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病毒性疫苗制造技术
任务一灭活苗的制造流程
菌种的选择（强毒株) → 菌液培养→ 灭活
↓↓
配苗（5份菌液+1份铝胶配苗) ←浓缩
工序一菌种与种子培养
选取毒力强、免疫原性好的1～3个品系菌株，按规定定期复壮和鉴定，将合格菌种增殖培养并经无菌检验、活菌计数达到标准后作为种子液。种子液保存于2～8℃冷暗处，在有效期内用于菌苗生产种子使用。大肠杆菌病的菌种应采集动物心血、腹水、肝渗出物、气囊附着物或正常动物的肠道内容物作为接种物。如用含大肠杆菌的病料，首先对大肠杆菌进行分离、鉴定，符合要求方可作为菌种使用。
工序二菌液的培养
用于规模化细菌培养的方法很多，有手工式、机械化或自动化等方式。可供菌体培养的方法有：固体表面培养法、液体静置培养法、液体深层通气培养法和透析培养法。一般固体培养易获得高浓度细菌悬液，含培养基成分少，易稀释成不同的浓度，但生产量较小。因此，大量生产疫苗时常用液体培养法。
实例大肠杆菌的菌液培养方法
(1)．将生化结果典型的菌种接种于伊红美兰琼脂平板或麦康凯琼脂平板上，置37℃温箱中培养18～24h，挑取单个典型菌落接种于琼脂斜面，置37℃温箱中培养18～24h，经显微镜检查无杂菌污染者，即可作为种子培养物。
(2)．取5ml马丁肉汤加入琼脂斜面洗下菌苔作为一级种子，用灭菌吸管按5%的量将一级种子接种于马丁肉汤中，置37℃培养18～24h后作为二级种子。
(3)．二级种子可以接种到营养琼脂培养基或马丁肉汤中做进一步扩大培养。如接种到营养琼脂培养基表面，37℃培养24～48h后，加入灭菌生理盐水，用灭菌接种环或特制的刮子将菌苔刮下，倾入灭菌的离心管中，低速离心5min (500r/min)，使其中可能掺杂的琼脂块下沉。吸取上层细菌悬浮液加入盛有玻璃珠的灭菌瓶中，用手或振荡器振荡30min，使细菌均匀分散,取少量菌液装于灭菌试管中供计数用，其余细菌将灭活(强毒细菌须在杀菌后，再行计数)。如接种于马丁肉汤培养基，经37℃培养24～48h后，直接取少量菌液供计数用，其余细菌则灭活。
工序三菌数计算
采用活菌计数法或比浊计数法，以概略地计算出每毫升菌液中的细菌总数。
工序四灭活与浓缩
对大肠杆菌菌液应加入0.5％甲醛溶液，置37℃温箱作用48～72h，以达到杀死细菌的目的。灭活后需对菌液进行浓缩，常用的浓缩方法有离心沉降法、氢氧化铝吸附沉淀法和羧甲基纤维沉淀法。可使菌液浓缩1倍以上。
工序五配苗与分装
配苗就是在菌苗的制备过程中加入佐剂，以增强免疫效果。由于灭活菌苗所用的佐剂不同，所以配苗方法也不同。例如,大肠杆菌氢氧化铝菌苗细菌计数所得原菌液的浓度，用灭菌生理盐水将其稀释成最终浓度为100亿～400亿个/ml。按每5份菌液加入1份氢氧化铝胶配苗，同时加入0.01%硫柳汞，充分振荡，置2～8℃静止2～3d，抽弃上清液，浓缩成全量的60%。塞上胶塞，用固体石蜡溶化封口，贴上标签，注明菌苗名称。使用前充分摇匀。,整个制备过程都必须在无菌条件下按照无菌操作进行
介绍常用灭活剂
1.甲醛
甲醛是最古典的、也是应用最广的一种灭活剂。为无色气体，易溶于水和乙醇，其36％～40％水溶液称为福尔马林。
甲醛用于疫苗灭活的浓度为0.1％～0.5％。一般需氧细菌用0.1％～0.2％的浓度，厌氧菌则多用0.4％～0.5％的浓度。病毒可在0.05％～0.4％的之间，多数使用0.1％～0.3％。
2.苯酚又称石炭酸。为无色结晶或白色熔块，有特殊气味，有毒及腐蚀性，易潮解，溶于水及有机溶剂。置于空气中易被氧化，应避光保存。
灭活机制是使微生物的蛋白质发生变性和抑制特异酶系统（如脱氨酶、氧化酶等）的活性，从而导致微生物死亡。制作生物制品的常用浓度为0.3％～0.5％。
3.β-丙内酯又名为羟基丙酸-β-内酯，性状为不稳定，无色，有刺激气味的液体，是一种良好的病毒灭活剂。
β-丙内酯的灭活机制是破坏病毒的核芯，但不损害衣壳蛋白，因此能保持病毒良好的免疫原性，主要用于狂犬病灭活苗的制备。
4.结晶紫是一种带有金属光泽的绿色结晶或深绿色结晶状粉末的碱性染料，易溶于醇、氯仿，不溶于水和醚。
灭活机制主要是它的阳离子与微生物蛋白质的羧基形成带弱电的化合物，妨碍了微生物的正常代谢，扰乱微生物的氧化还原作用，使电势太高而不适于微生物的增殖，对革兰氏阳性菌主要是干扰细胞壁肽聚糖的合成。
5.硫柳汞又称乙基汞硫代水杨酸钠，为无色结晶或乳白色粉末，微有特殊气味，易溶于水和乙醇，不溶于乙醚和苯，应避光保存。用于生物制品的防腐和消毒，对霉菌、细菌和病毒都有一定的灭活作用。常用浓度为0.01％～0.02％。
6.烷化剂是含有烷基的分子中去掉一个氢原子与另一种化合物作用，将烷基引入，形成烷基取代物。其灭活机制是烷化微生物DNA、RNA分子中的鸟嘌呤或腺嘌呤，引起单链断裂、双链交联，也可与酶系统和核蛋白起作用，破坏核酸代谢、合成，使病毒丧失感染力，但不损害蛋白衣壳，从而保留其抗原性。这类烷化剂常用的有N-乙酰乙烯亚胺、二乙烯亚胺及缩水甘油醛等。
介绍常用的免疫佐剂
(一)免疫佐剂的概念
免疫佐剂又称佐剂，是指单独使用没有免疫原性，与抗原物质合并使用能非特异性地改变或增强机体对该抗原的特异性免疫应答，发挥其辅佐作用的一类物质。其作用特点是：①对某些分子的相对质量小的多糖或多肽等抗原性微弱的物质，可明显增强其抗原性；②可用最小的抗原量、最少的接种次数，刺激机体产生足够的免疫应答和高滴度的抗体，在血流中或黏膜表面维持较长时间，发挥持久作用。
(二)常规免疫佐剂
1.铝盐类佐剂
(1)．氢氧化铝胶简称铝胶。铝胶可用制造多种兽用疫苗。
(2)．明矾
(3)．磷酸三钙
2.弗氏佐剂
弗氏不完全佐剂是由3份液体石蜡油、1份无水羊毛脂、4份磷酸缓冲盐水（pH7.2）混合而成。制造时，先将各成分混合均匀，116℃高压灭菌30min，冷却后加入1％吐温-80混匀，使用时与抗原物质等量混合。
弗氏完全佐剂是在不完全佐剂中加入杀死的分枝杆菌或卡介苗，按l～2mg／ml的量加入，使用时与抗原物质等量混匀。
3.油乳佐剂
油乳佐剂是指一类由油类物质和乳化剂按一定比例混合形成的佐剂。
4.蜂胶佐剂
蜂胶是由蜜蜂上颚腺的分泌物和由蜜蜂采自柳树、杨树、栗树和其他植物幼芽分泌的树脂以及蜂蜡、花粉等组成。
5.微生物佐剂
(三) 新型免疫佐剂
1.细胞因子类佐剂
白细胞介素-1（IL-1）、白细胞介素-2（IL-2）、白细胞介素-4（IL-4）
白细胞介素-12（IL-12）γ-干扰素。
2.免疫刺激复合物(ISCOM)佐剂
任务二活疫苗的制造流程
弱毒疫苗的制造流程
菌种与种子→菌液培养→浓缩→配苗与冻干
工序一菌种与种子。
弱毒菌种多是冻干制品，在使用前应按规程规定进行复壮、挑选，并作形态、免疫原性等鉴定，合格后将菌种接种于规定的培养基进行增殖培养，经纯粹检查及有关的检查合格者即作为种子液。种子液保存在0～4℃，有效期2个月。在保存期内用作菌苗生产的批量种子使用。工序二菌液培养。
按培养基1%～3%的比例接入种子液，依不同菌苗的要求制备菌液。如猪丹毒弱毒苗在深层通气培养中要加入适当植物油作消泡剂，并通入过滤除菌的热空气。菌液于0～4℃暗处保存，经抽样无菌检验、活菌计数合格后使用。
工序三浓缩。
经上述检验合格的菌液进行浓缩，其目的是提高单位活菌数，进而提高某些弱毒菌苗的免疫效果。常用的浓缩方法有吸附剂吸附沉降法和离心沉降法。浓缩菌液应抽样作纯粹检验、无菌检验及活菌计数。
工序四配苗与冻干。
将检验合格的菌液按比例加入冻干保护剂（如5%蔗糖脱脂乳）配苗，充分摇匀后立即分装。随后将菌苗迅速放入冻干柜预冻和真空干燥，并立即加塞、抽空、封口，移入冷库保存后由质检部门抽样检验
介绍常用的冻干保护剂
（一）冻干保护剂的组成和分类
1．低分子物质又称为营养液，是一种均匀的混悬液，使微生物保持稳定的存活状态及对水分子起缓解作用，使冻干生物制品保留一定量水分，促进高分子物质骨架形成，使冻干制品呈多孔的海绵状，从而增加溶解度。如糖类和氨基酸类（谷氨酸、天门冬氨酸、精氨酸、赖氨酸）等。
2．高分子物质又称为赋型剂，在冻干生物制品中主要起骨架作用，防止低分子物质的碳化和氧化；保护活性物质不受加热的影响；使冻干制品形成多孔性、疏松的海绵状物，从而使溶解度增加。高分子物质范围很广，种类甚多。如白蛋白、血清、明胶、脱脂乳、各种液体培养基、淀粉、酵母浸膏、聚乙烯吡咯烷酮和羧甲基纤维素等。
3．抗氧化剂具有抑制冻干制品中酶的活化作用，从而促进、保持微生物等活性物质的稳定性。抗氧化剂包括一些有机物质和无机物质，如维生素C、维生素E、硫脲、碘化钾、钼酸铵和硫代硫酸钠等。
(二)、冻干保护剂分类
1.根据冻干保护剂的化学性质分类
可分为复合物、糖类、盐类、醇类、酸类、碱类、聚合物等
2.根据冻干保护剂的作用机制分类⑴．渗透剂⑵．非渗透剂
(三)常用的冻干保护剂
1．5％蔗糖脱脂乳保护剂
2．脱脂乳-谷氨酸钠保护剂
3．7.5％葡萄糖血清保护剂
4．环乙醇-血清保护剂
5．喷雾干燥用保护剂
（四）不同微生物适用的保护剂
1．需氧和兼性厌氧菌可用5％蔗糖脱脂乳，或含1％谷氨酸钠的10％脱脂乳，或l0％脱脂乳与犊牛血清，或5％蔗糖，或1.5％明胶等。
2．厌氧菌可用10％脱脂乳，或7.5％葡萄糖加血清，或用含0.1％谷氨酸钠的10％乳糖等。3．病毒可用明胶、血清、蛋白胨、乳糖、蔗糖、山梨醇和聚乙烯吡咯烷酮等，也可加入脱脂乳，或者几种成分混合配成保护剂。
4．支原体可用3％脱脂乳加5％葡萄糖混合液，或1％牛血清白蛋白，或50％健马血清，或7.5％葡萄糖加血清等。
5．立克次体常用10％脱脂乳。
6．酵母菌可用健步马血清，或7.5％葡萄糖加血清，或脱脂乳加谷氨酸钠和蔗糖等。
任务三类毒素的制造流程
类毒素的制造流程
菌种与毒素→脱毒→类毒素的精制
工序1菌种与毒素
应选用中监所分发或批准的产毒效价高、免疫力强的菌株，必要时可对菌种进行筛选。菌种应定期作全面性状检查（如细菌形态、纯化试验、糖发酵反应、产毒试验及特异性中和试验等），并有完整的传代、鉴定记录。菌种应用冻干或其他适宜方法保存在2～8℃。选择适宜的培养基制造种子菌及毒素。毒素制造过程应严格控制杂菌污染，经显微镜检查或纯化试验发现污染者应废弃。毒素须经除菌过滤后方可进行下一步制造程序，亦可杀菌后进行精制。工序2脱毒
目前采用最可靠的脱毒方法仍是甲醛溶液法，温度控制在37～39℃，终浓度控制在0.3%～0.4%。脱毒后的制品即成粗制的类毒素。经检验合格者，置2～8℃保存，有效期可达3年。工序3类毒素的精制
用人工培养法所制得的粗制类毒素液含有大量的非特异性杂质，而毒素含量较低。因此，有必要对类毒素进行浓缩精制，以获得纯的或比较纯的类毒素制品。
（1）物理学方法可用冷冻干燥、蒸发、超滤、冻融等方法除水浓缩；也可用氧化铝和磷酸钙胶等固相吸附剂吸附。
（2）化学沉淀法有酸沉淀法（盐酸、硫酸、磷酸、三氯醋酸等）、盐析法（硫酸盐、硫酸钠及磷酸盐缓冲液等）、有机溶剂沉淀法（甲醇、乙醇及丙酮等）和重金属阳离子沉淀法（Mg2+、Ca2+、Zn2+、Ba2+等，其中以氯化锌应用最广）。
（3）层析法有凝胶过滤和离子交换层析法。
类毒素精制后应加终浓度0.01%硫柳汞防腐，并尽快除菌过滤。保存于2～8℃，有效期为3年。
实例猪链球菌蜂胶苗制备
1．材料与试剂
（1）器材：粉碎机或垫板和锤头.研磨器.量筒.玻璃棒.离心机.吸管等。
（2）试剂：95%酒精
2．蜂胶佐剂疫苗制备方法
（1）蜂胶的处理：
①用市售蜂胶，放4℃以下低温贮存，制备前用粉碎机或垫板和捶头在4-8℃下粉碎。
②过筛，按1：4加入95%乙醇，室温浸泡24-48h。
③冷却，过滤或离心取上清液，即得透明栗色纯净蜂胶浸液。
④除去干渣，计算出浸液中蜂胶含量，浸液置4℃以下保存备用。
（2）链球菌的培养
①将至病性链球菌接踵于普通肉汤培养基中，37℃震荡培养至细菌生长饱和状态。
②将菌液3000rpm 离心20min，弃去上清液，沉淀物用灭菌生理盐水或PBS液稀释至所需浓度，同时要求纯粹生长。
③将菌液灭活：在菌液中缓慢加入终浓度为0.5%的甲醛溶液，边加入变搅拌，使之完全混匀，置37℃灭活24h。
（3）蜂胶佐剂疫苗的制备：
在灭活菌液中加入蜂胶乙醇浸液，使每毫升菌液中喊蜂胶10mg，边加边摇荡，迅即成为乳浊状，即为蜂胶佐剂疫苗。
（4）疫苗的检验
自制菌苗的检验主要为安全检验，取注射计量的5-10倍的剂量注射实验猪，猪在注射后应无异常反应，或反应很轻微。
任务四几种主要细菌性疫苗的制作
实例1布鲁氏菌19号活疫苗的制作
（1）菌种制苗菌种为牛种布鲁氏菌弱株A19，其生物学特性典型。
（2）制备工序
工序1种子繁殖冻干菌种接种于胰蛋白琼脂平板培养基上,于36-37℃培养2-3d,选取典型菌落,再次接种于胰蛋白琼脂平板营养48-72h,作为种子.
工序2菌液培养按培养基总量的1%-2%将种子液接种于马丁肉汤,在 36-37℃下通气培养36h 期间于第12h、20h、28h分别按培养基总量的 1%-2%加入50%葡萄糖溶液。纯粹检验合格。工序3浓缩与配苗将菌液用PH6.3-6.8缓冲生理盐水稀释成120亿-160亿个/ml,无菌分装即为湿苗,若制冻干苗,按总量的 0.2%_0.4%加入羧甲基纤维素钠,浓缩沉淀菌体.浓缩的菌液纯粹检验及活菌计数合格后,加入PH7.0的蔗糖明胶稳定剂进行配苗,定量分装,迅速冷冻真
空干燥.
实例2仔猪大肠杆菌三价灭活苗制作
（1）菌种制苗用菌种为C83549.C83644.C83710菌株,检验用菌种,检验用菌种为 C83902
C83912 C83917菌株.要求用相应的 K88 K99和987P因子血清做平板凝集反应,达到强阳性反应.
（2）制备工序
工序1种子繁殖将各株冻干菌种接种改良Minca汤中培养后,用改良Minca琼脂平板划线分离,选取典型菌落若干,分别用相应的 K88 K99和987P因子血清逐个做平板凝集反应,选取强阳性反应菌落,接种改良Minca汤中培养,作为一级种子.取一级种子按上述方法繁殖,革兰氏染色镜检后 ,无杂菌者作为二级种子.
工序2菌液制备将二级种子进行连续通气培养,搅拌速度为600r/min，通气量大于1：1，第一代通气培养7h，取样检验合格，即收获，并按加入培养基的3%-5%留有种子，然后加入培养基，通气培养6-7h，再收获，如此循环培养，但最多吧超过10代。培养温度为36-37℃，0.01%花生油为消泡剂。
工序3配苗与分装按总量加入20%氢氧化铝胶，最后补加PBS和 0.01%硫柳汞，每1ml成品苗中应含有K88100个抗原单位、K99 50个抗原单位、987P50个抗原单位、菌种≦200亿个。经无菌检验合格后，进行混合、分装。
实例3猪丹毒灭活疫苗
本疫苗是用免疫原性两好的B型猪丹毒杆菌，接种于适宜培养基中培养，培养物经甲醛溶液灭活后，加氢氧化铝胶浓缩后制成。用于猪丹毒的预防。皮下或肌肉注射，体重在10kg以上
的断奶猪5ml；未断奶仔猪3ml，间隔1个月后，再注射3ml，注射后多无不良反映，但有时注射部位出现硬结，可逐渐消失。免疫期为6个月。
活疫苗国内猪丹毒弱毒疫苗使用菌株很多，目前，我过猪丹毒弱毒疫苗生产中
广泛使用是GC
42和G
4
T
10，
两个菌株。
实例4猪丹毒GC
42
活疫苗
将GC
42
弱毒菌株接种与明胶平板上进行培养，选取呈分支状生长的典型菌落，接种在血液琼
脂斜面上培养作为菌种。制苗时再将斜面培养物接于肉肝肠膜消化汤。37℃培养20h将培养物作为种子液，按1%接种于含2%血清或裂解红细胞全血的肉肝肠膜消化汤，35-37℃培养20h 经菌数计算和纯粹检验后，7份菌液与1份明胶蔗糖保护剂混合分装冻干即成。分头份活菌
GC
42
应不低于7亿个.安全检疫用小白鼠应全部健活.-15℃保存,有效期1年;2-8℃保存,有效期9个月.使用时,按瓶签标定的头份加入20%铝胶生理盐水稀释溶解,每头猪皮下注射1ml,疫苗
稀释后,限4h内用完, GC
42
疫苗亦可用于口服,口服时剂量加倍,口服前应停食4h,免疫后7-9天产生免疫力.断奶猪免疫期可达6个月.
任务五细菌性疫苗生产中的主要设备
仪器设备:超净工作台恒温培养箱灭菌平板灭菌试管培养病毒的方法:动物培养,组织培养,细胞培养
任务一病毒性组织疫苗的制备
流程：动物选择→ 种毒与接种→观察与收获→制苗
工序1动物选择
动物质量对组织疫苗的质量有着直接影响，特别是对疫苗的安全性和效力有着决定性的作用。所选择的动物应是SPF动物，对所接种的病毒易感性高，在品种、年龄和体重等方面应合乎要求。
工序2种毒与接种
种毒既可用强毒株的脏器组织毒或增菌培养物，也可用弱毒株的组织毒。无论何种种毒都必须经纯粹性、抗原性等检查合格后使用。无疑，生产不同批次的疫苗也可使用同一批检验合格的种毒批，以减少疫苗批次间的质量差别。
将检验合格的种毒接种到动物体内进行病毒的增殖培养。种毒的接种途径依病毒性质和目的而异。如猪瘟结晶紫疫苗，采取猪肌肉注射血液毒种；牛瘟兔化弱毒疫苗，以兔耳静脉注射脾、淋巴结毒种；狂犬病疫苗，用兔脑毒种接种绵羊脑内感染。
工序3观察与收获
动物在接种毒种后应每天观察和检查规定的各项指标，常规检查的项目有食欲、精神、活动状态、体温、粪尿和血液变化等。根据观察和检查的结果选出符合要求的发病动物，按。规定方式剖杀，采取、收集含毒量高的器官组织，用于制备疫苗。如兔出血症组织灭活疫苗采集病兔肝脏生产，猪瘟结晶紫疫苗采取发病猪的血液制备，狂犬病疫苗利用发病羊的羊脑组织制造。
工序4制苗
（1）组织灭活疫苗收获的含毒组织经无菌检验及毒价测定合格后按规定比例加入平衡液和灭活剂(甲醛、酚、结晶紫等)制成匀浆，然后按不同病毒的灭活温度、时间进行灭活。如猪瘟结晶紫疫苗配制，按血毒4份、结晶紫甘油溶液1份混合，于37～38℃减毒6～8d制成。（2）弱毒组织疫苗在无菌操作下剔除脏器上的脂肪与结缔组织等，
称重后剪碎，加入适量保护剂制成匀浆，然后过滤去除残渣，按实际滤过的组织液计算稀释倍数，加入余量保护剂即为原苗。原苗按100IU（μg）/ml加入青、链霉素，摇匀后置4℃作用一定时间，作无菌检验与毒价测定，合格者进行分装、冷冻真空干燥制成冻干疫苗。
病毒及其疫苗的生产制备技术
第25章病毒及其疫苗的生产制备技术 第一节病毒的生产制备 病毒需在活的敏感细胞中才能增殖，在细胞培养技术不成熟之前，人们为研究病毒，往往采用鸡胚接种或动物接种的方法来分离、鉴定病毒或制备一定量的病毒液，但这种方法因个体和种属差异，不仅许多病毒难以找到合适的敏感动物，而且即使在敏感动物中繁殖，往往个体差异大而影响结果的判定，随着细胞培养技术的发展，首先在病毒学研究方面获得了广泛的应用，为病毒的繁殖、鉴定提供了来自不同动物（包括人）、不同组织的细胞来源，通过敏感性筛选，目前绝大多数病毒均可有相应的敏感细胞，为病毒的分离、鉴定和增殖创造了条件。同时也为病毒的大量生产提供了细胞来源，随着细胞大量生产技术的发展，因此对病毒来说只要有敏感的细胞，就可以进行大规模生产。 一、病毒生产的目的和用途 1、为了制备大量的病毒抗原，以制备病毒的亚单位疫苗或表面抗原疫苗，或用病毒抗原制备免疫血清（抗体）。 2、为了制备病毒的减毒活疫苗或灭活的死疫苗，以用于预防接种。 3、为了生产基因改造后或重组有其它多肽因子的病毒，以用于基因治疗或杀肿瘤治疗及基因疫苗的预防接种。 4、为了制备干扰素的病毒诱生剂（NDV、仙台病毒等），用于干扰素的生产。 5、生物战用的病毒生物战剂。常选用毒力强、抵抗力强、对不同国家人群最敏感的病毒，又能通过气溶胶或昆虫和污染的水土进行传播的病毒。这是战争狂们正在开展的研究，应警惕。 二、病毒生产制备的方法 1、动物接种，如狂犬病毒、脑炎虫媒病毒采用鼠、兔脑内接种后收取脑组织制成悬液。 2、鸡胚、鸭胚接种：如流感病毒、副流感病毒（NDV-F）、仙台病毒等，目前尚无敏感细胞，常采用9～10日胚龄的尿囊腔接种，37℃孵育72小时收获尿液，用鸡红血球测定血凝效价。Q热用7日龄鸭胚进行卵黄囊接种收获卵黄囊，马脑炎病毒常采用10日龄鸡胚体接种，收获全胚体液等。 3、细胞培养法（详见第二篇第18章） 不同的病毒选用相应的敏感细胞，采用转瓶培养、多层培养、微载体培养或悬浮搅拌培养等方法,先大量增殖细胞，然后接种一定量的病毒,继续培养适当时间时，冻融细胞后，离心收获上清。 以上病毒大量生产后可制作病毒疫苗（死疫苗或减毒活疫苗），也可用来作干扰素诱生剂或提取病毒表面抗原成分，但反对用作生物战剂，危害人类健康和生命。 第二节病毒疫苗的生产制备 病毒疫苗的生产制备与病毒的生产制备基本相同，目前进行人工主动免疫，用于病毒病预防的疫苗有灭活疫苗（Killed Vaccine）,又称死疫苗，减毒活疫苗（Live Vaccine）,亚单位疫苗，多肽疫苗、基因缺失的减毒活疫苗，基因工程亚单位疫苗，重组牛痘多价疫苗。
国家科技支撑计划重点项目疫苗关键生产技术研究开发课题申报指引
附件2. “十一五”国家科技支撑计划重点项目“疫苗关键生产技术研究开发”课题申报指南 一、总体目标 本项目的总体目标是着力解决制约我国疫苗产业发展的关键生产技术，完善或建立疫苗关键性技术平台，发挥其示范作用，使我国疫苗大品种生产关键技术水平迈上新台阶，大幅度缩小与发达国家之间的差距。通过项目实施，提高紧缺疫苗大品种的产量，提高优势企业疫苗的质量，为疫苗行业的进一步集约化提供科技支撑；大力推动国际化进程，促进我国疫苗产品出口，提高我国疫苗产品在国际市场的占有率。 通过项目的实施，建立3-5个技术平台，突破5-10项关键技术，力争1-2个品种获得临床研究批件、2-3个品种获准换发生产文号，大幅度提高8-10种疫苗产品的产量，实现我国疫苗产业年销售收入新增8-10亿元。 二、实施年限 项目实施年限为2008年7月～2010年12月。 三、主要内容 课题1、细菌多糖-蛋白结合关键技术及其应用研究 1、研究内容
（1）研究多糖－蛋白质结合化学的适宜方法。利用具有代表性的Hib结合疫苗优化制备条件和结合物大规模纯化技术条件；优化Hib多糖衍生及多糖蛋白结合技术；解决Hib多糖活化、衍生，与载体蛋白结合过程中的条件优化，进行规模纯化层析条件的优化，最终使多糖-蛋白结合疫苗的产量提高，结合物原液质量指标稳定；建立Hib结合物原液、成品中结合物含量、成品中游离蛋白、游离多糖的快速、稳定的测定方法游离蛋白质和游离多糖含量的质量控制方法。 （2）细菌多糖蛋白质结合疫苗质量标准研究。主要包括多价结合疫苗和多联多价联合疫苗质量标准确立（多价疫苗中各种单价疫苗抗原含量检测，游离蛋白、游离多糖含量检测、多种抗原成分剂量、配伍研究，以及最低免疫剂量的确定等）。 （3）载体蛋白多样化研究。开发TT和DT以外的新载体蛋白质；对现有载体蛋白使用风险的评价，以及对新的载体进行安全性、有效性的全面评价研究，完成H21G、64K外膜蛋白、C5a 肽酶等新型载体蛋白的特性研究；以及探索这些新型载体蛋白与细菌多糖结合的方法或工艺。 （4）细菌多糖蛋白质结合疫苗效果评价方法建立。包括： ①标准参考物质的制备； ②抗体含量检测方法建立与标准化； ③抗体功能活性检测方法建立与标准化。 2、考核指标 (1)技术指标
病毒性肝炎
病毒性肝炎 一、概述 ●多种肝炎病毒引起 ●以肝脏炎症和坏死病变为主的一组常见传染病 ●临床表现基本相似、症状多样化（乏力、食欲减退、肝区痛、肝大、肝功异常） ●甲、戊型肝炎为急性肝炎。乙、丙、丁型主要为慢性肝炎 ●重型肝炎病死率高 ●目前缺乏特效治疗方法 ●目前甲、乙型肝炎有特异的预防方法（疫苗接种） 二、问题 1)流行病学特点如何？ 2)肝炎病毒标记物（乙肝两对半）的临床意义？ 3)临床特点？ 4)肝炎的诊断思路、鉴别诊断要点？ 5)抗病毒治疗的目标、指征、方法？ 6)重型肝炎治疗的思路？ 7)病毒性肝炎的预防方法？ 三、病原学 ●HA V RNA ●HBV DNA ●HCV RNA ●HDV RNA ●HEV RNA ●HGV RNA 1996 USA ●TTV DNA 1997 J 四、几种肝炎病毒的共同特点 1)除HBV和TTV属DNA病毒外，其余均属RNA病毒； 2)除HBV有3个抗原抗体系统外，其余只有一个抗原抗体系统； 3)HA V和HEV在肝细胞内复制，通过胆汁从粪便排出； 4)抵抗力较强，耐冷、耐干燥、一般浓度消毒剂无效。 五、【病原学】 （一）甲型肝炎病毒（HA V） 1.病毒分类：HA V属于微小RNA病毒科（picornavirus）,嗜肝RNA病毒属（heparnavirus）。 2.基因结构：单股RNA 3.抵抗力：较强。在水、泥土、贝壳类动物中存活数月。 4.抗原抗体系统：抗HAV lgM：急性感染标志，临床诊断检查 抗HA V lgG：保护性抗体，流行病学调查意义 5.分子生物学标志：HA V-RNA（血、粪） （二）乙型肝炎病毒（HBV） 1.归类：嗜肝DNA病毒（Hepadnavirus）科 2.形态和结构：HBV颗粒（Dane颗粒），42nM。 （1）胞膜：HBsAg在肝细胞内合成，释放到血液循环中。本身无传染性，但有抗原性。（2）核心：有HBV DNA、DNA聚合酶、核心抗原、E抗原。 HBV感染后病毒在体内存在形式：
生产病毒和制备病毒疫苗的常用方法.doc
生产病毒和制备病毒疫苗的常用方法 (一)制备工艺流程 （1）脊髓灰质炎病毒活疫苗制备工艺 | |猴肾细胞培养 | ←接种病毒（测0%正常细胞对照） | 收获病毒，合并，加MgCl2→ | | 无菌试验→ | ←猴病毒检查（获肾细胞）（SV40） | B病毒检查（兔肾细胞）→ | ←病毒效价滴定 | |←合并，过滤加MgCl2 | | ←无菌试验 | 分亚批→ | ←柯萨奇病毒检查（乳鼠） | 病毒滴定→ | ←型特异性检查 | B病毒复检（家兔）→ | ←T特征试验 | 分装病毒滴定→ | ←猴体残余致麻痹力试验 | （安全试验）病理切片 | 结核杆菌检查→ | | 分装→ | ←无菌试验 | 病毒滴定→ | → 保存于-20℃待检定合格后 加工糖丸 2、流行性乙型脑炎病毒死疫苗制备工艺 地鼠肾 剪碎，胰酶消化
地鼠肾细胞悬液 37℃,3天细胞培养液，pH7.0～pH7.2 单层细胞 洗涤细胞，去除牛血清 10-4～10-5浓度病毒感染细胞 32～34℃培养2～3天 收获病毒液（收二次） 按1:2000加入甲醛 22℃，8天 灭活病毒液 合并，安全及效力试验 原液 加入亚硫酸氨钠 半成品 分装 成品 检定(包括理化性质，无菌试验、安全试验， 防腐剂、试剂及残余牛血清含量等） 合格成品 (二)生产方法： 病毒和病毒疫苗的生产方法基本相同，其规模取决于细胞生产规模，因此上述介绍的细胞大量生产的方法和工艺均可用来生产病毒和病毒疫苗，可根据需要及适宜生产条件来选用培养装置，如转瓶培养，因设备简单，便于生产单位采用。而多层培养，微载体培养，目前国外已用于生产，我国仍在研究中。悬浮搅拌培养的简易装置已应用于疫苗生产，全自动悬浮发酵罐，在干扰素生产中有应用，但在疫苗生产中正在试用，下面着重介绍微载体培养法生产病毒的技术。 1、微载体悬浮培养细胞的病毒生产工艺 作者选VSV病毒来接种经微载体培养的敏感细胞，病毒的效价测定用A549细胞（也可用Wish或Hep-2细胞或鸡胚纤维母细胞测TCID50），病毒的效价为6 Log TCID50/m L，用鸡胚细胞空斑法测定一般为107Pfu/mL。 ①VSV在方瓶贴壁细胞中的增殖（100mL方瓶，10mL培养基）待BHK21、BHK13、CHO-K1细胞长满单层，弃上清加入10-2VSV病毒悬液0.2ml，37℃吸附1小时，加病毒维持液培养20小时，于-30℃冻存，待测效价。 ②VSV在微载体悬液培养的细胞中增殖。 微载体培养的BHK21或BHK13、或CHO-K1细胞，
病毒性肝炎
病毒性肝炎题库 一、单选题 3、对HBeAg阳性母亲生下的新生儿预防处理，最好的方法是:（D） A·丙种球蛋白 B·乙肝疫苗C·高效价乙肝免疫球蛋白 D·乙肝疫苗十高效价乙肝免疫球蛋白 E·乙肝疫苗十丙种球蛋白 4、某医务工作者在给一HbeAg阳性患者采血时，不小心刺破手指，下列哪项处理最 为重要:（D） A·立即酒精消毒 B·接种乙肝疫苗 C·肌注高效价乙肝免疫球蛋白 D·肌注高效价乙肝免疫球蛋白，接种乙肝疫苗 E·定期复查肝功能和HBV-IgM 5、当患者血清中只有抗-HBs、抗-HBc、抗-HBe阳性时应考虑:（D） A·急性乙型肝炎 B·慢性乙型肝炎 C·重型肝炎 D·急性乙型肝炎恢复期 E·乙肝病毒慢性携带者 6、关于HBV-DNA的描述哪项是正确的:（D） A·HBV-DNA是单链环状DNA B·HBV-DNA是双链线状DNA C·游离型HBV-DNA是指血清中除HBV颗粒以外形式存在的游离HBV-DNA D·整合到肝细胞基因组中的HBV-DNA称整合型HBV-DNA E·和HBsAg一样，HBV-DNA阳性只代表有HBV感染，与病毒的复制无关7、有关HAV感染与基因变异的概念，哪项是错误的:（B） A·HAV可分为4个基因型 B·与基因型相对应也有4个血清型 C·HAV感染后可刺激抗体产生特异性IgM和IgG抗体 D·IgM抗体仅存在于感染后6个月之内是近期感染标志 E·IgG抗体可保存多年，是过去感染的标志 10、下述哪项不是HBV的结构成分:（C） A·HbsAg B·HbcAg C·HbeAg D·HBV-DNA E·HBV-DNAp 11、HBV X区基因可编码的抗原是:（D） A·HbsAg B·HbcAg C·HbeAg D·HbxAg E·HBV-DNAp 12、HBV感染最早出现的血清学标志物是:（A） A·HbsAg B·抗-HBs C·HbeAg D·抗-Hbe E·抗-HBc 13、针对HBV的特异性抗体申具有免疫保护作用的抗体是:（A） A·抗HBs B·抗HBc C·抗Hbe D·抗HBx E·抗PreS 1 14、代表HBV复制的血清学指标是:（C） A·抗HBs B·抗Hbe C·HbeAg D·HbsAg E·抗PreS 2 15、HBeAg是HBV活动性复制和有传染性的重要标记是因为:（B） A·HBeAg是HBV的核心成分 B·它与DNAp和HBVDNA密切相关 C·仅见于HBsAg时阳性血清中 D·在血清中持续时间较HBsAg为长 E·HBeAg阳性者容易转为慢性 16、下述抗HBe阳性时的临床意义描述错误的是:（E） A·急性自限性肝炎时，与抗HBs同时出现，表现HBV复制减少
细菌性疫苗制造技术
细菌性疫苗制造技术 任务一灭活苗的制造流程 菌种的选择（强毒株) → 菌液培养→ 灭活 ↓ ↓ 配苗（5份菌液+1份铝胶配苗) ← 浓缩 工序一菌种与种子培养 选取毒力强、免疫原性好的1～3个品系菌株，按规定定期复壮和鉴定，将合格菌种增殖培养并经无菌检验、活菌计数达到标准后作为种子液。种子液保存于2～8℃冷暗处，在有效期内用于菌苗生产种子使用。大肠杆菌病的菌种应采集动物心血、腹水、肝渗出物、气囊附着物或正常动物的肠道内容物作为接种物。如用含大肠杆菌的病料，首先对大肠杆菌进行分离、鉴定，符合要求方可作为菌种使用。 工序二菌液的培养 用于规模化细菌培养的方法很多，有手工式、机械化或自动化等方式。可供菌体培养的方法有：固体表面培养法、液体静置培养法、液体深层通气培养法和透析培养法。一般固体培养易获得高浓度细菌悬液，含培养基成分少，易稀释成不同的浓度，但生产量较小。因此，大量生产疫苗时常用液体培养法。 实例大肠杆菌的菌液培养方法 (1)．将生化结果典型的菌种接种于伊红美兰琼脂平板或麦康凯琼脂平板上，置37℃温箱中培养18～24h，挑取单个典型菌落接种于琼脂斜面，置37℃温箱中培养18～24h，经显微镜检查无杂菌污染者，即可作为种子培养物。 (2)．取5ml马丁肉汤加入琼脂斜面洗下菌苔作为一级种子，用灭菌吸管按5%的量将一级种子接种于马丁肉汤中，置37℃培养18～24h后作为二级种子。 (3)．二级种子可以接种到营养琼脂培养基或马丁肉汤中做进一步扩大培养。如接种到营养琼脂培养基表面，37℃培养24～48h后，加入灭菌生理盐水，用灭菌接种环或特制的刮子将菌苔刮下，倾入灭菌的离心管中，低速离心5min (500r/min)，使其中可能掺杂的琼脂块下沉。吸取上层细菌悬浮液加入盛有玻璃珠的灭菌瓶中，用手或振荡器振荡30min，使细菌均匀分散,取少量菌液装于灭菌试管中供计数用，其余细菌将灭活(强毒细菌须在杀菌后，再行计数)。 如接种于马丁肉汤培养基，经37℃培养24～48h后，直接取少量菌液供计
病毒性肝炎防治知识归纳总结
病毒性肝炎防治知识归纳总结 一、基本知识 1、什么是病毒性肝炎？ 病毒性肝炎是由多种肝炎病毒引起的常见传染病，具有传染性强、传播途径复杂、流行面广泛，发病率较高等特点，肝炎病毒通常分为甲、乙、丙、丁、戊型。以疲乏、食欲减退、肝肿大、肝功能异常为主要表现，部分出现黄疸，无症状感染常见。 甲肝和戊肝多为急性发病，预后良好；乙肝和丙肝感染易发生慢性化，危害较大，感染是年龄越小，越容易慢性化；丁肝病毒只有与乙肝病毒同时或在乙肝病毒感染的基础上才可能感染。 2、我国肝炎现状与挑战 我国是病毒性肝炎的高发地区，发病率高。2010年我国报告病毒性肝炎病例近132万例，死亡884例，位居传染病发病之首，其中乙肝占所有肝炎病例的80%。 2006年全国乙型肝炎血清流行病学调查结果：1-59岁人群HBsAg 携带率为7.18%，15岁以下儿童HBsAg 携带率为2.08%，与1992年全国病毒性肝炎血清流行病学调查结果相比，我国1～59岁人群HBsAg阳性率下降了2.5百分点，15岁以下儿童下降更明显，下降7～8个百分点。特别是4岁以下儿童携带率已降低0.96%，达到发达国家水平。 根据2006年中国疾病预防控制中心开展的乙肝血清流行病学调查结果估计，全国约有9300万乙肝病毒感染者，每年因该病所致的
直接经济损失至少5000亿人民币。卫生部将乙肝列为重点控制的传染病。 3、肝炎的传播途径 甲肝和戊肝主要经粪-口途径传播，水源或食物被污染可引起暴发流行，也可经日常生活接触传播。 乙肝、丙肝的传播途径包括：血液传播（输血及血制品以及使用污染的注射器或针刺等）；母婴垂直传播；性接触传播。丁肝的传播途径与乙肝相同，但与乙肝病毒同时或在乙肝病毒感染的基础上才可能感染。 二、病毒性肝炎的预防 1、疫苗是预防乙肝的首选，国家实施新生儿乙肝疫苗预防接种为主的控制策略 接种乙肝疫苗是预防乙肝最安全、有效的措施。全程接种乙肝疫苗后，约80％－95%的人群可产生免疫能力，保护效果可持续20年以上。由于乙肝病毒感染是导致原发性肝癌的主要因素，因此接种乙肝疫苗也可降低原发性肝癌的发生。丁肝病毒只有与乙肝病毒同时或在乙肝病毒感染的基础上才能发生感染，因而接种乙肝疫苗还可预防丁肝病毒感染。 乙肝疫苗全程免疫需按0，1，6月接种3针。1992年开始实行新生儿乙肝疫苗接种策略，2002年起我国实施新生儿免费接种乙肝疫苗的策略，第1针应在出生24小时内接种，并完成全程接种。2009-2011年，实施对15岁以下人群进行乙肝疫苗查漏补种措施，以
疫苗生产用Vero细胞的控制
加强疫苗生产用Vero细胞的控制 洪小栩李琦涵 摘要：目前，传统病毒性疫苗生产用细胞基质主要包括原代细胞系、二倍体细胞系和传代细胞系。近年来，Vero细胞作为连续细胞系在我国越来越多地用于人用疫苗的生产。由于Vero细胞具有污染内源性或外源性感染因子以及细胞残留蛋白和DNA 具有潜在致瘤性和致癌性的风险，因此， Vero细胞系作为疫苗生产用细胞基质的安全问题备受关注，加强生产用Vero细胞库的管理和控制；优化疫苗生产工艺，提高对细胞残余蛋白和DNA的去除能力；执行严格的残留量限定标准，对保证Vero细胞生产疫苗的安全性具有重要意义。 关键词： Vero细胞、病毒性疫苗、致瘤性、致癌性 Strengthening the Control on the Vero Cell Used for the Production of Viral Vaccines Hong Xiaoxu Li Qihan Abstract: At present, the major cell substrates used for the traditional production of viral vaccines including the primary cell lines, diploid cell lines and continuous cell lines. The safety of the Vero cell strain is the main concerned on the potential risks of the endogenous and exogenous virus contamination, as well as the tumorigenicity and oncogenicity properties induced by the residual cellular protein and DNA. As this result, it will play very important role on improving the safety of viral vaccines by strengthening the management and control of the Vero cell bank, improving the production process, enhancing the ability of the removing the residual cellular protein and DNA, and carrying out the strict limit standard. Key words: Vero cell, viral vaccine，tumorgenicity, oncogenicity 作者单位：100060.北京. 国家药典委员会（洪小栩）；650118 昆明，中国医学科学院医学生物学研究所（李琦涵） 通信作者：洪小栩， Email： hongxiaoxu@https://www.sodocs.net/doc/b111959640.html,
病毒性肝炎
病毒性肝炎 定义：是由多种肝炎病毒引起的，以肝脏损害为主的一组全身性传染病。 各型病毒性肝炎临床表现相似，以疲乏、食欲减退、厌油、肝功能异常为主。 甲型和戊型主要表现为急性感染，经粪口途径传播；乙型、丙型、丁型多呈慢性感染，主要经血液、体液等胃肠外途径传播。 【病原学】 【一】甲型肝炎病毒 HAV。嗜肝RNA病毒，有实心和空心两种颗粒，实心颗粒为完整的HAV，有传染性；空心颗粒为未成熟的不含RNA的颗粒，具有抗原性但无传染性。 【二】乙型肝炎病毒。HBV是一种嗜肝DNA病毒。HBV感染者血清中存在三宗颗粒①大球形颗粒，为完整的HBV颗粒，又名Dane颗粒，内含HBsAg和环状双股DNA及核心抗原，是病毒复制的主体②小球形颗粒③管型颗粒。后两种颗粒由HBsAg组成，不含核酸无感染性。一般情况下，血清中小球形颗粒最多，Dane颗粒最少。HBV基因组中4个开放阅读框（ORF）均位于长链，分别是S区，C区、P区、X区。S区又分为前S1，前S2及S三个编码区，分别编码前S1蛋白，前S2蛋白及HBsAg。C区由前C基因和C基因组成，编码HBeAg和HBcAg。P区是最长的读码框，编码多种功能蛋白，参与HBV复制。X基因编码X蛋白，其具有反之激活的作用。HBsAg阳性表示现症感染，阴性表示无HBV感染；抗HBs是一种保护性抗体，阳性表示对HBV有免疫力，见于乙肝恢复期、过去感染及乙肝疫苗接种后。抗HBc IgM （6-18month）阳性提示急性期或慢性肝炎急性发作（急性感染标志物），IgG出现较迟，但可保持多年。HBeAg持续存在预示趋向慢性，其为复制活跃和传染性的标记，HBeAg消失而抗HBe产生称为血清转换；抗HBe阳转后，病毒复制多处于静止状态，传染性降低 乙肝两对半及意义（P25）: ①、HBsAg即乙肝表面抗原：感染后最早出现，只有抗原性，无传染性；②、HBsAb即乙肝表面抗体：表面对HBV有免疫力，见于乙肝恢复期、过去感染及乙肝疫苗接种后；③、HBeAg即乙肝e抗原：一般仅见于HBsAg阳性血清。如果HBeAg 持续存在提示急性HBV感染趋向慢性，在慢性HBV感染时其存在提示患者处于高感染低应答期；④、HBeAb即乙肝e抗体:发生血清转换时出现，提示机体由免疫耐受转为免疫激活，此时常有病变活动的激化。HBeAb转阳后，病毒复制多处于静止状态，传染性低。部分病人仍有病毒复制，肝炎活动，称为HBeAg阴性慢性肝炎；⑤、HBcAb即乙肝核心抗体：HBV 感染者都可以检查出HBcAb，HBcAb阳性提示急性期或慢性肝炎急性发作； 【注】大三阳指HBsAg（+）HBeAg（+）HBcAb（+），提示病毒在体内大量复制，有很强的传染性；小三阳指HBsAg（+）HBeAb（+）HBcAb（+），提示急性或慢性乙型肝炎，体内病毒复制，为乙型肝炎病毒复制状态，通常由大三阳转变而来，是人体对E抗原产生一定程度的免疫力。 【三】丙型肝炎病毒。属RNA病毒，其基因组中5'非编码区最保守，在设计用于诊断HCV 感染的PCR引物时，此区段是首选部位。HCV RNA阳性时病毒感染和复制的直接标志。【四】丁型肝炎病毒，为缺陷病毒，但其核内的RNA无需HBV的辅助能自行复制，大部分情况是在HBV基础上引起重叠感染。抗HDV不是保护性抗体。 【五】戊型肝炎病毒，RNA病毒，抗HEV IgM阳性时近期HEV感染的标志。 【流行病学】一、甲肝无病毒携带状态，吃出来的肝炎，感染后可获得持久免疫。 二、乙肝传播途径有母婴传播、血液和体液传播等，易感人群为抗HBs阴性者。 三、丙型主要通过肠道外传播：输血及血制品、注射针刺器官移植骨髓移植和血液透析、生活密切接触、性传播和母婴传播。人群对其普遍易感。 四、丁型肝炎，人群普遍易感。 五、戊型肝炎。暴发流行均由于粪便污染水源所致，隐形感染多见。
病毒性肝炎防治知识
病毒性肝炎防治知识 病毒性肝炎是由多种不同肝炎病毒引起的一组以肝脏损害为主的传染病，根据病原学诊断，肝炎病毒至少有5种，即甲、乙、丙、丁、戊型肝炎病毒，分别引起甲型肝炎、乙型肝炎、丙型肝炎、丁型肝炎及戊型肝炎。另外一种称为庚型病毒性肝炎，较少见。 病毒性肝炎的分布遍及全世界，但在不同地区各型肝炎的感染率有较大差别。我国属于甲型及乙型肝炎的高发地区，但各地区人群感染率差别较大。甲型肝炎全年均可发病，而以秋冬季为发病高峰，通常为散发；发病年龄多在14岁以下，在托幼机构，小学校及部队中发病率较高，且可发生大的流行；如水源被污染或生吃污染水中养殖的贝壳类动物食品，可在人群中引起暴发流行。 传染源、传播途径和易感人群 (一)传染源甲型肝炎的主要传染源是急性患者和隐性患者。病毒主要通过粪便排出体外，自发病前2周至发病后2～4周内的粪便具有传染性，而以发病前5天至发病后1周最强，潜伏后期及发病早期的血液中亦存在病毒。唾液，胆汁及十指肠液亦均有传染性。 乙型肝炎的传染源是急、慢性患者的病毒携带者。病毒存在于患者的血液及各种体液(汗、唾液、泪乳汁、阴道分泌物等)中。急性患者自发病前2～3个月即开始具有传染性，并持续于整个急性期。 丙型肝炎的传染源是急、慢性患者和无症状病毒携带者。病毒存在于患者的血液及体液中。 丁型肝炎的传染源是急、慢性患者和病毒携带者。 戊型肝炎的传染源是急性及亚临床型患者。以潜伏末期和发病初期粪便的传染性最高。 （二）传播途径 甲型肝炎主要经粪、口途径传播。粪便中排出的病毒通过污染的手，水苍蝇和食物等经口感染，以日常生活接触为主要方式，通常引起散发性发病，如水源被污染或生食污染的水产品（贝类动物），可导致局部地区暴发流行。通过注射或输血传播的机会很少。 乙型肝炎的传播途径包括：①输血及血制品以及使用污染的注射器或针刺等；②母婴垂直传播(主要通过分娩时产道血液，哺乳及密切接触，通过胎盘感染者约5%)；③生活上的密切接触；⑷性接触传播[如果皮肤没有破损是不会传染}。此外，尚有经吸血昆虫(蚊，臭虫，虱等)叮咬传播的可能性。 丙型肝炎的传播途径与乙型肝炎相同而以输血及血制品传播为主，且母婴传播不如乙型肝多见。
病毒毒性疫苗制造技术
病毒性疫苗制造技术 任务一灭活苗的制造流程 菌种的选择（强毒株) → 菌液培养→ 灭活 ↓ ↓ 配苗（5份菌液+1份铝胶配苗) ←浓缩 工序一菌种与种子培养 选取毒力强、免疫原性好的1～3个品系菌株，按规定定期复壮和鉴定，将合格菌种增殖培养并经无菌检验、活菌计数达到标准后作为种子液。种子液保存于2～8℃冷暗处，在有效期内用于菌苗生产种子使用。大肠杆菌病的菌种应采集动物心血、腹水、肝渗出物、气囊附着物或正常动物的肠道内容物作为接种物。如用含大肠杆菌的病料，首先对大肠杆菌进行分离、鉴定，符合要求方可作为菌种使用。 工序二菌液的培养 用于规模化细菌培养的方法很多，有手工式、机械化或自动化等方式。可供菌体培养的方法有：固体表面培养法、液体静置培养法、液体深层通气培养法和透析培养法。一般固体培养易获得高浓度细菌悬液，含培养基成分少，易稀释成不同的浓度，但生产量较小。因此，大量生产疫苗时常用液体培养法。 实例大肠杆菌的菌液培养方法 (1)．将生化结果典型的菌种接种于伊红美兰琼脂平板或麦康凯琼脂平板上，置37℃温箱中培养18～24h，挑取单个典型菌落接种于琼脂斜面，置37℃温箱中培养18～24h，经显微镜检查无杂菌污染者，即可作为种子培养物。 (2)．取5ml马丁肉汤加入琼脂斜面洗下菌苔作为一级种子，用灭菌吸管按5%的量将一级种子接种于马丁肉汤中，置37℃培养18～24h后作为二级种子。(3)．二级种子可以接种到营养琼脂培养基或马丁肉汤中做进一步扩大培养。如接种到营养琼脂培养基表面，37℃培养24～48h后，加入灭菌生理盐水，用灭菌接种环或特制的刮子将菌苔刮下，倾入灭菌的离心管中，低速离心5min (500r/min)，使其中可能掺杂的琼脂块下沉。吸取上层细菌悬浮液加入盛有玻璃珠的灭菌瓶中，用手或振荡器振荡30min，使细菌均匀分散,取少量菌液装于灭菌试管中供计数用，其余细菌将灭活(强毒细菌须在杀菌后，再行计数)。 如接种于马丁肉汤培养基，经37℃培养24～48h后，直接取少量菌液供计数用，其余细菌则灭活。 工序三菌数计算 采用活菌计数法或比浊计数法，以概略地计算出每毫升菌液中的细菌总数。 工序四灭活与浓缩 对大肠杆菌菌液应加入0.5％甲醛溶液，置37℃温箱作用48～72h，以达到杀死细菌的目的。灭活后需对菌液进行浓缩，常用的浓缩方法有离心沉降法、氢氧化铝吸附沉淀法和羧甲基纤维沉淀法。可使菌液浓缩1倍以上。 工序五配苗与分装
病毒性肝炎培训试卷
病毒性肝炎培训试卷 科室：姓名：成绩：日期： 一、选择题：（每题5分，共50分） 1、下列肝炎中不属于病毒性肝炎的是：（） A、甲肝 B、乙肝 C、丙肝 D、酒精性肝炎 2、近几年，我国乙肝发病率大约为：（） A、1% B、3% C、8% D、18% 3、目前，我国丙肝发病率大约为：（） A、1% B、3% C、8% D、18% 4、乙肝和丙肝主要通过（）传播 A、血液传播 B、空气传播 C、消化道传播 D、共用餐具 5、在中国乙肝最常见的传播途径是（） A、母婴传播 B、血液制品传播 C、医源性传播 6、下列行为，一般不会传染乙肝的是（） A、理发店剃刀 B、性传播 C、被HBV污染的医疗器械 D、共用餐具 7、下列预防乙肝的措施，不正确的是：（） A、减少不必要的输血； B、不使用公共剃刀； C、接种乙肝疫苗； D、不与乙肝病毒携带者说话 8、近年来，通过（）方法多数丙肝可以治愈，多数乙肝病人可以控制病情发展。 A、降酶 B、保肝 C、对症治疗 D、抗病毒治疗 9、用于乙肝治疗的药物主要是（）。 A、乙肝免疫球蛋白 B、乙肝疫苗； C、干扰素和核苷类抗病毒药物； D、抗生素 10、HA V随粪便排出体外最主要的时间是（） A. 感染后1周内 B. 发病2周后 C. 发病前后2周内 D. 恢复期 E. 发病后1个月 二、填空题：（每题3分，共42分） 1. 甲型肝炎的潜伏期为，平均；乙型肝炎的潜伏期为，平均约；丙型肝炎的潜伏期为，平均。 2、甲型肝炎的传播途径为。 3.乙型肝炎病毒感染主要哪些途径传播，、，和。 4. 人类感染丁型肝炎病毒，需要与乙型肝炎病毒混合感染，其方式有2种，即和。 5. 戊型肝炎的主要传染源是期和期的患者。 三、简单题：（8分） 什么是病毒性肝炎? 答案
病毒性肝炎的流行病学
病毒性肝炎的流行病学 在我国，病毒性肝炎是一个严重的公共卫生问题。根据卫生部发布的卫生统计资料，在法定报告的传染病中，病毒性肝炎的发病率和死亡率占首位。我国病毒性肝炎的平均发病率约为100/10万，即每年新发生的机型病毒性肝炎约120万例，其中50%为甲型，25%为乙型，5%丙型，10%为戊型，另10%为非甲~戊型。 我国一般人群的康甲型肝炎（甲肝）病毒抗体（抗-HA V）流行率为80.9%，但各省（自治区、直辖市，下同）差异较大，江苏省最低，为48.4%；贵州省最高，为85.4%。即使在同一个省得不同地区，抗-KA V流行率也有差异，一般农村高于城市，社会经济水平低的地区高于社会经济水平高的地区，提示人民生活水平和环境卫生是影响甲肝流行的重要因素。甲肝的预防主要包括：接种疫苗、免疫球蛋白预防、加强健康教育、注意个人卫生、疾病监测及控制爆发等。 根据1992~1995年全国病毒性肝炎的血清流行病学调查，我国一般人群的乙型肝炎（乙肝）病毒表面抗原（HBsAg）携带率为9.7%，估计约1.2亿人携带乙肝病毒（HBV）。慢性肝病的患病率和死亡率分别为1.6%和24.9/10万，据此推算，全国约有2000万例慢性肝病患者，每年约30万人死于慢性肝病。肝癌的死亡率为14.8/10万，每年因肝癌死亡约18万例。 为了预防HBV感染，我国采取了以下措施：①献血员筛查；②使用一次性注射器；③加强健康教育；④新生儿普遍接种乙肝疫苗（HepB）；⑤学龄前儿童及高危人群HepB免疫。 国产乙肝血源疫苗以1986年正式生产。1992年国产重组中国仓鼠卵巢细胞（CHO细胞）乙肝疫苗被批准试正式生产。1996年从美
病毒性肝炎防治知识
病毒性肝炎防治基本知识 一、基本知识 1、什么是病毒性肝炎？ 病毒性肝炎是由多种肝炎病毒引起的常见传染病，具有传染性强、传播途径复杂、流行面广泛，发病率较高等特点，肝炎病毒通常分为甲、乙、丙、丁、戊型。以疲乏、食欲减退、肝肿大、肝功能异常为主要表现，部分出现黄疸，无症状感染常见。甲肝和戊肝多为急性发病，预后良好；乙肝和丙肝感染易发生慢性化，危害较大，年龄越小，越容易慢性化；丁肝病毒只有与乙肝病毒同时或在乙肝病毒感染的基础上才可能感染。 2、我国肝炎现状与挑战 我国是病毒性肝炎的高发地区，发病率高。2010年我国报告病毒性肝炎病例近132万例，死亡884例，位居传染病发病之首，其中乙肝 占所有肝炎病例的80%。 3、肝炎的传播途径 甲肝和戊肝主要经粪-口途径传播，水源或食物 被污染可引起暴发流行，也可经日常生活接触传 播。乙肝、丙肝的传播途径包括：血液传播（输血 及血制品以及使用污染的注射器或针刺等）；母婴 垂直传播；性接触传播。丁肝的传播途径与乙肝相 同，但与乙肝病毒同时或在乙肝病毒感染的基础上才可能感染。 二、病毒性肝炎的预防 1、疫苗是预防乙肝的首选，国家实施新生儿乙肝疫苗预防接种为主的
控制策略：接种乙肝疫苗是预防乙肝最安全、有效的措施。全程接种乙肝疫苗后，约80％－95%的人群可产生免疫能力，保护效果可持续20年以上。 2、防止“病从口入”，预防甲肝和戊肝 甲肝和戊肝病毒主要经消化道传播，注意饮食和饮水卫生、防止“病 从口入”可预防甲肝和戊肝病毒感染。 3、切断传播途径，预防丙型肝炎 丙肝目前虽然无法通过接种疫苗进 行预防，但通过采取有效措施切断其传 播途径，是完全可以预防的。 三、病毒性肝炎的治疗 1、慢性乙肝和丙肝患者需到正规医院进行检查，定期接受随访，根据病情进行规范化治疗，切勿轻信虚假广告。 2、慢性乙肝和丙肝患者需要遵从医嘱，主动配合，切忌自行停药 3、鼓励检查了解乙肝感染状况，建议有疑似肝炎症状或高风险行为的人群主动到医疗机构检查 4、丙肝需要早期诊断和治疗（主动检测，规范治疗，良好预后） 四、健康教育 1、日常生活、工作、学习接触不会传播乙肝和丙肝病毒。 2. 乙肝病毒表面抗原阳性者可结婚、生育。 3、我国已明确取消了入学、就业乙肝体检项目。 4、防治肝炎是全社会共同的责任。
什么是病毒性肝炎
病毒性肝炎 一、基本知识 1、什么是病毒性肝炎？ 病毒性肝炎是由多种肝炎病毒引起的常见传染病，具有传染性强、传播途径复杂、流行面广泛，发病率较高等特点，肝炎病毒通常分为甲、乙、丙、丁、戊型。以疲乏、食欲减退、肝肿大、肝功能异常为主要表现，部分出现黄疸，无症状感染常见。 甲肝和戊肝多为急性发病，预后良好；乙肝和丙肝感染易发生慢性化，危害较大，感染是年龄越小，越容易慢性化；丁肝病毒只有与乙肝病毒同时或在乙肝病毒感染的基础上才可能感染。 2、肝炎的传播途径 甲肝和戊肝主要经粪-口途径传播，水源或食物被污染可引起暴发流行，也可经日常生活接触传播。 乙肝、丙肝的传播途径包括：血液传播（输血及血制品以及使用污染的注射器或针刺等）；母婴垂直传播；性接触传播。丁肝的传播途径与乙肝相同，但与乙肝病毒同时或在乙肝病毒感染的基础上才可能感染。 二、病毒性肝炎的预防 1、疫苗是预防乙肝的首选，国家实施新生儿乙肝疫苗预防接种为主的控制策略 接种乙肝疫苗是预防乙肝最安全、有效的措施。全程接种乙肝疫苗后，约80％－95%的人群可产生免疫能力，保护效果可持续20年以上。由于乙肝病毒感染是导致原发性肝癌的主要因素，因此接种乙肝疫苗也可降低原发性肝癌的发生。丁肝病毒只有与乙肝病毒同时或在乙肝病毒感染的基础上才能发生感染，因而接种乙肝疫苗还可预防丁肝病毒感染。 乙肝疫苗全程免疫需按0，1，6月接种3针。1992年开始实行新生儿乙肝疫苗接种策略，2002年起我国实施新生儿免费接种乙肝疫苗的策略，第1针应在出生24小时内接种，并完成全程接种。2009-2011年，实施对15岁以下人群进行乙肝疫苗查漏补种措施，以更大程度保护儿童少年免受乙肝病毒危害。 医务人员、经常接触血液的人员、托幼机构工作人员、经常接受输血或血液制品者、乙肝病毒表面抗原阳性者的家庭成员、男性同性恋或有多个性伴侣和静脉内注射毒品者等也应接种乙肝疫苗。 2、防止“病从口入”，预防甲肝和戊肝
病毒性肝炎
病毒性肝炎 （一）单项选择题 1、下列哪项不是慢性乙型肝炎常见体征：（D ） A、肝病面容 B、肝掌 C、蜘蛛痣 D、杵状指 2、慢性肝炎是指肝功能异常多长时间，伴有HBsAg阳性者( C) A、4月 B、9月 C、6月 D、1年 3、下列描述哪项是错误的：（ C ） A、甲型肝炎病毒主要经消化道传播 B、甲型肝炎病毒属于微小RNA病毒科中的肝RNA病毒属 C、急性甲型肝炎易发展为慢性肝炎 D、人类对HAV普遍易感，感染治愈后可产生持久免疫力 4、主要经粪一口途径传播的肝炎病毒为：（B ） A、HBV B、HAV+HEV C、HAV+HCV D、HCV 5、主要经肠道外途径传播的肝炎病毒为：（ D ） A、HBV B、HAV+HEV C、HAV+HCV D、HBV+HCV+HDV 6、关于重型肝炎描述下列哪项为正确：（ B ） A、重型肝炎凝血酶原活动度(PTA)多大于40% B、慢性重型肝炎是发生在慢性肝炎或肝硬化基础上的亚急性肝坏死 C、重型肝炎出现ALT快速下降、胆红素快速上升为病情好转的表现 D、重型肝炎分为急性、亚急性、慢性重性肝炎和肝性脑病 7、下列哪项描述是错误的：（ A ） A、ALT/AST大于1.0提示肝细胞损伤严重 B、ALT是目前临床上反映肝功能最常用指标 C、酶胆分离现象是指ALT快速下降、胆红素快速上升 D、AST/ALT大于1.0提示肝功能损伤严重
8、乙型肝炎病毒活动复制的指标为：（ D ） A、血清HBV DNA, HBeAg B、血清抗-HbcIgM C、肝内HBcAg D、以上全对 9、哪种肝炎病毒为DNA病毒：（B ） A、HAV B、HBV C、HCV D、HDV 10、关于乙型肝炎下列哪项描述是错误的：（ D ） A、HBV经煮沸10分钟可被灭活 B、我国为乙型肝炎的高度流行区域 C、乙型肝炎传染源是急性和慢性病人及携带者 D、急性乙肝患者作为乙型肝炎传染源的意义最大 11、关于戊型肝炎下列哪项是正确的：（ A ） A、抗HEV1gM阳性可确诊 B、HEV是单股正链DNA病毒 C、戊型肝炎主经血液途径传播 D、戊型肝炎隐性感染者无传染性 12、关于抗-HBs与抗-HBc，下列哪一项是正确的：（C） A、两者均为自身抗体 B、两者均为保护性抗体 C、抗-HBs为保护性抗体，抗-HBc。不是保护性抗体 D、抗-HBs不是保护性抗体，抗一HBc为保护性抗体 13、关于丙型肝炎下列哪项是错误的：（ D ） A、血清HCV RNA阳性可诊断丙型肝炎 B、丙型肝炎是经肠道外途径传播的 C、人类对HCV普遍易感 D、急性丙型肝炎进展为慢性肝炎机率为10%左右 14、病毒性肝炎传染源管理包括：（ D ） A、对病人早发现、早诊断、早报告、早隔离、早治疗，急性病人住院隔离治疗 B、慢性病人、携带者应养成良好卫生习惯，防止经体液、血液传染他人 C、对从事饮食、饮水、托幼学行业的人群应加强管理，发现病人应调离工作岗位，对携带者应按照有关规定调离或限制工作岗位 D、以上全是 15、下述哪项错误：（A ） A、急性甲型、戊型肝炎隔离期为自发病日算起6月
病毒性肝炎教案
病毒性肝炎教学设计 教学目的 1、掌握病毒性肝炎临床表现、诊断与治疗。 2、熟悉病毒性肝炎流行病学特征、辅助检查。 3、了解病毒性肝炎发病机制及病理特点。 教学目标 知识目标：掌握病毒性肝炎临床表现、诊断与治疗。 能力目标：能运用所学知识能正确接待患者并做出合理的护理计划。 素质目标： 1.具有勤奋学习的态度，严谨求实、创新的工作作风。 2.具有良好的心理素质和职业道德素质。 3.具有博大爱心和高度责任心。 4.具有一定的科学思维方式和判断分析问题的能力。 学时 2 能力训练任务与案例 任务1：掌握病毒性肝炎临床表现、诊断与治疗 任务2：分析案例中患者，能正确接待患者 任务3：熟悉病毒性肝炎流行病学特征、辅助检查 任务4：能运用所学知识能正确接待患者并做出合理的护理计划 教学重难点 重点： 1. 病毒性肝炎临床表现、诊断与治疗。 难点： 1. 病毒性肝炎的发病机理。 解决方案: 从临床案例入手，引出本次工作任务，以任务为驱动引导学生共同参与完成教学目标 教学方法：讲授法、案例教学法、提问式、讨论法、情境教学法 教学资源： 教材《内科护理学》、《内科学》、课程网站教学资源：习题、作业、课件、课程录像等 教学过程设计 课程教学总计（时间：90分钟） 【步骤一】内容引入，案例导入（时间：5分钟）
演示病例1：患者男性，24岁，发热、尿黄、皮肤巩膜黄染6天入院。患者于6天前受凉后发热,头痛、咽痛、乏力、食欲减退、恶心、上腹部胀痛及右上腹隐痛，伴尿黄，渐呈浓茶样。体格检查：皮肤巩膜明显黄染，肝肋下1.5cm，质软，压痛。实验室检查：尿胆红素(+)，尿胆原(+)。肝功能：TB84μmol/L，DB 60μmol/L，ALT＞200u/L。入院诊断：急性肝炎（典型）。 【步骤一】简述讲授病毒性肝炎的概念、病原学（时间：10 分钟） 教师：1. 讲授：自实行乙肝疫苗计划免疫后，我国乙肝感染率已经由过去10%下降到7.4%，按我国人口13亿计算感染人群下降率是非常明显的。这要归功于计划免疫政策的实施，崔然发病率有明显下降，但我国人口基数大，乙肝发病人数众多，仍不可掉以轻心。因此学习病毒性肝炎的护理知识是非常重要的。 一、概述： （一）定义： 1、病毒性肝炎：是指多种嗜肝肝炎病毒引起的以肝脏病变为主的全身性疾病。确定的肝炎病毒有甲、乙、丙、丁、戊共五型。 2、病原体不同行，但临床症状基本相似，以疲乏、无力、食欲不正、肝肿大、肝功能异常为主要表现。部分病例出现黄疸。 乙型和丙型、丁型易转为慢性。 （二）病原学： 1、甲肝（HAV）:为单股正链RNA病毒，在体外抵抗力较低，低温下可长期存活，传染性高于HEV,发病有家庭聚集现象。在100℃加热5分钟可使病毒灭活，70%酒精25℃3分钟均可有效灭活HAV。 HAV仅一个血清型和一个抗原抗体系统。 抗HAV-IgM：是诊断HAV急性感染的指标抗HAV-IgG：是保护性抗体，是产生免疫力的标志。 2、乙肝（HBV）：血清中抗原抗体的临床意义 1）HBsAg：出现时间：在HBV感染后2~6个月（潜伏期），持续时间：急性自限性肝炎，6个月内可消失；慢性肝炎或慢性HbsAg携带者：可持续阳性。抗—HBs:为保护性抗体，期出现标志着HBV感染进入恢复期，对HBV再感染有免疫力。但对不同亚型HBV 保护力不完全。 2）HBeAg：是病毒复制和传染性的标志。 抗-）HBe：出现时间：随着）HbeAg消失而出现。 3）HbcAg：主要存在于HBV感染的肝细胞内或者DANE颗粒核心中，到血液中被降解为HbeAg。 抗-HBc：抗-HBc-lgM：是HBV近期感染或者慢性感染者病毒活动的标志，抗-HBc-lgG：凡有过HBV感染者均可阳性。 4）HBV DNA：是病毒复制和有传染性最直接的证据。 3、丙肝： 传染源：主要为急慢性丙肝患者和慢性丙肝携带者 传播途径：主要通过血液和体液传播：输血、血透、注射、针刺等 易感人群：人群普遍易感。HCV感染的母亲所生婴儿感染率高。 4、简述丁戊肝炎的病原学 学生：思考并理解乙肝（HBV）：血清中抗原抗体的临床意义