病毒纯化-PEG6000

Lentiviral concentration by precipitation of lentiviral vectors using PEG 6000

(i) Take 204 ml of a vector-containing cell culture supernatant (from Step 17) after filtration using a 250-ml 0.45-mM PES

filter flask.

(ii) Add 51 ml of a 50% PEG 6000 solution.

(iii) Add 21.7 ml of a 4 M NaCl stock solution.

(iv) Add 23.3 ml of PBS. This will result in a final volume of 300 ml. The final PEG 6000 concentration will be 8.5% and the

final NaCl concentration will be B0.3 M.

(v) Distribute the sample as 150-ml aliquots in two 250-ml polypropylene wide-mouthed bottles.

(vi) Store the bottles at 4 1C for 1.5 h. Mix contents every 20–30 min.

(vii) Centrifuge bottles at 7,000g for 10 min at 4 1C using a Beckman fixed-angel

JLA-10.500 rotor.

(viii) After centrifugation, a white pellet should be visible.

(ix) Carefully decant the supernatant and add 1.2 ml of 50 mM Tris-HCl, pH 7.4, per bottle. Resuspend the pellets by

vigorously pipetting liquid up and down.

(x) Vortex the bottles vigorously for 20–30 s to further resuspend the pellets.

(xi) Transfer the vector suspension into screw-cap microfuge tubes in aliquots of 100 ml. (xii) Snap-freeze the tubes in crushed dry ice and store at -80 。C.

病毒纯化

现代病毒研究往往需要大量的纯病毒粒子，以便于化学研究或制备抗体。在这里我们简明地描述一下脊髓灰质炎病毒（Polio virus）的纯化步骤。它是一种已被广泛研究的危害人体健康的病毒。 在开展人体病毒实验工作以前，让实验工作人员获得抵抗这种病毒的免疫力是非常必要的。脊髓灰质炎病毒疫苗很容易获得，大多数工作人员可能已经获得免疫，但重新免疫是必要的预防措施。 病毒的纯化步骤主要是：1.在大规模的装置中培养病毒；2.去除富含病毒培养液；3.通过沉淀将病毒浓缩；4.通过密度梯度离心最终纯化病毒。现在我们讲解每个步骤的一些细节。 1.在大型装置中培养细菌。为获得足够的用于化学研究的病毒，必须制备大量病毒。每种病毒的培养都有不同的步骤。脊髓灰质炎病毒是在人或灵长类动物细胞系中培养的，可以培养在一大瓶中沿壁生长的单层细胞上，也可以在一个轻轻搅拌的细胞悬液中。在有利病毒生长的条件下，每个宿主细胞能生产10～1000的感染单位的病毒，即每毫升一个感染单位的滴度（或称效价）。 2.富含病毒培养液的去除。病毒的生长和释放伴随着细胞的破损。在病毒复制完成的时候，培养液中大多数细胞已经变成了细胞碎片。为使所有病毒分子完全释放，要通过反复冷冻—融化的循环过程使细胞进一步破碎。然后将富含病毒的液体从培养瓶转移到离心试管中。低速离心除去大分子的细胞残骸。 3.通过沉淀将病毒物质浓缩。由于病毒是蛋白质性质的，它们能通过蛋白质沉淀法沉淀。脊髓灰质炎病毒可通过高浓度的NH4Cl（每毫升培养液中加0.4g）沉淀下来。这一过程要在低温下进行，NH4Cl要在搅拌下缓慢加到培养液中。由于病毒蛋白沉降，溶液将变得浑浊。将沉淀物通过低速离心（2000g，1-2hr）。然后将含有病毒分子的沉淀物在少量磷酸盐缓冲液中再次悬浮培养。这一步骤可浓缩病毒大约10倍，99％以上的病毒粒子可沉淀回收。 4.通过密度梯度离心最终纯化病毒。脊髓灰质炎病毒可以通过蔗糖或CSCl的密度梯度离心纯化。在后者中，病毒在离心试管中成为一个分离带，这一过程与对DNA的分离相同，离心须要高速，即120000g,且要进行好几个小时，最好是一整夜。离心管中的液体通过试管底部的一点点滴出来，要检测每一滴的病毒滴度。在合适的离心条件下，所有的病毒分子都集聚在一或两个组分中，所以它们是非常纯的。结晶脊髓灰质炎病毒。如果能在合适的条件下浓缩大量且高纯度的病毒，就可以获得病毒晶体。这种晶体为化学分析提供了很好的材料，且易于通过X射线衍射技术进行结构分析。本章的部分讲到的脊髓灰质炎病毒的计算机拟合就是从这种高浓度脊髓灰质炎的病毒晶体获得的。

病毒的分离纯化

病毒的分离纯化 我设计了一套方案，请大家批评指正： 1. 新鲜病叶200g，-70℃冰冻30分钟，以2倍体积0.2mol/L磷酸缓冲液（PH7.5，含0.1%巯基乙醇,2%TritionX-100,0.01mol/LEDTA）。组织捣碎机捣碎，双层纱布过滤。 2. 滤液中加入等体积的氯仿，冰浴激烈搅拌15分钟，充分乳化后2000 g离心15分钟 3. 上清液中加入6%聚乙二醇-6000，3%Nacl,0.5%TritionX-100（W/V）。冰浴搅拌，4℃下过夜，次日取出10000g离心20分钟。 4. 沉淀悬浮于0.02mol/L磷酸缓冲液（PH7.2，2%TritionX-100, 0.1%巯基乙醇，1mol/L尿素），2小时后，2000g离心10分钟。 5. 上清液中加入6%聚乙二醇-6000，3%Nacl,0.5%TritionX-100（W/V）。冰浴搅拌4小时，10000g离心30分钟。 6. 沉淀悬浮于0.02mol/L磷酸缓冲液（PH 7.2，2%TritionX-100,0.01mol/LEDTA，1mol/L尿素），4℃下4小时后，10000g离心10分钟。 7. 上清用10%～40%蔗糖密度梯度离心(30000r/min,1.5h)，收集病毒带，用0.02mol/L磷酸缓冲液（PH7.2，2%TritionX-100, 0.1%巯基乙醇，1mol/L尿素）稀释，123000g离心2小时。 8.沉淀用0.02mol/L磷酸缓冲液（PH7.2，2%TritionX-100, 0.1%巯基乙醇，1mol/L尿素）悬浮，5000g离心15分钟，上清即为提纯病毒制品。 lf_12345

病毒空斑纯化步骤

猪流行性腹泻病毒(PEDV)纯化分离方案 (1) 将已准备好的VERO细胞消化均匀铺于6孔板中。 (2) 细胞长成单层后吸去培养液，将病毒做10倍稀释，共做5个梯度并向每孔滴加0.4ml稀释好的病毒液, 置37℃吸附2小时后弃残液。 (3) 制备2％的琼脂糖（PCR电泳胶一样的琼脂糖），置40－50℃水浴待用。 (4) 将上述琼脂糖和双倍维持液（1:1）混合后，加入培养板各孔，每孔2ml，使冷却凝固成覆盖层。 (5) 把培养板倒置，在37℃二氧化碳培养箱培养48h。 (6) 制备含0.002％中性红的2%琼脂糖：双倍维持液（1:1），置40－50℃水浴待用。 (7) 吸取上述琼脂加入培养板各孔，每孔2ml，使冷却凝固成第二覆盖层。 (8) 把培养板倒置，在37℃二氧化碳培养箱继续培养，48小时内观察结果。 (9) 挑出蚀斑下的细胞作病毒的进一步增殖和鉴定。 主要问题： 1、铺完琼脂糖层之后，24h之后细胞轮廓模糊，不清晰。48h之后有些孔的细胞基本上看 不清了，但是这都不是病毒造成的。（支原体的存在会不会导致这种情况） 2、使用中性红染色在一开始就染色还是等病毒造成一定的噬斑再染色，覆盖一层还是两层 琼脂糖层？ 3、使用的琼脂糖是不是有问题，与琼脂区别大不大？ 4、之前按照这个方法加了中性红的琼脂糖层之后，细胞着色很不理想。看不出明显的染色 区域，只是有些红色的点点。 5、温度不会出现问题，因为把握的很好，细胞不会被烫死的。就是不知道自己配制的液会 不会由于渗透压的原因导致细胞死亡。 6、一直拿不出照片的原因就是没法看到空斑，板孔中不能显示出一个一个比较像样的噬 斑，我挑也是挑病变情况有点不一样的病灶。

病毒纯化浓缩方法

病毒纯化浓缩方法 方法一超速离心沉淀法 1 仪器 超速离心机(BECKMAN OPTIMAL-80XP) 50000~80000rpm相对离心力最大可达510000×g；高速冷冻离心机(BECKMAN AVANTIJ-26XP)20000~25000rpm 最大离心力为89000×g；超速离心管 (Beckman 344058)，Ultra-clear SW28离心管 2 方法步骤 （1）转染后44-48小时，收集上清液到50ml离心管内，并加入20ml Production 培养基以便第二轮病毒的收集。将收集的上清液4℃，4000g离心10分钟，去除细胞碎片，然后0.45 μm滤膜过滤到40ml超速离心管中。 （2）取6个Beckman超速离心管，70%乙醇清洗后在生物安全柜中风干并紫外消毒30min。 （3）每个Ultra-clear SW28管加入30ml 预先处理过滤过的病毒上清。

（4）取一支10ml的移液管，吸取12 ml 20%的蔗糖溶液(PBS配制)。将移液管一直插入到离心管的底部，缓慢将蔗糖溶液打出4 ml，形成一个蔗糖垫。同样地，将剩下8 ml的蔗糖溶液分别加入到另两个离心管中。另取一支干净的移液管，对剩下3管进行同样处理。 （5）务必确定离心管没有裂缝且用PBS调整各管重量使两两平衡。 （6）4℃离心，25000rpm （82700g）2 h。 （7）离心完毕后小心取出超速离心管，小心弃去上清液，留下管底沉淀。管底可见少量的半透明或白色沉淀。将超速离心管倒置在吸水纸上晾干约10min，并用Tip头吸去管壁上多余的液体。 （8）每管中加入100ul不含钙和镁的冷PBS洗下沉淀。 （9）将SW28超速离心管插入到50ml锥底离心管中，盖上盖子。 （10）在4℃溶解2小时，每隔20分钟轻轻震荡。 （11）4℃，500g离心1分钟，使溶液集中于管底。 （12）用200μl 移液器轻柔吹打使沉淀重悬。避免产生泡沫。将所有管中的液体集中到一个SW28离心管中，分装50ul/管，保存于成品管中，用碎干冰速冻后储存在-80℃冻存。 方法二 PEG-8000浓缩法

病毒和病毒成份的提纯

第十四章病毒和病毒成份的提纯 一、病毒的提纯 (一)沉淀法 (二)层析法 (三)两相溶剂间分配系数法 (四)红细胞吸附法 (五)电泳法 (六)超速离心法 (七)超滤法 二、病毒蛋白亚单位的分离 三、病毒脂质的抽提 四、病毒糖类的抽提 一、病毒的提纯 所谓病毒提纯,就是应用各种物理、化学方法，以不使病毒受损伤和失活为前提，去除宿主细胞组分等非病毒杂质，提取出高纯度浓缩的病毒样品。病毒提纯是病毒学研究的重要前提，病毒微细形态结构的研究、病毒抗原蛋白的分离提纯、病毒化学成分及其遗传物质——DNA或RNA的详细研究都需要高纯度的病毒样品。 病毒纯度只是一个相对的概念，很难有绝对的标准，通常以下几点可以作为判定标准。 1.物理均一性 测定病毒样品的物理均一性,是证明其纯度的常用方法,包括电镜检查、病毒粒子沉降系数和扩散常数及其在凝胶电泳、等电聚焦中的迁移率等。 2.病毒滴度与蛋白含量的比例 测定病毒材料的感染力或其血清学反应滴度与其蛋白含量的比例，也是一种通常采用的纯度测定方法。病毒滴度对蛋白含量的比例越高,说明病毒的纯度越高。

3.免疫学反应 免疫反应单一而无非特异反应，则说明病毒材料比较纯净。 4.结晶形成 病毒粒子在十分纯净的情况下，经常可以形成结晶，但少数混有杂质的病毒样品亦可形成结晶，所以这也只是一个相对标准。 病毒提纯的主要依据和条件有: (1)病毒只在活的细胞内寄生、复制和增殖, 要在病毒不失活的前提下，使之从细胞中释放出来，去除细胞成份。有些病毒如痘病毒、正粘病毒、副粘病毒、披膜病毒,病毒粒子被释放到细胞外，可以从培养液或尿囊液中提纯；而另一些病毒如腺病毒、乳多空病毒、小DNA病毒，在毒粒成熟后只有少数病毒释放到细胞外，大量提纯时必须首先裂解细胞，使病毒大量释放。实验室常用冻融、研磨、高速捣碎、超声波处理或高压冲击、中性去污剂裂解、蛋白酶解等物理和化学的方法。通过这些方法处理获得的粗制的病毒悬液，其中常含有大量的细胞碎片，一个有效的方法是以2000～6000r/min离心30～40分钟，可除去90％以上的细胞碎片和杂质。 (2)病毒粒子实际上是大的蛋白颗粒，可以应用提纯蛋白质的一些技术方法。 (3)对大小、形状和密度高度一致的病毒粒子,可以采用分级分离的技术。当然不同的病毒，其生长特性及理化学性质不同，因此提纯方法也不尽一致。 (一)沉淀法 主要是从稀的悬浮液中浓缩病毒，有中性盐沉淀法、聚乙二醇(PEG)沉淀法、有机溶剂沉淀法、等电点沉淀法、皂土法和鱼精蛋白沉淀法等。 1.中性盐沉淀法 病毒一般在45%以上饱和度的硫酸铵溶液中沉淀，且保持其感染性。在含有病毒的组织培养液中加入等体积的饱和硫酸铵，可以很容易地沉淀某些病毒如狂犬病毒、鸡新城疫病毒等。 2.聚乙二醇沉淀法 聚乙二醇(PEG)为水溶性非离子型聚合物，具有各种不同的分子量，用于病毒沉的主要是分子量为2000～6000的PEG。将PEG配成50%左右的溶液，或直接将固体PEG

PEG沉淀法-病毒提纯方法

1. Viruses such as baculovirus can be concentrated by polyethylene glycol precipitation. 2. Adjust the pH of the virus-containing supernatant to Polyethylene glycol (PEG, MW 6,000) is added to a final concentration of 8% (w/v). 3. Stir at 4℃for 2 hours. 4. Centrifuge at 10,000 x g for 2 hours. 5. Resuspend the pellet in a small volume of appropriate buffer ( ., RNase-free ddH2 for virus RNA prep). 沉淀法-病毒提纯方法 主要是从稀的悬浮液中浓缩病毒，有中性盐沉淀法、聚乙二醇(PEG)沉淀法、有机溶剂沉淀法、等电点沉淀法、皂土法和鱼精蛋白沉淀法等。 1.中性盐沉淀法：病毒一般在45%以上饱和度的硫酸铵溶液中沉淀，且保持其感染性。在含有病毒的组织培养液中加入等体积的饱和硫酸铵，可以很容易地沉淀某些病毒如狂犬病毒、鸡新城疫病毒等。 2.聚乙二醇沉淀法：聚乙二醇(PEG)为水溶性非离子型聚合物，具有各种不同的分子量，用于病毒沉淀的主要是分子量为2 000～6000的PEG。将PEG配成50%左右的溶液，或直接将固体PEG加于病毒悬液中，使其达到所需浓度，通常在4℃搅拌过夜，然后离心使病毒沉淀。Tanncock(1985年) 成功地用PEG浓缩了禽脑脊髓炎病毒。 3.有机溶剂沉淀法：甲醇、氯仿、正丁醇、氟碳化合物等都可用于提纯病毒，但乙醚、氯仿等脂溶剂对于具有脂质囊膜的病毒具有破坏和灭活作用，故不适于这类病毒的浓缩提纯。 4.等电点沉淀法：病毒粒子在等电点时，所携带的正电荷与负电荷相互中和，因而失去相互排斥的作用而发生沉淀。多数病毒的等电点在～之间，因此在pH3～6范围内均可沉淀，由于一部分细胞成份在等电点时亦发生沉淀，此法效果不太理想，但从感染的组织培养液中浓缩病毒，可以获得较好结果。应用酸性范围的等电点沉淀或分级沉淀病毒时，必须注意pH对病毒活性的影响及病毒粒子电荷与组织蛋白电荷的差异。 5.皂土法：Girin(1989年)应用皂土在酸性条件下(pH4～吸附轮状病毒SA-11，再在碱性条件下（），又使其洗脱下来，从而达到纯化目的。 6.鱼精蛋白沉淀法：鱼精蛋白为碱性蛋白，具有携带其它蛋白质共沉淀的作用，能和直径大于50nm的病毒共同沉淀而不影响病毒的感染力。当向这种沉淀物加入1mol/LNaCl时，病毒又重新释放到悬液中，而鱼精蛋白仍然沉淀。直径小于50nm的小型病毒则不与鱼精蛋白共同沉淀。因此，可利用鱼精蛋白去除病毒材料中直径大于50nm的异种蛋白质。 聚乙二醇HOCH2(CH2OCH2)nCH2OH(n＞4)( Polyethylene Glycol 简写为PEG)，它的亲水性强，溶于水和许多有机溶剂，对热稳定，有广泛围的分子量，在生物大分子制备中，用的较多的是分子量为6000～20000的PEG。 PEG 的沉淀效果主要与其本身的浓度和分子量有关，同时还受离子强度、溶液pH 和温度等因素的影响。在一定的pH 值下，盐浓度越高，所需PEG 的浓度越低，溶液的pH 越接近目的物的等电点，沉淀所需PEG 的浓度越低。在一定范围内，高分子量和高浓度的PEG 沉淀的效率高。以上这些现象的理论解释还都仅仅是假设，未得到充分的证实，其解释主要有：①认为沉淀作用是聚合物与生物大分子发生共沉淀作用。②由于聚合物有较强的亲水性，使生物大分子脱水而发生沉淀。③聚合物与生物大分子之间以氢键相互作用形成复合物，在重力作用下形成沉淀析出。④通过空间位置排斥，使液体中生物大分子被迫挤聚在一起而发生沉淀。 有机聚合物沉淀的优点是：①操作条件温和，不易引起生物大分子变性；②沉淀效能高，使用很少量的PEG 即可以沉淀相当多的生物大分子；③沉淀后有机聚合物容易去除。 水溶性非离子型聚合物沉淀法常用的聚合物为聚乙二醇（PEG）及硫酸葡聚糖。水溶性聚合物沉淀蛋白质的机制尚不清楚，大致有如下解释：①聚合物与蛋白质形成共沉物；①聚合物与蛋白质之间发生水的重分配；①聚合物与蛋白质形成复合物。此法受许多因素影响，主要是pH、离子强度、蛋白质浓度和PEG的分子量等。分子量为2000～6000的PEG皆适宜于做蛋白沉淀用。如若使用得当，效果甚为满意。一般认为，PEG浓度在3％～4％时沉淀免疫复合物，6％～7％可沉淀IgM，8％～12％可沉淀IgG，12％～15％可沉淀其他球蛋白，25％可沉淀白蛋白。最突出的应用是用3％～4％的PEG沉淀免疫复合物，未结合的抗原和抗体留在溶液中。按此原理设计了快速测定法和循环免疫复合物测定法 从网上搜索到得关于PEG沉淀提纯病毒的方法，先汇总至此贴，希望大家支持本版 1、用超声波或冻融的方法使细胞破碎释放出病毒； 2、慢慢搅动并加入NaCl终浓度是L,有助于病毒的沉淀，再等量加入10％PEG(一般使用的是PEG6000就可以了。

慢病毒包装、浓缩、纯化、滴度实验步骤

创作编号： GB8878185555334563BT9125XW 创作者：凤呜大王* 一、包装细胞293T细胞的培养 一、293T细胞的冻存 1. 随着传代的次数增加，293T细胞会出现生长状态下降，出现突变等。所以要在细胞购进时就进行冻存。 2. 在细胞对数生长期进行冻存，增加细胞复苏成活率。 3. 倒去细胞上清液，加入D-Hank's液洗去残留的培养基。 4. 加入0.25%的胰酶，消化10-20s后倒去。 5. 镜下观察细胞变圆，细胞间间隙加大时，加入新鲜培养基吹打混匀。 6. 细胞计数。 7.将细胞离心，1000rpm，2min。 8. 根据计数结果加入细胞冻存液（70%完全培养基+20%FBS+10% DMSO）重悬细胞，密度为3×106个/ml。 10. 第二天将细胞放入液氮灌，并记录。 二、293T细胞的传代 1. 当细胞生长至汇合率达到80~90%需要对细胞进行传代操作，以扩大细胞数量，维持细胞良好的生长状态。 2. 消化细胞，方法同上。 3. 细胞离心结束后，加入完全培养基重悬。密度为3×105个/ml。 4. 分到10cm培养皿中，10ml/皿。 三、293T细胞的复苏 1. 当细胞传代次数过多（超过50代），细胞状态变差时或细胞出现污染事故时，需要丢弃并对开始冻存的细胞进行复苏。 2. 打开水浴锅，设置温度为40℃。

3. 查看细胞库记录，根据记录从液氮灌中取出冻存的细胞（需戴上棉手套，防止被冻伤），迅速丢入水浴锅中并快速晃动，在1~2 min内使细胞溶液完全溶解。 4. 将1ml细胞溶液加入9 ml完全培养基中并混匀后转入10cm培养皿。 5. 放回37℃、3%CO2和95%相对湿度的培养箱中培养。 6. 第二天观察细胞存活率。倒掉旧的培养基，加入10ml新鲜培养基。 二、慢病毒的包装、浓缩和滴度测定 1. 所用病毒检测引物为WPRE特异引物，序列如下 5'-CCTTTCCGGGACTTTCGCTTT-3' (forward primer), 5'-GCAGAATCCAGGTGGCAACA-3' (reverse primer) and 5'-FAM-ACTCATCGCCGCCTGCCTTGCC-TAMRA-3' (probe) 2. TaqMan Universal PCR Master Mix (Applied Biosystems，cat. no. 4304437) 3. TaqMan DNA Template Reagent Kit (Applied Biosystems，cat. no. 401970) 4. TaqMan RNaseP control reagent (Applied Biosystems，cat. no. 4316844) 用于包装的293T细胞的培养 用于包装的293T细胞(ATCC No. CRL-11268)必需选择处于生长旺盛期，细胞状态较佳，存活率90%以上，细胞边缘清晰，传代次数较低。任何时候细胞汇合率都不准达到100%。 慢病毒的包装 1. 预先准备3个T150瓶的293T细胞，培养基为DMEM + 10% FBS，1% Glutamax ，1% 青霉素-链霉素。

2020年病毒纯化浓缩方法

作者：非成败 作品编号：92032155GZ5702241547853215475102 时间：2020.12.13 病毒纯化浓缩方法 方法一超速离心沉淀法 1 仪器 超速离心机(BECKMAN OPTIMAL-80XP) 50000~80000rpm相对离心力最大可达510000×g；高速冷冻离心机(BECKMAN AVANTIJ-26XP)20000~25000rpm 最大离心力为89000×g；超速离心管 (Beckman 344058)，Ultra-clear SW28离心管 2 方法步骤 （1）转染后44-48小时，收集上清液到50ml离心管内，并加入20ml Production 培养基以便第二轮病毒的收集。将收集的上清液4℃，4000g离心10分钟，去除细胞碎片，然后0.45 μm滤膜过滤到40ml超速离心管中。 （2）取6个Beckman超速离心管，70%乙醇清洗后在生物安全柜中风干并紫外消毒30min。 （3）每个Ultra-clear SW28管加入30ml 预先处理过滤过的病毒上清。 （4）取一支10ml的移液管，吸取12 ml 20%的蔗糖溶液(PBS配制)。将移液管一直插入到离心管的底部，缓慢将蔗糖溶液打出4 ml，形成一个蔗糖垫。同样地，将剩下8 ml的蔗糖溶液分别加入到另两个离心管中。另取一支干净的移液管，

对剩下3管进行同样处理。 （5）务必确定离心管没有裂缝且用PBS调整各管重量使两两平衡。 （6）4℃离心，25000rpm （82700g）2 h。 （7）离心完毕后小心取出超速离心管，小心弃去上清液，留下管底沉淀。管底可见少量的半透明或白色沉淀。将超速离心管倒置在吸水纸上晾干约10min，并用Tip头吸去管壁上多余的液体。 （8）每管中加入100ul不含钙和镁的冷PBS洗下沉淀。 （9）将SW28超速离心管插入到50ml锥底离心管中，盖上盖子。 （10）在4℃溶解2小时，每隔20分钟轻轻震荡。 （11）4℃，500g离心1分钟，使溶液集中于管底。 （12）用200μl 移液器轻柔吹打使沉淀重悬。避免产生泡沫。将所有管中的液体集中到一个SW28离心管中，分装50ul/管，保存于成品管中，用碎干冰速冻后储存在-80℃冻存。 方法二 PEG-8000浓缩法 (1)5X PEG8000+NaCl配制称取NaCl 8.766 g; PEG8000 50g溶解在200ml Milli-Q纯水中；121摄氏度 30min 湿热灭绝 30min；保存在4℃。 (2)使用0.45μm滤头过滤慢病毒上清液； (3)每30ml过滤后的病毒初始液，加入5X PEG-8000+NaCl母液7.5 ml； (4)每20～30min混合一次，共进行3-5次； (5)4度放置过夜； (6)4度，4000 g，离心 20min； (7)吸弃上清，静置管子1～2分钟，吸走残余液体；

慢病毒包装、浓缩、纯化、滴度实验步骤

一、包装细胞293T细胞的培养 一、293T细胞的冻存 1. 随着传代的次数增加，293T细胞会出现生长状态下降，出现突变等。所以要在细胞购进时就进行冻存。 2. 在细胞对数生长期进行冻存，增加细胞复苏成活率。 3. 倒去细胞上清液，加入D-Hank's液洗去残留的培养基。 4. 加入0.25%的胰酶，消化10-20s后倒去。 5. 镜下观察细胞变圆，细胞间间隙加大时，加入新鲜培养基吹打混匀。 6. 细胞计数。 7.将细胞离心，1000rpm，2min。 8. 根据计数结果加入细胞冻存液（70%完全培养基+20%FBS+10% DMSO）重悬细胞，密度为3×106个/ml。 10. 第二天将细胞放入液氮灌，并记录。 二、293T细胞的传代 1. 当细胞生长至汇合率达到80~90%需要对细胞进行传代操作，以扩大细胞数量，维持细胞良好的生长状态。 2. 消化细胞，方法同上。 3. 细胞离心结束后，加入完全培养基重悬。密度为3×105个/ml。 4. 分到10cm培养皿中，10ml/皿。 三、293T细胞的复苏 1. 当细胞传代次数过多（超过50代），细胞状态变差时或细胞出现污染事故时，需要丢弃并对开始冻存的细胞进行复苏。 2. 打开水浴锅，设置温度为40℃。 3. 查看细胞库记录，根据记录从液氮灌中取出冻存的细胞（需戴上棉手套，防止被冻伤），迅速丢入水浴锅中并快速晃动，在1~2 min内使细胞溶液完全溶解。 4. 将1ml细胞溶液加入9 ml完全培养基中并混匀后转入10cm培养皿。 5. 放回37℃、3%CO2和95%相对湿度的培养箱中培养。 6. 第二天观察细胞存活率。倒掉旧的培养基，加入10ml新鲜培养基。 二、慢病毒的包装、浓缩和滴度测定 1. 所用病毒检测引物为WPRE特异引物，序列如下

病毒空斑纯化

病毒空斑纯化 病毒蚀斑如同噬菌体的噬斑，一个蚀斑为一个病毒体的繁殖后代品系。在细胞培养中做蚀斑是一种较精确的测定病毒感染的方法，将病毒各稀释度种入单层细胞瓶，吸附1h，在单层细胞上覆以营养琼脂培养基，病毒在细胞中繁殖使细胞死亡。但由于琼脂的限制只能感染临近的细胞，形成“蚀斑”的退化细胞区，经中性红活细胞染料着色后，活细胞显红色，而蚀斑区细胞已退化步着色，形成不染色区域。凡是能在细胞培养物中产生CPE的病毒都可以采用蚀斑技术来分离和测定。 蚀斑技术在测定病毒感染时是很好的定量方法，也是测定干扰素和抗体中和病毒繁殖能力的一种非常敏感的方法。此外还可以用来纯化病毒，纯化时挑选合适的空斑进行传代即可。若目的是要提高病毒能力，应选大空斑，若是为了减毒以制备疫苗应挑选小空斑，但每瓶空斑数不得超过20-40个。 试验时，培养瓶应翻转培养，以防止水滴在琼脂面流动，以免各个蚀斑交叉融合，中性红应在蚀斑出现前加入，在暗处孵育，以防止染料抑制病毒和破坏细胞。对那些生长缓慢的病毒蚀斑，中性红则不是加在最初的覆盖层里，而是加在经过几天培养后的最后一层覆盖层上，可使培养物维持更久，甚至有的中间还得补加营养琼脂覆盖层1-2次。 蚀斑使用的琼脂往往有少量抑制物而影响蚀斑的产生，应将琼脂用单蒸水浸泡过夜，再用单蒸水冲洗2-3次，而后用去离子水冲洗1-2次后，用Hanks液配制成3%浓度，煮沸1h 除菌备用。 有人在试验时补加25mmol的MgCl2或CaCl2及1mmol的半胱氨酸，可加强肠道病毒形成蚀斑。而MgCl2的加强作用最强。 流感病毒纯化（蔗糖梯度法） 概论 转头选择 密度梯度选用 一、概论 在密度梯度离心中单一样品组份的分离是借助于混合样品穿过密度梯度层的沉降或上浮来达到的。梯度液的密度随着离心本经的增大而增加。密度梯度可以予形成，也可以在离心过程中自形成，经常，密度梯度的可以分为：速率一区带（Rate-30nal）离和等密度（Isopycnic）离心。 在速率一区带离心中混合样品的以很薄的一层铺在梯度液的上部，在离心过程中由于不同组份"颗粒"在梯度液中沉降速率的差别，而在离心的某一时刻形

病毒纯化-PEG6000

Lentiviral concentration by precipitation of lentiviral vectors using PEG 6000 (i) Take 204 ml of a vector-containing cell culture supernatant (from Step 17) after filtration using a 250-ml 0.45-mM PES filter flask. (ii) Add 51 ml of a 50% PEG 6000 solution. (iii) Add 21.7 ml of a 4 M NaCl stock solution. (iv) Add 23.3 ml of PBS. This will result in a final volume of 300 ml. The final PEG 6000 concentration will be 8.5% and the final NaCl concentration will be B0.3 M. (v) Distribute the sample as 150-ml aliquots in two 250-ml polypropylene wide-mouthed bottles. (vi) Store the bottles at 4 1C for 1.5 h. Mix contents every 20–30 min. (vii) Centrifuge bottles at 7,000g for 10 min at 4 1C using a Beckman fixed-angel JLA-10.500 rotor. (viii) After centrifugation, a white pellet should be visible. (ix) Carefully decant the supernatant and add 1.2 ml of 50 mM Tris-HCl, pH 7.4, per bottle. Resuspend the pellets by vigorously pipetting liquid up and down. (x) Vortex the bottles vigorously for 20–30 s to further resuspend the pellets. (xi) Transfer the vector suspension into screw-cap microfuge tubes in aliquots of 100 ml. (xii) Snap-freeze the tubes in crushed dry ice and store at -80 。C.

病毒的提纯

病毒的提纯 (1)病毒只在活的细胞内寄生、复制和增殖，要在病毒不失活的前提下，使之从细胞中释放出来，去除细胞成份。有些病毒如痘病毒、正粘病毒、副粘病毒、披膜病毒，病毒粒子被释放到细胞外，可以从培养液或尿囊液中提纯；而另一些病毒如腺病毒、乳多空病毒、小DNA 病毒，在毒粒成熟后只有少数病毒释放到细胞外，大量提纯时必须首先裂解细胞，使病毒大量释放。实验室常用冻融、研磨、高速捣碎、超声 波处理或高压冲击、中性去污剂裂解、蛋白酶解等物理和化学的方法。通过这些方法处理获得的粗制的病毒悬液，其中常含有大量的细胞碎片，一个有效的方法是以2 000～6 000r/min 离心30～40分钟，可除去90％以上的细胞碎片和杂质。 (2)病毒粒子实际上是大的蛋白颗粒，可以应用提纯蛋白质的一些技术方法。 (3)对大小、形状和密度高度一致的病毒粒子，可以采用分级分离的技术。当然不同的病毒，其生长特性及理化学性质不同，因此提纯方法 也不尽一致。 (一)沉淀法 主要是从稀的悬浮液中浓缩病毒，有中性盐沉淀法、聚乙二醇(PEG)沉淀法、有机溶剂沉淀法、等电点沉淀法、皂土法和鱼精蛋白沉淀法等。 1.中性盐沉淀法 病毒一般在45%以上饱和度的硫酸铵溶液中沉淀，且保持其感染性。在含有病毒的组织培养液中加入等体积的饱和硫酸铵，可以很容易地沉淀某些病毒如狂犬病毒、鸡新城疫病毒等。 2.聚乙二醇沉淀法 聚乙二醇(PEG)为水溶性非离子型聚合物，具有各种不同的分子量，用于病毒沉淀的主要是分子量为2 000～6 000的PEG。将PEG配成50%左右的溶液，或直接将固体PEG加于病毒悬液中，使其达到所需浓度，通常在4℃搅拌过夜，然后离心使病毒沉淀。Tanncock(1985年)成功地用PEG浓缩了禽脑脊髓炎病毒。 3.有机溶剂沉淀法 甲醇、氯仿、正丁醇、氟碳化合物等都可用于提纯病毒，但乙醚、氯仿等脂溶剂对于具有脂质囊膜的病毒具有破坏和灭活作用，故不适于这类病毒的浓缩提纯。 4.等电点沉淀法 病毒粒子在等电点时，所携带的正电荷与负电荷相互中和，因而失去相互排斥的作用而发生沉淀。数病毒的等电点在pH4.5～5.5之间，因此在pH3～6范围内均可沉淀，由于一部分细胞成份在等电点时亦发生沉淀，此法效果不太理想，但从感染的组织培养液中浓缩病毒，可以获得较好结果。应用酸性范围的等电点沉淀或分级沉淀病毒时，必须注意pH对病毒活性的影响及病毒粒子电荷与组织蛋白电荷的差异。 5.皂土法 Girin(1989年)应用皂土在酸性条件下(pH4～4.5)吸附轮状病毒SA-11，再在碱性条件下（pH8.5），又使其洗脱下来，从而达到纯化目的。 6.鱼精蛋白沉淀法 鱼精蛋白为碱性蛋白，具有携带其它蛋白质共沉淀的作用，能和直径大于50nm的病毒共同沉淀而不影响病毒的感染力。当向这种沉淀物加入1mol/L NaCl时，病毒又重新释放到悬液中，而鱼精蛋白仍然沉淀。直径小于50nm的小型病毒则不与鱼精蛋白共同沉淀。因此，可