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食品中致病菌的快速检测技术的研究现状与进展

参考文献：

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［９］潘瑞炽，董愚德．植物生理学（第３版）［Ｍ］．北京：高等教育出版社，１９９５．６７－１１．

食品中致病菌的快速检测技术的

研究现状与进展

陈庆森１，冯永强２，黄宝华１，魏国祥１，庞广昌１，胡志和１

（１．天津商学院生物工程系，天津３００１３４；　２．天津市海河乳业有限公司，天津３００１３４）

摘要：本文从食品中致病菌快速检测的技术发展现状的角度出发，较系统地介绍了利用生物化学、免疫学和分子生物学的技术手段快速检测病原菌的技术和方法，特别是近几年来基因操作技术在病原菌快速检测方面的应用研究，这些技术对该领域产生了很大的推动作用。

关键词：致病菌；快速检测技术；微生物

Ｔｈｅ　Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ　ａｎｄ　ｔｈｅ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ　Ｓｔａｔｕｓ　ｏｆ　Ｆａｓｔ　ＤｅｔｅｃｔｉｏｎＴｅｃｈｉｎｑｕｅ　ｏｆ　Ｐａｔｈｏｇｅｎｉｃ　Ｂａｃｔｅｒｉａ　ｉｎ　Ｆｏｏｄｓｔｕｆｆ

ＣＨＥＮ　Ｑｉｎ－ｓｅｎｇ１，ＦＥＮＧ　Ｙｏｎｇ－ｑｉａｎｇ２，ＨＵＡＮＧ　Ｂａｏ－ｈｕａ１，

ＷＥＩ　Ｇｕｏ－ｘｉａｎｇ１，ＰＡＮＧ　Ｇｕａｎｇ－ｃａｎｇ１，ＨＵ　Ｚｈｉ－ｈｅ１

（１．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ　ｏｆ　Ｂｉｏｌｇｉｃａｌ　Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，　Ｔｉａｎｊｉｎ　Ｕｎｉｒｅｒｓｉｔｙ　ｏｆ　Ｃｏｍｍｅｒｃｅ，　Ｔｉａｎｊｉｎ　３００１３４，　Ｃｈｉｎａ；

　２．Ｔｉａｎｊｉｎ　Ｈａｉｈｅ　Ｄａｉｒｙ　Ｃｏ．　Ｌｔｄ．，　Ｔｉａｎｊｉｎ　３００１３４，Ｃｈｉｎａ）

Ａｂｓｔｒａｃｔ　：Ｔｈｉｓ　ｔｅｘｔ　ｃａｕｓｅｓ　ｔｈｅ　ａｎｇｌｅ　ｏｆ　ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｃａｌ　ｃｕｒｒｅｎｔ　ｓｉｔｕａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ　ｔｈａｔ　ｔｈｅ　ｇｅｒｍ　ｍｅａｓｕｒｅｓ　ｆａｓｔ　ｔｏ　ｓｅｔｏｕｔ　ｆｒｏｍ　ｔｈｅ　ｆｏｏｄ，　ｈａｖｅ　ｒｅｃｏｍｍｅｎｄｅｄ　ｕｔｉｌｉｚｉｎｇ　ｔｈｅ　ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｃａｌ　ｍｅａｎｓ　ｏｆ　ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，　ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ　ａｎｄ　ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　ｂｉｏｌｏｇｙ　ｔｏｍｅａｓｕｒｅ　ｔｈｅ　ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　ａｎｄ　ｍｅｔｈｏｄ　ｏｆ　ｐａｔｈｏｇｅｎｓ　ｆａｓｔ　ｍｏｒｅ　ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃａｌｌｙ，　Ｅｓｐｅｃｉａｌｌｙ　ｔｈｅ　ｏｐｅｒａｔｉｎｇ　ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　ｏｆ　ｇｅｎｅ　ｈａｓｍｅａｓｕｒｅｄ　ｔｈｅ　ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ　ｓｔｕｄｙ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｒｅｓｐｅｃｔ　ｆａｓｔ　ｉｎ　ｐａｔｈｏｇｅｎｓ　ｉｎ　ｒｅｃｅｎｔ　ｙｅａｒｓ，　Ｔｈｅ　ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　ｈａｓ　ｐｒｏｄｕｃｅｄ　ｔｈｅ　ｅｎｏｒｍｏｕｓｉｍｐｅｔｕｓ　ｔｏ　ｔｈｉｓ　ｆｉｅｌｄ．

Ｋｅｙ　ｗｏｒｄｓ：ｐａｔｈｏｇｅｎ；ｆａｓｔ　ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ　ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ；ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍ

中图分类号：　ＴＳ２０７．７文献标识码：　Ａ文章编号：１１０２－６６３０（２００３）１１－０１４８－０５

收稿日期：２００３－０５－０８

作者简介：陈庆森（１９５７－），男，教授，从发酵生物技术及活性蛋白质、酶技术的研究。

随着科学技术水平的日新月异的发展，人类对文明程度的要求越来越高，特别是对危害人类健康的重要的致病微生物。人类进入２１世纪，一些致病微生物的快速检测技术也得到了迅速地发展［１］［９］［１３］，如：免疫学中的放射免疫分析（ＲＩＡ）、酶免疫分析（ＥＩＡ）［６］、荧光免疫分析（ＦＩＡ）、时间分辨荧光免疫分析（ＴｒＦＩＡ）、化学发光免疫分析（ＣＩＡ）、生物发光免疫分析（ＢＩＡ）等，足以检出临床标本中痕量的（１０－１８～１０－２１）微生物抗原；生物化学中的快速专有酶反应和细菌代谢产物的检测技术；分子生物学方面已经形成了核酸探针（Ｎｕｃｌｅａｒ　ａｃｉｄ　ｐｒｏｂｅ）［２］［５］和聚合酶链反应（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ　ｃｈａｉｎ　ｒｅａｃｔｉｏｎ）［３，４］的检测技术，该技术以其敏感、特异、简便、快速的特点成为世人瞩目的生物技术革命的新产物，业已逐步应用于食源性病原菌的检测。然而传统的细菌分离、培养及生化反应，已远远不能满足对各种病原微生物的诊断以及流行病学的研究，更跟不上人类对致病微生物快速、简便、特异、敏感、低耗且适用的快速诊断及检测的方法。本文仅就微生物实验室可常规应用的技术即快速微生物检查法作一介绍。

１以生物化学手段建立的快速检测技术

１．１常规的致病微生物的检测技术

法国科学家巴斯德（ＬｏｕｉｓＰａｓｔｅｕｒ，１８２２～１８９５年）首先实验证明有机物质发酵和腐败是由微生物引起，而酒类变质是因污染了杂菌所致，从而推翻了当时盛行的“自然发生说”。巴斯德的研究，开始了微生物的生理学时代，人们认识到不同微生物间不仅有形态学上的差异，在生理学特性方面亦有所不同，进一步肯定了微生物在自然界中所起的重要作用。众所周知，不同病原体的化学组成或所产生的代谢产物各异，利用微生物（主要是细菌）的不同生化和生理特性，可以对细菌进行鉴定。生化鉴定是检测细菌最常用的方法。细菌检验中的微量化和自动化，是微生物学诊断中的发展方向，经过多年的研究和不断改进，常规的临床细菌学诊断已由系列的试剂盒商品成套供应，来替代各检验部门自行配制试剂，手工操作的缓慢和繁琐状态［９］。

另外，气相色谱和高效液相色谱的分析也应用到致病微生物的检测中，主要是依据不同病原体的化学组成或所产生的代谢产物各异，利用上述色谱检查可直接分析各种体液中的细菌代谢产物、细胞中的脂肪酸、蛋白、氨基酸、多肽、多糖等，以确定病原微生物的特异性化学标志成分，协助病原诊断和检测，其中以气相色谱应用较多。尽管该法具有简单、快速、可靠，在数小时内即可得出结果的特点，但由于使用的仪器设备相对比较昂贵，所以不适应现场的快速检测，特别是食品加工过程中的ＨＡＣＣＰ中的关键控制点的检测；另外其特异性和低耗也是不明显的。

天津医科大学检验系王金良教授报道了快速检测细菌生化反应的色原或荧光底物及成套鉴定系统（Ｃｈｒｏｍｏｇｅｎｉｃ　ｏｒｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ　ｓｕｂｓｔｒａｔｅｓ　ｆｏｒ　ｒａｐｉｄ　ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｂａｃｔｅｒｉａ）的技术，该生化反应的成套系统中底物系由色原（呈色）或荧光与糖类或氨基酸人工合成。此底物无色，经细菌的细胞内或细胞外酶的作用而释放出色原（呈色）或荧光，其优点是特异性强，反应迅速，易于自动化检测，明显提高了细菌生化反应的准确性，实现了细菌生化反应革命性变化。

常用的酶有：糖苷酶和氨基肽酶；呈色的色原有：α、β萘酚、邻位或对位硝基酚、对硝基苯胺、酚酞、２－氨４－硝基苯……；常用的荧光物有：４－甲基伞形酮（４ＭＵ）、７－氨基－４－甲基伞形酮香豆素。　以此类先进的生化反应底物为基础，已制成各菌属细菌鉴定装置，一次可做１０～４０项试验，反应结果可由人工或仪器判定，在通过编码得出鉴定结果。先进的细菌自动鉴定系统可在２～６ｈ完成鉴定，就是在鉴定系统中应用了此类色原或荧光底物。１．２微生物专有酶快速反应系统的检测技术

微生物专有酶快速反应是根据细菌在其生长繁殖过程中可合成和释放某些特异性的酶，按酶的特性，选用相应的底物和指示剂，将他们配制在相关的培养基中。根据细菌反应后出现的明显的颜色变化，确定待分离的可疑菌株，反应的测定结果有助于细菌的快速诊断。这种技术将传统的细菌分离与生化反应有机的结合起来，并使得检测结果直观，正成为今后微生物检测发展的一个主要发展方向。

利用细菌中某些具有特征性的酶，应用适当的底物可迅速完成细菌鉴定。如沙门氏菌具有辛酸酯酶，以４ＭＵ－辛酸酯酶为底物，经沙门氏菌酶解，在紫外灯下观察游离４ＭＵ的荧光。卡他莫拉菌具有丁酸酯酶，可用丁酸酯色原底物快速鉴定等。现将快速鉴定用细菌的特异性酶列于表１。

表１致病菌快速诊断用的特异性酶

部分微生物种类所具有的特异性酶

脑膜炎奈瑟菌γ谷氨酰转肽酶

肠球菌吡咯芳胺酶（ＰＹＲ）、亮氨酸氨肽酶（ＬＡＰ）

沙门菌辛酸酯酶

大肠埃希菌β葡萄糖醛酸酶

白色念珠菌脯氨酸氨肽酶、Ｎ－乙酰β－Ｄ半乳糖苷酶

热带念珠菌吡咯磷酸酶

产单核李斯特菌丙氨酸氨肽酶

金黄色葡萄球菌β－　Ｎ－乙酰葡萄糖胺酶

腐生，中间，斯氏葡萄球菌β半乳糖苷酶

Ａ族链球菌吡咯芳胺酶（ＰＹＲ）

难辨梭菌谷氨酸脱氢酶（ＧＤＨ）、脯氨酸酶

克柔念珠菌酸性磷酸酶

Ｄｅｌｉｓｅ等新合成一种羟基吲哚－β－Ｄ葡萄糖甘酸（ＩＢＤＧ），在β－Ｄ葡萄糖苷酶的作用下，生成不溶性的蓝，将一定量的ＩＢＤＧ加入到麦康盖培养基琼脂中制成ＭＡＣ－ＩＢＤＧ平板，３５℃培养１８ｈ，出现深蓝色菌落者为大肠埃

希氏阳性菌株。其色彩独特，且靛蓝不易扩散，易与乳糖发酵菌株区别。王金良教授等应用β－萘酚辛酯酶为底物，经沙门氏菌酶解，释出β－　萘酚与固兰作用出现紫色，反应在纸片上进行，只需５ｍｉｎ即可完成沙门氏菌的鉴定。这对食品与环境卫生检验有重要价值。他们还运用对硝基酚－β－葡萄糖醛酸为底物不仅可快速鉴定大肠埃希菌，尚可在４０５　ｎｍ测定对硝基酚的释放量而定量，检测最低限可达１００ＣＦＵ／ｍｌ。定量检测在环境与食品卫生检验中极为重要，此法提供一新的手段。

２以免疫学方法建立的快速检测技术

免疫检测的基本原理是抗原抗体反应。抗原抗体反应是指抗原与相应抗体之间所发生的特异性结合反应。不同的微生物有其特异的抗原并能激发机体产生相应的特异性抗体。在免疫检测中，可利用单克隆抗体检测微生物的特异抗原，也可利用微生物抗原检测体内产生的特异抗体，两种方法均能判断机体的感染状况。

细菌由于表面结构复杂，其抗原较多，同属细菌中有致病菌也有非致病菌，如Ａ族链球菌为致病菌，而粪链球菌一般不致病，此外，不同细菌之间，细菌与宿主之间也可能存在共同抗原，故实际所开展的研究方面很少根据抗原检测判断致病细菌。检测细菌的抗体，要结合污染物的污染程度来作出初步诊断，若被测污染物的抗体滴度逐渐升高，就可以明确地给出判断结果。病毒、立克次体、支原体、衣原体抗原结构简单、特异性较好，加之难以培养、分离，应用免疫学试验诊断具有很大的实用价值。一般情况下，在实际被检测物品中检测到上述微生物抗原可判断为该物品受到污染，而仅发现抗体，只能表明该污染物品感染过该微生物。２．１免疫荧光技术

免疫荧光技术（ｉｍｍｕｎｏｆ１ｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ　Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ）是用荧光素标记的抗体检测抗原或抗体的免疫学标记技术，又称荧光抗体技术。所用的荧光素标记抗体通称为荧光抗体，系由荧光素（常用异硫氰基荧光黄，Ｆ１ＴＣ），以化学方法与效价较高、活性较强的抗体共价结合后制备而成［１３］。免疫荧光技术在实际应用上主要有直接法和间接法。直接法是在检测样品上直接滴加已知特异性荧光标记的抗血清，经洗涤后在荧光显微镜下观察结果。间接法是在检样上滴加已知的细菌特异性抗体，待作用后经洗涤，再加入荧光标记的第二抗体。如研制成的抗沙门氏菌荧光抗体，用于７５０份食品样品的检测，结果表明与常规培养法符合率基本一致。免疫荧光直接法可清楚地观察抗原并用于定位标记观察，如病毒和病毒相关抗原在感染细胞内的定位。该技术已广泛应用于病毒感染过程的研究以及病毒感染性疾病诊断。

２．２酶免疫测定技术

酶免疫测定（ｅｎｚｙｍｅ　ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ，ＥＩＡ）根据抗原抗体反应是否需要分离结合的和游离的酶标记物而分为均相和非均相两种类型。非均相法较常用，包括液相免疫测定法与固相免疫测定法。固相免疫测定法的代表技术是ＥＬＩＳＡ。ＥＬＩＳＡ技术是抗原或抗体吸附到固相载体上作为一种试剂来检测标本中有元相应的抗体或抗原的一种方法。根据反应原理，加入某种酶标记的抗体或抗原，洗涤除去未结合物，加入该酶的底物，酶催化底物生成有色产物，产物的量与标本中受检物的量有关，根据反应颜色的深浅可定量测定。应用酶联免疫技术制造的ｍｉｎｉ－Ｖｉｄａｓ全自动免疫分析仪，是用荧光分析技术通过固相吸附器，用已知抗体来捕捉目标生物体，然后以带荧光的酶联抗体再次结合，经充分冲洗，通过激发光源检测，即能自动读出发光的阳性标本，其优点是检测灵敏度高，速度快，可以在２４～４８ｈ的时间内快速鉴定沙门氏菌、大肠杆菌Ｏ１５７：Ｈ７、单核李斯特菌，空肠弯曲杆菌和葡萄球菌肠毒素等。我们承担的“十五”国家奶业重大专项计划“乳品质量安全监测关键技术研究与应用”中重点要研究建立志贺氏菌、葡萄球菌、溶血性链球菌等主要致病菌的快速检测方法及预警控制机制。研究已了解部分原料乳生产基地的微生物污染的现状，初步建立了志贺氏菌、金黄色葡萄球菌的ＥＬＩＳＡ监测的技术方法，以及制备快速检测的试剂盒的技术［７］［１０］［１３］。

ＥＩＡ在微生物学领域中可用于病原的检测、抗体检测和细菌代谢产物的检测。ＥＩＡ具有高度的特异性和敏感性，几乎所有可溶性的抗体抗原反应系统均可检测，最小可测值能够达到ｎｇ甚至ｐｇ水平。与放射免疫方法相比较，ＥＩＡ的标记试剂较稳定，且无放射性危害；与免疫荧光技术相比，ＥＩＡ敏感性高，不需特殊设备，结果观察简便。酶免疫技术发展较晚，但随着试剂的商品化以及自动化操作仪器的广泛使用，已使酶免疫技术日趋成熟，方法稳定，结果可靠，在很多领域取代了荧光技术和放射免疫测定法。

２．３免疫印迹技术

免疫印迹（ｉｍｍｕｎｏｂ１ｏｔ）法分三个步骤：第一，ＳＤＳ聚丙烯酞胺凝胶电泳（ＳＤＳ－ＰＡＧＥ）。将蛋白质抗原按分子大小和所带电荷的不同分成不同的区带；第二，电转移。目的是将凝胶中已分离的条带转移至硝酸纤维素膜上；第三，酶免疫定位，该步的意义是将前两步中已分离，但肉眼不能见到的抗原带显示出来。将印有蛋白抗原条带的硝酸纤维素膜依次与特异性抗体和酶标记的第二抗体反应后，再与能形成不溶性显色物的酶反应底物作用，最终使区带染色。本法综合了ＳＤＳ－ＰＡＧＥ的高分辨率及ＥＬＩＳＡ的高敏感性和高特异性，是一种有效的分析手段，在蛋白质化学中应用广泛，既可用于分析抗原组分及其免疫活性，也可用于疾病的诊断。免疫印迹实践

中最早的应用是ＨＩＶ感染的血清学诊断。病毒感染细胞或可溶性病毒、细菌材料等都可以采用免疫印迹方法检测。２．４免疫组织化学方法

是应用免疫学中的抗原抗体反应，借助可见的标记物，在组织原位显示抗原或抗体的方法。常用的免疫组织化学方法有荧光免疫和酶免疫组化技术、金标免疫组织化学技术和免疫电镜，该技术特点是对细胞涂片、印片、组织切片进行处理和染色镜检。免疫组化技术弥补了上述血清学诊断方法的不足，使得在细胞或组织内检测病原微生物成分成为可能。对于在宿主组织液中微量表达或不表达抗原、抗体的微生物，免疫组化具有较好的辅助诊断价值。利用免疫组化技术，还能观察被侵犯组织致病微生物繁殖和对组织破坏情况。

３基因操作技术在快速检测食品中病原微生物的研究进展

随着微生物学、生物化学和分子生物化学的飞速发展，对病原微生物的鉴定已不再局限于对它的外部形态结构及生理特性等一般检验上，而是从分子生物学水平上研究生物大分子，特别是核酸结构及其组成部分。在此基础上建立的众多检测技术中，核酸探针（Ｎｕｃｌｅａｒ　ａｃｉｄ　ｐｒｏｂｅ）和聚合酶链反应（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ　ｃｈａｉｎ　ｒｅａｃｔｉｏｎ），以其敏感、特异、简便、快速的特点成为世人瞩目的生物技术革命的新产物，业已逐步应用于食源性病原菌的检测。３．１核酸探针（Ｎｕｃｌｅａｒ　ａｃｉｄ　ｐｒｏｂｅ）在快速检测食品中致病菌的研究现状［５，６］

将已知核苷酸序列ＤＮＡ片段用同位素或其他方法标记，加入已变性的被检ＤＮＡ样品中，在一定条件下即可与该样品中有同源序列的ＤＮＡ区段形成杂交双链，从而达到鉴定样品中ＤＮＡ的目的，这种能认识到特异性核苷酸序列有标记的单链ＤＮＡ分子核酸探针或基因探针。根据核酸探针中核苷酸成分的不同，可将其分成ＤＮＡ探针或ＲＮＡ探针，一般大多选用ＤＮＡ探针；根据选用基因的不同分成两种，一种探针能同微生物中全部ＤＮＡ分子中的一部分发生反应，它对某些菌属、菌种、菌株有特异性，另一种探针只能限制性同微生物中某一基因组ＤＮＡ　发生杂交反应，如编码致病性的基因组，它对某种微生物中的一种菌株或仅对微生物中某一菌属有特异性。这类探针检测的基因相当保守，包括大部分ｒＲＮＡ，因为他既可能在一种微生物中出现，又可代表一群微生物。如应用ｒＲＮＡ探针检测作为筛选食品污染程度的指示菌Ｅ．Ｃｏｌｉ．选择探针的原则是只能同检测的细菌发生杂交反应，而不受非检菌存在的干扰。

核酸探针的应用主要的范围有（１）用于检测无法培养，不能用作生化鉴定、不可观察的微生物产物以及缺乏诊断抗原等方面的检测，如肠毒素。（２）用于检测同食源性感染有关的病毒病，如检测肝炎病毒，流行病学调查研究，区分有毒和无毒菌株。（３）检测细菌内抗药基因。（４）分析食品是否会被某些耐药菌株污染，判定食品污染的特性。（５）细菌分型，包括ｒＲＮＡ分型。

核酸探针检测技术的最大优点是⑴特异性，就是说一个适当组建的ＤＮＡ探针能绝对特异性地与所检微生物而不与其他微生物发生反应。对食品检测而言，就是不与样品中内源性杂菌和样品自身ＤＮＡ发生非特异性反应。另外，核酸之间的识别连接比抗原抗体准确，并且探针检测比免疫学方法灵活。尽管形成抗原抗体复合物比核酸杂交快，但能通过加磺化葡聚糖把退火速度增加１００倍，从而提高反应速度，核酸比蛋白质耐受高温（１００℃）、有机溶剂、螯合剂和高浓度工作液的破坏能力强，所以用比提取制备蛋白质强烈的多的方法制备核酸，不会影响杂交反应。当然ＲＮＡ探针除外，因为ＲＮＡ不耐受碱处理，需用其它方法制备检测用ＲＮＡ。⑵敏感性，ＤＮＡ探针敏感性取决于探针本身和标记系统，其目的是检测出单个病毒和细菌。用３２Ｐ标记物通常可检出１０－８ｍｏｌ特异ＤＮＡ片段，相当于０．５ｐｇ；１０００个碱基对的靶系列，相当于１０００～１００００个细菌。用亲和素标记探针检测１ｈ培养物ＤＮＡ含量在１１０ｐｇ，两者敏感性大致相同，而血清学方法只能达到１ｎｇ的水平。

但探针检测技术中也存在一定的问题，如检测一种菌就需要制备一种探针；要达到检测量还要对样品进行一定时间的培养；探针检测是分析基因序列，对毒素污染的食品有时因样品中不含产毒菌而无法检测。

目前制备核酸探针杂交技术有⑴夹心杂交法（Ｓａｎｄｗｉｓｈ　ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ），该法是由三种不同作用的核酸成分组成：①与固相支持物连接的捕获探针；②产生信号的检测探针；③靶核酸序列。靶核酸在这个体系中起连接捕获探针和信号检测探针的作用。如体系中存在上述三种成分，靶核酸能于上述两种核苷酸杂交，洗脱去除杂质后能得到一个清晰的检测信号，如果靶核酸不与上述两种探针杂交，则信号探针无法连接在固相物上，洗脱后固相物上无信号应答。⑵核酸置换杂交分析法（Ｓｔｒａｎｄ　ｄｉｓｐｌａｃｅｍｅｎｔ　ａｓｓａｙ），该法是在夹心杂交法的基础上改进的一种方法。先奖捕获探针连接在固相物上，然后在此探针上以微弱的结合方式杂交一个短小能产生信号的核酸，如果靶ＤＮＡ能与捕获探针杂交可通过竞争置换出带信号的核苷酸片段，在检测过程中产生信号的单股核酸可转化为ＡＴＰ，再加入荧光素酶，用生物发光分析法检测。其优点在于背景干扰小，敏感性强。缺点为不是所有捕获探针都能应用这种方法杂交，且信号探针会不断地从捕获探针上脱落。⑶浸染棒法　（Ｄｉｐｓｔｉｃｋ　ａｓｓａｙ），该法是夹心杂交法最新的一种改进方法。它用两种探针，其中一个进行标记，另一个是单核苷酸长链，如多聚腺苷酸。浸染棒上包裹与多聚腺苷酸长链探针能互补配对的碱基成分，即多聚胸腺嘧啶，尽管杂交反应在溶液中完成，但浸染棒是完成最后检测的固相支持物。它

比薄膜法能更有效地减少背景干扰，提高检测效率。亦已用于沙门氏菌和李氏菌的检测。对荧光素标记探针可用辣根过氧化物酶标记荧光素抗体，通过比色法检测复合物浓度。

３．２聚合酶技术（ＰＣＲ）在快速检测食品中致病菌的研究进展［２～４］

为提高ＤＮＡ探针的敏感性，可先将靶ＤＮＡ序列扩增，增加ＤＮＡ数量，使其达到足够的检测量，若反应以动力学为基础，则能定量分析。自１９８３年Ｍｉｌｌｕｓ　和Ｃｅｔｕｓ发明了最基本的聚合酶链反应即ＰＣＲ法以来，又先后对ＰＣＲ法进行了改良如：Ｑβ复制酶法、连续扩增反应法（Ｌａｒ）和转录放大系统（ＴＡＳ／３ＳＲ／ＮＡＳＢＡＴＭ），到核酸片段扩增法（ＮＡＳＢＭＴＭ）已能将１００个分子的ＤＮＡ扩增到１００μｇ的水平。其次，放大信号同时能改善ＤＮＡ探针的敏感性。其中酶标抗体是所推崇的一种方法，使标记抗体能与共价结合的ＤＮＡ探针标记物相结合。如在探针尿嘧啶残基上标记荧光素，再用高度亲和力的辣根过氧化物酶标记抗荧光素抗体检测原始探针。最近有人又研究出一种新方法，它是把探针切成两半，每半标记两种不同的能相互联结的荧光物质或酶系统成分中的一种。当两种探针杂交相互靠近时，激活能量状态的荧光物质转移到邻近的荧光物质或酶系统受体上，而激活受体产生信号。反应过程不用进行分离，因为若没有发生杂交反应，两种成分不能相互靠近，不会产生检测信号。３．３核酸探针和ＰＣＲ在快速检测食品中病原菌上的应用食品中沙门氏菌污染量小，常受应激损伤，不易恢复，现用检测方法得到阴性报告最少需４ｄ，阳性报告还要延迟２～３ｄ。研究检测沙门氏菌的探针难度大，因为它拥有２０００多个血清型，还不清楚它们是否存在共同特异性的致病因子。Ｆｉｌｌａｌ等人从染色体序列和构建的质粒文库中分离到一个适用于沙门氏菌检测的探针。它能和沙门氏菌而不和其他微生物及样品培养基发生非特异性反应。这种用同位素标记的探针，能识别３５０株不同的沙门氏菌。由于该方法最小检出量只有１个细菌／２５ｇ样品，所以需要增菌培养。

ＡＯＡＣ最近认可了Ｇｅｎｅ－Ｔａｒｋ沙门氏菌比色分析法。这种探针标记物为异硫氰酸荧光素（ＦＩＴＣ），再用辣根过氧化酶标记抗ＦＩＴＣ的抗体结合放大探针，在多聚腺苷酸尾部和多聚胸腺嘧啶浸染棒固相薄膜上杂交，对２３９株沙门氏菌的特异性检出率为１００％，假阳性率为０．８％（ＢＡＭ／ＡＯＡＣ培养法假阳性率是２．２％。）

目前，志贺氏菌检测方法存在着质粒容易丢失和受内源菌干扰的问题。用核酸探针检测可克服上述缺陷。现采用人工合成３２Ｐ标记的寡核苷酸探针在固定薄膜上做菌落杂交检测志贺氏菌和侵袭性大肠杆菌（ＥＩＥＣ），也有人用ＰＣＲ扩增技术检测志贺氏菌和侵袭性大肠杆菌（ＥＩＥＣ）。其敏感性为≤１个细菌／ｇ。但ＰＣＲ扩增后需做凝胶电泳进一步鉴定，对常规检测来讲太繁琐。

大多数检测葡萄球菌的探针是针对肠毒素的。它们能同编码肠毒素有关的基因序列杂交，这类探针能检测肠毒素Ａ、Ｂ、Ｃ和Ｅ。最近，ＧｅｎｅＴａｒｋ推出检测金黄色葡萄球菌的探针，能半定量样品中的葡萄球菌，尚未得到ＡＯＡＣ的认可。方法采用浸染棒比色法，探针检测的基因序列是２３ｓｒＲＮＡ。敏感性１００％，假阳性率为９．３％，人工污染样品中没有假阳性结果发生。

另外，利用基因操作技术快速检测致病微生物的研究工作，还涉及有假单胞菌属、大肠杆菌、李斯特杆菌、弧菌、耶尔森氏菌、弯曲杆菌和病毒。

参考文献：

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食品致病菌检测

食品致病菌快速检测技术时间:2004-05-11 10:24:00 来源:食品商务网沙门氏菌、李斯特氏菌、大肠杆菌O157、弯曲杆菌等食物致病菌已成为危害食品安全的头号杀手。如何快速而准确地检测这些致病菌，是有效遏制这些杀手、确保食品安全的首要任务。常规食品微生物检测方法包括反复增菌、菌落分离及多种生化和血清学鉴别实验，不仅步骤复杂，而且耗费时间，难以适应飞速发展的现代食品生产和流通领域。因此为了确保食品的安全性，开发快速检测致病菌的方法非常重要。随着生物、化学、材料科学以及计算机领域的进步，新的快速检测和识别方法层出不穷，这些方法主要包括微量生化试剂盒、抗原－抗体检测、DNA检测，以及常规检测的改进方法。微量生化试剂盒主要用于食品微生物的纯培养的生化鉴别上，与常规方法原理相同。一般是特别针对肠道菌或非肠道菌（如弯曲杆菌、李斯特氏菌、厌氧菌、非发酵性G－菌和G ＋菌）而设计，采用鉴别某种微生物的多种微量培养基及底物，其结果可人工识读；如结合自动保温、监测并记录设备，再与计算机中储存的数据库比较而自动鉴别的话，则可进行多样品大规模快速检测。 DNA检测方法包括应用探针、PCR技术和噬菌体技术，这些检测方法已商品化。探针检测一般是检测rRNA，因其rRNA在细菌中的高拷贝数，无须扩增，检测灵敏。PCR技术是用小片段的 DNA探针或引物，与特异性模板杂交，并用Taq酶扩增。几次循环后，PCR可以在2h 内扩增单拷贝DNA到1百万倍，所以从理论上说无须增菌培养。但由于食品和培养基中存在的抑制剂，可能阻止引物连接和减低扩增效率，所以在检测食品时，还是需要在检测前先进行增菌培养。应用噬菌体对其宿主的高度专一性的特点，进行食品致病菌的检测的实例就是沙门氏菌的检测，其中所使用的噬菌体经过基因工程改造而携带有可检测标记。如有沙门氏菌存在，此噬菌体将标记带给宿主并表达，从而被检出。抗体检测方法是利用抗原－抗体的高度专一性结合的特点。由于反应简单和易操作，现已开发了许多方法用于食品检测。最简单的是乳胶凝集（LA），此法采用抗体包埋的有颜色的乳胶珠或胶体金颗粒，用于从食品中分离的纯培养的快速血清学识别或分型，LA的改良方法是反向被动乳胶凝集（RPLA），法常用于检测食品萃取液中的毒素。例如，食品中金黄色葡萄球菌即可采用此法检出：葡萄球菌的表面存在A蛋白，具有种属特异性，该A 蛋白能与人及多种哺乳动物的免疫球蛋白IgG的Fc段结合，因此可采用IgG包埋的乳胶颗粒，结合血浆纤维蛋白原与凝集因子的凝集反应，来检测金葡菌的有无。酶联免疫分析（ELISA）是食品病原菌检测最常用的抗体分析方法。常设计成“三明治夹心”实验：固体基质上连接抗体，用来捕获增菌培养物中的抗原，与酶相连的第二抗体用于检测。塑料微孔板的侧壁、涂抹棒等检测用具常作为固体基质。在食品微生物检测的国家标准中，金葡菌肠毒素即是采用此法检出的。免疫沉淀或免疫层析也是采用“夹心法”，但是没有采用酶连接物，而是用耦联在有色乳胶珠或胶体金上的抗体来检测。该方法简便易行，无须洗涤或操作，在获得增菌样品后，短短十来分钟即可完成。现已商品化的李斯特氏菌检测试剂盒即采用此方法。此外，用含脱水培养基的一次性板卡，以替代传统的琼脂平板；用荧光法检测细菌ATP，以快速在线检测细菌总数；将生色物质和荧光物质加入到培养基内，以快速检测特征酶活力———这些方法，在食品微生物的快速检测中都已成为常用方法。快速方法的优点是可从大量食品样品中快速筛选某致病菌或毒素。但要注意的是，快速

食品快速检测方法现状及建议

食品快速检测方法现状及建议发表时间：2019-11-27T13:22:33.487Z 来源：《中国西部科技》2019年第24期作者：徐颖[导读] 食品方面的安全问题是人们最为关注的一个问题，并且随着一系列的安全事件的发生，使得人们越来越重视这个问题。由于当前的食品种类特别多，人们在进行食品的购买过程当中对于食品包装当中的成分以及含量都不太了解，同时质量监督的管理部门对这种食品的安全监管不到位，就会使得人们的生命健康受到一定的影响，更重要的是可能会，对人们造成一些心理方面的影响。为了保证，人们在生活当中，有一个健康的身体，避免受到食品安全问题摘要：食品方面的安全问题是人们最为关注的一个问题，并且随着一系列的安全事件的发生，使得人们越来越重视这个问题。由于当前的食品种类特别多，人们在进行食品的购买过程当中对于食品包装当中的成分以及含量都不太了解，同时质量监督的管理部门对这种食品的安全监管不到位，就会使得人们的生命健康受到一定的影响，更重要的是可能会，对人们造成一些心理方面的影响。为了保证，人们在生活当中，有一个健康的身体，避免受到食品安全问题的影响，因此就需要建立以及完善这一种食品检测的方法。本篇文章主要是对于这一种快速食品检测的方法，相关特点进行分析，并对当前国内的检测技术的现状进行分析。在当前的食品检测技术当中存在有许多问题，因此要想，提高食品的检测过程，需要对这种技术进行加强，本篇文章当中就对这样检测技术应用的提高，提出了一系列的建议。 0 引言食品安全是当前人民健康以及构建一种良好的和谐型社会的重大问题，随着近些年来环境污染的问题以及食品添加剂滥用等问题，使得人们对于食品安全的关注程度，逐渐提升。这种食品安全的检测技术是进行科学监管的一项重要的技术，也是对于食品安全进行监督执法的科学依据之一。在以往的一些监督过程当中，使用传统的检测方法，虽然准确性比较高，但是检测方法比较复杂，耗费的时间和成本都比较多，就没有办法迅速的对食品的安全状况进行检测，也不适合进行大量样品的检测，因此就需要推动，快速检测方法以及快速检测技术的发展。 1 食品快速检测概述当前没有对食品快速安全的检测进行定义，通常都认为的是使用较短的时间来进行准确的检测。这一种检测基础首先是，能够缩短安全检测的时间，并且在进行操作的过程当中也能够比较简便，在这样的意义之上，检测的技术，通过分析，可以得出以下的几个方面的特点，首先是，进行检测的实验比较简单，样品通过一些简单的处理之后就可以进行测试。其次，是对技术操作的人员要求比较低，不需要有较高的技术水平也能够进行检测。并且这种样品在进行检测过程当中能够迅速的检测出结果。最后一点则是，使用的成本比较少，尤其是在一些大量的检测过程当中，可以减少时间的成本以及金额的耗费。按照一些检测的时间与应用场合的不同，这种检测的方法也可以分为现场快速检测以及实验室快速地检测，在实验室当中的检测，主要指的就是能够在较短的时间当中将样品进行检测并化验出最后的结果。现场的快速检测就是在30分钟就可以出具一种检验的报告。 2 食品安全快速检测技术的运用 2.1 国外应用现状在韩国和美国的一些国家开始投入快速研究方法的研究。比如说在对疯牛病的污染进行检测的过程当中，就使用了快速检测的方法。并且一些比较发达的国家还使用了速测卡等检测的方法。国外在对快速检测技术进行研究的过程当中，主要将重点放在控制食品生产的一些关键环节。在发达国家由于一些食品企业的自律意识比较强，并且国家的法律执行力度也很大，在快速检测这一方面的重要性并不凸显，仅仅只是从现场快速检测的技术来说，每个国家按照他们不同的国情以及不同的关注焦点来进行检测。实验室当中快速筛选以及检验的技术，在发达国家当中，重视程度比较高，一般使用的就是进出口检验分析。另外在一些发达国家，由于他们在食品生产的规模化方面程度比较高，因此对于生产当中的仪器和控制的技术，有特别的要求。 2.2 国内应用现状国内对于快速检测方法的关注度也开始逐渐提高，在2006年的时候，主要对于食品出口的企业进行检测，在此之后，许多企业开始大规模的使用。当前食品快速检测的装备已经应用在一些食药监的系统当中，不仅仅，是应用在各个节日期间的安全管理当中，还可以广泛的运用在日常的快速检测过程当中，这样能够对餐饮食品的安全进行日常的检测与监控。 3 食品快速检测技术的研发通过我国的食品安全检测的科研人员，多年的努力，在一些农药残留以及兽药残留的检验当中，有着较大的检验成果，在这些方面的检测技术以及方法都有着很大的进展。特别是在十五期间，国家还建立了一种重大科技专项，这一种专项的建立也进一步的使得我国检验技术的进一步发展，在进行了5年的不懈努力之后，已经取得了较好的成果，特别是在检验的方法以及相关检验技术方面的研究有较大的成功。而在检验的设备方面，科研人员已经研究出了一批，有先进技术水平的检验设备。 4 食品安全快速检测技术的发展及建议从20世纪开始，食品安全快速检测技术就开始发展到如今，研究出了一种便携式的检测仪器，并且从一些简单的项目检测发展到如今的几百个项目的检测，从早期的食物中毒的处理到今天，对于食品安全的检测与预防，经历了几个阶段的变革。当前现场快速检测的技术与国家规定的标准方法，具有相同的操作简单并且检测结果快速的优点，但是由于许多的检测方法，再进行样品的处理以及操作规范性方面，还是有许多不足之处就需要最后的研究过程当中进行进一步的完善，当前仅仅只是能够通过快速筛选，并不能作为最终食品安全诊断的依据。当前的食品快速检测当中，仪器设备检测的灵敏度逐渐提高对其中的残留物分析水平也开始提高，第二点则是，检测的速度开始逐渐加快，第三点则是，对于快速检测的技术选择性开始增多，第四点则是，检测的仪器开始不断的发展，不再是之前的大型检测仪器，而是可以设计出一些便携的检测仪器。针对我国当前的国情，许多的单位对于这种快速检测技术的应用还比较少，应该加强这种快速检测技术的推广以及应用。综上所述，当前在市场当中最常用的，快速检测的方法，主要是对一些食品添加剂以及污染物方面进行检测，基本上可以满足对于日常的食品的安全检测。但是在实际的使用过程当中，快速检测技术使用的主要问题，就是体现在使用的成本以及准确性和简便性的方面。并且，我国相关部门也需要积极的进行配合，拓展市场当中的安全监管的范围完善，在流通过程当中的食品安全问题的监督体系，促进食品安全监管平台的发展，使得快速检测的技术能够应用在食品检测过程当中的各个方面。参考文献

常见致病菌的检测

常见致病菌的检测摘要：近年来食品药品安全的问题屡见不鲜，做好致病菌的检测，是防范于未然的措施，因而显得尤为的重要，也越来越受到人们的重视。这就要求我们对一些常见的致病菌检测技术的要有一定的了解。关键词：致病菌，肠球菌，霉菌和酵母菌，金黄色葡萄球菌，沙门氏菌。一.肠球菌（1）、形态与染色【1】肠球菌为革兰阳性（G+）球菌,广泛分布于自然环境及人和动物消化道内。20世纪80年代以来，肠球菌严重感染的发生率和病死率明显升高，并且由于肠球菌的固有耐药和获得性耐药，使许多常用抗菌药物在治疗肠球菌感染时失败。因此，从分子水平对肠球菌致病因子、肠球菌引起的感染机制与治疗的研究显得尤为重要。肠球菌为圆形或椭圆形、呈链状排列的革兰阳性球菌，无芽胞，无鞭毛，为需氧或兼性厌氧菌。本菌对营养要求较高，在含有血清的培养基上生长良好。（3）致病性【1】一般而言，肠球菌的毒力不高。与金黄色葡萄球菌和化脓性链球菌相比，肠球菌对大多数动物的半数致死量（LD50）值相当高，而且肠球菌很少引起蜂窝织炎和呼吸道感染。肠球菌只有在宿主组织寄殖，耐机体非特异及免疫防御机制，并引起病理改变，才能导致感染。粘附测定显示肠球菌可通过细菌表面表达的为粘附素，吸附至肠道、尿路上皮细胞及心脏细胞。这些粘附素的表达亦受细菌生长环境的影响。另外，肠球菌可产生一种聚合物质（系一种蛋白表面物质，可聚集供体与受体菌，以利质粒转移），在体外增强其对肾小管上皮细胞的粘附。细菌生长环境亦影响肠球菌与多形核白细胞反应。血清中生长的肠球菌与多形核白细胞反应较弱，而肉汤中生长的细菌反应较强。体外多形核白细胞对肠球菌的有效杀灭作用需血清补体蛋白参与，而抗肠球菌抗体可增强该作用。（4）、肠球菌属主要检测步骤如下：【2】方法一：肠球菌平板计数法检验程序 25g (mL) + 225 mL 缓冲蛋白胨水

食品安全快速检测作用一

1、食品安全快速检测的要求有哪些？首要的是能缩短检测时间，以及在样品制备、实验准备、操作过程和自动化上的简化方法，体现为三个方面：一是实验准备过程简化，使用的试剂较少；二是样品经简单前处理后即可进行测试，或采用高效快速的样品处理方式；三是简单、快速和准确的分析方法，能对处理好的样品在很短的时间内测试出结果。从广义上来讲，能将原有的检测方法时间缩短的都可以称为快速检测方法，但从严格意义上讲，快速检测出现的是“仪器革命”，传统的检测过程中，检测仪器昂贵，步骤复杂，对操作人员的要求较高，而便携型或易用型设备操作简单，易于掌握，且对操作人员专业知识和技术的要求不高。这些便携型设备的出现使速测技术能够更适应现场检测要求，为快速检测的普及提供了保障，特别是为基层检验人员提供了方便。 2、食品快速检测的方法有哪些？ 1、化学比色分析法 2、近红外与傅里叶变换红外光谱法 3、免疫学分析法 4、生物传感器技术 5、生物芯片检测法 6、生物学发光检测法 7、物理性质检测法 3、简述现场快速检测与实验室快速检测的区别。速测技术是相对于传统和经典的化学检测与仪器检测而言，其特点是需要的检测时间相对较少，对仪器设备等的条件的要求不高，能够携带到交易9(生产）现场（或在线）实验检测。食品安全快速检测可以扩大对食品安全不利因素的监测范围，增加食品样品的监测数量，及时发现问题，迅速采取控制措施，必要时将监测到的问题食品送实验室进行第一步检验，由此达到即发挥快速检测的特点，又充分利用检验室资源，快速检测方法与常规检测方法彼此互补，形成全方位的食品安全监测技术体系 4、常见的食品安全问题有哪些？我国农产品、食品生产企业数量大、规模小、分散，且法律和自制意识很弱，而人口众多，消费人群和渠道也多，因此构成了食品安全问题多发，除了法律、法规、标准、管理等方面需要改进外，再就是一些客观因素不足所致；一是食品安全检验室数量有限，尤其是欠发达地区和广大农村地区；而是检验成本较高，有些应该送检的样品，未能及时送检；三是检验室的检验周期较长，有些样品如蔬菜、豆浆、鲜类食品等，没等检测报告出来食品就已销售完毕。因此现在食品安全检测仅靠常规的化学检验已经不能，满足现场、快速判定的需要，尤其是对于大批量的样品常规检测耗费时间长、成本高、要求相关条件复杂。 1、急性中毒物质，急性中毒物质是指毒性较强的物质，如毒鼠强、甲胺磷、砷、汞、氰化物、甲醇、亚硝酸盐等，当人体摄入一定剂量后，在几分钟或几小时即可出现中毒症状。当

食品检测技术发展现状与展望

食品检测技术发展现状与展望为了人民生活中所食用的食品安全性，我们国家的食品安全检测工作也是逐步的在提高。不过在食品安全的检测上面，检测的工作也是相对复杂的，对于不同种类的食品所采用的技术手段也是不一样的。下面我们就对食品安全检测的技术做一个详细的分析研究。食品检测的含义当今社会的发展，在食品检测方面已经和传统的检测已经大不一样了，在传统的食品检测工作只是判断食品是否存在毒素等简单的检测工作，而现在的食品检测工作不论是在对食品的深度检测、食品的内容检测等多种角度的检测都有全面的进步。其中包括了对食品的营养成分、食品所包含的化学成分、食品中的微生物种类等等方面做出了很专业的评价。而且在食品的生产也是有着严格的把关。发展现状分析食品毒素检测技术。人们在食用食品时，最担心的就是食品中包含毒素，因为食品一旦含有毒性物质就会对人体产生极大的伤害，严重的甚至能够致人死亡。所以在对食品安全进行检测时，对食品的毒性检测也是第一位的，也是最关键的检测内容。所以必须要对食品是否含有毒素物质进行检

测，一旦发现超过国家食品安全的相关规定的毒素物质，绝对不可以进入消费市场进行售卖。这些毒素物质主要的是指：玉米赤酶烯酮、黄曲酶毒素、赫曲酶毒素、脱氧雪腐镰刀菌烯醇等真菌类毒素物质和霉菌类毒素物资以及一些人工合成类的物质毒素，包括重金属超标等待方面。在食品安全的检测上，使用最广泛的是物理化学类检测方法也是各个地区使用最多的技术手段，使用原理相对简单，就是检测食物所包含的各种物质成分和物理化学中标注出来的毒素物质表相对照，做一个基本的判断。不过这种技术手段还不是非常全面的，对于有些食物就不能起到准确的检测能力，所以在这一方面也是需要我们做出跟好的研究及开发方向。食物转基因的检测技术。现代社会中的科技手段也在逐步的提高，我们的日常生活中也是随之出现了很多的转基因食品。伴着转基因食品的出现，对于转基因食品到底能否食用的话题也是越来越多，其安全问题也是人们迫切想要知道的。转基因食品如果能够正常的被人们食用，那将会大大的提升我们的生活质量。但是现在各国的专家也是不能够做到百分之百的确定转基因食品能够被人们安全食用。针对此种情况的出现，就需要我们对转基因食品检测的技术要更加深入的研究发展，要让更多的食品检测方面的专家进行大力的研究工作。目前，我们检测的转基因食品大多数都是来自于进口食品。所使用的转基因技术检测的方法也只是比较一般

食品中常规致病菌快速检测(恒温扩增芯片法)

食品中常规致病菌快速检测（恒温扩增芯片法） 1范围本标准规定了食品中沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、单核细胞增生李斯特氏菌、大肠埃希氏菌O157：H7、阪崎肠杆菌、副溶血性弧菌、志贺氏菌和侵袭性大肠埃希氏菌的快速检测方法。本标准适用于食品中沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、单核细胞增生李斯特氏菌、大肠埃希氏菌O157：H7、阪崎肠杆菌、副溶血性弧菌、志贺氏菌和侵袭性大肠埃希氏菌的快速检测。 2术语与定义下列术语和定义适用于本文件。 2.1 微流控芯片microfluidic chip 利用微加工技术，在硅、石英玻璃或高分子材料等基质上加工出各种微细结构，如管道、反应池、微泵、微阀等功能单元，进行样品的处理和分子的微系统。 3设备和材料除微生物实验室常规灭菌及培养设备外，其他设备和材料如下： 3.1冰箱：2℃~5℃、-20℃±5℃。 3.2恒温培养箱：36℃±1℃。 3.3均质器。 3.4漩涡震荡仪。 3.5电子天平：感量0.1g。 3.6水浴锅：能升温至95℃。 3.7高速离心机：12000rpm/分钟。 3.8瞬时离心机。 3.9生物安全柜。 3.10微型分光光度计。 3.11恒温扩增仪。 3.12微流控芯片。 3.13低速离心机。 3.14微量移液器。 3.15无菌离心管：1.5ml、200ul。 3.16无菌吸管：50ml。 3.17锥形瓶：容量1000ml、500ml。 3.18量筒：容量500ml。 3.19擦镜纸。

4 培养基和试剂 4.1食源性致病菌加强型培养基：配置方法见附录A 中A.1。4.2适用型核酸提取试剂盒。 4.3生理盐水：配置方法见附录A 中A.2。 4.4 适用型核酸检测试剂盒（生物芯片法）：碟式芯片结构示意图，见图 1。图1 碟式芯片结构示意图 5 检测程序食品中常规致病菌的快速检测程序，见图2。样本前处理 25g （mL ）样品+225mL 食源性共増菌培养基36℃±1℃，16h ～20h 取100ul 共増菌培养液收集菌体，提取核酸浓度范围50pg/ul~50ng/ul 配置反应体系，上芯片上机芯片离心样本

食品中致病菌限量问答

《食品中致病菌限量》（GB29921-2013）问答中华人民共和国国家卫生和计划生育委员会2014-03-06 一、标准的制定目的致病菌是常见的致病性微生物，能够引起人或动物疾病。食品中的致病菌主要有沙门氏菌、副溶血性弧菌、大肠杆菌、金黄色葡萄球菌等。据统计，我国每年由食品中致病菌引起的食源性疾病报告病例数约占全部报告的40%至50%。《食品安全法》规定，食品安全标准应当包括食品、食品相关产品中的致病性微生物、农药残留、兽药残留、重金属、污染物质以及其他危害人体健康物质的限量规定。目前，我国涉及食品致病菌限量的现行食品标准共计500多项，标准中致病菌指标的设臵存在重复、交叉、矛盾或缺失等问题。为控制食品中致病菌污染，预防微生物性食源性疾病发生，同时整合分散在不同食品标准中的致病菌限量规定，国家卫生计生委委托国家食品安全风险评估中心牵头起草《食品中致病菌限量》（GB29921-2013，以下简称GB29921）。标准经食品安全国家标准审评委员会审查通过，于2013年12月26日发布，自2014年7月1日正式实施。 GB29921属于通用标准，适用于预包装食品。其他相关规定与本标准不一致的，应当按照本标准执行。其他食品标准中如有致病菌限量要求，应当引用本标准规定或者与本标准保持一致。二、标准的实施要求

GB29921实施日期（2014年7月1日）前，允许并鼓励食品生产经营单位按照本标准执行。在标准实施日期之后，食品生产经营单位、食品安全监管机构和检验机构应按照本标准执行。在实施日期前已生产的食品可在保质期内继续销售。进口食品的标准执行时间应按照相关规定执行。致病菌检验应按照GB29921引用的检验方法执行。食品生产经营者应当严格执行食品生产经营规范标准或采取相应控制措施，严格生产经营过程的微生物控制,确保产品符合GB29921规定。国家卫生计生委将组织对GB29921实施情况进行跟踪评价，根据评价情况适时修订完善标准。三、标准的制定原则与制定过程（一）以健康保护为目的。GB29921制定目的是控制食品中致病菌污染，预防食源性疾病。起草组分析我国2005年至2011年食源性疾病发生原因，参照国际管理经验，对“致病菌-食品”组合开展风险评估，根据风险监测和风险评估结果，优先制定高危食品中的重要致病菌限量，降低高危致病菌导致食源性疾病的风险。（二）以科学为依据。起草组在食品中致病菌风险监测和风险评估基础上，综合分析相关致病菌或其代谢产物可能造成的健康危害、原料中致病菌情况、食品加工、贮藏、销售和消费等各环节致病菌变化情况，充分考虑各类食品的消

食品安全快速检测技术汇总

食品安全快速检测技术汇总快速检测技术广泛用于食品安全快速检测，临床检验、检验检疫、毒品检验等公共领域。食品安全快速检测是指对食品利用便携式分析仪器及配套试剂快速得到检测结果的一种检测方式。食品安全问题主要有害污染物 1.农药、化肥:有机磷,有机氯，硝酸盐 2.兽药：兴奋剂，镇静剂，抗生素 3.重金属离子：镉，铅，汞，铬，砷，钼 4.生物毒素：黄曲霉毒素，呕吐毒素，肉毒素 5.致病菌：大肠杆菌，沙门氏菌，葡萄球菌等快速检测含义包括样品制备在内，能够在短时间内出据检测结果的行为称之为快速检测。三方面体现：（1）实验准备要简化（2）样品经简单前处理后即可测试，后采用先进快速的样品处理方式（3）分析方法简单，快速，准确食品安全快速检测分类按分析地点：现场快速检测，实验室快速检测按定性定量：定性快速筛选检验，半定量检验，全量检验农药残留检测方法（一）生物法 1.生物化学测定法(酶抑制率法，速测卡法) 2.分子生物学方法(如：ELISA) 3.活体生物测定法(发光细菌，大型水藻，家蝇) 4.生物传感器法

生物传感器在食品分析中的应用：（1）食品成分分析（2）食品添加剂的分析（3）农药和抗生素残留量分析（4）微生物和生物毒素的检验（5）食品限度的检验 (二)化学方法酶抑制法酶联免疫检测法蔬菜中硝酸盐含量的快速测定将NO3-还原N02-后，芳香胺与亚硝酸根离子发生重氮化反应，生成重氮盐，重氮盐再与芳香族化合物发生偶联反应，生成一种红颜色偶氮化合物(偶氮染料)，其颜色强度与硝酸盐含量呈正比，通过试纸由无色变为红色，变色的试纸放入基于光学传感器原理的硝酸盐检测仪中比色测定硝酸盐含量。仪器与材料：硝酸盐试纸. 快速测定仪硝酸盐速测管适用范围：乳品、饮用水、蔬菜等食物中硝酸盐的快速检测。方法原理：按照国标GB/T5009. 33盐酸蔡乙二胺显色原理，在格林试剂中加入硝酸盐转化剂，并将其做成速测管，速测管中的试剂可将N03-还原为N02-后，再与芳香胺(氨基苯磺酸) 发生重氮反应，生成重氮盐，重氮盐再与芳香族化合物( A-祭胺)发生偶联反应，生成红色偶氮化合物(又叫偶氮染料)，颜色深浅与硝酸盐含量成正比，与标准色卡比对，确定硝酸盐含量. 兽药残留快速检测微生物法检测检测管中的培养基预先接种了嗜热脂肪芽孢杆菌，并含有细菌生长所需的营养以及pH指示剂。只需加入100ul样品于检测管中。将含有样品的检测管放入64±1℃水浴中加热一段时间。奶或奶制品在培养基中迅速扩散，若该样品中不含有抗生素(或者抗生素低于检测值)，嗜热脂肪芽孢杆菌将在培养基中生长，葡萄糖呗分解后所产生的酸会改变Ph指示剂颜色，由紫色变为黄色。相反若高于检测限的抑菌剂，则嗜热脂肪芽孢杆菌不会生长，指示剂颜色不变仍为紫色。黄色表明该样品没有抗生素残留或抗生素残留的含量低于试剂盒的检测限(阴性) 紫色表明该样品中含有抗生素残留且浓度高于试剂盒的检测限(阳性) 如果介于黄色紫色之间，则说明该样品可能不含抗生素残留或者抗生素残留的含量低于试剂盒的检测限(部分阳性) 免疫金标记技术

牛奶中三种常见食源性致病菌快速检测方法的建立

牛奶中三种常见食源性致病菌快速检测方法的建立食源性疾病是全球最重要的公共卫生问题之一,导致食源性疾病的有病原微生物、寄生虫及其代谢产物、天然毒素以及化学性有毒有害物质等等。微生物引起的食源性疾病是全球食品安全面临的最重要挑战之一。在发达国家70%～80%的细菌性食物中毒是由沙门氏菌引起的,在我国甚至达到90%;引起沙门氏菌中毒的食品中,蛋类、奶类等动物性产品约占90%,沙门氏菌生存能力较强,可在乳制品中生存几个月。单增李斯特菌广泛存在于自然界中,且在冷藏温度4℃下依然能够生长,引起单增李斯特菌食物中毒的食品主要有: 奶及奶制品、肉制品、水产品、蔬菜及水果,其中以乳制品最为常见,单增李斯特菌能够给高风险人群带来严重的感染性疾病。志贺氏菌又称痢疾杆菌,是引起人类细菌性痢疾中最为常见的食源性致病菌,该菌也是食品卫生相关法规及标准中要求必须检测的项目之一。本文以牛奶中常见的食源性致病菌单增李斯特菌、沙门氏菌和志贺氏菌为目标菌种,利用环介导等温扩增技术和高分辨率熔解曲线技术建立了多重LAMP检测体系和多重 HAND-HRM检测体系,结果如下:1.针对单增李斯特菌溶血素蛋白(hly)基因、沙门氏菌侵袭蛋白A(invA)基因和志贺氏菌侵袭性质粒抗原H(ipaH)序列的高度保守序列设计引物,通过引物筛选分别建立了三种食源性致病菌的LAMP反应体系。进一步经过引物筛选,及对影响反应效率和特异性的镁离子浓度、甜菜碱浓度、引物浓度进行优化,建立了多重LAMP反应体系。对多重LAMP反应体系进行特异性和灵敏度检测。在特异性检测中含有目标菌的模板出现扩增,空白对照和非目标菌均未发生特异性扩增,提示该多重LAMP反应体系特异性强。在灵敏度检测中单增李斯特菌

食品快检实验室相关制度

食品安全快速检测工作相关人员职责一、法定代表人（负责人）职责 1、对食品安全快速检测工作负总责； 2、确定食品安全管理员、食品安全快速检测员，并组织其参加相关业务知识培训； 3、签批可疑（问题）食品的处置意见。二、食品安全管理员职责 1、对食品安全快速检测员的工作进行检查、指导，保证检验工作质量； 2、对可疑（问题）食品检测结果进行审核，提出合理合法的处理意见，并报单位法定代表人（负责人）； 3、按法定代表人（负责人）对可疑（问题）食品的处置意见，具体负责处置工作。三、检测员职责 1、认真学习专业技术，熟练掌握快速检测操作规程； 2、负责检测设备的保养、维护和保管； 3、对样品进行取样，按规范和流程实施检测； 4、清楚、准确地填写食品安全快速检测登记表，不得任意涂改，检测登记表实行检测员签字负责制度； 5、发现可疑食品填写可疑（问题）食品处置登记表，将检测结果及时报送食品安全管理员。

食品安全快速检测操作规范一、现场环境 1、环境整洁、无污染，有良好的采光条件和照明设备，室内物品摆放整齐、合理，有固定位置，不得存放个人物品； 2、工作台应保持水平，无渗漏； 3、禁止在室内吸烟及吃东西，不准用实验器皿作茶具或餐具； 4、检测用过的废弃物应放在固定的垃圾桶内，并及时妥善清理。二、仪器管理 1、食品快速检测箱应有专人管理，建立档案，备有使用说明。做到经常维护、保养和检查； 2、检测试纸、试剂的购买和使用应建立档案，登记购买时间、单位、数量、有效期等。已变质、污染、超保质期的试纸、试剂不能继续使用。三、采集样品 1、所有采集的样品一定要随机抽取，有代表性； 2、采集液体样品时，应充分混合均匀后采集； 3、样品采集的数量及方法应严格按说明书的要求进行； 4、采集的每份样品应使用干净的容器分别盛放，防止

食品安全快速检测方法一览表

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19191151食用油中桐油的快速检测溶液变色定性；检出限0.5% 20201161食用油中大麻油的快速检测溶液变色定性；检出限9% 21211171食用油中巴豆油的快速检测溶液变色定性；检出限2.5% 22221181食用油中矿物油的快速检测浊度定性；检出限0.1% 23231191食用油中蓖麻油的快速检测离心变量定性；检出限5% 24241201生熟豆浆的快速检测速测管变色定性 25251202有毒扁豆的快速检测速测管变色定性 26262090变质水产品的快速检测酸度计定性判定 27272090变质肉的快速检测酸度计定性判定 28282172变质牛乳的快速筛查试液反应挂壁定性；判定是否≥18oT 29292178乳品中蛋白质含量的快速检测速测管变色半定量；检出限0.5% 30302179乳品中三聚氰胺的快速检测试剂盒浊度限量检测；限定值2.5mg/kg,L 31312091食品加工用水无机污染物的快速检测测量范围：0～1999μS/cm 3232S304食品加工用水有机污染物的快速检测“滴瓶”标准溶液滴定；检出线0.333mg/L 二.劣质食品与非法添加物快速检测项目 3312013水发水产品中甲醛的快速定性检测比色定性；检出限10mg/L 3422014水发水产品中甲醛的快速半定量检测比色半定量；线性范围0.25～10mg/L(kg) 3532015水发产品中工业碱的快速检测pH试纸或酸度计检测 3642016水发水产品中双氧水的快速检测试纸显色半定量；线性范围：100～1000ppm 3752022二氧化硫的快速检测“滴瓶”法检出限8ppm，比色法50ppm 3862031吊白块甲醛的快速检测速测管比色；线性范围0.25～10mg/L(kg) 3972041苏丹红等油溶性非食用色素的快速检测试纸快速层析定性；苏丹红检出限0.8mg/L 4082042水溶性非食用色素的快速检测脱脂羊毛吸色定性；孔雀石绿检出限10ug/mL

食源性致病菌快速检测方法研究报告

食源性致病菌快速检测方法研究报告发表时间：2011-05-13T14:13:40.207Z 来源：《中外健康文摘》2011年第5期作者：高友中 [导读] 目的应用酶联免疫吸附实验（ELISA）快速检测奶类及肉类制品中沙门菌。高友中（湖南省岳阳县疾病预防控制中心 414100）【中图分类号】R446.1 【文献标识码】A 【文章编号】1672-5085 (2011)5-0106-02 【摘要】目的应用酶联免疫吸附实验（ELISA）快速检测奶类及肉类制品中沙门菌。方法样品经增菌后，用ELISA法及国标法对样品中的沙门菌进行初步检测，并比较ELISA法检测结果与国标法灵敏性、特异性、符合率。结果检测200份奶类制品和肉制品，经ELISA法检测阳性率为8.3%，国标法阳性率为6.7%。ELISA法敏感性、特异性分别为100%、97%，与国标法符合率达99.3%。结论 ELISA法可快速、方便的对食品中沙门菌的污染情况进行初步检测，灵敏度高、特异性好，与国标法符合率高。适用于食品中沙门菌的初步检测。【关键词】奶制品肉制品沙门菌 ELISA 沙门菌为常见的引起食源性疾病爆发的病原菌，在我国微生物性食物中毒中一直位居首位，而受沙门菌污染的奶、肉制品为造成人类感染的主要来源，因此沙门菌一直为医疗卫生、食品卫生及商检部门重点检验对象之一[1]。本研究采用ELISA法检测奶、肉制品中沙门菌，并与国标法进行比较研究，现报道如下： 1 材料与方法 1.1实验材料奶、肉制品分别来自本市8家不同超市，包括70份奶及奶制品样本，60份肉及肉制品样本。取样均采取随机抽样的方法进行。每份样品250ml或250g，经无菌包装后置冷链保存送实验室检测。缓冲蛋白胨水，氯化镁孔雀绿增菌液，四硫酸钠煌绿增菌液，亚硒酸盐胱氨酸增菌液，亚硫酸铋琼脂，DHL琼脂，HE琼脂，WS琼脂，SS琼脂，三糖铁琼脂，蛋白陈水、靛基质试剂，尿素琼脂（pH7.2)，氰化钾（KCN）培养基，氨基酸脱梭酶试验培养基，糖发酵管，ONPG培养基，半固体琼脂，丙二酸钠培养基，沙门氏菌因子血清。均按国标相关规定进行。 ELISA相关试剂均购自试剂公司。 1.2实验方法样品按国标法相关规定预先增菌。样品处理后于36°C培养4h，转种于100ml氯化镁孔雀绿增菌液中，42°C18-24h，另取10ml转种于亚硒酸盐胱氨酸增菌液中，36°C18-24h。 ELISA法简要步骤如下：特异性抗沙门菌单克隆抗体包被，加入待见样品检测。显色于酶标仪上读取OD值。国标法简要步骤如下：经增菌后，划线接种于亚硫酸铋琼脂平板和EHL琼脂平板。36°C培养18-24h，观察菌落生长情况。挑选可疑菌落接种于三糖铁琼脂，鉴别反应结果。如出现异常结果，按国标相关规定选择补做甘露醇和山梨醇试验，ONPG等。 1.3数据分析参考田素娟[1]等的方法进行。即利用检验通用的计算方法，并国标法比较实验的敏感性、特异性、符合率。 2 结果 2.1ELISA及国标法检测结果用ELISA法同步检测份奶、肉制品的沙门菌污染情况，采用国标法进一步验证，结果见表1。表1沙门菌污染情况检测 2.2ELISA法与国标法敏感性、特异性、符合率计算结果表2ELISA法与国标法比较 3 讨论 3.1常规检测沙门菌方法目前，沙门菌常用检测方法有：（1）酶快速反应检测技术。包括快速酶促反应显色培养基及自动化微生物分析仪两种方法。VITEK AMS自动微生物检测系统对细菌鉴定是基于细菌的微量生化反应，可鉴定405种细菌。（2）以免疫学为基础的检测技术。包括酶联免疫吸附实验（ELISA）；免疫磁分离技术，如王海明[2]等报道的使用抗沙门氏菌免疫磁珠经增菌后于VITEK全自动生化鉴定仪和荧光PCR分子检测确认；免疫胶体金技术等。（3）以核酸为基础的检测技术，如杨俊超[3]等报道的使用实时荧光定量PCR与常规PCR比较研究，其敏感性、特异性均较好；依赖PCR的DNA指纹图谱技术；随机引物扩增DNA多态性（RAPD）；基因内重复性一致序列（ERIC）的扩增；多重PCR检测技术；NASBA；基因芯片技术等。 3.2本研究采用检测方法本研究采用ELISA法快速检测奶及奶制品、肉及肉制品中沙门菌的污染情况。其敏感性、特异性较高，且与国标法符合率较高。一般24h 之内可以出检测结果。其不足之处在于：（1）不能定量检测沙门菌的含量，只能做定性分析，即是否存在沙门菌污染，但不能测得污染量的大小。后续研究考虑通过设置标准沙门菌对照（蛋白含量已知）的情况下，设立不同稀释度，然后比较样品各组OD值，用统计软件作出标准曲线，进而推算出沙门菌含量。（2）检测结果不太稳定，有可能出现假阳性结果。ELISA实验普遍存在抗体效价下降很快的通病，如

食品安全检测技术研究现状

食品安全检测技术研究现状近年来，食品安全所受关注度越来越高，加强食品安全问题的保障的技术手段是势在必行。本文主要介绍了我国近几年的食品安全现状、食品检测的多种检测技术以及对存在的问题和展望，希望对食品检验检测研究提供依据。目前，我国人民生活水平日益增高，食品安全意识也越来越强。食品安全主要是指“对食品按它原定的用途进行生产和（或）进行食用时不会对消费者造成损害的一种担保”。这些主要集中在农业化学控制物质、农药残留、微生物危害、生物毒素、食品掺假等方面[1，2]。近年来我国食品安全问题频现，引起较大社会反响，而食品安全检测技术则是保证食品质量以及食品安全管理的重要技术手段。标签：食品安全；检测技术；安全管理 1 我国食品安全现状因我国食品安全法律条例不够完善，农药残留超标、非法添加及掺假的现象日趋严重[3]。2008年3月到2008年10月，三鹿集团等乳制品公司为了降低成本，在出售的婴幼儿奶粉中添加工业原料三聚氰胺，结果导致29万多婴幼儿患泌尿系统结石，对众多婴幼儿的身心造成了严重的伤害；2010 年，继三鹿奶粉事件两年后，西安市执法部门在进行执法检测时，发现在一家火锅店里装有泔水油回收的装置，经过这一事件之后“地沟油”就被国人所熟知；2011年，双汇集团即食肉制品中被检测出瘦肉精，同年年末我国牛奶行业中的领头者蒙牛企业出产的奶制品，也被查出了问题，其产品中被检测出黄曲霉毒素严重超标；2013年，湖南的致癌辣椒事件、恒天然肉毒杆菌乳粉的事件、病死猪流入市场件等各类食品安全事件，给人们的身心健康及生命安全造成了极大的危害[4]。 2 食品安全检测技术食品安全领域的检测参数种类繁多，检测方法也较多，通常可分为色谱法、电化学分析法、生化分析法等几大类。 2.1 色谱技术色谱分析技术是近年来对食品安全检测普遍使用的检测方法，尤其在添加剂、色素、农残、重金属等方面的应用，与传统化学检测相比，色谱分析技术检测法具有成本低廉、检测周期短，检测结果直观、准确、有效等特点。色谱分析技术的本质是一种物理化学分离方法，主要是利用被检测物中固定相和流动相的分配、吸附系数的不同，对样品进行反复多次的吸附与脱附、溶解与挥发，实现被检测物品中不同物质被分离出来，以达到检测物质的种类与含量。色谱类型很多，如气相色谱法、高效液相色谱法、色谱/质谱联用到毛细管电泳和电色谱等方法已被广泛应用于食品工业的安全检测中。

食品安全快速检测技术展望

食品安全快速检测技术展望 1、食品安全快速检测技术现状随着高科学技术发展和研究的深入，大量快速和采用现代技术的检测方法不断出现，这些新的快速方法，一般都缩短了传统检测方法的时间，能够较快的得到检测结果，并且操作相对简单。控制农药残留对人体的危害，最为有效的方法之一是加强对食品中农药残留检测的力度。常用的农药残留理化分析方法不但要有昂贵的气相色普等分析仪器，而且分析方法手续复杂。国内外诸多研究者开发研制了多种农药残留的快速测定方法，包括生物法和化学法。目前，国内外化肥污染物硝酸盐快速测定方法主要有硝酸盐电极法、硝酸盐比色法、硝酸盐试粉试纸法。硝酸盐现场快速测定法是市场经济发展趋势，其特点是快速、稳定、灵敏、准确定量、携带方便。我国研究者在研究硝酸盐快速测定方法上已有很大的进展，研制出了硝酸盐试纸快速测定法。食品金属污染物的检验技术，特别是快速检验技术的发展，是食品安全检验技术发展的重要方向之一。金属污染物快速检测技术首先从样品前处理制备入手，通过有效缩短样品前处理时间达到快速测定的目的。因为随着各种高效、灵敏、快速的金属污染物分析仪器（分析方法）的不断出现，传统的样品制备技术与之相比已不相适应，成为快速检验技术发展的主要障碍。微波溶样技术的出现和快速发展，有了一种很好的快速的样品预处理技术与金属污染物的快速准确的检验技术相配合，在一定程度上缩短了常规方法时间，达到食品安全快速检验目的。在兽药残留检验方面，为了尽可能的保证供应不含残留药物的食品，需要有可以在各种各样复杂基质的检样中对含量非常低的残留药物进行检测的方法以及定量和鉴定的分析方法。兽药残留快速检测方法有抑制试验法、试剂盒法（酶联免疫法）、放射免疫测定法等。对食品中黄曲霉毒素快速、有效的检验方法可以检测食品中是否受黄曲霉毒素的污染。通过检验食品中的黄曲霉毒素含量，以保证消费者食用的食品不含黄曲霉毒素。对于贝类毒素的测定，目前由于毒素的缺乏显得难以进行。在贝类毒素检测中，虽然也出现了使用酶联免疫快速分析方法，但由于易出现假阳性结果，难以控制等种种原因而不能得到推广。目前小鼠生物试验法检测麻痹型贝类毒素和腹泻型贝类毒素还是常使用的分析方法。近年来，随着生物技术的快速发展，新技术新方法在食品微生物检验领域得到了广泛应用，有效的提高了检测效率和检验速度。现行一些快速检测方法