拟南芥成花时间调控

拟南芥成花时间调控

REGULATION OF TIME TO FLOWER IN ARABIDOPSIS

THALIANA

朱克明学号：D06064 导师：梁建生

摘要：调控开花时间是大多数植物由营养生长向生殖生长转化的一个重要生长发育过程。影响拟南芥开花时间的因素有很多，其中光照和温度是两个主要的外部因素，而赤霉素(GA)和一些自主性因子是主要的内部因素。目前，一般按照对以上因素的反应将晚花突变体归于四条开花调控途径：光周期途径、春化途径、自主途径和GA途径。在不断变化的外部环境条件和内部生理条件下，这些途径通过一些主要的整合基因如SOC1、FT、LFY等实现了对拟南芥开花时间的精确调控。

关键词：拟南芥，开花时间，整合途径

Abstract:The timing of the floral transition has significant consequences for reproductive success in plants. There are many factors affecting the flowering time of Arabidopsis. The photoperiod and temperature are the major external factors, and the GA and autonomous factors are the major internal factors. Genetic analysis of Arabidopsis thaliana has identified numerous pathways that control the timing of the floral transition: photoperiod pathway, vernalization pathway, autonomous pathway and GA pathway. Depending on abiotic (photoperiod, temperature, nutrients) and biotic (competition, pollinators, herbivores) conditions, these processes are integrated by the function of the genes LHY, SOC1, and FT at the integration pathway. The integrated signal of the floral induction is transmitted to the floral meristem identity genes , and floral morphogenesis is performed.

Key words:Arabidopsis, flowering time, integration pathway

开花是植物由营养生长向生殖生长转型的最重要的一个过程，在合适的时间完成这个转型是植物实现生殖发育所必需的。通过对开花时间的调控，植物才能实现种间同步杂交并产生尽可能多的种子，这是植物在长期进化过程中形成的对环境条件的一种适应。最近十余年来，利用拟南芥为模式植物，对高等植物开花时间调控机理与信号转导途径的研究取得了长足的进步。目前我们对植物开花时间调控机制的了解主要是通过对拟南芥的遗传学研究获得的。

拟南芥的开花时间受许多因素的影响，其中光照(光质、光强、日照长度) 和温度是主要的外部因素，自主途径因子和赤霉素(GA)是主要的内部因素。此外，植物的生理状况(如年龄、植株大小)、胁迫条件(如干旱、营养匮乏、拥挤、病害、极点温度)、植物激素、水杨酸、碳水化合物、维生素C、谷胱甘肽、过氧化氢、Ca2+浓度、micro RNA等也对开花时间产生一定的影响。通常这多种信号汇集在一起调控顶端分生组织(shoot apical meristem；SAM)的发育过程，这种随着内在生理条件和外界环境条件的变化而对开花时间所进行的精细调控，是拟南芥在长期进化过程中形成的一种适应性的选择优势。

拟南芥对开花时间的调控是通过多个不同的遗传位点来实现的。现在已发现拟南芥中有80 多个位点影响开花时间，其中20多个位点与晚花有关。目前对开花时间的研究主要集中于筛选开花时间改变的突变体及这些突变基因的克隆和功能研究。根据开花突变体在不同环境条件下(主要指光照、温度) 的表型和遗传上位性实验，通常将晚花突变体分为四条开花促进途径：光周期途径(photoperiodpathway)、自主途径(autonomous pathway)、春化途径(vernalization pathway) 和赤霉素途径(GApathway)。本文主要对最近几年拟南芥开花时间调控的研究进展作一小结并对部分重要结果进行简单的讨论。

1 拟南芥的开花促进途径

1.1 光周期途径

日照长度(即光周期)是影响开花时间的主要因素之一。拟南芥是一种兼性的(facultative)长日照植物，长日照条件能促进拟南芥开花转型，而短日照条件则促进其营养生长。目前发现，在光周期途

径中的主要调控基因有CONSTANS (CO)、CRY2/FHA、GIGANTEA(GI)、FT和FWA。它们的突变体在长日照(LD)条件下延迟开花，但在短日照(SD)条件下开花时间与野生型相似。除CO以外，其他基因还参与其他途径。其中FWA和FT位于CO的下游而GI和CRY2位于CO上游。

CO编码具有两个B-box类型锌指结构的GATA 转录因子，其C端有CCT域。其中CCT域是GFP::CO核定位所必需的，而B-box与蛋白质之间的互相作用有关。由于没有任何突变能完全抑制35S:CO的早花表型，说明CO能激活几条平行的开花途径。此外，CO位于生物钟的输出途径，因而也是生物钟和开花时间途径之间监测日照长度的重要元件。FT与TFL1相似，是一个Raf-like 激酶抑制蛋白。除受CO调节促进开花以外，在拟南芥中最新发现的温度感知途径和光质途径也是通过调节FT 的表达调节开花时间。GI是具有6个跨膜域的核蛋白，其突变表型及下游基因的表达方式说明GI 与光信号输入生物钟有关。FWA编码一个具有同源域(homeodomain)的转录因子。在fwa突变体中，FWA编码区的核酸序列并没有发生变化，造成功能获得性突变的原因是FWA启动子上两个正向重复序列的甲基化水平下降，使FWA异位表达。一些控制DNA甲基化的突变体，例如ddm1(decreased DNA methylation 1)和ddm2 (decreasedDNA methylation 2)均可以使FWA启动子上的DNA甲基化丢失，造成FWA过量表达和晚花的表型最近Kinoshita等发现，FWA甲基化调控“印迹”(imprint)的建立是通过特异的母配子来源的DME DNA糖基化酶活性实现的。

光对开花时间的调节一般是通过下列过程实现的：不同波长的光被其受体接收后，由光信号传导分子将光信号传递到内源的控时器——“生物钟(circadian clock)”。通过信号输出途径，生物钟将检测的日照长度信号传输给主要信号分子CO，进而诱导其靶位基因FT的表达，从而实现了日照长度对开花时间的调控。CO位于生物钟输出途径，在生物钟和开花时间之间起着纽带作用。在此过程中，任何影响光信号检测(如光受体)、生物钟组分和光信号输入、输出生物钟途径的突变都会影响拟南芥的开花时间。生物钟对开花时间的调控已有许多报道，这里不展开讨论。

不同的植物对光周期反应采用不同的机制。拟南芥是一种长日植物，而水稻、马铃薯、烟草、牵牛花等短日照植物中也发现了一些拟南芥开花基因的同源基因，它们通过与拟南芥类似或截然不同的方式调控开花时间。水稻的OsGI、Hd1(Se1)和Hd3a基因分别是拟南芥GI、CO和FT的同源基因。在SD和LD条件下水稻的Hd1能分别促进和抑制Hd3a的转录从而控制开花转型，这与拟南芥的CO基因在LD下促进FT的表达相反。水稻OsGI激活Hd1(Se1)的机制与拟南芥很相似，但在LD下Hd1(Se1)抑制Hd3a的表达，导致水稻延迟开花。小麦中也发现了三个AtCO的同源基因，TaHd1、TaHd2和TaHd3，其中TaHd1-1能互补水稻Hd1的功能。这说明，为了适应环境，一个重要的进化过程能通过同一组基因的不同调控方式而产生多样性。另外，牵牛花中CO的同源基因PnCO在LD或SD下过量表达都能促进拟南芥co突变体开花，这也表明SD和LD植物中的这些同源基因在结构和功能上都很相似。

1.2 春化途径

当物种传播时，环境的选择压力使得开花时间改变的植物对新的环境具有一定选择优势，不同生态型的拟南芥采用了不同策略适应环境。大多数拟南芥生态型为晚花生态型，即冬季生态型(winter-annual)，它们在越冬前主要进行营养生长，经过冬季低温后在翌年春季适宜条件下迅速开花。而夏季生态型(summer-annual)不需要经过低温过程就能直接开花。目前在实验室条件下最常用的Columbia (Col)、Wassilewskija (WS)、Landbergerecta (Ler)等都属于夏季生态型。冬季生态型的晚花

表型主要由两个显性位点FRIGIDA (FRI)和FLOWER LOCUS C (FLC)共同控制。FRI编码一个植物特异的未知蛋白，而FLC编码一个含MADS结构域的转录因子。FRI能促进FLC mRNA的高水平表达，从而导致了冬季生态型的晚花表型。春化低温能拮抗FRI的作用降低并保持FLC的这种低水平表达状态，从而促进了冬季生态型在春天合适的条件下开花。FRI和FLC的二者之中任一个发生突变都能削弱或克服晚花表型，夏季生态型就是通过FRI功能缺失性突变或FLC等位基因的自发突变进化而来。最近还发现，FRIGIDA LIKE1(FRL1)特异地在FRI促进FLC表达方面起作用，并且FRI、FRL1、FRL2都是维持拟南芥冬季生态型的习性所必需的。此外，由于flc功能缺失性突变体还能对春化作用作出反应，因此除了依赖于FLC的春化途径以外，还存在一条不依赖于FLC的春化途径，但这条途径的作用机制还不清楚。

春化反应是拟南芥冬季生态型对环境条件的一种适应。春化作用分二个阶段，首先响应春化低温起始抑制FLC mRNA的表达，然后保持这种FLC低水平表达状态。VIN3 (vernalization-insensitive 3)和VRN1 (vernalization 1)、VRN2 (vernalization 2)分别在这两个阶段起主要作用。VIN3编码一个PHD finger(与蛋白质之间的相互作用有关)蛋白，许多染色质重建(remodeling)复合体的组分中含有PHD finger。VRN2是果蝇Polycomb-Group (PcG)发育调节因子Su (Z)12的同源基因，在果蝇中Su(Z)12能通过修饰染色质结构调节基因表达。最近发现，Su(Z)12作为组蛋白甲基转移酶复合体的一部分直接作用于组蛋白H3的Lys27，并且还可能作用于Lys9。VRN1定位于核内，具有二个植物特异的与DNA结合有关的B3结构域。除与VRN2一起保持春化后FLC的低水平表达之外，VRN1在春化作用及调控开花方面还有其他功能。

VRN1、VRN2 和VIN3的结构和突变表型说明它们可能参与了FLC染色质的修饰。对vin3、vrn2和vrn1突变体进行染色质免疫沉淀(ChIP)时的确发现春化作用导致FLC的染色质发生了一系列修饰作用，其中VIN3是春化过程中组蛋白乙酰化修饰所必需的，而VRN1和VRN2与FLC组蛋白H3Lys9和Lys27的甲基化有关。vrn1和vrn2在春化过程中发生了低乙酰化修饰，但当转回温暖的生长条件时这种低乙酰化水平和对FLC的抑制状态不能维持。根据以上研究结果，Sung等提出了春化作用的上位性抑制模型(图1)：在春化过程中，首先VIN3通过起始HDAC去乙酰化使FLC染色质的特异区域乙酰化水平降低，随后通过包含VRN1和VRN2组分的组蛋白甲基转移酶复合体对FLC组蛋白H3 Lys9和Lys27进行甲基化修饰，抑制了FLC的高水平表达，并可能通过招募HP1异染色质蛋白最终导致了在有丝分裂时能稳定存在的抑制性的异染色质状态。与此同时，植物通过这种机制对冬季产生“记忆”。

各种植物种属间的春化机制究竟在多大程度上保守现在还不能确定。在芸苔属中发现了多个FLC的同源基因，其中VFR2是芜菁(B. rapa)中的FLC同源基因。油菜(B. napus)中的5个FLC同源基因BnFLC1～BnFLC5过量表达能导致晚花，并且春化作用能降低它们的表达水平。Schranz 等从芜菁中克隆的5个重复的BrFLC都以与AtFLC类似的方式在春化过程中起作用。二倍体小麦的春化作用主要由VRN1和VRN2介导，而VRN1的变异是多倍体小麦进化为春季生态型的分子基础。由此可见，这些作物春化作用的目标基因与拟南芥的FLC基因感受长时间低温的基本机制还是相同的。

1.3 自主途径

自主途径的突变体无论在长日照条件还是在短日照条件下都延迟开花，尤其在短日照条件下，这种晚花表型更明显。春化作用或低比率红光：远红光(R:FR)能恢复自主途径突变体的正常开花表

型。自主途径的突变体有fca、fpa、fy、fld、ld、fve，最近刚发现的flk也属于自主途径。自主途径的基因能抑制FLC的表达，因此它们的突变体中FLC mRNA的水平都比野生型和长日照途径、GA途径的晚花突变体中高。自主途径的基因与不同生态型中FLC的作用结果不同，但这种等位基因调控FLC 表达的不同之处现在难以解释。此外，虽然所有的自主途径基因都能抑制FLC表达，但它们之间并不是简单的线性关系。通过双突变体分析，发现自主途径的这些基因通过彼此独立的相互平行的途径调控FLC的表达。目前，所有的七个自主途径突变体都已克隆，它们通过不同的机制调控开花时间。

LD编码一个核蛋白，它对开花时间的调节至少部分是通过调控LFY的表达实现的。FPA、FCA 和FLK都编码RNA 结合蛋白。与FCA和FPA具有多个RNA识别位点(RNA recognition motifs，RRMs)的RNA结合蛋白不同，FLK是具有三个KH motifs的RNA结合蛋白。FLK和FCA都定位于核内，并通过FLC调控整合基因FT和SOC1的表达。FCA编码的蛋白质具有两个RNA-binding域和一个WW 蛋白互相作用域。FCA转录的前体mRNA选择性剪切为四种形式：α、β、γ、δ，其中只有γ编码完整的有功能的FCA蛋白。最近，Quesada等的研究使我们对FCA用选择性剪接方式调控开花时间的机制有了更深的了解。FCA通过促进内含子3的剪接和polyA的形成负向调控自身表达，结果导致有功能的FCA-γ转录减少而无编码功能的FCA-β转录增加。FCA WW蛋白互作域对其负向自我调控表达是必需的，而FY也正是通过这个WW域与FCA形成FCA-FY复合体调节FCA pre-mRNA 3′端剪接。FY蛋白与酵母多腺苷酸化因子Psf2p类似，通过RNA结合蛋白FCA与多腺苷酸化因子的相互作用可能是FCA实现自我调控的生化机制。FPA、FCA、FLK这些RNA结合蛋白的发现说明转录后调控可能是自主途径成员控制开花时间的一种重要的调节机制。

FLD是人类KIAA0601的同源蛋白，其N端都有一个特殊的与染色质重建有关的SWIRM结构域。KIAA0601是人类组蛋白脱乙酰酶1，2(HDAC1/2)抑制复合体(通过使组蛋白脱乙酰化抑制基因表达)的一个组分，因此FLD可能具有类似的功能。与此一致，fld中FLC染色质组蛋白H4乙酰化水平明显升高，因而导致FLC表达增加以及明显的晚花表型。FVE是酵母染色质装配及组蛋白修饰复合体组分MSI和哺乳动物眼瘤相关蛋白(retinoblastoma-associated protein) RbAp46、RbAp48的同源蛋白，能

通过与FLD相似的方式控制开花时间，说明对FLC组蛋白进行乙酰化修饰是拟南芥调控开花时间的一种机制。

1.4 GA 途径

GA控制一系列的生长发育过程，调控开花时间是其重要功能之一。在拟南芥中，GA是非诱导

性条件下开花所必需的，施加外源GA能促进拟南芥开花。GA合成突变体和GA信号途径突变体一般延迟开花。现在发现的一些影响拟南芥GA合成的突变体如ga1、ga4、ga5，它们的野生型基因编码GA合成过程中不同步骤的酶。而功能获得性突变体ddf1中GA水平的降低可能与GA20ox 催化的GA 合成步骤受阻有关。从另一个角度来看，过量表达编码2β- 羟化酶的AtGA2ox7 和AtGA2ox8通过水解C20-GAs，也造成了GA缺陷型表型。

GA信号传导途径的基因也影响开花时间，其中GAI、RGA 和RGL1是GA信号传导途径中三个关键组分，它们的功能部分冗余，当GA缺乏时都负调控GA信号途径，而活性GA则能消除它们的抑制作用。GAI、RGA 和RGL1这三个蛋白质属于植物特异的调控蛋白中的GRAS (GAI、RGA、SCARECROW)家族。除了GRAS家族成员中高度保守的VH11D和RVER区域外，在RGA、GAI和RGL1的N端还有一个特异的保守的DELLA结构域。DELLA结构域的序列为GAI、RGA、RGL1的功能所必需，缺失导致一系列GA缺陷表型。SPY是GAI上游的一个负调控因子，编码一个类似于哺乳动物丝氨酸/ 苏氨酸N-乙酰氨基葡萄糖(O-O- binding-N-acetylglacosamine)转移酶的蛋白质。spy突变体升高的GA水平及早花表型可能是增强了GA传导信号所致。PHOR1是另一个与开花时间有关的GA信号途径组分，在GA的作用下能转移到核内。PHOR1属于与armadillo相关的螺旋状重复蛋白(通常作为其他蛋白质和核酸装配的脚手架)家族，具有一个与泛素系统组分相关的结构域。当有GA存在时，与PHOR1有关的泛素复合物可能通过与GRAS家族GAI/RGA蛋白的DELLA域相互作用而将其降解，从而激活GA信号传导途径，促进下游信号分子如SOC1、FPF1、GAMYB的表达，进而促进花序分生组织基因(如LFY)的表达，由此完成了GA对开花时间的调控。

2 拟南芥开花促进途径的整合

上述四条调控拟南芥开花的途径并不是孤立的，而是根据外部环境条件和拟南芥内在生理条件的变化，通过控制一些开花途径共同控制的整合因子的表达强度，激活或抑制下游花序分生组织基因和花器官基因的表达，从而使植物适应环境条件和自身生理条件的变化，最大程度上优化其生长及发育的需要。

在拟南芥中，目前已发现了三个整合基因SOC1/AGL20、FT 和LFY。SOC1编码一个含MADS 结构域的转录因子，由于SOC1和FT都是CO的直接靶基因，因此长日照途径与其整合很可能是通过转录调控实现的，而自主途径和春化途径通过FLC抑制这两个基因表达的机制尚不清楚。最近发现，GA途径也能通过SOC1促进开花转型，这种激活SOC1表达的方式很可能是通过GA信号传导实现的。LFY是一个花序分生组织基因(floralmeristem identity gene)，在开花转型期被诱导，当花序分生组织出现后，LFY的表达逐渐增强。另外，作为花器官基因(floral organ identity gene)，LFY还能直接激活AP1的表达。LFY不受CO的直接调节，并且GA途径和长日照途径在LFY启动子上作用的顺式元件不

同。这说明环境信号和内部信号是在LFY 这个下游基因发生整合而不是在哪个上游组分(图2)。

图2 调控拟南芥开花时间的四条途径

虽然这些整合因子在开花时间的调节方面具有类似功能，但它们在各种途径中的地位有主次之

分，而且每条开花途径不可能控制所有的整合因子的表达。作为各条开花途径的关键交叉点，目前这些整合因子如何相互作用尚不十分清楚。其中，FT可能与LFY平行发挥作用并且为LFY功能所必需。由于FT 也能激活花序分生组织基因AP1，因此FT也可能平行地激活LFY与AP1的表达，而随后LFY 能直接激活AP1。另外，SOC1通过AGL24实现对LFY的部分表达调控，而FT 又可能参与了SOC1的调节。

3 植物开花时间调控研究的前景与展望

20年前，Koornneef首次报道在拟南芥中发现了11个控制开花的遗传位点，这在植物开花时间调控的研究史上具有里程碑式的意义。自此以后，各国的科技工作者一直致力于这些开花基因的克隆、功能研究和新的开花基因的发掘、功能分析及这些开花基因之间的相互关系研究。目前，已经在分子水平上建立了受内部信号和外界环境共同调控的拟南芥开花时间模型。虽然最近的发现使人们对开花时间调控机制的认识上升到一个新的层次，但是还不能完全解释这种复杂的调控机制，仍然需要从分子水平上进一步了解这些开花基因的功能。由于其他一些因素(如胁迫或营养状况)对开花时间的调节是不直接的或多方面的，而我们对其作用机制了解甚少。在这种情况下，如何采取措施剔除这些不确定因素的影响，使研究工作集中于开花时间调控的连贯性和一致性上？另外，还有一些基本问题需要回答，如拟南芥是如何检测到温度等促进开花转型信号的？其他植物的开花时间调节是否与拟南芥采取类似的机制？

从应用的角度来看，开花时间基因功能的研究必将推进现代农业生产的发展。例如，早花基因可以用来缩短农作物的生长期，从而像拟南芥一样实现一季多代。晚花基因可以用来提高甜菜，牧草等作物的产量。同时，人们还可以利用开花基因来调整花卉等观赏植物的花期，从而极大地提高

这些作物的经济效益。

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Arabidopsis, the Rosetta stone of flowering time?. Science, 2002, 296 (5566): 285～289

农杆菌侵染拟南芥花序的转化方法

农杆菌侵染拟南芥花序的转化方法 制备转化用的农杆菌菌液 准备： 1．灭菌试管 400毫升细长烧杯2瓶，离心瓶4-6个（250ml）。 2．试剂：YEP 1200ml（每瓶300ml 共4瓶）+Kan 1;1000，Rif1:500。 1/2MS+2%蔗糖（灭菌115度20分钟），Silwet在-20℃贮存。 3．步骤： 共转化农杆菌：于中午12点接菌于有YEP培养液的试管中10ul：10ml接种。28℃，3000rpm摇过夜，约30小时，次日下午6点将已摇活的菌按（1：400）及750ul菌液转至汉300毫升YEP+K50+Rif中培养28℃，300rpm约14小时，次日上午8点测OD值，用YEP+Rif作为空白对照，当菌液达到OD600为1.5~3.0之内时，可收集菌体于250ml离心瓶（灭菌）,4℃，4000g 离心10min 。用10%蔗糖（含0.02%silwet）稀释至OD600 约为0.8-- 1.0左右即，用10%蔗糖作对照。转化时将花在溶液中浸泡50s左右，于弱光下生长。 4．浇水：转化前一天将需要做转化的野生型拟南芥苗子浇水浇透。 （注意：选取上述配好的溶液2ml，充分打碎管底部的菌体，在将混匀的菌体溶入600ml溶液中，混匀后再加入Silwet(100%)120ul终浓度为0.02%）。 2．先将浇透水用于转化的苗子的夹全部剪掉，再用宽胶带把花盆的土封好。3．转化的准备工作：2个400细长烧杯，宽胶带，记号笔，表等。 4．转化过程略，视苗的长势弱 0.8 Pa 3`，长势好的0.8 Pa 5`。 5．标记好，将转化好的苗平放于盒子内，上盖封口膜封好，避光培养24hrs 2天后，将植株立起正常培养，浇水，3天1次。 花序浸泡(flower-dipping)法转化拟南芥

培养基制备的基本方法和注意事项

培养基制备的基本方法和注意事项 1.培养基配方的选定 同一种培养基的配方在不同着作中常会有某些差别。因此，除所用的是标准方法，应严格按其规定进行配制外．一般均应尽量收集有关资料．加以比较核对．再依据自己的使用目的加以选用，记录其来源。 2 ．培养基的制备记录 每次制备培养基均应有记录，包括培养推各称，配方及其来源．和各种成份的牌号。最终pH 值、消毒的温度和时间制各的日期和制备者等，记录应复制一份，原记录保存备查，复制记录随制好的培养基一同存放、以防发生混乱。 3.培养基成分的称取 培养基的各种成分必须精确称取并要注意防止错乱．最好一次完成，不要中断。可将配方置于傍侧，每称完一种成分即在配方上做出记号，并将所需称取的药品一次取齐，置于左侧，每种称取完毕后，即移放于右侧。完全称取完毕后．还应进行一次检查。 4.培养基各成份的混合和溶化 培养基所用化学药品均应是化学纯的。使用的蒸煮锅不得为铜锅或铁锅，以防有微量铜或铁混入培养基中，使细菌不易生长。最好使用不锈钢锅加热溶化．也可放入大烧杯或大烧瓶中置高压蒸汽灭菌器或流动蒸汽消毒器中蒸煮溶化。在锅中溶化时、可先用温水加热并随时扰动，以防焦化、如发现有焦化现象、该培养基即不能使用，应重新制备。 待大部分固体成分溶化后，再用较小火力使所有成分完全溶化．迄至煮沸。如为琼脂培养基，应先用一部分水将琼脂溶化，用另一部分水溶化其它成分，然后将两溶液充分混合。在加热溶化过程中，因蒸发而丢失的水分，最后必须加以补足。 5.培养塞pH 的初步调整 培养基各成分完全溶解后，应进行pH 的初步调正，因培养基在加热消毒过程中、pH 会有所变化，例如，牛肉浸液约可降低.而肠浸液pH 却会有显着的升高。因此，对这个步骤，操作者应随时注意探索经验、以期能掌握培养基的最终pH ，保证培养基的质量。 pH 调正后，还应将培养基煮沸数分钟，以利培养基沉淀物的析出。

镉胁迫对拟南芥的毒害作用及自噬现象的观测_高玲

自噬现象的观测 高玲1,2*，张卫娜2,4*，陈文利2,3 1.青岛农业大学生命科学学院，山东青岛266109； 2.华南师范大学激光生命科学教育部重点实验室，广州510631； 3.华南师范大学生命科学学院，广东省植物发育生物工程重点实验室，广州510631； 4.广东省农业科学院，广州510640 收稿日期：2011-03-23；接受日期：2011-04-29 基金项目：教育部长江学者和创新团队发展计划项目(IRT0829)，广东省科技攻关项目(2007A020300008-6)， 华南师范大学激光生命科学教育部重点实验室开放课题基金项目 通讯作者：陈文利，电话：(020)85211436-8512，E-mail ：chenwl@https://www.sodocs.net/doc/ba15190712.html, *并列第一作者 摘要：镉离子(Cd 2+)具有强植物毒性，可抑制植物生长，甚至导致植物死亡。为了研究重金属镉 对拟南芥的毒害作用，采用叶绿素荧光技术、流式细胞技术、激光共聚焦技术及半定量RT-PCR 技术，检测光合参数的变化、活性氧(reactive oxygen species ，ROS)的累积、自噬的发生，以及 病原相关蛋白（pathogenesis-related protein ，PR ）基因表达的变化。实验结果显示，随着 50μmol/L CdCl 2处理时间的延长，ROS 和Cd 2+在细胞中大量积累。而在镉胁迫的初期，会观察 到自噬的发生及PR 基因表达的变化。说明植物受到外界Cd 2+作用的初期，会通过自噬及增强 PR 基因表达来抵抗外界胁迫。但随着处理时间的延长，植物细胞内累积了大量的ROS 和Cd 2+， 当植物不足以通过自噬途径抵抗胁迫时，就会导致生长受阻，最终对光合系统造成损伤。 关键词：镉；活性氧；自噬；叶绿素荧光；流式细胞技术 中图分类号：Q945，Q947 DOI ：10.3724/SP.J.1260.2011.00676 引言 近年来，工业、矿业生产中产生的大量重金属被释放到环境中，镉(Cd )即是其中之 一。大量研究表明，镉是环境中的主要重金属污染源，是对植物毒性最强的元素之一。镉 毒害同其它逆境一样，主要伤害机制之一是影响植物体内活性氧(reactive oxygen species ， ROS )和自由基的代谢平衡，引起ROS 和自由基的积累，产生膜脂过氧化作用，导致植物 的中毒甚至死亡[1]。植物体内的超氧化物歧化酶(superoxide dismutase ，SOD )和过氧化氧 酶(catalase ，CAT )等保护酶对ROS 及自由基的清除能力，是决定其逆境抗性的重要因素 之一[2]。镉胁迫成为各种生物面临的一种新挑战。植物和藻类细胞虽然可以耐受一定量的镉 胁迫[3]，但过量的镉会直接或间接地抑制植物体的生理过程，如呼吸作用、光合作用和氮代 生物物理学报2011年8月第27卷第8期:ACTA BIOPHYSICA SINICA Vol.27No.8Aug.2011:676-686 676-686 676

选拔和培养人才的四个注意事项

选拔和培养人才的四个注意事项 --明阳天下拓展随着行业垄断和企业日扩大经营规模需求的日益增加，企业对人才的需求的情况可以说是求贤若渴。但由于空降兵在我国的短命，所以大多企业便把选拔人才的方向转到了企业内部。但我国的大多数企业，尤其是中小型企业很少有人才储备的观念，大都是到了破不得以的时候才赶鸭子上轿，开始虽然是周瑜打黄盖，但结果通常是不欢而散。所以，一个企业只有真正解决了人才储备，即对人才充分做到了选拔和培养，才能真正解决企业人才匮乏的问题。 一、如何选拔人才 在一次企业培训公开课中，笔者听到这样一个故事。从前有个蝎子想要过河，但它不会游泳。正在它发愁的时候旁边跳过来一只青蛙。于是它就对青蛙说：“青蛙、青蛙，你背我过河好么？”青蛙回答道：“当然好，但我不能，因为你可能在我背你过河的时候蜇我。”“可我为什么要这么做呢？”青蛙反问道，“这对我没有任何好处，如果你死了我也会葬身鱼腹的。”青蛙虽然知道蝎子的狠毒，但想想它的话也有道理。于是背着蝎子就游到了水中。这时突然蝎子弯起了尾巴蜇了青蛙一口。疼痛中的青蛙大声喊道：“你为什么蜇我，这对你也没有好处，如果我死了，你也会沉下去的。”可蝎子却边下沉边说：“可你千万别忘了我是蝎子，只要我还是蝎子，就一定会蜇你的，这是我的天性。” 这是一个很传统很古老的智慧。但我们不得不承认它在今天的社

会中依然很有用处。也许有些人会问到，人虽然本性难移，但还是可以通过教育培养得到改善的。或者说选拔人才的关键是要看才干和个人能力。这两点笔者当然不否认。但笔者更认为在注重这两点的同时，更应该注重的是这个人的本性和人品，尤其是比较重要的职位，更应如此。教育当然会改变很多，比如人的行为习惯和行为动机，也许你可以举出1000个例子来证明你的观点，但它要花费的时间和精力通常是我们企业负担不起的。不公平的说，优秀的企业是选拔合格的人才放在适当的位置上，而不是培养人才放在合适的位置上，尤其是考虑的企业运营资本和战略经营时机的时候。所以笔者认为选拔人才在先，培养在后。而不是普遍培养，重点选拔。不但费时费力，还会造成部分人员因为失望而产生不必要的流动。 二、提出合理的绩效 企业选拔人才，当然会有让他们做的事情。但如何能让他们委依重任，又能很好的完成工作任务呢？提出合理的绩效要求很是重要。过高或过低都是很不适宜的。要有挑战，又要够得到。但也不能只留下问题，而不予指导，这也是很多企业的通病。上级领导下目标，下级领导满地跑。为什么呢？不知道怎么做。所以，尤其是对待新提拔和新重用的人们来说，不但要给方向，还要帮助寻找路径，并提供相应的资助，才能达到令人满意的绩效。同时有两点也要格外注意。一是一定要有完成绩效的时间，另一个就是明确的叙述出公司的绩效标准是什么？也就是说在什么时间内完成什么样的任务。 三、适时的激励

(完整版)实验室要求及注意事项_0

---------------------------------------------------------------最新资料推荐------------------------------------------------------ 实验室要求及注意事项 实验室要求及注意事项上海畅通净化工程 changtongsys 上海畅通建筑装饰 changtongsh 首先要根据仪器的要求设计好相 对的房间，比如说精密天平要考虑，热源、震动、气流、静电等，原子荧光还要考虑空气的洁净，原子吸收要考虑排风等等。 总之实验室的装修原则是； 1 安全、 2 科学、 3 适用、 4 美观。 要做一个标准的实验室是要有很深的专业人员才能做到的。 1. 温湿度控制，涉及到空调，除湿机的配置等； 2. 通 风系统，一定要的； 3. 防震防火，一般没问题； 4. 防尘，注意门窗的设计； 5. 电源，注意有没有三相电和两相电的特别 需要。 6. 气体管路的布置，一般也没问题。 针对不同的客户群需要设计有全钢结构，钢木结构，铝木 结构，全木结构，全不锈钢结构及玻璃钢结构的产品；实验仪器：超净工作台，生物安全柜，烘箱，培养箱，电子天平等。 净化设备： 粗，中，高效过滤器；风淋室；净化空调；洁净传递窗；空 气自净器；净化工作台；洁净服；净化送风口等；一、实验 室要求理想的组织培养实验室应该建立在安静、清洁、远离污 染源的地方，最好在常年主风向的上风方向，尽量减少污染。 1/ 18

规模化生产的组织培养实验室最好建在交通方便的地方，便于培养产品的运送。 实验室的建设均需考虑两个方面的问题： 一是所从事的实验的性质，即是生产性的还是研究性的，是基本层次的还是较高层次的；二是实验室的规模，规模主要取决于经费和实验性质。 无论实验室的性质和规模如何，实验室设置的基本原则是：科学、高效、经济和实用。 一个组织培养实验室必须满足 3 个基本的需要： 实验准备（培养基制备、器皿洗涤、培养基和培养器皿灭菌）、无菌操作和控制培养。 此外，还可根据从事的实验要求来考虑辅助实验室及其各种附加设施，使实验室更加完善。 在进行植物组织培养工作之前，首先应对工作中需要哪些最基本的设备条件有个全面的了解，以便因地制宜地利用现有房屋，或新建、改建实验室。 实验室的大小取决于工作的目的和规模。 以工厂化生产为目的，实验室规模太小，则会限制生产，影响效率。 在设计组织培养实验室时，应按组织培养程序来没计，避免某些环节倒排，引起日后工作混乱。 植物组织培养是在严格无菌的条件下进行的。

拟南芥原生质体制备转化方法整理

溶液配制 1、纤维素酶解液：

2、PEG4000溶液（一次配置可以保存五天，但是最好现用现配，每个样品需100μl PEG4000溶液，可根据实验样品量调整溶液配置总量）

3、W5 溶液 4、MM G溶液

5、WI溶液 拟南芥原生质体制备转化方法整理 一、土培室播种种植的拟南芥。 二、生长良好情况下在未开花前用于取材叶片制备原生质体。 三、剪取中部生长良好的叶片用刀片切成0.5 -1 mm宽的叶条。 四、将切好叶条掷入预先配置好的酶解液中（每5-10 ml酶解液大约需10-20片叶子）。并用镊子帮助使叶子完全浸入酶解液。

五、用真空泵于黑暗中抽30分钟。（此时可配制PEG4000溶液，200和1000 ul 枪头去尖使操作时吸打缓和。） 六、在室温中无须摇动继续黑暗条件下酶解至少3个小时。当酶解液变绿时轻轻摇晃培养皿促使原生质体释放出来。（此时预冷一定量W5溶液） 七、显微镜下检查溶液中的原生质体，拟南芥叶肉原生质体大小大约30-50 um。 八、在过滤除去未溶解的叶片前用等量的W5溶液稀释含有原生质体的酶液。 九、先用W5溶液润湿35-75 um的尼龙膜或60-100目筛子，然后用它过滤含有原生质体的酶解液。 十、用30毫升的圆底离心管100g，1-2分钟离心沉淀原生质体。尽量去除上清然后用10ml 冰上预冷的W5溶液轻柔重悬原生质体。 十一、在冰上静至原生质体30分钟。 以下操作在室温23℃下进行

十二、100g离心八至十分钟使原生质体沉淀在管底。在不碰触原生质体沉淀的情况下尽量去除W5溶液。然后用适量MMG溶液（1m）重悬原生质体，使之最终浓度在2X105个/ml。 十三、加入10 ul DNA（10-20微克约5-10kb的质粒DNA）至2ml离心管中。 十四、加入100 ul原生质体（2x104个），轻柔混合。 十五、加入110 ul PEG溶液，轻柔拍打离心管完全混合（每次大约可以转化6-10个样品）。 十六、诱导转化混合物5-15分钟（转化时间视实验情况而定，要表达量更高也许需要更高转化时间）。 十七、室温下用400-440 ul W5溶液稀释转化混合液，然后轻柔颠倒摇动离心管使之混合完好以终止转化反应。 十八、室温下用台式离心机100g离心2分钟然后去除上清。再加入1ml W5溶液悬浮清洗一次，100g离心两分钟去上清。

细胞培养的过程注意事项

细胞的培养过程及注意事项 根据培养过程中是否需要分割培养物进行再培养而将细胞培养分为原代培养和传代培养。 一、原代培养 （一）过程 原代培养的基本过程包括取材、培养材料的制备、接种及培养等步骤。原代培养的方法很多，基本和最常用的是组织块培养法和分离细胞法。 1、组织块培养法 (1)基本操作过程 1）、用培养液湿润所取组织材料，并用锋利的眼科剪将附在其上的脂肪和结缔组织去除干净。再用平衡液（PBS）或Hanks液漂洗；用锋利的眼科弯剪将组织块剪成小块；再用PBS 或Hanks液漂洗多次，直至液体不浑浊、无油滴、清亮为止。 2）、用湿润的吸管吸取切碎的组织块，清清吹到培养瓶皿中，并将其按一定间距均匀放在培养瓶底壁上，量不要过多，要将组织块切面贴在培养瓶底壁上； 3）、将培养瓶翻转，使瓶底朝上，在种植了组织块一侧的对侧面加足培养液，勿使组织块与培养液接触，塞紧瓶塞； 4）、将种植了组织块的一侧朝上，静置于37℃培养箱中；待组织块贴壁1h到3h后翻瓶，使贴壁的组织块浸没与培养液中，静置； 5）、每隔2到3天更换一次培养液，或者根据培养瓶种颜色的变化确定换液时间。 2、注意事项 1）、组织块接种后的前3天，从组织块向外迁徙的细胞数很少，组织块的黏附不牢固，在观察和移动的过程中，注意不要引起液体的振荡。要避免经常翻动和振动，否则组织块不易附着于瓶壁上或附着后也会脱落飘起。 2）、加入的培养液不宜过多，避免浸泡的组织块受轻微的波动而脱落下来。 3）、用组织块培养时，要及时观察，当细胞向外迁徙出来后要注意记录并去除漂浮的组织块和残留的细胞，因为已漂浮的组织块和那些细胞碎片已经死亡，它们产生的有毒物质会影响原代细胞的生长，要及时清除。

拟南芥原生质体的提取和转化

拟南芥原生质体的提取和转化 (1)取4周后抽薹前的叶片，切成1mm宽的长条，置于甘露醇溶液（称1.82g D-甘露醇于 20ml双蒸水中）；共需叶片约90片； (2)将步骤1中细条捞出，置于酶解液中；避光，23℃,40-50rpm摇床上酶解3小时； (3)酶解液过100-200目的筛子，收集滤液，置于15ml离心管中，均分为两管；于4℃， 60g，离心15min； (4)原生质体用冰冷W5溶液轻柔洗涤，每管4ml；4℃，100g，离心1min； (5)弃上清，沉淀用冰冷的W5溶液轻柔悬浮，每管4ml；冰上放置30min； (6)23℃，100 g离心1min；弃上清，每管沉淀用0.5ml MaMg重悬； 以下操作均在23℃下进行： (7)取约10-20ug 质粒于1.5ml EP管中，加100ul 步骤6中的原生质体；用200ul 枪头（剪 去前端）轻柔混匀； (8)加入110ul PEG/Ca 溶液，轻柔混匀；放置20-30min； (9)加入0.44ml W5 溶液，来回颠倒混匀；23℃，100 g，1min，brake 设为4-5； (10)弃上清，加100ul W5，混匀；加900ul W5，混匀； (11)上述混合液体置于六孔板内，23℃，避光，孵育6-18小时。 (1)酶解液： cellulose R10 15% Macerozyme R10 0.3% Mannitol 1.09g KCl 0.3M MES 0.3M 调节pH值到5.7，55℃加热10min，冷却到室温再加入下列溶液 CaCl20.15M β-巯基乙醇0.75mM (2)PEG溶液（40%，v/v） PEG4000 1g 0.8M Mannitol 0.625ml 1M CaCl2 0.25m (3)W5溶液

拟南芥转化 浸花法

拟南芥转化—浸花法 实验步骤： 关键记录： a浸染的最好阶段是一个花盆里有20-30个花絮以及一些成熟的果夹，这些果夹浸染之前需要剪掉。 b/颠倒植株将植株浸入农杆菌细胞悬浮液10s。 c.塑料膜包裹保持黑暗高湿度16-24h。一周后可再次侵入农杆菌细胞悬浮液浸染。

d.移去塑料膜，让植株在温室中生长一个月。 e.干燥成熟的果夹用小袋套住。 f.筛选主要转基因植株在筛选培养基上。

说明： 如果转化实验要延迟或者构建没有准备好又或者想要植株有很多的花序，可以剪掉植株第一次的抽苔，使其长出更多的分支和花序，在剪去第一个抽苔的6-8天后，开始农杆菌悬浮液浸染。 如果希望增强营养来支持转化的细胞，同时又减少野生型种子（即增加转化效率）以及减少筛选主要转基因植株期间真菌病害。去掉用于转化植株上的果夹。 具体步骤： 1.已转化的农杆菌在含抗生素筛选培养基上长出单克隆，对鉴定后确定转化成功的单克隆于5ml液体YEP培养基（含抗生素）28℃活化培养16h。 2.取适量（1:50）活化培养的菌液于50ml液体YEP培养基（含抗生素）中28℃扩大培养6h。 注意：在此要鉴定是否为正确的转化农杆菌，酶切、PCR均可。确认后，为了下次转化浸染，可以在这一步将农杆菌甘油管-70℃保存或者将菌液密封保存于4℃,高达1个月。 3.将20ml农杆菌细胞悬浮液于4000g、10min室温离心，加入1倍体积的10mM MgCl2,5%蔗糖溶液（即100ml H2O中加MgCl2·6H2O 0.202g，蔗糖 5g）。 浸染前加表面活性剂使其终浓度为0.02%（20ml加4uL）。混匀，转移至50ml离心管。 注意：表面活性剂浓度过高有毒害。为了产生含两种独立载体的转化植株，我们要用两种农杆菌细胞，各含有一种载体，分别加入30mL 10mM MgCl2,5%蔗糖溶液，浸染前加入适量表面活性剂，将它们混合在一个大烧杯里。在双转化试验中我们至少要用48株植株。间隔7天进行第二次浸染植株。 小心：戴手套及口罩防止表面活性剂的毒害。 4.浸染时将农杆菌悬浮液倒满50mL离心管的小盖子，将拟南芥横放使花序浸入小盖子中的悬浮液10s，轻微晃动小盖，20ml农杆菌悬浮液至少有效用于转化30株拟南芥， 150个花序以上，这一步骤要保证能在植株上看到菌液。 注意：确定所有花盆都已浸染，有时很有必要浸染整个植株确保浸染更短更多的花芽。将过多的农杆菌液移除也很重要。否则长时间

贴壁细胞培养步骤及注意事项

贴壁细胞培养步骤 一、复苏 1.把冻存管从液氮中取出来，立即投入37℃水浴锅中，轻微摇动。液体都融化 后（大概1-1.5分钟），拿出来喷点酒精放到超净工作台里。 2.把上述细胞悬液吸到装有10ml培养基的15ml的离心管中（用培养基把冻存 管洗一遍，把粘在壁上的细胞都洗下来），1000转离心5分钟。 3.把上清液倒掉，加1ml培养基把细胞悬浮起来。吸到装有10ml培养基的10cm 培养皿中前后左右轻轻摇动，使培养皿中的细胞均匀分布。 4.标好细胞种类和日期、培养人名字等，放到CO2培养箱中培养，细胞贴壁后 换培养基。 5.3天换一次培养基（具体看细胞生长状态及培养液情况）。 二、传代 1.培养皿中的细胞覆盖率达到80%-90%时要传代。 2.把原有培养基吸掉。 3.加入2毫升PBs洗两遍，最后吸净培养皿中的PBS 4.加适当的胰蛋白酶（能覆盖细胞就行），消化（消化时长看情况而定）。 5.当看到细胞开始脱离培养皿时倒掉酶液，加入2毫升左右含血清的培养基终 止消化。 6.用移液枪吹打细胞，把细胞都悬浮起来。 7.把细胞吸到15ml的离心管中，1000转离心5分钟。 8.倒掉上清液，加1-2ml培养基，把细胞都吹起来。 9.根据细胞种类把细胞传到几个培养皿中。一般，癌细胞分5个，正常细胞传 3个，继续培养。 10.若是只培养一皿，只需吹散后倒剩1/4左右，重新加入培养液继续培养。 三、冻存 1.把原有培养基吸掉。 2.加入2毫升PBs洗两遍，最后吸净培养皿中的PBS 3.加适当的胰蛋白酶（能覆盖细胞就行），消化（消化时长看情况而定）。 4.去掉酶液，加入2毫升左右含血清的培养基终止消化。 5.吹落后把细胞吸到15ml的离心管中，1000转离心5分钟。 6.加入1毫升冻存液悬浮细胞，装到灭菌的冻存管中，静止几分钟，写明细胞 种类，冻存日期。 7.4℃30min，-80℃过夜，然后放到液氮灌中保存。

拟南芥培养Protocol

拟南芥培养Protocol 拟南芥生长的适宜温度白天为22℃-24℃,夜温最好比日温低2℃,适宜的湿度为60-70%,生长期适宜的光强为150μmol·s-1·m-2(6支36W日光灯下35cm处测得)。幼苗期不耐高光强,可适当遮荫.光质也较重要,应选用植物生长专用的日光灯(如荷兰产TLD型Philip豪华直管荧光灯).拟南芥在日照长于12小时下才会开花,一般拟南芥生长室的日照长度定于14-16h为佳 1.准备发苗培养基:1/2 MS,Sucrose:10g/L,pH5.7,agar:0.7-0.8%.灭菌后,在超净台上分装入培养皿. 2.种子消毒:种子放在1.5ml试管中, 加入1ml10%NaClo,混匀,消毒5min,用无菌水洗5次以上(用移液枪吸). 3.播种:用移液枪将种子吸到培养皿上,可多加些水,将种子铺均匀(不要太密,太密根缠在一起不好移苗),用移液枪吸干水,在超净台上让培养皿干了,密封盖子,4℃暗处理两天后,移到光照培养箱(22℃,光周期12h),若种子较密,则在光照培养箱中生长1周后即可移苗,否则根长太长后易缠在一起,但太小的苗移栽后,需适当遮荫.最好是在每皿<30株这样的密度下,让其生长两周后再移苗. 4.移苗:将蛭石与珍珠岩按(3:1)的比例混好,装入花盆,将花盆放入有水的塑料周转框中,框中的水就会通过花盆底部的孔渗上来,待花盆中的基质湿透后即可移苗.小心轻轻用镊子从培养皿中连根拉出小苗,把根平放在蛭石表面,用镊子把根轻轻压下.移苗结束后,用保鲜膜覆盖3-4天后揭膜.从苗期直至开花,可在塑料周转框中始终保持1-3cm的水层,在开始收籽期,不再需要过多的水分,可保持塑料周转框干燥,此时每隔2-3天浇一次水即可.整个生长期可浇3-4次拟南芥营养液. 5.收籽:在种荚变黄,变干时可以收籽.将种子抖落在纸上,用金属滤网过一下以除去杂质,将种子装入写了标记的小纸袋中,放于干燥的环境中让种子进一步干燥后,封存于1.5ml试管中.

细胞培养的注意事项

相关疾病： 每天对待细胞比孝敬爹妈还用心，那真是捧在手里怕碎了，含在嘴里怕化了，看在眼里怕丢了，培养细胞时有哪些惨痛经验教训可以分享呢? 早走早脱身，从此专注黑生物 1. 严格无菌操作，多喷喷酒精，要是对灭菌的东西不放心，自己包自己送自己烘干。 2. 不要和别人共用试剂耗材，自己准备一套。 3. 有可能的话在拿到新细胞的时候做好支原体衣原体检测。 4. 水浴锅很脏，生化培养箱要是得手动加湿的话盘里的水也会很脏，勤换(灭菌水加进去)。 5. 晚上离开的时候最好给细胞房照紫外，超净台是用完就开。 6. 最好的是同一时间就你一个人在用细胞房在养细胞。 非科班出身经验分享 1. 别怕浪费。枪头什么的只要有可能污染就换，如果用酒精灯就什么都稍微烤一下，别直接放到火上，离一段距离。 2. 动作要既轻柔又有力。动作太重会有一堆一堆的气泡，动作太轻就吹不下来... 刚开始的时候吹细胞太痛苦了，稍微一下就起泡。后来就是吹的时候枪里的培养基不要一次全都压出来，留一点，枪的最头部尽量深的在液面以下。 3. 离开过操作台的东西再进操作台之前一定要用酒精喷一遍，包括一切实验耗材、仪器、以及你带着手套的手。 4. 实验结束后对实验台的消毒。紫外什么的，用前用后都照个30 分钟。 5. 身体的各个部分尽量的少接触不需要接触的地方的地方。比如实验台，又比如培养箱内部。 6. 细胞的密度根据细胞的性质、传代的时间以及自己的心情来定。培养基的话最多最多不要超过2 天就要换一次。细胞可以不传代，但是培养基是一定要换的。 大概就是，不该碰的地方不碰，有影响的地方少碰; 该使劲的时候绝对不含糊，不该使劲的地方一定忍住。如果是比较简陋的操作台就一定要摆个酒精灯，所有操作紧密围绕在酒精灯周围进行。如果是高级台子就多用酒精喷喷。感觉生物的实验，心疼钱就还是不要做了。 最后一点点绝对非科班的经验。癌细胞真是坚挺。有一次实在是不想传了，放了 5 天

拟南芥培养

实验目的：拟南芥无菌培养。 实验仪器：光照培养箱,盆.培养皿,超净台,灭菌锅. 实验试剂：营养土,蛭石,MS培养基 实验步骤： 1、配制MS培养基（一般装在三角瓶里，最好只装最大体积的70％以内），高温灭菌（115 度15分钟）在未固化情况下，（固化的话可以在微波炉里融化再使用）在超净台里倒入培养皿（一般一个培养皿内装25ml左右培养基，培养皿也是要灭菌的，一般用报纸或者牛皮纸包一排，十几个吧），待充分凝固之后平放密封保存（倒好之后最好静置15－20分钟，然后放在塑料袋里，保存在4度） 2、将拟南芥种子用10％消毒水（洗洁精体积分数）浸泡15分钟左右（要保证每粒种子都 浸透），无菌水冲洗3遍，加入适量0.12%的琼脂溶液（要灭菌的）用蓝枪头播在之前准备的灭菌MS固体培养基上(要在超净台中操作)，点种子大概的确有点难以想象，下次你来拿种子和苗的时候我可以给你演示一下； 3、４℃春化2天后转到光照培养间，温度２２℃／１８℃（日／夜），1６ｈ／８ｈ光周期， （也不用这么严格的，一般22－25度，5000－7000lx，白炽灯光照培养，光照强度五千Lx。 差不多就行了） 4、大约7－10天后，拟南芥根须和芽均已长出，长到3至4片叶后可以移入土中培养（平 板里长太久的话似乎会影响植物以后的生长）。 5、用营养土和蛭石以1：1的比例混合拌匀配制，以保证营养及透气性。用高温杀菌以杀 死土中的害虫。（我们现在种得多，土都不灭菌的，注意拔拔杂草就行了） 6、用镊子小心夹住培养皿中的拟南芥茎处，取出放在土上，卷起根须塞入土中。避免将叶 片带入土里。放在光照培养间，条件和长平板一样就行了 7、在托盘中浇水，通过毛细作用由底部的孔吸收上去，保证土壤湿润。刚移植的前两天可 以用基本上透明的盖子盖住盆顶。 MS培养基的配方是对的 单位mg/L 大量元素：NH4NO3 1 650 KNO3 1 900 CaCl２·2H2O 440 MgSO4·7H2O 370 KH2PO4 700 微量元素：KI 0.83 H3BO3 6.2 MnSO4·4H2O 22.3 ZnSO4·7H2O 8.6 Na2MnO4·2H2O 0.25 CuSO4·5H2O 0.025 CoCl2·6H2O 0.025 FeSO4·7H2O（27.8）+Na2-EDTA·2H2O（37.3） 有机成分：肌醇100 烟酸0.5 盐酸吡哆醇（维生素B6）0.5 盐酸硫胺素（维生素B1）0.5

植物组织培养的一些注意事项

植物组织培养的一些注意事项 一、常用培养基主要特性 1、高盐成分培养基包括MS、LS、BL、BM、ER 等培养基。其中MS 培养基应用最广泛,其钾盐、铵盐及硝酸盐含量均较高, 微量元素种类齐全, 其养分数量及比例均比较合适, 广泛用于植物的器官、花药、细胞及原生质体的培养。LS、BM、ER 培养基由MS 培养基演变而来。 2 、硝酸钾含量较高的培养基包括B5 、N6 、LH、GS 等培养基。 ①B5 培养基B5 培养基除含有较高的钾盐外, 还含有较低的铵态氮和较高的盐 酸硫胺素, 较适合南洋杉、葡萄及豆科与十字花科植物等的培养。 ②N6 培养基N6 培养基( 朱至清等1975 ) 系我国学者创造, 获国家发明二等奖, 适用于单子叶植物花药培养, 柑橘花药培养也适合, 在楸树、针叶树等的组织培养中使用效果也好。 ③SH 培养基是矿盐浓度较高的一种培养基, 其中铵与磷酸是由磷酸二氢铵 ( NH4 H2 PO4 ) 提供的, 这种培养基适合于某些单子叶及双子叶植物的培养。 3 、中等无机盐含量的培养基 ①H 培养基本培养基大量元素约为MS 培养基的一半, 仅磷酸二氢钾及氯化钙稍低, 微量元素种类减少, 而含量较MS 为高, 维生素种类比MS 多。适于花药培养。 ②尼奇培养基(Niotsch 1969 ) 此培养基与H 培养基成分基本相同, 仅生物素比 H 培养基高10 倍。也适合于花药培养。 ③米勒培养基(Miller 1963 ) 此培养基和Blaydes(1966) 培养基二者成分完全相同。适合大豆愈伤组织培养和花药等培养用。 4 、低无机盐培养基大多情况下用于生根培养基。有以下几种: ①改良怀特培养基(White 1963 ) ②WS 培养基(Wolter & Skoog 1966) ③克诺普液( Knop 1965 ) 花卉培养上用得多。 ④贝尔什劳特液(Berthelot 1934) ⑤HB 培养基( Holley & Baker 1963) 此培养基在花卉脱毒培养和木本植物的茎尖培养中效果良好。其成分是大量元素比1/ 2 克诺普( Knop ) 液稍多, 微量元

拟南芥室内简易栽培和田间大规模种植的方法_王爱荣 (1)

福建农林大学学报(自然科学版)第34卷第2期Journa l o f Fu jian A g ricu lt ure and Fo re stry U niversit y(N atura l Sc ience Edition)2005年6月 拟南芥室内简易栽培和田间大规模种植的方法 王爱荣,刘　丽,周　洁,鲁国东,王宗华* (福建农林大学教育部生物农药与化学生物学重点实验室,福建福州350002) 摘要:采用菜园土、草木灰、锯木屑体积比为4∶2∶1的培养基质,用1g L-1琼脂水悬浮种子直播培养拟南芥,根据其生物学特性在温度、空气相对湿度、土壤水分、光照以及病虫害防治等方面进行管理,培养出生长健壮、充分满足实验要求的拟南芥植株.用同样基质,适当遮荫,可以在田间大规模种植拟南芥.在月均温为11-14℃,日最低气温为2.1-4.7℃的自然条件下,夜间覆盖塑料薄膜,拟南芥仍能正常生长. 关键词:拟南芥;栽培技术;田间种植;突变体库 中图分类号:Q94-331文献标识码:A文章编号:1006-7817(2005)02-0252-03 I ndoor culture and large scale fiel d cultivation of A rabidopsis t h aliana WANG A i-rong,LI U Li,ZHOU Jie,LU G uo-dong,WANG Zong-hua (K ey Laborato ry for Biope sticide and Che m i ca l B io l ogy o f M inistry of Educati on,Fu jian Ag ricu lture and F orestry U ni ve rsit y, Fuzhou,Fuji an350002,Chi na) Ab strac t:The so il,p l ant ash and w ood chips at the propo rtion o f4∶2∶1we re used a sm ed i u m t o trea t t he seeds o f Arabi dopsis t ha li-ana,and t o sus pend t he m i n1g L-1aga r w ater so l u tion a t4℃for2-4day s and directl y s ow t he m onto tho se p repa red pots to m ake t he m ge r m i na t e and gro w at t he indoo r or ou t doo r conditions w it h regu l a r t emperature m anagement,w atering,fe rtiliza tion,and pest con tro.l A.t ha liana wa s still g row i ng we ll i n t he fie l d even when the ave rage mon t hly te m pe ra t ure w as a round11.0-14.0℃and the dail y m ini m u m te m pe ra t ure decli ned to2.1-4.7℃i n w i n t e r as l ong as covered w it h p l a stic fil m.The result prov i des a ne w w ay t o g row A.t hali ana a t l a rge sca le but w it h l ow co stwh ich may facilita t e the p l ant f unc tiona l geno m ics. K ey word s:Ar abidopsis tha li ana;culture technique;fie l d plan ting;m utan t base 拟南芥(Arabidopsis t h ali a na)属十字花科拟南芥属植物,具有显花植物的全部特征,且还具有基因组小、结构简单、形体小、生长周期短、繁殖系数高、自花授粉等优点[1],这些特点使它成为“植物界的果蝇”,分子生物学、发育生物学和遗传学研究的模式物种.2000年,其基因组全序列测定工作的完成更加激发了人们对其基因结构与功能进行更为详尽研究的兴趣[2].现在,我国越来越多的实验室以拟南芥为试验材料.但拟南芥种子小,幼苗弱,对生长环境又有一定要求,这给它的培育带来了一定困难.目前,拟南芥的栽培方法主要有2种:一种是移栽法,即先将种子种在无菌培养基上,1周后再移栽到土壤中;另一种是土壤培养法,即直接把种子种在土壤中[3].国际上,已有很成熟的拟南芥栽培方法和材料[4],但是国内的条件往往达不到规范的要求,为此,已有一些改进方法的报道[3,5-7],但这些方法对设施依赖性很强,成本高,难以大规模种植.本研究摸索了一套简便易行的室内和田间栽培方法,为大规模、低成本栽培拟南芥提供参考. 1　材料与方法 供试拟南芥为Co lu m bia-4、Co lu m bia-0、g l、W s等生态型. 根据福州市的取材情况和拟南芥的生长特点配制了多种基质.各基质不同组分的体积比为:菜园土∶沙子=1∶1、菜园土∶花土=1∶1、菜园土∶椰糠=1∶1、椰糠∶沙子=1∶1、菜园土∶椰糠∶沙子=1∶1∶1、菜园土∶泥炭土=1∶1、菜园土∶草木灰∶锯木屑=4∶2∶1.观察拟南芥在不同基质的生长情况. 将混合均匀的培养基质装入培养盆中,培养盆放置于托盘上,一个托盘可放置多个培养盆.播种前向 收稿日期:2005-01-14 修回日期:2005-03-25 基金项目:国家自然科学基金资助项目(30471178);福建自然科学基金资助项目(B0210018);福建省科技厅资助项目(2003F008). 作者简介:王爱荣(1975-),女,硕士.研究方向:分子植物病理学. *通讯作者.

拟南芥原生质体的制备及转化

拟南芥原生质体制备转化操作流程 主要试剂 1. 纤维素酶解液： 试剂 15ml酶液体系 1．1-1.5﹪Cellulase R10 (YaKult Honsha)0.225g干粉 2．0.2-0.4﹪Mecerozyme R10 (YaKult Honsha)0.045g干粉 3．0.4M mannitol1.09g干粉 4．20mM KCl1 ml 0.3 M KCl母液 5．20mM MES,pH5.7，1 ml 0.3 M MES,pH5.7母液 6．加入10ml 水 7．55℃水浴加热10分钟（钝化酶，提高酶的可溶性），冷却至室温后加入以下试剂8．10mM CaCl，1 ml 0.15M CaCl2 9．5 mM β-Mercaptoethanol（可选用）1ml 75mM β-Mercaptoethanol母液(Sigma A-6793) 10．0.1﹪BSA，1 ml 1.5﹪BSA（4℃保存） 11．用0.45μm滤膜过滤后使用，酶液是淡棕色的澄清溶液。 2. PEG溶液（40%, v/v）（一次配置可以保存五天，但是最好现用现配，每个样品需100ul PEG4000溶液，可根据实验样品量调整溶液配置总量） PEG4000( Fluka, #81240)……………1g………………………………….4g 水…………………………………………………0.75ml…………………………..3g 0.8 M Mannitol…………………………..0.625ml…………………………2.5ml 1 M CaCl2或Ca(NO3)2………………..0.25ml………………………….1ml 约1.2ml 3. W5 溶液（1000ml） 154mM NaCl, NaCl9g 125mM CaCl2, CaCl2.H2O18.4g 5mM KCl, KCl0.37g 2mM MES（PH 5.7），MES0.39g pH to 5.8 with KOH，高温高压灭菌20分钟，室温保存。 4. MMG溶液 MaMg溶液（500ml） 15mM MgCl2，MgCl0.71g 4 mM MES(PH5.7)MES0.39g 0.4 M mannitol，Mannitol36.5g 用KOH调pH 5.7，高温高压灭菌20分钟，室温保存。 5. WI溶液 WI(200ml) 0.5M mannitol，mannitol18.217g 4mM MES,pH5.7，MES0.156g

PEG介导法制备拟南芥原生质体及瞬时表达方法

采用PEG介导拟南芥叶片原生质体瞬时表达法。具体方法如下： 1）在MS培养基上用无菌牙签点种拟南芥种子，萌发后待根长至1-3厘米（2周左右），移栽到营养土:蛭石为1:1的培养土中，置于培养箱，温度22℃，光照16h，湿度70%，培养2-3周； 2）配制酶解液，选10ml酶解体系，置于90mm培养皿中； 3）在长势良好且未抽薹的拟南芥植株上选取鲜嫩叶片10-15片，用洁净的手术刀在培养皿的盖子上将叶片切成1mm宽的细条； 4）将切好的细条均匀铺在含酶解液的培养皿中，可以一边切一边从植株上取； 5）将酶解液和细叶条真空抽滤30 min； 6）将培养皿取出，静置在黑暗中，23℃，酶解3小时； 7）酶解液过100-200目的筛子，将过滤后的绿色混合物置于2.0 ml离心管中，常温，100 g离心1 min； 8）弃上清，沉淀用冰冷的W5溶液轻柔洗涤，4℃，100 g，离心1min； 9）弃上清，沉淀用冰冷的W5溶液轻柔洗涤，冰上放置30min； 10）23℃，100 g，离心1min，弃上清，每管沉淀用0.5ml MaMg重悬（本步骤及以下操作均在23℃）； 11）取约10-20ug质粒于2.0 ml EP管中，加100ul 制备好的原生质体，用剪去前端的200ul 枪头轻柔混匀； 12）加入110ul PEG/Ca溶液，轻柔混匀，23℃静置5-30min； 13）加入800 ul W5 溶液，轻柔的颠倒混匀，23℃，100 g，离心1min； 14）弃上清，加100ul W5，混匀，再次再加100ul W5，混匀； 15）上述混合液体置于恒温加热器中，23℃，避光，孵育6-18小时。 16）荧光观察，观察之前轻柔混匀，吸取观察物所用的枪头必须剪去前端。

细胞培养的注意事项

相关疾病: 每天对待细胞比孝敬爹妈还用心,那真就是捧在手里怕碎了,含在嘴里怕化了,瞧在眼里怕丢了,培养细胞时有哪些惨痛经验教训可以分享呢? ?早走早脱身,从此专注黑生物??１。严格无菌操作,多喷喷酒精,要就是对灭菌得东西不放心,自己包自己送自己烘干。 ?２.不要与别人共用试剂耗材,自己准备一套。 ?３、有可能得话在拿到新细胞得时候做好支原体衣原体检测。??4。水浴锅很脏,生化培养箱要就是得手动加湿得话盘里得水也会很脏,勤换(灭菌水加进去)。 5、晚上离开得时候最好给细胞房照紫外,超净台就是用完就开、?? 6、最好得就是同一时间就您一个人在用细胞房在养细胞。? 非科班出身经验分享 1、别怕浪费。枪头什么得只要有可能污染就换,如果用酒精灯就什么都稍微烤一下,别直接放到火上,离一段距离、? 2、动作要既轻柔又有力。动作太重会有一堆一堆得气泡,动作太轻就吹不下来.。、刚开始得时候吹细胞太痛苦了,稍微一下就起泡。后来就就是吹得时候枪里得培养基不要一次全都压出来,留一点,枪得最头部尽量深得在液面以下。??3。离开过操作台得东西再进操作台之前一定要用酒精喷一遍,包括一切实验耗材、仪器、以及您带着手套得手。??４。实验结束后对实验台得消毒、紫外什么得,用前用后都照个3０分钟、? 5。身体得各个部分尽量得少接触不需要接触得地方得地方、比如实验台,又比如培养箱内部。 ?6、细胞得密度根据细胞得性质、传代得时间以及自己得心情来定。培养基得话最多最多不要超过２天就要换一次。细胞可以不传代,但就是培养基就是一定要换得。 大概就就是,不该碰得地方不碰,有影响得地方少碰; 该使劲得时候绝对不含糊,不该使劲得地方一定忍住、如果就是比较简陋得操作台就一定要摆个酒精灯,所有操作紧密围绕在酒精灯周围进行。如果就是高级台子就多用酒精喷喷。感觉生物得实验,心疼钱就还就是不要做了。 最后一点点绝对非科班得经验。癌细胞真就是坚挺。有一次实在就是不想传了,放了5天吧,感觉都长了几层出来,培养基都黄了。抱着试一试得心情传了一次,又坚强得活过来了。当然,状态肯定也差得很了。? 换种心情,好好生活! 养了三年细胞,各种肿瘤细胞,说一点自己得瞧法: ?１。培养细胞前,可以瞧瞧细胞特点说明书,包括细胞正常生长得状态图、传代、培养 2. 不同细胞生长周期不同,有得生长很快,比如说MＤA-MB—2３1,传代基得类型等。?? 得时候取离心悬液得十分之一就已经足够了,有得又就是特别慢,等得人心焦,BT474就就是,传代就是一分二,复苏起始得时候两周多才能长满,所以就要在培养细胞得过程中多多摸索了。? 3、对于娇弱得细胞,就得细心呵护了,胰酶消化不能过久,吹得时候要轻柔,离心时候也要注意转速与时间,每天都要去瞧一下细胞,肉眼观察培养基状况、显微镜下观察细胞生长状况。?