缺陷型 (E1 和 E3 缺失) 的腺病毒 3）病毒滴度高，产生病毒经过浓缩后可以达到 1012 PFU/mL，能有效的进行增殖。 4）腺病毒载体感染宿主的范围比较广，制备容易，操作简单. 5）感染细胞时，不整合到染色体中，不存在激活致癌基因或插入突变等危险，生物安全性高。 腺病毒包装简要流程 1）构建表达 siRNA/miRNA 的腺病毒载体 2）采用 PacI 消化纯化的质粒。 3）消化好的腺病毒表达载体转染 293A 细胞，收获细胞以制备病毒粗提液。 4）将病毒粗提液感染 293A 细胞以扩增病毒。 5）分装，-80℃保存。 、慢病毒和腺病毒的比较 2、构建目的基因到载体

细胞生物学试验指导

细胞生物学实验指导 细胞生物学的发展总是依赖于技术和实验手段的进步,所以学习细胞生物学的技术和方法至关重要。 实验一普通显微镜及其使用（装片观察） 一、目的要求： 1、掌握显微镜的构造、油浸系的原理、使用方法、保护要点。 2、参观了解其他各类显微镜。 二、材料：普通光学显微镜及其他显微镜、细菌标本片、香柏油、二甲苯、擦镜纸。 三、方法和步骤： 1、介绍普通光学显微镜的构造 机械部分：镜座、镜臂、镜筒、转换器、载物台、调焦螺旋。 光学部分：接目镜、物镜、反光镜、聚光器。 2、油镜的原理及使用方法 原理：油镜头的晶片细小，进入镜中的光线亦少，光线经聚光器，通过载玻片进油镜时，由于空气介质和玻璃介质的折射率不一样，光线因折射而损失，使视野更暗。在载玻片和油镜之间加上和玻璃折光系数相同的香柏油，光线直接进入镜头，不发生折射，视野明亮，便于观察。 3、如何维护显微镜：机械部分的维护，光学部分的维护。 4、注意事项： （1）观察油镜载片时，先在载片上有菌影的地方滴1-2滴香柏油，然后放载物台中央，眼侧面看，慢慢降低油镜浸入香柏油中，镜头几乎接触标本。再用左眼在接目镜观察，同时慢慢旋动粗螺旋提起镜筒至能模糊看到物象时，再转动微调螺旋，直至看清晰为止。注意镜头离开油，就不能看清，重新按刚才的步骤进行。 （2）油镜使用过后，立即用擦镜纸擦拭镜头，如油渍已干，则可用香柏油粘二甲苯擦拭镜

头，再用干净擦镜纸擦去二甲苯。 5、观察几种细菌标本片。 6、示教看相差显微镜和荧光显微镜。 四、作业及思考题： 1、油镜的原理是什么？ 2、光线强弱如何调节？与哪些部件有关？ 实验二、细胞膜的渗透性 实验目的 了解细胞膜的渗透性及各类物质进入细胞的速度。 实验原理 将红细胞放入数种等渗溶液中，由于红细胞对各种溶质的透性不同，有的溶质可以渗入，有的不能渗入，渗入的溶质能够提高红细胞的渗透压，所以促使水分进入细胞，引起溶血，由于溶质透入速度互不相同，因此溶血时间也不相同。 实验用品 一、器材 50ml烧杯, 试管（1～10cm）, 10ml移液管, 试管架。 二、材料 羊血。 三、试剂0.17mol/L氯化钠，0.17mol/L氯化胺，0.17mol/L醋酸胺，0.17mol/L硝酸钠，0.12mol/草酸胺，0.12mol/硫酸钠，0.32mol/葡萄糖，0.32mol/甘油，0.32mol/乙醇，0.32mol/丙酮。 实验方法 一、羊血细胞悬液 取50ml小烧杯一个，加1份羊血和10份0.17mol/L氯化钠，形成一种不透 明的红色液体，此即稀释的羊血。

细胞凋亡实验步骤及注意事 项

细胞凋亡实验步骤及注意事项 一、实验目的 1、掌屋凋亡细胞的形态特征 2、学会用荧光探针对细胞进行双标记来检测正常活细胞、凋亡细胞和坏死细胞的方法 二、实验原理 细胞死亡根据其性质、起源及生物学意义区分为凋亡和坏死两种不同类型。凋亡普遍存在于生命界，在生物个体和生存中起着非常重要的作用。它是细胞在一定生理条件下一系列顺序发生事件的组合，是细胞遵循一定规律自己结束生命的自主控制过程。细胞凋亡具有可鉴别的形态学和生物化学特征。 在形态上可见凋亡细胞与周围细胞脱离接触，细胞变园，细胞膜向内皱缩、胞浆浓缩、内质网扩张、细胞核固缩破裂呈团块状或新月状分布、内质网和细胞膜进一步融合将细胞分成多个完整包裹的凋亡小体，凋亡小体最后被吞噬细胞吞噬消化。在凋亡过程中细胞内容物并不释放到细胞外，不会影响其它细胞，因而不引起炎症反应。 在生物化学上，多数细胞凋亡的过程中，内源性核酸内切酶活化，活性增加。核DNA随机地在核小体的连接部位被酶切断，降解为180-200bp 或它的整倍数的各种片断。如果对核DNA进行琼脂糖电泳，可显示以180-200bp为基数的DNA ladder（梯状带纹）的特征。 相比之下，坏死是细胞处于剧烈损伤条件下发生的细胞死亡。细胞在坏死早期即丧失质膜完整性，各种细胞器膨胀，进而质膜崩解释放出其中的内容物，引起炎症反应，坏死过程中细胞核DNA虽也降解，但由于存在各种长度不等的DNA片断，不能形成梯状带纹，而呈弥散状。 一些温和的损伤刺激及一些抗肿瘤药物可诱导细胞凋亡，通常这些因素在诱导凋亡的同时，也可产生细胞坏死，这取决于损伤的剧烈程度和细胞本身对刺激的敏感程度。 三尖杉酯碱（HT）是我国自行研制的一种对急性粒细胞白血病，急性单核白血病等有良好疗效的抗肿瘤药物。研究表明HT在0.02~5μg/ml范围内作用2小时，即可诱导HL-60细胞凋亡，并表现出典型的凋亡特征。本实验用1μg/ml HT在体外诱导培养的HL-60细胞发生凋亡，同时也有少数细胞发生坏死。用Hoechst33342和碘化丙啶（propidium iodide，PI）对细胞进行双重染色，可以区别凋亡、坏死及正常细胞。细胞膜是一选择性的生物膜，一般的生物染料如PI等不能穿过质膜。当细胞坏死时，质膜不完整，PI就进入细胞内部，它可嵌入到DNA或RNA 中，使坏死细胞着色，凋亡细胞和活细胞不着色。而一些活细胞染料由于为亲脂性物质，可跨膜进入活细胞，因而可进行活细胞染色。

细胞生物学实验

实验一：细胞凝集反应和细胞膜通透性的观察 【基本原理】 细胞膜表面的有分支状糖外被，细胞间的联系、细胞的生长和分化、免疫反应、肿瘤的发生等都和细胞表面的分支状糖分子有关。凝集素（lectin）是一类含糖并能与糖分子专一结合的蛋白质，它具有凝集细胞和刺激细胞分裂的作用。凝集素使细胞凝集是由于它与细胞表面的糖分子连接，在细胞表面间形成“桥”的结果，加入与凝集素互补的糖可以抑制细胞的凝集。 细胞膜是细胞与外界环境进行物质交换的结构。可选择性地让某些物质进出细胞，各种物质出入细胞的方式是不同的，水是生物界最普遍的溶剂，水分子可以按照物质浓度梯度从渗透压低的一侧通过细胞膜向渗透压高的一侧扩散，以至于在高渗环境中，动物细胞会失水而收缩；在低渗环境中，动物细胞会吸水膨胀直至破裂。 本实验将红细胞分别放于各种等渗溶液中，由于红细胞膜对不同溶质的通透性不同，使得不同溶质透入细胞的速度相差很大，有些溶质甚至不能透入细胞。当溶质分子进入细胞后可引起渗透压升高，水分子随即进入细胞，使细胞膨胀，当膨胀到一定程度时，红细胞膜会发生破裂，血红素溢出，此时，原来不透明的红细胞悬液突然变成红色透明的血红蛋白溶液，这种现象称为红细胞溶血。 由于各种溶质进入细胞的速度不同，所以不同的溶质诱导红细胞溶血的时间不同，相反可通过测量溶血时间来估计细胞膜对各种物质通透性的大小。 【实验报告】 1．简图表示凝集素使血细胞凝集原理 2．怎样根据细胞膜渗透性实验结果分析确定物质进入细胞的速度？物质进入细胞的快慢有什么规律？ 实验二：聚乙二醇（PEG）介导的细胞融合 【基本原理】 两个以上的细胞合并成为一个双核或多核细胞称为融合细胞。在通常情况下，两个细胞接触并不发生融合现象，因为各自存在完整的细胞膜，在特殊融合诱导物的作用下，两个细胞膜发生一定的变化，就可促进两个或多个细胞聚集，相接触的细胞膜之间融合，继之细胞质融合，形成一个大的融合细胞。 人工细胞融合开始于五十年代，六十年代到七十年代作为一门新兴的技术发展很快，应用范围极广。细胞与组织不同，不排斥异类、异种细胞。不仅能产生同种细胞融合、种间细胞融合，而且也能诱导动植物细胞间产生融合。因此，融合细胞的研究为生物学无论在基础理论上或生产实践上开辟了一条新的道路。这一技术已成为研究细胞遗传、细胞免疫、肿瘤和生物新品种培育的重要手段。 细胞融合(Cell fusion)，即在自然条件下或用人工方法(生物的、物理的、化学的)使两个或两个以上的细胞合并形成一个细胞的过程。人工诱导的细胞融合不仅能产生同种细胞融合，也能产生种间细胞的融合，因此细胞融合技术目前被广泛应用于细胞生物学和医学研究的各个领域，如研究核质关系、绘制染色体基因图谱、制备单克隆抗体、育种等。

实验总结细胞培养方法

一、培养细胞常用配置 培养基的配置：基础培养基500ml+胎牛血清50ml+双抗5ml 冻存液的配置：10 % DMSO + 90%胎牛血清 依次比例酌量配置。 超净工作台常规配置 移液器1套（2.5μl、20μl、200μl、1ml），酒精灯1盏，液器1台，斜架1台，酒精喷壶1个，酒精棉球缸1个，污缸1个， 常规耗材：培养瓶（50㎝2），定量移液管（5ml、10ml），枪头（1ml、200μl、10μl），培养皿，6/24/48/96孔板，医用脱脂棉球，冻存管 所需试剂：培养基，胎牛血清，双抗，DMSO，胰酶，75%酒精…… 实验前准备：所需的各项高压后的耗材及污物缸放于超净工作台内，用酒精喷壶喷洒实验台面，并关闭工作台打开紫外灯照射30min后开始实验操作。培养基及胰酶恢复常温后使用，可37℃水浴5-10min

二、细胞复苏 步骤： 1. 紫外消毒30min后关闭紫外灯，开启超净台正常工作状态，用酒精消毒操作者的双手。 2. 培养液（DMEM），恒温水浴箱37℃预热20min，备用。超净台内准备一支15ml离心管备用。 3.将所需的培养基确保瓶身干净后酒精消毒放于工作台面内，点燃酒精灯，再将瓶口对准在酒精灯上消毒2-3次，旋开瓶盖后需再次分别消毒瓶口和瓶盖。 4. 从液氮保存罐中取出冻存管，立即放入37℃水浴中，快速摇晃，直至冻存液融化至黄豆粒大小后迅速取出。 5. 将细胞悬液移入15ml离心管，缓慢加入4ml培养液，离心（1000r/min，5min）。 6. 取出2个培养皿并做好标记（复苏日期等），提前加入5-10ml培养液；离心结束后用1ml培养液悬液混悬沉淀细胞后分别加入培养皿内。 7. 将培养基瓶口和瓶盖消毒2-3次后拧紧，熄灭酒精灯，整理实验台面，取出实验试剂及污缸等，关闭超净工作台。 8. 将培养瓶放入培养箱内培养 注意事项： 1. 取细胞的过程中注意带好防冻手套。此项尤为重要，细胞冻存管可能漏入液氮，解冻时冻存管中的气温急剧上升，可导致爆炸。 2. 冻存液的问题：冻存液的配置已是常识，在这里不作详述，但二甲基亚砜（DMSO）对细胞不是完全无毒副作用，在常温下，二甲基亚砜对细胞的毒副作用较大，因此，必须在1-2min内使冻存液完全融化。如果复苏温度太慢，会造成细胞的损伤，二甲基亚砜（DMSO）最好选择进口产品。 3. 离心前须加入少量培养液。细胞解冻后二甲基亚砜浓度较高，注意加入少量培养液可稀释其浓度，以减少对细胞的损伤。 4. 离心问题：目前主要有两种见解。一种是解冻后的细胞悬液直接吹打均匀后分装到培养瓶中进行培养，第二天换液。因为离心的目的是两个，去除DMSO，去除死细胞，这个是标准流程，但对一般人来说，把握不好离心转速和时间，转的不够活细胞沉底的少，细胞就全被扔掉了，转过了活细胞会受压过大，死亡。此外在操作过程中容易污染，所以不推荐。另一种说法为细胞悬液中含有二甲基

CCK8实验原理与步骤

CCK8实验 1、在96孔板中配置100μl的细胞悬液。将培养板在培养箱预培养24小时（37℃，5% CO2）。 2、向培养板加入10μl不同浓度的待测物质。 3、将培养板在培养箱孵育一段适当的时间（例如：6、12、24或48小时）。 4、向每孔加入10μl CCK8溶液（注意不要在孔中生成气泡，它们会影响OD值的读数）。 5、将培养板在培养箱内孵育1-4小时。 6、用酶标仪测定在450nm处的吸光度。 7、若暂时不测定OD值，可以向每孔中加入10μl 0.1M的HCL溶液或者1% w/v SDS溶液，并遮盖培养板避光保存在室温条件下。24小时内测定，吸光度不会发生变化。 PS：1% w/v SDS溶液配制方法： 组份浓度：10% (W/V)SDS 配制量：100ml 配制方法： 1.称量10g高纯度的SDS置于100-200ml烧杯中，加入约80ml的去离子水，68℃加入溶解 2.滴加浓盐酸调节pH值至7.2 3.将溶液定容至100ml后，室温保存。

注意：如果待测物质有氧化性或还原性的话，可在加CCK8之前更换新鲜培养基（除去培养基，并用培养基洗涤细胞两次，然后加入新的培养基），去掉药物影响。当然药物影响比较小的情况下，可以不更换培养基，直接扣除培养基中加入药物后的空白吸收即可。 活力计算： 细胞活力*（％）=[A(加药)-A（空白）]/[A（0加药）-A（空白）] ×100 A（加药）：具有细胞、CCK8溶液和药物溶液的孔的吸光度 A（空白）：具有培养基和CCK8溶液而没有细胞的孔的吸光度 A（0加药）：具有细胞、CCK8溶液而没有药物溶液的孔的吸光度*细胞活力：细胞增殖活力或细胞毒性活力 CCK-8 可以用于细胞增殖和毒性分析。其基本原理为:该试剂中含有WST-8，它在电子载体(1-Methoxy PMS)的作用下被细胞线粒体中的脱氢酶还原为具有高度水溶性的黄色甲瓒染料，生成的甲瓒物的数量与活细胞的数量成正比,因此可以用这一特性直接进行细胞增殖和毒性分析。 其使用方法在增殖和毒性试验中有所区别: 细胞增殖试验: 1.接种细胞悬液100微升于96孔板,预先置于37度,5%CO2饱和湿度的培养箱内培养

本科《细胞生物学实验》课件

实验一、光学显微镜的基本使用方法 一、实验目的 1. 了解光学显微镜的结构、原理和保养方法； 2. 掌握光学显微镜的操作。 二、实验要求 1．遵守实验室安全制度，听从指导教师安排； 2．认真听讲，不懂就问； 3．完成实验报告 三、实验仪器和材料 1．光学显微镜、擦镜纸、香柏油、二甲苯 2．微生物示范片：蛙血涂片 四、显微镜的结构、光学原理及其操作方法 （一）显微镜的结构和光学原理 显微镜分机械装置和光学系统两部分。 1．机械装置 （1）镜筒：镜筒上端装目镜，下端接转换器。镜筒有单筒和双筒两种。单筒有直立式（长度为160mm）和后倾斜式（倾斜45°）。双筒全是倾斜式的，其中一个筒有屈光度调节装置，以备两眼视力不同者调节使用。两筒之间可调距离，以适应两眼宽度不同者调节使用。 （2）转换器：转换器装在镜筒的下方，其上有3个孔，有的有4个或5个孔。不同规格的物镜分别安装在各孔上。 （3）载物台：戴物台为方形（多数）和圆形的平台，中央有一光孔，孔的两侧各装1个夹片，载物台上还有移动器（其上有刻度标尺），可纵向和横向移动，移动器的作用是夹住和移动标本用。

（4）镜臂：镜臂支撑镜筒、载物台、聚光器和调节器。镜臂有固定式和活动式 （可改变倾斜度）两种。 （5）镜座：镜座为马蹄形，支撑整台显微镜，其上有反光镜。 （6）调节器：调节器包括大、小螺旋调节器（调焦距）各一个。可调节物镜和所需观察的物体之间的距离。调节器有装在镜臂上方或下方的两种，装在镜上方的是通过升降镜臂来调焦距，装在镜臂下方的是通过升降载物台来调焦距，新式显微镜多半装在镜臂的下方。 2．光学系统及其光学原理 （1）目镜：每台显微镜备有3个不同规格的目镜，例如，5倍（5×）、10倍（10×）和15倍（15×），高级显微镜除了上述三种外，还有20倍（20×）的。 （2）物镜：物镜装在转换器的孔上，物镜有低倍（8×、10×、20×三种）、高倍（40×或45×）及油镜（100×）。物镜的性能由数值孔径（N.A.）决定，数值孔径=n. sinα/2，其意为玻片和物镜之间的折射率乘上光线投射到物镜上的最大夹角的一半的正弦。光线投射到物镜的角度越大，显微镜的效能越大，该角度的大小决定于物镜的直径和焦距。n 是影响数值孔径的因素，空气的折射率n=1，水的折射率n=1.33，香柏油的折射率n=1.52，用油镜时光线入射α/2为60°，则sin60°=0.87。 以空气为介质时：N.A.=l×0.87=0.87 以水为介质时：N.A.=1.33×0.87=1.16 以香柏油为介质时：N.A.=1.52×0.87=1.32 显微镜的性能还依赖于物镜的分辨率，分辨率即能分辨两点之间的最小距离的能力。分辨率用δ表示，A .N λ/61.0δ?=（λ为波长），分辨率与数值孔径成正比，与被长成反比。增大数值孔径，缩短波长可提高显微镜的分辨率，使目的物的细微结构更清晰可见。事实上可见光的波长（0.38～0.7μm ）是不可能缩短的，只有靠增大数值孔径来提高分辨率。 物镜上标有：N ．A ．1．25、100×、“OI”、160/0.17、0.16等字样，其中N ．A ．1.25为

ChIP原理及实验方法

染色质免疫沉淀技术（ChIP）实验方法 实验原理 染色质免疫沉淀技术（ChIP）通过与染色质片段共沉淀和PCR技术，在体内检测与特异蛋白质结合的DNA片段。ChIP技术最大的优点就是在活体细胞状态下研究了蛋白质和目的基因结合状况，减少了体外实验的误差。在活体细胞中，先对与调节蛋白结合的染色质进行分离，然后通过一定的方法（例如：超声波）随机剪切染色质，用调节蛋白的抗体沉淀目的染色质，再通过一定手段把目的染色质上的蛋白质去除掉，最后用PCR等方法检测鉴定共沉淀的DNA片段的特性。 仪器和试剂

真空设备、涡旋器、液氮、冷冻离心管、离心机、超声波粉碎仪、miracloth 37%甲醛，2M甘氨酸，ddH O，剪切的鲑精DNA/protein A琼脂糖珠(Sant cruz)， 2 蛋白酶K（14mg/ml）,RNaseA,酚：氯仿：异戊醇（25：24：1）,氯仿,无水乙醇, 提取缓冲液1（EB1）:0.4M蔗糖；10mM Tris-HCl，pH8.0；5mM β-ME； 0.1mM PMSF；蛋白酶抑制剂混合物（aprotinin、pepstain A、Leupeptin、 Antipain、TPCK、Benzamidine） ?提取缓冲液2（EB2）:0.25M 蔗糖；10mM Tris-HCl，pH8.0；10mM MgCl2； 1%Triton X-100(聚乙二醇辛基苯基醚) ；5mM β-ME；0.1mM PMSF；蛋白酶抑制剂混合物（同上） 提取缓冲液3（EB3）：1.7M蔗糖；10mM Tris-HCl，pH8.0；0.15%Triton X-100；2mM MgCl ；5mMβ-ME；0.1mM PMSF；蛋白酶抑制剂混合物（同上） 2 核裂解缓冲液（NLB）：50mM Tris-HCl，pH8.0；10mM EDTA；1%SDS；PMSF和蛋白酶抑制剂混合物（同上） ChIP稀释缓冲液（ChIP DB）：1.1%Triton X-100；1.2mM EDTA；16.7 mM Tris-HCl，pH8.0；167mM NaCl；PMSF和蛋白酶抑制剂混合物（同上） 洗脱缓冲液（EB）：1%SDS；0.1M NaHCO3（现配） 低盐洗脱液：150mM NaCl；0.1%SDS；1%Triton X-100；2mM EDTA；20mM Tris-HCl，pH8.0

TUNEL法检测细胞凋亡实验原理和方法

TUNEL法检测细胞凋亡实验原理和方法细胞凋亡中染色体DNA的断裂是个渐进的分阶段的过程，染色体DNA首先在内源性的核酸水解酶的作用下降解为50-300kb的大片段。然后大约30 ﹪的染色体DNA在Ca 2和Mg2依赖的核酸内切酶作用下，在核小体单位之间被随机切断，形成180～200bp 核小体DNA多聚体。 DNA双链断裂或只要一条链上出现缺口而产生的一系列DNA的3’-OH末端可在脱氧核糖核苷酸末端转移酶（TdT）的作用下，将脱氧核糖核苷酸和荧光素、过氧化物酶、碱性磷酸化酶或生物素形成的衍生物标记到DNA的3’-末端，从而可进行凋亡细胞的检测，这类方法一般称为脱氧核糖核苷酸末端转移酶介导的缺口末端标记法（TUNEL）。 由于正常的或正在增殖的细胞几乎没有DNA的断裂，因而没有3’-OH形成，很少能够被染色。低分子量的DNA分离后，也可使用DNA聚合酶进行缺口翻译（nick translation），使低分子量的DNA标记或染色，然后分析凋亡细胞。 TUNEL或缺口翻译法实际上是分子生物学与形态学相结合的研究方法，对完整的单个凋亡细胞核或凋亡小体进行原位染色，能准确的反应细胞凋亡最典型的生物化学和形态特征，可用于石蜡包埋组织切片、冰冻组织切片、培养的细胞和从组织中分离的细胞的细胞凋亡测定，并可检测出极少量的凋亡细胞，灵敏度远比一般的组织化学和生物化学测定法要高，因而在细胞凋亡的研究中已被广泛采用。 一、过氧化物酶标记测定法 原理：脱氧核糖核苷酸衍生物地高辛[（digoxigenin）-11-dUTP]在TdT酶的作用下，可以掺入到凋亡细胞双链或单链DNA的3-OH末端，与dATP形成异多聚体，并可与连接了报告酶（过氧化物酶或碱性磷酸酶）的抗地高辛抗体结合。在适合底物存在下，过氧化物酶可产生很强的颜色反应，特异准确的定位出正在凋亡的细胞，因而可在普通光学显微镜下进

【高中生物】高中生物所有实验方法及必备知识点

（生物科技行业）高中生物所有实验方法及必备知识 点

高中生物实验整理 实验一：使用高倍显微镜观察几种细胞（必修一P7） 1．是低倍镜还是高倍镜的视野大，视野明亮？为什么？ 低倍镜的视野大，通过的光多，放大的倍数小；高倍镜视野小，通过的光少，但放大的倍数高。 2.为什么要先用低倍镜观察清楚后，把要放大观察的物像移至视野的中央，再换高倍镜观察？ 如果直接用高倍镜观察，往往由于观察的对象不在视野范围内而找不到。因此，需要先用低倍镜观察清楚，并把要放大观察的物像移至视野的中央，再换高倍镜观察。 3.用转换器转过高倍镜后，转动粗准焦螺旋行不行？ 不行。用高倍镜观察，只需转动细准焦螺旋即可。转动粗准焦螺旋，容易压坏玻片。 4..使用高倍镜观察的步骤和要点是什么？ 答：（1）首先用低倍镜观察，找到要观察的物像，移到视野的中央。 （2）转动转换器，用高倍镜观察，并轻轻转动细准焦螺旋，直到看清楚材料为止。 5.总结：四个比例关系

a.镜头长度与放大倍数：物镜镜头越长，放大倍数越大，而目镜正好与之相反。 b.物镜头放大倍数与玻片距离：倍数越大（镜头长）距离越近。 c.放大倍数与视野亮度：放大倍数越大，视野越暗。 d.放大倍数与视野范围：放大倍数越大，视野范围越小。 实验二检测生物组织中的糖类、脂肪和蛋白质（必修一P18） 一实验原理：某些化学试剂能使生物组织中的有关有机化合物，产生特定的颜色反应。 1．可溶性还原糖（如葡萄糖、果糖、麦芽糖）与斐林试剂发生作用，可生成砖红色的Cu2O沉淀。 葡萄糖+Cu(OH)2葡萄糖酸+Cu2O↓（砖红色）+H2O，即Cu(OH)2被还原成Cu2O，葡萄糖被氧化成葡萄糖酸。 2．脂肪可以被苏丹Ⅲ染液染成橘黄色（或被苏丹Ⅳ染液染成红色）。淀粉遇碘变蓝色。 3．蛋白质与双缩脲试剂发生作用，产生紫色反应。（蛋白质分子中含有很多肽键，在碱性NaOH溶液中能与双缩脲试剂中的Cu2+作用，产生紫色反应。）二实验材料

流式细胞仪实验方法

流式细胞仪实验方法 一、实验准备 1．标本制备： 2．最小化非特异性结合： 二、凋亡 1．凋亡的检测方法：网站和其它 2．PI染色法 3．Annexin V 法 4．TUNNEL法 三、细胞因子 1．激活的细胞因子 2．CBA 四、血小板 1．活化 2．活化检测 3．网织血小板 五、红细胞 1．网织红细胞 2．PNH 3．胎儿红细胞 六、肿瘤学 1．DNA 细胞周期 2．蛋白 3．多药耐药 4．微小残留白血病

第一部分标本处理 一、流式细胞术常规检测时的样品制备 (一)直接免疫荧光标记法 取一定量细胞(约1X106细胞／ml)，在每一管中分别加入50μl的HAB，并充分混匀，于室温中静置1分钟以上(),再直接加入连接有荧光素的抗体进行免疫标记反应(如做双标或多标染色，可把几种标记有不同荧光素的抗体同时加入)，。孵育20-60分钟后，用PBS(pH7．2—7．4)洗1-2次，加入缓冲液重悬，上机检测。本方法操作简便，结果准确，易于分析，适用于同一细胞群多参数同时测定。虽然直标抗体试剂成本较高，但减少了间接标记法中较强的非特异荧光的干扰，因此更适用于临床标本的检测。 (二)间接免疫荧光标记法 取一定量的细胞悬液(约1X106细胞／ml)，先加入特异的第一抗体，待反应完全后洗去未结合抗体，再加入荧光标记的第二抗体，生成抗原—抗体—抗抗体复合物，以FCM检测其上标记的荧光素被激发后发出的荧光。本方法费用较低，二抗应用广泛，多用于科研标本的检测。但由于二抗一般为多克隆抗体，特异性较差，非特异性荧光背景较强，易影响实验结果。所以标本制备时应加入阴性或阳性对照。另外，由于间标法步骤较多，增加了细胞的丢失，不适用测定细胞数较少的标本。 二、最小化非特异性结合的方法 1．荧光标记的抗体的浓度应该合适，如果浓度过高，背景会因为非特异性的相互作用的增加而增加。 2．在使用第一抗体之前，将样品与过量的蛋白一起培育，如小牛血清蛋白（BSA），脱脂干奶酪，或来自于同一寄主的正常血清来作为标记的第二抗体。这个步骤通过阻断第一抗体和细胞表面或胞内结构的非特异性的交互作用来降低背景。 3．在使用第一抗体之后，将样品与5%至10%的来自于同一寄主的正常血清和作为标记的第二抗体一起培育。这个步骤会减少不必要的第二抗体与第一抗体、细胞表面或胞内结构之间的交互作用。 通过用来自于同样的样品的血清稀释标记过的抗体可以略过此步骤。此步骤适用于很多方面，但有时候它也会导致已标记的第二抗体和正常血清中的免疫球蛋白的免疫复合体的形成。这种复合体会优先与一些细胞结构进行结合，或者它们最终会导致期望得到的抗体活性的丢失。 4．使用F(ab’)2片段会使背景决定于第一或第二抗体与FC受体的全分子结合。大多数的第二抗体的F(ab’)2片段容易利用。而第一抗体的F(ab’)2片段一般是不能利用或很难制作。因此，在NaN3存在的条件下，将新鲜组织或细胞与正常血清一起培育应选择优先加入第一抗体。在此情况下，即使在随后的步骤中用完所有的抗体分子，FC受体决定的背景影响已不再重要。 5．其它：已标记的抗体和其他一些内在的免疫球蛋白或加入实验系统中的其它物质的交叉反应也可能会有背景影响。为了降低背景，在多重标记过程中，所有的已标记的抗体应被吸附，避免其他种类蛋白的交叉反应。

中和实验方法

中和实验方法 Document serial number【LGGKGB-LGG98YT-LGGT8CB-LGUT-

RSV特异性中和抗体滴度检测 一、实验原理： 抗体与相应的病毒粒子特异地结合，使后者失去对易感动物或细胞的致病力。（该试验方法以测定抗病毒血清的中和价，将待检血清2倍递增稀释，加等量已知毒价的病毒液。） 二、实验分类： 1. 固定血清--稀释病毒中和试验 2. 固定病毒—稀释血清中和试验 3. 简单定性中和试验 4. 空斑减少法 三、实验步骤： 1.提前设定56 ℃水浴锅，将分装好的待测血清于56 ℃灭活（降低补体对实验结果的影响）30min 。 2.将加过双抗的培养基DMEM/F-12（用于Hep-2细胞；Vero细胞常用DMEM培养基）和BI血清进行37℃预热30min，与此同时灭好实验台（该准备3599细胞培养板灭过菌枪头以及15ml和50ml摇菌管）为后续实验做准备。 3.实验台灭菌30min，灭好台子后进行实验，首先取1.5mlEP管，用DMEM/F-12培养基8倍稀释待测血清（每管中加培养基210μl，再加相应的血清30μl），拆开96孔培养板后在盖子进行设计（实验设计参考图1），最后向每孔中加入75μl的培养基，按照实验设计加入相应的稀释血清75μl，用排枪以两倍梯度稀释血清。（注意：最终到256倍时吸出的多余的75μl血清并弃掉。） 4.实验孔以及阳性对照孔分别每孔加入25 μl（注意：加毒时应从血

清低浓度到高浓度）的104 TCID50病毒混匀，4℃孵育2 h。 5.在实验剩余半小时左右进行消化细胞，镜检细胞汇合度为90%左右即可用，弃掉培养液后，用2-3 ml无血清培养吹洗几遍细胞（意图为去除死细胞或活性不好的细胞），加入 2 ml 胰酶后开始计时，将细胞培养板置于37℃的CO2无菌培养箱培养消化2-3min，在镜检细胞间有间隙或细胞收缩为单个状态为好，加入等体积的无血清培养基终止，小心吸掉液体，加入有血清的培养基2-3ml轻轻地吹下皿底部的细胞，轻微用枪吹吸几次使其成为均匀的单细胞悬液后转移到新的15ml离心管中等待细胞计数。经过计数和相应的稀释后使得细胞浓度为105个/ml 。最后加入104个Hep-2细胞（或1.5*104个Vreo 细胞）100 μl，将细胞铺好后于37 ℃的 CO2无菌培养箱培养。 注意：使用细胞一般为5代以内，培养的细胞汇合度为90%左右即可用。 6.培养72 h后弃掉培养基，用PBST洗板3次，然后加入80 % 丙酮-PBS溶液（v/v）在 4 ℃冰箱固定15 min ，将孔内的液体弃掉，室温干燥。 7.加入质量体积比为5% BSA（或5 %脱脂奶粉）封闭，37℃放置2h，弃掉废液后用PBST洗板3次，用力拍板数次使得孔内无水珠。 8.使用2 %BSA（或2 % 脱脂奶粉）将山羊抗RSV 的多克隆抗血清稀释4000倍，加入每孔100 μl后37 ℃放置1h，PBST洗板5次，用力拍板数次使得孔内无水珠。 9.使用2 %BSA（或2 %脱脂奶粉）将HRP(辣根过氧化物酶)标记的抗山羊IgG的多克隆抗血清稀释4000倍，加入每孔100 μl后37 ℃放置1h，PBST洗板6次，再次用力拍板数次使得孔内无水珠。 10.每孔加入100 μl TMB显色液，于37 ℃显色 5 min。每孔加入100μl的2 moL/L的硫酸终止液，于OD450/620nm测定每孔的光密度值。中和抗体滴度的判断以低于阳性的50 % 光密度值为依据。