随机扫描多光子荧光显微成像系统
第26卷 第12期
2006年12月
光 学 学 报AC TA
O P TICA SIN ICA
Vol.26,No.12
December ,2007文章编号:025322239(2006)122182326
随机扫描多光子荧光显微成像系统
3
吕晓华1 占 成1 张红民1 骆清铭1 陈 伟2 曾绍群1
1华中科技大学生物医学光子学教育部重点实验室武汉光电国家实验室(筹)生物医学光子学研究部,武汉430074
2耶鲁大学神经生物学系,New Haven ,CT ,06511
摘要: 多光子荧光显微成像是生物学研究的有力手段,但目前的成像速度难以满足神经成像中快事件检测的需要。针对这一问题,提出了一套随机扫描快速多光子荧光显微成像系统。系统采用二维声光偏转器快速扫描飞秒激发光束,能够以每点10μs 的速度对特定的感兴趣区域进行跳跃式扫描,即随机扫描,使得有效的扫描速度大为提高。引入单棱镜补偿方法解决应用声光偏转器带来的色散问题。以170nm 荧光小球为样品,测得系统的横向分辨力为0.3μm ,纵向分辨力为1.3μm 。给出了随机扫描系统和商品化多光子荧光显微镜对同一个荧光细胞的成像结果,证明了新系统的成像能力。
关键词: 显微成像;随机扫描;声光偏转器;飞秒激光;多光子荧光成像中图分类号:T H742 文献标识码:A
3国家自然科学(30370463,60278017,30328014)和国家重点基础研究发展规划项目(2004CB520804)资助课题。
作者简介:吕晓华(1981～),男,江西丰城人,华中科技大学生物医学光子学教育部重点实验室博士研究生,主要从事显微成像方面的研究工作。E 2mail :xhualv @https://www.sodocs.net/doc/bc10043789.html,
导师简介:曾绍群(1969～),男,湖南洞口人,华中科技大学生命科学与技术学院教授,博士生导师,主要从事生物医学光子学方面的研究。E 2mail :sqzeng @https://www.sodocs.net/doc/bc10043789.html,
收稿日期:2005211221;收到修改稿日期:2006206215
Construction of R andom 2Access Scanning Multiphoton Fluorescence
Microscope System
L üXiaohua 1 Zhan Cheng 1 Zhang Hongmin 1 Luo Qingming 1 Wei R.Chen 2 Zeng Shaoqun 1
1Key L aboratory of B iomedical Photonics ,M inist ry of Education ,Division of B iomedical Photonics ,
W uhan N ational L aboratory f or O peoelect ronics (p roposed ),W uhan 430074
2De partment of N eurobiolog y ,Yale Universit y ,N ew H aven ,C T ,06511
Abstract : Multiphoton fluorescence microscopy is a powerful tool for studying biology.However ,the current
scanning method is not fast enough to fulfill the requirement for fast f unctional event detection in the neuroimaging field.A random 2access scanning multiphoton fluorescence microscope system is reported.Two 2dimensional acousto 2optic deflectors (AODs )are used to scan rapidly the femtosecond excitation laser.The system is capable of achiering the scanning speed of 10μs per scanning spot in the regin of thterest ,and increases the effective scanning speed greatly.A single prism is used to compensate the severe dispersion of the excitation light introduced by the https://www.sodocs.net/doc/bc10043789.html,ing a 170nm fluorescent bead ,the lateral resolution of the system is measured to be 0.3μm and the axial resolution is about 1.3μm.Multiphoton fluorescence image of a fluorophore 2labelled cell is acquired by using the random 2access scanning system and a commercial multiphoton fluorescence microscope ,respectively.The result proves the multiphoton fluorescence collection efficiency of the system.
K ey w ords : microscopy ;random 2access scanning ;acousto 2optic deflector ;femtosecond laser ;multiphoton fluorescence imaging
1 引 言
多光子激发荧光成像内在的光学层析能力[1]和相比于共聚焦成像技术更深的成像深度[2],使其在
生命科学研究领域得到了广泛的应用,与功能性荧光标记技术的结合更使其成为功能性研究中不可缺少的手段。多光子激发荧光成像的光学层析能力来
[1,3,4],只有在焦点位置激发光光子数密度才足以实现多光子荧光激发的要求
像是一种扫描成像技术,一般通过对激发光束进行扫描来实现成像。x y扫描镜的扫描技术每秒只能得到几帧扫描图像,远不能满足神经功能成像中快事件(ms级)检测的需要。
基于声光偏转器的扫描技术因为不受机械惯性的影响,可以实现若干不连续的扫描位置之间的跳跃式扫描,这样就无需为获得感兴趣区域的信号而把整个样品顺序地扫描一遍,从而提高了有效的扫描速度。商业共聚焦显微镜NORAN OZ在其扫描机构中使用了声光偏转器,Lechleiter等[5]和Roorda等[6]将其改造为多光子激发荧光显微镜,但是声光偏转器在其中只用于完成沿一个方向的扫描,另一个方向的扫描仍通过普通扫描镜扫描实现,不能利用声光偏转器的随机扫描能力。Bullen等[7]建立了基于两个声光偏转器的随机扫描单光子荧光显微成像系统多光子激发荧光使用超短脉冲光为激发光,而声光偏转器的色散问题限制了其在这一领域的应用。等[8]分析了声光偏转器扫描超短脉冲光的时间色散和空间色散问题,并分别提出了时间色散补偿和空间色散补偿方法,但并未将这些补偿方法应用于其建立的随机扫描多光子显微系统[9]中,使得系统的空间分辨力等受到限制。我们曾简要报道了基于单棱镜补偿方法[10]的二维声光偏转器的随机扫描多光子激发荧光显微成像系统的实现[11],给出了系统成像和随机扫描功能初步的验证性实验。本文对系统的工作原理、设计考虑进行更为详细的介绍,同时以近似点源的170nm荧光小球对系统的横向和纵向分辨力进行了测量,并给出了与商品化多光子荧光显微镜对相同的荧光标记细胞样品的多光子荧光图像的对比,表明系统在随机扫描能力之外,并没有牺牲其空间分辨能力且具有较好的多光子荧光图像获取能力。
2 原 理
2.1 声光偏转器扫描原理
声光偏转器(AOD)是一种基于衍射光栅的扫描器件[7,8,12]。一定频率的正弦信号,通过声光晶体上的压电换能器的作用,产生同频率的声波通过晶体传播。声光偏转器中的声波为疏密波,会造成晶体沿声波传播方向上密度的周期性分布,从而造成晶体折射率的周期性分布。这时晶体相当于一个光栅,其光栅常量等于声波的波长,入射光通过晶体发生衍射(图1)。当入射光的入射角满足布拉格条件[7,13]时,输出光的能量几乎完全集中于第一衍射级(衍射效率接近100%),改变声波的频率即改变声光晶体光栅的光栅常量可以改变第一衍射级相对于衍射零级的夹角,即实现了光束的偏转扫描。偏转角可以表达为
θ=λf/V,(1)其中λ为光波长,f为声波频率,V为声光偏转器中的声速。在光入射角度固定的情况下,布拉格条件在一定的声波频率范围内才能得到满足(或近似满足)。声波频率范围(带宽)决定了偏转角的范围,即最大扫描角:
Δθ=λΔf/V,(2)Δf为声波带宽。将两个声光偏转器分别沿x和y方向放置,即可实现对xy平面的二维扫描
。
图1声光偏转器扫描原理
Fig.1Illustration of the mechanism of acousto2optic
deflector
声光偏转器的扫描定位时间由声波通过光束所需时间(称为渡越时间)决定,即
t=d/V,(3) d取声光偏转器通光孔径和光束直径两者中的较小者。
声光偏转器的衍射机制决定了声光偏转器的偏转光存在一定的发散角,限制了整个扫描范围内可分辨的扫描方向的个数。由衍射效应导致的偏转光的发散角可近似表示为[7]:Δθd=λ/d。则可分辨的扫描方向的个数(静态扫描[13]情况下的可分辨点数)为
N=
Δθ
Δθ
d
=
dΔf
V
=t?Δf,(4)可分辨点数正好等于渡越时间与声波带宽的乘积,所以又称为时间带宽积[6]。
2.2 顺序扫描与随机扫描
声光偏转器扫描时,通过改变声波频率,在经过渡越时间(μs级)的延迟后光束即可确定地扫描到
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指定的角度。声波频率的改变通过电子电路和压电换能器实现,其扫描定位的重复性和精度都非常高。与此相反,普通扫描镜等机械式扫描方法,因为受到机械惯性的影响,难以在很短的时间内稳定地定位于一个指定的扫描角度,因而只能采取逐行顺序扫描的方式,并不在特定的扫描位置停留。而声光偏转器扫描方式则可以通过改变x 方向和y 方向声光偏转器的声波频率快速地跳跃到扫描范围内的任一扫描点(图2),即拥有对扫描范围内任意扫描点的随机寻访能力,因而称为随机扫描。多光子激发荧光显微技术应用于生物领域功能性研究中时,研究者往往只关注扫描图像中若干感兴趣区域的多光子荧光信号的快速(ms 量级)变化过程,随机扫描方式可以只对选定的感兴趣区域进行反复的快速高精度扫描,无需进行全场扫描,从而将系统的有效扫描
速率提高到了k Hz 量级以上。
图2顺序扫描方式。(a )与随机扫描方式,(b )的对比
Fig.2Scanning trajectory comparison of sequence scanning method (a )and random 2access scanning method (b )
2.3 声光偏转器的色散及色散补偿
声光偏转器的偏转角依赖波长,而多光子激发荧光成像中激发光为高重复频率的超短脉冲光。脉冲宽度越小,则光谱越宽。超短脉冲光经过声光偏转器时不同光谱分量的偏转角度不同,使偏转光产
生一定的发散。发散角为Δθdispersion =Δλf /V ,其中Δλ为光谱宽度,这即称为空间色散。空间色散会减少整个扫描范围内可分辨的扫描方向的数量,导致空间分辨力的降低。两个声光偏转器的共同作用,会使得偏转光沿与x 成45°左右的方向发散。偏转光的这种发散将导致得到的荧光图像产生倾斜方向的拉伸畸变[10]。另一方面,超短脉冲光中不同光谱
分量在声光偏转器中传播速度的不同(群速度色散)会导致偏转光脉冲宽度的展宽,这就是声光偏转器对超短脉冲光的时间色散。脉冲展宽会降低多光子荧光的激发效率。
单棱镜补偿方法[10]通过在光路中加入一块补偿棱镜,使该棱镜的色散与两个声光偏转器大小相等而方向相反,可以使空间色散得到补偿。而补偿
棱镜与声光偏转器又构成了类似棱镜光栅对的脉冲压缩器结构,改变棱镜和声光偏转器之间的距离,可以对扫描光脉宽进行压缩,即实现时间色散补偿。
3 系统实现
3.1 光路设计
声光偏转器做为系统的核心,其时间分辨力和空间分辨力对系统的扫描速度和成像的空间分辨力有直接的影响,是最为重要的参量。声光偏转器的时间分辨力和空间分辨力分别由渡越时间[(3)式]和可分辨点数[(4)式]描述。从(4)式可以看出,两参量之间存在相互矛盾的关系,即提高时间分辨力(减小t )的同时必然会降低空间分辨力(N 减小),反过来也一样,必须折衷考虑。首先考虑时间分辨力的要求,以满足神经成像中快事件检测的需要。设想对100个扫描位点能够达到1k Hz 的扫描速率,则要求声光偏转器的渡越时间小于10μs 。选择AA 公司的二维声光偏转器AA.D TS.XY ,晶体中
声速为650m/s ,有效通光孔径为4.5mm ,渡越时间在7μs 左右。受声光偏转器所能实现的声波带宽的限制(36M Hz ,中心频率96M Hz ),可分辨点数为250。但考虑到系统的采样特性,在进行高分辨力成像时,可以进行过采样,图像大小将并不局限于250×250。
图3给出了简化的系统结构示意图。使用钛蓝宝石激光器(Mai Tai ,Spect ra 2Physics )输出中心波长为800nm ,带宽10nm 左右的超短脉冲光为多光子荧光的激发光。经过电光调制器(eom ,Model 302,Conoptics )调节光强并经过扩束(以便充满声光偏转器的有效孔径充分利用声光偏转器的分辨能力)和准直之后导入棱镜和声光偏转器构成的色散补偿单元。扫描镜(Scan lens ),筒镜(Tube lens )和物镜共同构成了一个显微成像系统。图3为简化示意图,实际系统中为了便于观察样品,使用正置显微镜(BX61WI ,Olymp us ),筒镜内置于显微镜中。扫描镜和筒镜焦点重合,将声光偏转器偏转光的偏转起始位置成像到物镜的后焦面对样品进行扫描,同时也起扩束作用,使激发光能充分充满物镜;另一方面,扫描角则会因此而缩小,且缩小的倍数等于扩束比。假设声光偏转器引入的色散被完全补偿,则系统的横向分辨力主要由声光偏转器的可分辨点数N 和所使用物镜的数值孔径N A 共同决定。光路设计时,近似地,认为系统的分辨力取决于两者中影响较大者。对于双光子荧光物镜决定的分辨力(照
5
28112期 吕晓华等: 随机扫描多光子荧光显微成像系统
明点扩展函数平方的半峰全宽值)由(5)式决定[3]:
Δl obj =2ln20.325λ
2N A
0.91
, N A >0.7(5)如果不考虑声光偏转器之后的光学元件的衍射效应,则物平面内可分辨的相邻扫描点的间隔由偏转
光的发散角Δθd ,物镜焦距f obj 和扫描镜和管镜对光束的扩束比A 决定:Δl aod =Δθd ×f obj /A ,
(6)选择A 的大小,当Δl aod <Δl obj ,且声光偏转器引入
的色散得到满意的补偿时,可以接近显微成像系统所能提供的最高空间分辨力。做为演示,系统中物镜使用60×,N A =1.42的油镜,为了满足Δl aod <Δl obj 的关系,扩束比A 应大于2.5,实际系统中将A 设置为3左右,能同时完全满足对扩束的要求(过充满物镜孔径)。物镜收集到的荧光经过二向色镜(DM )(675DCSP ,chroma )和一块红外截止片(B G39)为光电倍增管所探测。
图3随机扫描多光子荧光显微系统示意图
Fig.3Schematic of the random 2access scanning multiphoton fluorescence microscope system
3.2 色散补偿单元
补偿棱镜与x 方向成45°倾斜放置,棱镜的出射光经过两个反射镜水平出射。为了满足对空间色散量的要求,使用的棱镜材料为高色散的ZF4(SF10)玻璃,棱镜顶角为60°。改变棱镜入射角可以调节棱镜空间色散补偿量的大小,可以计算得到当棱镜的入射角为47°时,正好可以满足两个声光偏转器(均工作于中心频率)空间色散补偿量的要求,调节放置棱镜的旋转台对入射角进行设置。改变棱镜和声光偏转器之间的距离并用自相关仪(Model 409,Spect ra 2Physics )测量扫描光的脉宽,当棱镜和声光偏转器之间的光程为35cm 时,脉宽最短(中心频率下140f s 左右,不使用棱镜时为570f s 左右;激光器输出光的脉宽为90f s 左右)。3.3 声光偏转器的扫描控制
声光偏转器扫描单元由频率源,功率放大器和声光偏转器晶体和换能器组成。频率源采用直接数字合成技术用于输出指定频率的正弦信号,输出的
正弦信号的频率由15位数字信号控制。频率源输出经两个功率放大器驱动声光偏转器晶体上的压电换能器产生在晶体内传播的相同频率的声波。单独对频率源和功率放大器进行测试,正弦信号产生相对于控制信号发出的时间延迟小于100ns ,可以忽
略不计。声光偏转器的渡越时间为7μs ,考虑信号采集所需时间和对系统时间分辨力的要求,将单个像素的扫描时间(像素时间)定为10μs 。这个时间比扫描镜扫描的像素时间(1μs 或更短)要长。但是与声光偏转器的随机扫描能力相结合,则能以更高的速度得到感兴趣区域的荧光信号的变化,且因为荧光信号收集时间更长而可以获得更高的信噪比。
选用National Inst rument s 公司的PCI -6259多功能数据采集卡进行扫描控制和PM T 信号采集。系统软件使用LabV IEW 编写,实现全场扫描多光子荧光图像的获取,感兴趣区域的选取和感兴趣区域荧光信号的采集和实时显示。
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4 实验与讨论
为了对系统的空间分辨力进行测量,以170nm 荧光小球(PS 2Speck ,Molecule Probes )为样品,使用z 轴压电扫描器(P 2721,PI )按0.1μm 步距移动物镜,获取不同聚焦面的荧光小球AOD 扫描图像。每一聚焦面获取10帧图像进行图像平均以提高信噪比,结果如图4所示。从图4(c )和图4(d )得到系统的横向分辨力为0.3μm 左右,纵向分辨力为1.3μm 左右。理论计算结果[2]横向分辨力[
(5)式]
为0.22μm ,纵向分辨力为0.51μm 。在商品化多光子荧光显微镜(基于扫描镜进行扫描,FV1000,Olymp us )对相同的170nm 荧光小球得到的横向分辨力和纵向分辨力分别为0.3μm 和0.8μm 左右。可见系统具有较好的空间分辨力,其中横向分辨力较好,而纵向分辨力略差。纵向分辨力的差距可能与衍射效应引起的激发光中不同波长成分发散角的差异以及光路导入部分使用的普通透镜的色差相关
。
图4170nm 荧光小球中心层面多光子荧光图像(a );多光子荧光图像纵向截面(b );横向荧光强度分布(c ),
纵向荧光强度分布(d )
Fig.4Multiphoton fluorescence image (a ),axial view (b ),lateral fluorescence intensity distribution (c ),axial
fluorescence intensity distribution (d )of a 170nm fluorescent bead
图5荧光标记细胞多光子荧光图像。(a )随机扫描系统成像结果;(b )商品化系统(FV1000,Olympus )成像结果
Fig.5Multiphoton fluorescence image of a fluorophore 2
labelled cell ,acquired by using the random 2access scanning system (a )
and commercial system
(FV1000,Olympus )(b )
图5为随机扫描系统和商品化多光子荧光显微镜(FV1000,Olymp us )对同一个荧光标记细胞的成像结果(两者通过一个切换光路共享同一台激光器)。实验中保证样品处功率基本一致(1.5mW 左右),像素时间基本一致(随机扫描系统为3μs ,FV1000为4μs ),并通过加入发射滤片使随机扫描系统与FV1000有相近的荧光探测光谱范围(500～550nm )。因为FV1000系统的原因,以共聚焦方式使用内部PM T 收集荧光信号,将共焦针孔设置为最大位置(800μm ),但这种方式会造成荧光收集效
率一定程度的降低。因为探测方式以及使用的PM T 不同,对成像结果的比较不是基于完全一致的
条件。但按上述设置,根据实验结果判断,随机扫描系统收集到的荧光信号略强,这也可以从图5中图像信噪比的表现看出。需要注意的是FV1000因为使用共聚焦方式探测而使其荧光收集效率降低,但这样的实验结果至少表明随机扫描系统多光子荧光收集效率可以达到比较高的水平。从图5(a )中也可以看到图像左上角信号很弱。这是由声光偏转器边缘频率(对应扫描场边缘位置)较低的衍射效率引起的,这对于扫描荧光成像有一定的影响,但可以通过根据声光晶体衍射效率的分布进行校正;而进行感兴趣区的随机扫描时,因为关注的是同一位置信号随时间的变化,则这种影响并不太大,而这种扫描模式也正是随机扫描系统的优势所在。
随机扫描多光子荧光显微系统相比于传统扫描镜扫描方式的多光子荧光显微系统,其像素时间受声光偏转器渡越时间的影响其实并不高(10μs ,传统扫描显微镜可以达到2μs 或更短),如果进行全场扫描成像时在速度上并不具有优势,但其随机寻访能力,使得在获取特定区域的荧光信号时能够提供高得多的有效扫描速度。而上面的实验结果说明随机扫描系统在空间分辨力方面也可以达到传统方
7
28112期 吕晓华等: 随机扫描多光子荧光显微成像系统
式的水平,这对于将随机扫描系统应用于一些细微功能结构(如树突棘)的研究是非常重要的保证。
5 结 论
基于二维声光偏转器实现了随机扫描多光子激发荧光显微成像系统。该系统能能够对感兴趣区域以10μs/pixel的速度进行快速随机扫描。实验结果则表明当扫描范围比较小时(通过扫描镜和管镜的作用),该系统能够达到很高的横向分辨力和较好的纵向分辨力。并且与基于扫描镜扫描的商品化系统相比,其荧光收集和成像的能力也较为满意。
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显微成像系统资料
品名型号数量供货单价备注 奥林巴斯生物成像系统显微镜CX31 1套30000元见配置清单奥林巴斯生物显微镜CX23 1套25000元见配置清单备注：以上为人民币含税报价单，含运费和包装培训费，壹年保修期。 生物显微镜CX31技术规格： 用途：可观察普通染色的切片观察。 1．工作条件 1.1 适于在气温为摄氏-40℃～＋50℃的环境条件下运输和贮存，在电源220V （ 10%）/50Hz、气温摄氏-5℃～40℃和相对湿度85%的环境条件下运行。 1.2 配置符合中国有关标准要求的插头，或提供适当的转换插座。 2．主要技术指标 2.1 生物显微镜 *2.1.1 光学系统：无限远光学矫正系统，齐焦距离必须为国际标准45mm。 2.1.2 放大倍率：40-1000倍 *2.1.3 载物台：钢丝传动，无齿条结构，尺寸为188mm × 134mm，活动范围为 X轴向76mm × Y轴向50mm，双片标本夹 2.1.4 调焦机构：载物台垂直运动由滚柱（齿条—小齿轮）机构导向，采用粗 微同轴旋钮，粗调行程每一圈为36.8mm，总行程量为25mm，微调行程为每圈 0.2mm，具备粗调限位挡块和张力调整环 2.1.5 聚光镜：带有孔径光阑的阿贝聚光镜，N.A. 1.25，带有蓝色滤色片 *2.1.6 照明系统：内置6V30W卤素灯，内置透射光柯勒照明 *2.1.7 三目观察筒：视场数≥20，瞳距调节范围为48-75mm，铰链式 2.1.8 目镜：10X，带眼罩，视场数≥20带目镜测微尺 *2.1.9 物镜：平场消色差物镜4X（N.A.≥0.1）、10X（N.A.≥0.25）、40X（N.A.≥0.65）、 100X（N.A.≥1.25）
超分辨荧光显微技术原理
2014年的诺贝尔理综奖颁发给了“超分辨荧光显微技术”。也许接下来的几天，媒体会关注StefanHell、EricBetzig二人的传奇经历，或者另一名华人女科学家与该奖项失之交臂的遗憾。但是八卦之外，这项成果背后的科学本身也非常有意思。 这里面有三个关键词：“超分辨”、“荧光”和“显微技术”，我希望能够解释清楚以下几个问题，尤其是后两个问题： 1.为什么需要（光学）显微技术？ 2.为什么光学显微镜的分辨率存在理论极限？ 3.用怎样的方法可以突破这个理论极限以达到“超分辨”？为什么这个理论极限可以被突破？ 5.为什么非得是荧光显微技术，而非普通的明场（透射光）显微技术？ 1.采样定理与显微镜 我们用肉眼观察或者用相机拍摄一个物体时，物体上的每一个细微的点都会在眼睛的视网膜或是相机的感光芯片上成像。那么我们为什么不能看到细菌等微小的东西，为什么不能把照片无限放大以看清远处树木上面的每一片叶子呢？ 这个问题的答案比较简单：因为组成视网膜的每一个感光细胞（视杆细胞和视锥细胞）、相机芯片上的每一个感光元件（CCD、CMOS等）都是有大小的。比如视网膜中央凹区域的视锥细胞直径平均约为5微米。而由于奈奎斯特-香农采样定理的限制，视网膜上能分清的两个相邻像点的距离是视锥细胞直径的两倍，即10微米。再结合眼球的构造，大致可以推断出，在距离眼睛25厘米的位置，我们能分辨物体上相距为80微米的两个点，换算成点阵密度就是大约320ppi，这也是苹果所谓“视网膜屏”分辨率的来历。
如果要观察小于80微米的物体，比如细菌，就需要先将物体放大，再用眼睛或者相机观察。现代光学显微镜的构造其实非常简单，样品放置在物镜的焦点处，从样品上发射或散射的光经过物镜变成平行（准直）光，再经过一个结像透镜，然后会聚到相机的感光芯片上成像。 按照前面的方法来推算，要区分物体上相距为200纳米的两个点，如果使用科研级相机，比如最近火起来的sCMOS相机（每个感光像素尺寸为6.5微米），只需要使用放大倍率为65倍的物镜就足够了。 那么是否可以通过提高物镜的放大倍率来观察低于200纳米的物体，比如细胞里面微管呢？ 答案是不可以。 2.光学衍射极限 由于光是一种电磁波，具有衍射和干涉的特性。 图1.光学显微镜简化示意图 如上面的简图所示，紫色箭头表示的物体PQ经过物镜等之后在相机上成像为 P'Q'。由于光的衍射，物体上的点如P、Q，在相机上并不是单独的点，而是一个个有一定大小的斑，被称为夫琅禾费衍射斑（或称艾里斑），如右侧的同心圆所示。那么，当P'、Q'相距太近的时候，两个斑会叠加导致难以分辨。这就要求物体上的P、Q要相距一定的距离。 1873年，德国物理学家、卡尔蔡司公司的恩斯特·阿贝（ErnstAbbe）首次推算出衍射导致的分辨率极限。根据瑞利判据——“当一个像斑的中心落到另一个像斑的边缘时，就算这两个像刚好能被分辨”，显微镜能分辨的物体上两点P、Q 的最小距离h为：
光学显微镜的原理及构造
光学显微镜的原理及构造显微镜是人类认识物质微观世界的重要工具，是现代科学研究工作不可缺少的仪器之一。显微镜自1666年问世以来已有300多年的历史了，其间随着科学技术不断发展，显微镜的品种不断增加，结构和性能逐步得到完善和提高。 根据不同的使用用途，光学显微镜可分为普通光学显微镜、暗视野显微镜、相差显微镜、荧光显微镜、倒置显微镜、体视显微镜、偏光显微镜等10多种。目前，世界上许多国家都可以生产光学显微镜，牌名、种类繁杂，其中德国、日本等国制造的显微镜品质、数量占优势，但价格昂贵。 对于现代的光学显微镜，包括各种简单的常规检验用显微镜、万能研究以及万能照相显微镜等，首先要认识其构造及各部件的功能，同时要掌握正确的调试、使用和保养方法，才能在实际应用中面对各种要求时以不同的显微镜检方法，充分发挥显微镜应有的功能，提高常规检验工作效率. 光学显微镜的原理和构造 随着科学技术的发展，显微镜检方法由最传统的明视野、暗视野发展出了相差法、偏光方法；荧光方法也由透射光激发进展为落射光激发，使荧光效率大为提高；微分干涉相衬方法基于偏光方法，而巧妙地利用了微分干涉棱镜，使之能应用于医学与生物学的样品，又能应用于金相样品的分析与检验。 下面以德国ZEISS公司生产的Axioplan万能研究用显微镜，简单介绍万能显微镜的基本组成部件。 1. 显微镜主机体（stand） 显微镜的主机体设计成金字塔形，而底座的截面呈T字形，使显微镜的整体相当稳固。显微镜的光学部件和机构调节部件、光源的灯室、显微照相装置、电源变压稳压器等，都可安装在主机体上或主机体内。 2. 显微镜的底座（base） 底座和主机体通常组成一个稳固的整体。底座内通常装有透射光照明光路系统（聚光、集光和反光）部件，光源的滤光片组，粗/微调焦机构，光源的视场光阑也安装在底座上。 3. 透射光光源（tranilluminator） 透射光光源由灯室（lamp housing）、灯座（lamp socket）、卤素灯（halogen lamp）、集光与聚光系统（lamp collector and lamp condenser）及其调整装置组成。 4. 透射光光源与反射光光源的转换开关（toggle switch） 这是新一代AXIO系列显微镜特有的装置，透射光和反射光可通用。当具有透/反两用的配置时，利用这一转换开关能方便而又迅速的使透射光 和反射光互相转换。在纯透射光的配置中，这一开关就改为电源开关。
(完整版)推扫式扫描系统
推扫式扫描系统 ——《遥感应用分析原理与方法》赵时英 推扫式扫描（push-broom scanning）系统，又称“像面”（along-track）扫描系统，用广角光学系统在整个视场内成像，它所记录的多光谱图像数据是沿着飞行方向的条幅。与光机扫描系统相似的是，它也是利用飞行器的向前运动，借助于与飞行方向垂直的“扫描”线记录而构成二维图像。也就是说，它通过飞行器与探测器成正交方向的移动获得目标的二维信息。但是推扫式扫描系统与光机扫描系统对每行数据记录的方式有明显差异。后者是利用旋转式扫描镜，一个像元一个像元的轮流采光，即沿扫描线逐点扫描成像；前者（推扫式扫描系统）不用扫描镜，而是把探测器按扫描方向（垂直于飞行方向）阵列式排列来感应地面响应，以代替机械的真扫描。具体地说，就是通过仪器中的广角光学系统——平面反射镜采集地面辐射能，并将之反射到反射镜组，在通过聚焦投射到焦平面的阵列探测元件上。这些光电转换元件同时感应地面响应，同时采光，同时转换为电信号，同时成像。若探测器按线性阵列排列，则可以同时得到整行数据；若面试阵列排列，则同时得到的是整幅图像。 一般线性阵列由很多CCD电荷耦合器件组成。CCD为一种固态光电转换元件。每个探测器元件感应相应“扫描”行上一个唯一的地面分辨单元的能量。图像上每行数据是由沿线性阵列的每个探测器元件采样得到的。探测器的大小决定了每个地面分辨单元的大小。因此，CCD被设计的得很小，一个线性阵列可以包含上千、上万个分离的探测器。每个光谱波段或通道均有它自己的线性阵列。一般阵列位于遥感器的焦平面上，以确保所有阵列同时观测所有的“扫描“线。 线性阵列的推扫式扫描系统较镜扫描的光机扫描系统有许多优点： 1、线性阵列系统可以为每个探测器提供较长的停留时间，以便更充分的测量每个地面分辨 单元的能量。因此，它能够有更强的记录信号和更大的感应范围（动态范围），增加了相对信噪比，从而得到更高的空间和辐射分辨率。 2、由于记录每行数据的探测器元件间有固定的关系，且它消除了因扫描过程中扫描镜速度 变化所引起的几何误差，具有更大的稳定性。因此，线性阵列系统的几何完整性更好、几何精度更高。 3、由于CCD是固态微电子装置，一般它们体积小、重量轻、能耗低。 4、由于没有光机扫描仪的机械运动部件，线性系统稳定性更好，且结构的可靠性高，使用 寿命更长。 推扫式扫描系统也有它固有的问题，如：大量探测器之间灵敏度的差异往往会产生带状噪声，需要进行校准；目前长于近红外波段的CCD探测器的光谱灵敏度尚受到限制；推扫式扫描仪的总视唱一般不如光机扫描仪。
双光子显微镜
双光子显微镜 https://www.sodocs.net/doc/bc10043789.html,/view/1428311.htm?fr=ala0_1 双光子荧光显微镜是结合了激光扫描共聚焦显微镜和双光子激发技术的一种新 技术。双光子激发的基本原理是：在高光子密度的情况下，荧光分子可以同时吸收 2 个长波长的光子，在经过一个很短的所谓激发态寿命的时间后，发射出一个波长较短的光子；其效果和使用一个波长为长波长一半的光子去激发荧光分子是相同的。双光子激发需要很高的光子密度，为了不损伤细胞，双光子显微镜使用高能量锁模脉冲激光器。这种激光器发出的激光具有很高的峰值能量和很低的平均能量，其脉冲宽度只有100 飞秒，而其周期可以达到80 至100 兆赫。在使用高数值孔径的物镜将脉冲激光的光子聚焦时，物镜的焦点处的光子密度是最高的，双光子激发只发生在物镜的焦点上，所以双光子显微镜不需要共聚焦针孔，提高了荧光检测效率。双光子荧光显微镜有很多优点：1）长波长的光比短波长的光受散射影响较小容易穿透标本；2）焦平面外的荧光分子不被激发使较多的激发光可以到达焦平面，使激发光可以穿透更深的标本；3）长波长的近红外光比短波长的光对细胞毒性小；4）使用双光子显微镜观察标本的时候，只有在焦平面上才有光漂白和光毒性。所以，双光子显微镜比单光子显微镜更适合用来观察厚标本、更适合用来观察活细胞、或用来进行定点光漂白实验。 激光共聚焦显微镜在进行生物样品研究工作中还存在很多局限和问题： 一是标记染料的光漂白现象。因为共焦孔径光阑必须足够小以获得高分辨率的图像，而孔径小又会挡掉很大部分从样品发出的荧光，包括从焦平面发出的荧光，相应的，激发光必须足够强以获得足够的信噪比；而高强度的激光会使荧光染料在连续扫描过程中迅速褪色，荧光信号会随着扫描进程度进行变得越来越弱。 光毒作用是另外一个问题，在激光照射下，许多荧光染料分子会产生诸如单态氧或自由基等细胞毒素，所以实验中要限制扫描时间和激发光的光功率密度以保持样品的活性。在针对活性样品的研究中，尤其是活性样品生长、发育过程的各个阶段，光漂白和光毒现象使这些研究受到很大的限制。 在传统荧光显微镜中，一个荧光团吸收一个光子，该光子能量对应于荧光团基态和激发态能量之差。通过一个较短寿命的虚态，也可以通过同时吸收两个较低能量（即更高的波长）的光子激发荧光。例如，吸收两个红色波长的光子，可以激发一个吸收紫外的分子。双光子激发是一个非线性过程，对激发光强度有平方依赖关系。
倒置荧光显微镜CCD成像系统
中国医科大学实验技术中心 主要实验仪器及相关技术 倒置荧光显微镜CCD 成像系统仪 器 名 称 Inverted Fluorescence Microscope with Digital CCD Imaging System 型 号 IX71/DP70 生 产 厂 OLYMPUS 国 别 日本 所在科室 实验技术中心三部 综合楼10F 负 责 人 赵蕾 薛晓霞 联系电话 23256666转5104，5100 起用日期 2002.09 主要技术指标及配置： IX71倒置荧光显微镜 调焦：粗调/微调机制，最小微调刻度1μm ，一圈100μm 三目镜筒，目镜：10×/FN22.0；通用长工作距离聚光镜NA0.55 WD27mm ； 配置DIC 相差（10×、20×、40×）、相差（4×、10×、20×、40×、60×）装置 物镜： 4×、10×、20×、40×、60×，适于荧光、DIC 相差、相差观察 透射光照明：12V100W 卤素灯，带TTL 触发控制、光标指示 落射荧光：IX-RFA/U-LH100HGAPO 100W 汞灯；装有视场光阑调节机制 激发/发射滤光片组件：UV （U-MWU2, BP330-385）、IB(U-MWIB2 BP460-490,BA515IF)、IG(U-MWIG2 BP520-550,BA580IF)、BV(U-MWBV2 BP400-440, BA455)、IY(U-MWIY2 BP545-580, BA610IF)、IB GFP/FITC(U-MWIBA/GFP BP460-490, BA510-550)； 需用BV 、IY 激发/发射滤光片组件的实验者要提前说明，以便进行实验配置。 DP70数字CCD 成像 2/3”彩色CCD ，有效像素：1.5MP ，经像素转移技术为4080×3072（12.5MP 像素） 最大图像采集速度：3fps （36bit ，最高分辨率），图像预览：1360×1024，15fps 测光/曝光方式：30％平均测光，1％、0.1%点测光；自动、手动和自动超级荧光(SFL)曝光时间控制：1/44,000秒～60秒 灵敏度：相当于胶片ISO200～ISO1600，分档可选；BINNING ：最高4×4 动态范围：36-bit ，文件存储格式48-bit Peltier 半导体制冷：低于环境温度10℃ 图像采集分析软件：图像融合、加校准标尺、测量，序列图像记录和回放、基本的图像处理功能等。图像还可在荧光图像工作站做反卷积去模糊等处理。 可连接35mm 胶片自动显微照像装置（30％平均测光，1％、0.1%点测光；自动、手动和自动超级荧光SFL)。 主要技术功能及适用领域： 1. 细胞静态或动态荧光观察、图像采集；DIC 相差观察、图像采集。 2. 其它在培养器皿内荧光标本或需倒置观察的有关标本的观察、图像采集。 申请实验技术有关事项及自备条件： 1.提前4个工作时预约；使用60×物镜、DIC 观察和35mm 自动显微照像要事先说明。 2.自带纱布或纸，观察前，要擦拭净培养器皿表面水迹。 3.完成实验后，带走样品，不得随意丢弃，并清理实验台面。
扫描电子显微镜成像原理及基本操作
扫描电子显微镜成像原理及基本操作 一、基本结构组成： 1.电子光学系统：电子枪；聚光镜（第一、第二聚光镜和物镜）；物镜光阑。 2.扫描系统：扫描信号发生器；扫描放大控制器；扫描偏转线圈。 3.信号探测放大系统：探测二次电子、背散射电子等电子信号。 4.图象显示和记录系统：SEM采用电脑系统进行图象显示和记录。 5.真空系统：常用机械真空泵、扩散泵、涡轮分子泵等使真空度高于10 -4 Torr 。 6.电源系统：高压发生装置、高压油箱。 二、扫描电子显微镜成像原理 扫描电镜是用聚焦电子束在试样表面逐点扫描成像。试样为块状或粉末颗粒，成像信号可以是二次电子、背散射电子或吸收电子。其中二次电子是最主要的成像信号。由电子枪发射的能量为 5 ～35keV 的电子，以其交叉斑作为电子源，经二级聚光镜及物镜的缩小形成具有一定能量、一定束流强度和束斑直径的微细电子束，在扫描线圈驱动下，于试样表面按一定时间、空间顺序作栅网式扫描。聚焦电子束与试样相互作用，产生二次电子发射（以及其它物理信号），二次电子发射量随试样表面形貌而变化。二次电子信号被探测器收集转换成电讯号，经视频放大后输入到显像管栅极，调制与入射电子束同步扫描的显像管亮度，得到反映试样表面形貌的二次电子像。三、扫描电镜具有以下的特点
(1) 制样方法简单，对试样的尺寸、形态等无严格要求，可以观察直径为的大块试样以及粉末等。 (2) 场深大，适用于粗糙表面和断口的分析观察；图像富有立体感、真实感、易于识别和解释。 (3) 放大倍数变化范围大，对于多相、多组成的非均匀材料便于低倍下的普查和高倍下的观察分析。 (4) 具有相当高的分辨率，可达到为3.5 ～6nm。 (5) 可以通过电子学方法有效地控制和改善图像的质量，如通过调制可改善图像反差的宽容度，使图像各部分亮暗适中。 (6) 可进行多种功能的分析。与X 射线谱仪配接，可在观察形貌的同时进行微区成分分析。 (7) 可使用，观察在不同环境条件下（加热、冷却和拉伸等样品台进行动态试验）的相变及形态变化等。 四、扫描电镜的用途 通过样品中的电子激发出的各种信号，扫描电镜可以做出电子图像分析，如可利用二次电子进行样品表面形貌及结构分析的分析；以两片探测器信号做积分运算，通过背散射电子可以分析样品表面成分像，以两片探测器信号做微分运算时，则可用于样品表面形貌像德分析；此外，通过透射电子则可对析晶体的内部结构及晶格信息进行分析。而且，其配上其它一些配套设备，还可做显微化学成份分析，显微晶体结构分析，显微阴极发光图像分析，这更加扩大的扫描电镜的广泛应用度。常见的扫描电镜配套设备主要有：x射线波谱仪、x射线能
LSM780双光子激光共聚焦显微镜技术参数
1.设备名称 双光子荧光寿命成像激光共聚焦扫描显微镜 2.数量 1套 3.设备用途说明 4.工作条件 电源220V±10%，50HZ 室温：20~25℃ 其他：防尘，除湿，抗震动 工作台：牢固，稳定，防震 5.规格、技术要求及参数 5.1 双光子飞秒激光器部分 5.1.1Ar激光：458nm、488nm、514nm，25mW 5.1.2HeNe激光：543nm，1mW 5.1.3HeNe激光：633nm，5mW 5.1.4405激光：405nm，30mW 5.1.5*红外飞秒脉冲激光器，波长范围:680-1080nm, 包含负色散补偿功能 5.1.6根据标本的情况利用飞秒激光器的双光子可观看800微米深度样品数据。 5.1.7*稳定的可见光AOTF，同时控制激光各波长的激光强度，8通道，切换时间<5 微秒。AOTF对激光强度的控制连续可调（0~100%），步进0.1%）。 5.1.8每支激光器通过独立的光纤连接到扫描器部分，光纤即插即用，无需校准。 5.1.9光纤末端具有可对激光进行聚焦的集光镜，电动调节。 5.1.10具有8个激光光路接口和红外飞秒激光器直接耦合端口。 5.2扫描器 1
5.2.1扫描器（含检测器）与显微镜直接连接于显微镜端口（非光纤连接），一体化设 计，一体化像差及色差校正。 5.2.2*整个光路的光学设计适用波长范围为360nm～1000nm全光谱范围。 5.2.3每个荧光检测器具有独立的10级可调数码增益。 5.2.4有可调大小的针孔，调节范围为连续调节，免维护。 5.2.5*光栅分光方式，并且具有减少信号损失的循环光路设计。 5.2.6各荧光检测通道均不采用发射光滤光片，荧光信号经光栅分光后可直接到达检 测器。 5.2.7*共聚焦成像通道：具备34个荧光检测通道，可以同时采集10个荧光通道和 1个透射光通道图像，10种荧光染料可同时分离成像，1个透射光通道（明场DIC效果） 5.2.8*扫描器（含检测器）必须内置高灵敏度GaAsP spectral 检测器，而且该仪 器能够整合FCS技术，使影像品質(S/N ratio)信噪比有2X提升，具有检测微弱的单分子荧光的功能。 5.2.9一个可用于明场和DIC观察的透射光检测通道。 5.2.10*两个独立的电动的10位滤光片转轮，通过滤光片导入激发光、透过荧光并阻 断从样品反射回的激光，可提供多至50种激发光波长组合。其中一个转轮可由用户自由更换滤光片，满足系统升级扩展的需要。 5.2.11可对荧光光谱进行分析，拆分光谱重叠的不同标记的信号，可以解决同时使用 多种荧光标记时，如GFP/YFP双标记，激发光或发射光波长重叠造成的串色问题。 5.2.12具有实时计算机系统（Real time computer ）监控扫描过程、同步及数据采 集，可选择使用16位、12位和8位A/D转换的动态范围。 5.2.13采用X、Y轴独立的双镜扫描，扫描为线性扫描。 5.2.14*扫描分辨率：可以在4 x 1至6144 x 6144之间自由选择。所有通道同时使 1
LeicaSP8激光扫描共聚焦显微镜快速操作手册2013-5-13
Leica激光扫描共聚焦显微镜 快速操作手册 制作：徕卡显微系统（上海）贸易有限公司 2013年3月
目录： 1 系统的组成 系统组成 (3) 光路示意图 (4) 2 系统的使用 2.1 开机顺序 (5) 2.2 软件界面简介 (7) 2.3 在显微镜下观察样品 (8) 2.4 采集共聚焦图像 (9) 2.5 XYZ三维扫描（Z-Stack） (11) 2.6 时间序列扫描（Timeseries or xyt Scan） (15) 2.7 波长扫描（xyλScan） (16) 2.8 HyD检测器 (17) 2.9 图像的保存及输出 (18) 2.10 关机 (20) 3 系统的维护 (21)
Leica SP8 系统组成图
1可见波长激光或白激光15UVIS, HIVIS或VISIR的光路镀膜 2声光调制器（AOTF）16扫描视场旋转镜（Abbe-Konig 旋转）* 3红外激光（IR）* 17在NND位置上的反射光检测器（RLD）* 4电光调制器18物镜（可提供各种选择）* 5紫外激光* 19在NND位置上的透射光检测器（TLD）* 6 AOTF或直接调制器（DMOD）20正方型针孔 7STED 激光* 21Fluorifier盘* 8Setlight监控二极管22X1出口接口* 9AOBS, 及其他选配件23外置检测器* 10用于FRAP的光束增强镜* 24色散棱镜 11红外激光耦合25分开的荧光光谱 12与CS2紫外光路耦合的紫外激光26最多5个光电倍增管或4个HyD检测器 13STED激光耦合*选配组件 14全视野扫描镜及串行高速扫描镜选件
超分辨荧光显微技术原理
2014 年的诺贝尔理综奖颁发给了“超分辨荧光显微技术”。也许接下来的几天，媒体会关注 Stefan Hell、Eric Betzig 二人的传奇经历，或者另一名华人女科学家与该奖项失之交臂的遗憾。但是八卦之外，这项成果背后的科学本身也非常有意思。 这里面有三个关键词：“超分辨”、“荧光”和“显微技术”，我希望能够解释清楚以下几个问题，尤其是后两个问题： 1. 为什么需要（光学）显微技术？ 2. 为什么光学显微镜的分辨率存在理论极限？ 3. 用怎样的方法可以突破这个理论极限以达到“超分辨”？为什么这个理论极限可以被突破？ 5. 为什么非得是荧光显微技术，而非普通的明场（透射光）显微技术？ 1. 采样定理与显微镜 我们用肉眼观察或者用相机拍摄一个物体时，物体上的每一个细微的点都会在眼睛的视网膜或是相机的感光芯片上成像。那么我们为什么不能看到细菌等微小的东西，为什么不能把照片无限放大以看清远处树木上面的每一片叶子呢？ 这个问题的答案比较简单：因为组成视网膜的每一个感光细胞（视杆细胞和视锥细胞）、相机芯片上的每一个感光元件（CCD、CMOS等）都是有大小的。比如视网膜中央凹区域的视锥细胞直径平均约为 5 微米。而由于奈奎斯特-香农采样定理的限制，视网膜上能分清的两个相邻像点的距离是视锥细胞直径的两倍，即 10 微米。再结合眼球的构造，大致可以推断出，在距离眼睛 25 厘米的位置，我们能分辨物体上相距为 80 微米的两个点，换算成点阵密度就是大约 320 ppi，这也是苹果所谓“视网膜屏”分辨率的来历。 如果要观察小于 80 微米的物体，比如细菌，就需要先将物体放大，再用眼睛或者相机观察。现代光学显微镜的构造其实非常简单，样品放置在物镜的焦点处，从样品上发射或散射的光经过物镜变成平行（准直）光，再经过一个结像透镜，然后会聚到相机的感光芯片上成像。 按照前面的方法来推算，要区分物体上相距为 200 纳米的两个点，如果使用科研级相机，比如最近火起来的 sCMOS 相机（每个感光像素尺寸为 6.5 微米），只需要使用放大倍率为 65 倍的物镜就足够了。 那么是否可以通过提高物镜的放大倍率来观察低于 200 纳米的物体，比如细胞里面微管呢？ 答案是不可以。 2. 光学衍射极限 由于光是一种电磁波，具有衍射和干涉的特性。
多光子共聚焦扫描显微镜的原理以及应用
多光子共聚焦扫描显微镜的原理以及应用 多光子共聚焦显微镜是光学显微镜的重大改进，主要表现为可以观 察活细胞、固定细胞和组织的深层结构，并且可以得到清晰锐利的 多层Z平面结构，即光学切片，并以此可以构建标本的三维实体结构。共聚焦显微镜采用激光光源，经过扩充后充满整个物镜后焦平面，然后经过物镜的透镜系统，在标本的焦平面上会聚成非常小的点。根据物镜数值孔径不同，最亮照明点直径大小约0.25 ~ 0.8μm，深度约0.5 ~ 1.5μm。共聚焦点大小决定于显微镜设计、激光 波长、物镜特性、扫描单元状态设定和标本性质。场式显微镜的照 明范围和照明深度都很大，而共聚焦显微镜的照明则集中到焦平面 上的一个精确的焦点上。共聚焦显微镜最基本的优点是可以对厚荧 光标本（可以达到50 μm或以上）进行精细的光学切片，切片的厚度约为0.5到1.5μm。系列光学切片图像可以通过精确的显微镜Z 轴步进马达上下移动标本获得。图像信息的采集被控制在精确的平 面内，而不会被位于标本上其他位置发出的信号干扰。在去除背景 荧光影响和增加信噪比后，共聚焦图像的对比度和分辨率比传统场 式照明荧光图像有明显的提高。在很多标本中，许多错综的结构成 分相互交织构成复杂的系统，仅用几张光学切片很难还原标本本身 的结构特征，但是一旦能够采集到足够的光学切片，我们就能通过 软件对其进行三维重建。这种实验方法已经被广泛应用与生物学研 究中，用来阐明细胞或组织之间复杂的结构和功能关系。 与传统光学显微镜相比，多光子共聚焦显微镜具有更高的分辨率，实现多重荧光的同时观察并可形成清晰的三维图象等优点。所 以它问世以来在生物学的研究领域中得到了广泛应用。在对生物样 品的观察中，多光子显微镜有其优越性：对活细胞和组织或细胞切 片进行连续扫描，可获得精细的细胞骨架、染色体、细胞器和细胞 膜系统的三维图像。可以得到比普通荧光显微镜更高对比度、高解 析度图象、同时具有高灵敏度、杰出样品保护。多维图象的获得， 如7 维图象(XYZaλIt): xyt、xzt和xt 扫描,时间序列扫描旋转 扫描、区域扫描、光谱扫描、同时方便进行图像处理。细胞内离子 荧光标记，单标记或多标记，检测细胞内如PH和钠、钙、镁等离子浓度的比率测定及动态变化。荧光标记探头标记的活细胞或切片标 本的活细胞生物物质，膜标记、免疫物质、免疫反应、受体或配体，核酸等观察；可以在同一张样品上进行同时多重物质标记，同时观察。对细胞检测无损伤、精确、准确、可靠和优良重复性；数据图 像可及时输出或长期储存。 当前，激光共聚焦显微镜较广泛应用的研究领域有：细胞生物学：
激光扫描共聚焦显微镜的原理和应用
激光扫描共聚焦显微镜的原理和应用 一、激光扫描共聚焦显微镜的原理 传统的光学显微镜使用的是场光源，标本上每一点的图像都会受到邻近点的衍射或散射光的干扰；激光扫描共焦显微镜(Laser Scanning Confocal Microscope，LSCM)采用点光源照射样本，在焦平面上形成一个轮廓分明的小的光点，该点被照射后发出的荧光被物镜搜集，并沿原照射光路回送到由双色镜构成的分光器。分光器将荧光直接送到探测器。光源和探测器前方都各有一个针孔，分别称为照明针孔和探测针孔。照明针孔与探测针孔相对于物镜焦平面是共轭的，焦平面上的点同时聚焦于照明针孔和发射针孔，焦平面以外的点被挡在探测针孔之外不能成像，这样得到的共聚焦图像是标本的光学切面，避免了非焦平面上杂散光线的干扰，克服了普通显微镜图像模糊的缺点，因此能得到整个焦平面上清晰的共聚焦图像。 原理图 二、激光扫描共聚焦显微镜组成特点 LSCM由显微镜光学系统，激光光源，扫描装置和检测系统构成，整套仪器由计算机控制，各部件之间的操作切换都可在计算机操作平台界面中方便灵活地
进行。显微镜是LSCM的主要组件，它关系到系统的成像质量。通常有倒置和正置两种形式，前者在切片、活细胞检测等生物医学应用中使用更广泛。 三、激光扫描共聚焦显微镜的应用 （一）细胞的三维重建 普通荧光显微镜分辨率低，显示的图像结构为多层面的图像叠加，结构不够清晰。LSCM能以0.1μm的步距沿轴向对细胞进行分层扫描，得到一组光学切片，经A/D转换后作为二维数组贮存。这些数组通过计算机进行不同的三维重建算法，可作单色或双色图像处理，组合成细胞真实的三维结构。旋转不同角度可观察各侧面的表面形态，也可从不同的断面观察细胞内部结构，测量细胞的长宽高、体积和断层面积等形态学参数。通过模拟荧光处理算法，可以产生在不同照明角度形成的阴影效果，突出立体感。通过角度旋转和细胞位置变化可产生三维动画效果。LSCM的三维重建广泛用于各类细胞骨架和形态学分析、染色体分析、细胞程序化死亡的观察、细胞内细胞质和细胞器的结构变化的分析和探测等方面。（二）静态结构检测 1.细胞原位检测核酸 用于细胞核定位及其形态学观察、检测细胞内DNA的复制及断裂情况以及染色体定位观察。 2.原位检测蛋白质、抗体及其他分子 原位检测蛋白质、抗体及其他分子 免疫荧光标记技术 检测荧光蛋白 3.检测细胞凋亡 检测细胞凋亡不同时期细胞形态、细胞凋亡相关蛋白
超微型显微成像系统(中英文版)
一、超微型显微成像系统产品介绍如下所示： 1.功能和用途 1.1功能 1.1.1系统组件包括显微镜镜体、固定板、GRIN透镜、CMOS、图像采集卡及采集软件等。 1.1.2在单细胞分辨水平，记录一群神经元的钙信号。 1.1.3适用于自由活动动物的在体实验。 1.1.4通过植入GRIN透镜，可以实现深脑成像。 1.1.5系统体积小、重量轻，不影响小鼠自由运动和行为实验。 2.1用途： 2.1.1用于行为动物在体钙成像的超微型显微成像系统。 2.1.2检测新型可遗传编码的乙酰胆碱和多巴胺等探针的荧光变化，即可实时监测乙酰胆碱、多巴胺等浓度的动态变化情况。 二、产品彩图：
Miniature Fluorescent Microscope 1.1 function 1.1.1 System Components include Miniscope body、Base Plate、GRIN Lens、CMOS、DAQ card and software； 1.1.2 Record the calcium signal of a group of neurons at the single cell resolution level; 1.1.3 experiments for freely moving animals; 1.1.4 Deep brain imaging can be achieved by implanting a GRIN lens; 1.1.5 The system is small in size and light in weight, and does not affect the free movement and behavioral experiments of mice. 2.1 Uses: 2.1.1 Ultra-microscopic microscopic imaging system for in vivo calcium imaging of behavioral animals. 2.1.2 To detect the changes in the fluorescence of new genetically-encoded probes such as acetylcholine and dopamine, the dynamic changes of concentrations of acetylcholine and dopamine can be monitored in real time.
光学显微镜的发展历史
杨拓拓 (苏州大学现代光学技术研究所，江苏苏州215000) 1基本原理 显微镜成像原理及视角放大率 显微镜由物镜和目镜组成。物体AB 在物镜前焦面稍前处，经物镜成放大、倒立的实像A'B'，它位于目镜前焦面或稍后处，经目镜成放大的虚像，该像位于无穷远或明视距离处。 图1-1显微镜系统光路图 牛顿放大率公式： f f x x ''= 'x 是像点到像方焦点的距离，x 是物点到物方焦点的距离。 根据牛顿放大率公式可得物镜的垂轴放大率为 '1'1'11--f f x ?== β 目镜的视觉放大率为： '22250 f =Γ 组合系统的放大率为 '2'121250f f ? -=Γ=Γβ 显微镜系统的像方焦距 ?-=/'2'1'f f f '250 f = Γ 显微镜系统成倒像轴向放大率 ' 1 f
'2'1'2'1/f f x x =β 若物点A 沿光轴移动很小的距离，则通过显微镜系统的像点'2A 将移动很大的距离，且移动 方向相同。 显微系统的角放大率 '2'1'2'1/x x f f =γ 即入射于物镜为大孔径光束，而由目镜射出为小孔径光束。 显微镜的孔径光阑 单组低倍显微物镜，镜框是孔径光阑。 复杂物镜一般以最后一组透镜的镜框作为孔径光阑。 对于测量显微镜，孔阑在物镜的象方焦面上，构成物方远心光路。 显微镜的视场光阑和视场 在显微物镜的象平面上设置了视场光阑来限制视场。由于显微物镜的视场很小，而且要求象面上有均匀的照度，故不设渐晕光阑。 显微镜是小视场大孔径成像，为获得大孔径并保证轴上点成像质量，显微镜线视场不超过物镜的1/20,线视场要求： 1 '120202β?=≤f y 显微镜的分辨率和有效放大率 光学仪器分辨率 瑞利判据：两个相邻的“点”光源所成的像是两个衍射斑，若两个等光强的非相干点像之间的间隔等于艾里圆的半径，即一个像斑的中心恰好落在另一个像斑的第一暗环处，则这两个点就是可分辨的点。当物面在无穷远时，以两点对光学系统的张角可表示两分辨点的距离，其值为：
荧光显微镜介绍及使用
荧光显微镜 一.荧光显微镜(Fluorescence microscope) ： 荧光显微镜是利用一个高发光效率的点光源，经过滤色系统发出一定波长的光作为激发光、激发标本内的荧光物质发射出各种不同颜色的荧光后，再通过物镜和目镜的放大进行观察。 在强烈的对衬背景下，即使荧光很微弱也易辨认，敏感性高，主要用于细胞结构和功能以及化学成分等的研究。 荧光显微镜是以紫外线为光源，用以照射被检物体，使之发出荧光，然后在显微镜下观察物体的形状及其所在位置。荧光显微镜用于研究细胞内物质的吸收、运输、化学物质的分布及定位等。细胞中有些物质，如叶绿素等，受紫外线照射后可发荧光；另有一些物质本身虽不能发荧光，但如果用荧光染料或荧光抗体染色后，经紫外线照射亦可发荧光，荧光显微镜就是对这类物质进行定性和定量研究的工具之一。
荧光显微镜的光源所起的作用不是直接照明，而是作为一种激发标本的内荧光物质的能源。我们之所以能观察标本，不是由于光源的照明，而是标本内荧光物质吸收激发的光能后所呈现的荧光现象。 荧光显微镜和普通显微镜有以下的区别： 1.照明方式通常为落射式，即光源通过物镜投射于样品上； 2.光源为紫外光，波长较短，分辨力高于普通显微镜； 3.有两个特殊的滤光片，光源前的用以滤除可见光，目镜和物镜之间的用于滤除紫外线，用以保护人眼。 荧光显微镜也是光学显微镜的一种，主要的区别是二者的激发波长不同。由此决定了荧光显微镜与普通光学显微镜结构和使用方法上的不同。 荧光显微镜是免疫荧光细胞化学的基本工具。它是由光源、滤板系统和光学系统等主要部件组成。是利用一定波长的
光激发标本发射荧光，通过物镜和目镜系统放大以观察标本的荧光图像。 二．工作原理 光源 多采用200W的超高压汞灯作光源，它是用石英玻璃制作，中间呈球形，内充一定数量的汞，工作时由两个电极间放电，引起水银蒸发，球内气压迅速升高，当水银完全蒸发时，可达50～70个标准大气压力，这一过程一般约需5～15m i n。超高压汞灯的发光是电极间放电使水银分子不断解离和还原过程中发射光量子的结果。它发射很强的紫外和蓝紫光，足以激发各类荧光物质，因此，为荧光显微镜普遍采用。 超高压汞灯也散发大量热能。因此，灯室必须有良好的散热条件，工作环境温度不宜太高。 新型超高压汞灯在使用初期不需高电压即可引燃，使用一
激光扫描共聚焦显微镜的原理和应用-17954讲解
激光扫描共聚焦显微镜的原理和应用 Tina(2007-10-23 09:40:17 一、激光扫描共聚焦显微镜的原理 传统的光学显微镜使用的是场光源，标本上每一点的图像都会受到邻近点的衍射或散射光的干扰；激光扫描共焦显微镜(Laser Scanning Confocal Microscope，LSCM采用点光源照射样本，在焦平面上形成一个轮廓分明的小的光点，该点被照射后发出的荧光被物镜搜集，并沿原照射光路回送到由双色镜构成的分光器。分光器将荧光直接送到探测器。光源和探测器前方都各有一个针孔，分别称为照明针孔和探测针孔。照明针孔与探测针孔相对于物镜焦平面是共轭的，焦平面上的点同时聚焦于照明针孔和发射针孔，焦平面以外的点被挡在探测针孔之外不能成像，这样得到的共聚焦图像是标本的光学切面，避免了非焦平面上杂散光线的干扰，克服了普通显微镜图像模糊的缺点，因此能得到整个焦平面上清晰的共聚焦图像。 原理图
二、激光扫描共聚焦显微镜组成特点 LSCM由显微镜光学系统，激光光源，扫描装置和检测系统构成，整套仪器由计算机控制，各部件之间的操作切换都可在计算机操作平台界面中方便灵活地进行。显微镜是LSCM的主要组件，它关系到系统的成像质量。通常有倒置和正置两种形式，前者在切片、活细胞检测等生物医学应用中使用更广泛。 三、激光扫描共聚焦显微镜的应用 一）细胞的三维重建
普通荧光显微镜分辨率低，显示的图像结构为多层面的图像叠加，结构不够清晰。LSCM 能以0.1μm的步距沿轴向对细胞进行分层扫描，得到一组光学切片，经A/D转换后作为二维数组贮存。这些数组通过计算机进行不同的三维重建算法，可作单色或双色图像处理，组合成细胞真实的三维结构。旋转不同角度可观察各侧面的表面形态，也可从不同的断面观察细胞内部结构，测量细胞的长宽高、体积和断层面积等形态学参数。通过模拟荧光处理算法，可以产生在不同照明角度形成的阴影效果，突出立体感。通过角度旋转和细胞位置变化可产生三维动画效果。LSCM 的三维重建广泛用于各类细胞骨架和形态学分析、染色体分析、细胞程序化死亡的观察、细胞内细胞质和细胞器的结构变化的分析和探测等方面。 二）静态结构检测：原位鉴定细胞或组织内生物大分子、观察细胞及亚细胞形态结构 1.细胞原位检测核酸 用于细胞核定位及其形态学观察、检测细胞内DNA的复制及断裂情况以及染色体定位观察。 2.原位检测蛋白质、抗体及其他分子 原位检测蛋白质、抗体及其他分子 免疫荧光标记技术 检测荧光蛋白 3.检测细胞凋亡
超分辨荧光显微技术原理
超分辨荧光显微技术原 理 Document number：NOCG-YUNOO-BUYTT-UU986-1986UT
2014年的诺贝尔理综奖颁发给了“超分辨荧光显微技术”。也许接下来的几天，媒体会关注StefanHell、EricBetzig二人的传奇经历，或者另一名华人女科学家与该奖项失之交臂的遗憾。但是八卦之外，这项成果背后的科学本身也非常有意思。 这里面有三个关键词：“超分辨”、“荧光”和“显微技术”，我希望能够解释清楚以下几个问题，尤其是后两个问题： 1.为什么需要（光学）显微技术？ 2.为什么光学显微镜的分辨率存在理论极限？ 3.用怎样的方法可以突破这个理论极限以达到“超分辨”为什么这个理论极限可以被突破？ 5.为什么非得是荧光显微技术，而非普通的明场（透射光）显微技术？ 1.采样定理与显微镜 我们用肉眼观察或者用相机拍摄一个物体时，物体上的每一个细微的点都会在眼睛的视网膜或是相机的感光芯片上成像。那么我们为什么不能看到细菌等微小的东西，为什么不能把照片无限放大以看清远处树木上面的每一片叶子呢？ 这个问题的答案比较简单：因为组成视网膜的每一个感光细胞（视杆细胞和视锥细胞）、相机芯片上的每一个感光元件（CCD、CMOS等）都是有大小的。比如视网膜中央凹区域的视锥细胞直径平均约为5微米。而由于奈奎斯特-香农采样定理的限制，视网膜上能分清的两个相邻像点的距离是视锥细胞直径的两倍，即10微米。再结合眼球的构造，大致可以推断出，在距离眼睛25厘米的位置，我们能分辨物体上相距为80微米的两个点，换算成点阵密度就是大约320ppi，这也是苹果所谓“视网膜屏”分辨率的来历。
§8.3 扫描光学系统
§8.3 扫描光学系统 光束传播方向随时间变化而改变的光学系统称其为扫描光学系统。扫描光学系统在现代光学和光电技术中具有极其重要作用，例如使用激光束扫描装置可实现以时间为顺序的图像电信号转变为二维目视图像。此外，在激光存储器、激光打印机和高速摄影系统中都使用扫描光学系统，因此有必要介绍扫描光学系统的特性及扫描物镜的设计要求。 一、扫描方程式 光束扫描的形式可由多种方法得到，如光学透镜扫描、棱镜扫描、反射镜扫描、全息扫描和声光扫描等。但不管其扫描方式如何，表征其扫描特性的只有三个参数，即扫描系统的孔径大小D、孔径的形状因子a和最大扫描角θ。根据瑞利衍射理论，扫描系统的衍射极限分辨 角为 由上式可见，孔径大小D和形状因子决定了扫描系统的极限分辨角，即决定了扫描系统的扫描光点大小和成像质量。 对不同的扫描系统，其扫描孔径是不一样的。例如透镜扫描系统，其扫描孔径的形状是圆形的，棱镜扫描系统，其扫描孔径的形状是矩形或梯形的。因此它们的孔径形状因子a值是不同的。为了能准确地描述各种扫描系统的衍射分辨角，表给出了各种不同扫描孔径的形 状因子a的数值。 扫描孔径形状因子 孔径形状矩形圆形梯形三角形 形状因子a 1 1.22 1.5 1.67 若扫描系统的最大扫描角(扫描范围)为，则扫描系统的扫描点数N为 称为扫描系统的扫描方程式，它表明扫描系统的扫描点数与扫描光束的波长和扫描系统的三个参数(a、和D)有关。 二、光学扫描系统 扫描光学系统的种类很多，为简单起见，本节只讨论光学扫描系统。光学扫描系统分为物
镜扫描、物镜前扫描和物镜后扫描三种形式，其中以物镜扫描的扫描形式最为简单，只要运动物镜即可达到光束扫描的目的。一束平行光平行于物镜L的光轴入射，且平行光束的中心距物镜光轴为x，当物镜L严格校正像差后，平行光通过物镜L后一定聚焦于焦平面上的光轴处。若物镜L绕平行光束的中心轴线转动，则平行光束的聚焦点在物镜L的焦平面上扫描出半径为x的圆，当调整物镜光轴与平行光束中心轴线间的距离时，任意半径的扫描圆均可得到，所得扫描圆的最大直径应小于物镜L的直径。 物镜后扫描系统扫描反射镜位于物镜之后，其优点是物镜口径相对较小（只要满足扫描光束的口径要求），且扫描物镜只要求校正轴上点像差即可。物镜后扫描系统的缺点是扫描像面为一曲面，不利于图像的接收与转换。 地校正轴上点和轴外点像差，即可获得很好的扫描成像，且扫描成像面为一平面。因此一般的光学扫描系统多采用物镜前扫描形式。 为了保证物镜前扫描系统在扫描像面上得到均匀的像面照度和尺寸一致的扫描像点，扫描物镜一般设计成像方远心光路，使其像方主光线始终垂直于扫描像平面，如图8－14所示，这种扫描系统又称其为远心扫描系统。若要保证远心扫描特性，除扫描物镜作远心物镜设计要求外，对提供给扫描物镜的成像光束也必须满足远心光路的要求，即只有扫描反射镜的转动轴心与扫描物镜的物方焦点重合时，才能使轴外扫描光束的中心光线（主光线）通过物镜的物方焦点，构成像方远心光路。 三、扫描物镜物镜 物镜前扫描光学系统的光束入射角是随时间而变化的，且通过扫描物镜在垂直于光轴的像平面上成像，因此像平面上的成像位置应为光束入射角的函数，一般可表示为 两边对微分，可得 当光束入射角以等角速度变化时，应为常量，若想在扫描成像面上作等速扫描 成像，则也应为常量，可知，也必为常量，则函数的表达式可写 成下式 得 引入成像关系的条件，并略去常数项，则有