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博士学位论文
牙周炎影响肥胖大鼠胰岛素抵抗
机制的初步研究
博士研究生：倪佳
指导教师：章锦才教授
摘要
研究背景和目的
继口腔病灶学说之后，近十余年来研究者们运用分子生物学、基因学及蛋白组学等方法研究来深入探讨牙周感染和系统性疾病或异常状况之间存在的内在联系及相应机制，的大量研究结果表明，牙周感染可能是某些重要的系统性疾病或异常状况的一个重要的潜在危险因素，包括心血管疾病(动脉粥样硬化心肌梗死、及脑中风等)，早产及低体重新生儿，糖尿病，呼吸道感染等。1996年美国北卡罗来纳大学Offenbacher教授据此提出了牙周病学中的一个新的分支学科，即为牙周医学（periodontal medicine），以揭示牙周健康或疾病与全身健康和疾病之间的双向联系及其意义。
牙周炎低度炎症状态可以增加全身的炎症负荷, 这可能是因为慢性牙周炎是细菌引起牙周组织的慢性感染，在细菌及其毒性产物的作用下，造成牙周组织破坏，牙周袋内形成溃疡。重度的牙周炎牙周袋内的溃疡面积可达72 cm2，相当于成人手掌大小，研究表明，这些牙周感染可通过三种不同的机制影响远隔器官或部位：1、细菌本身通过入血或淋巴等的迁移性感染，如拔牙、牙周治疗、咀嚼等均可引起短暂的菌血症(bacteremia)，在炎症的作用下引起血管通透性增加，因此刷牙、口腔治疗、甚至咀嚼硬物时很容易引起牙周致病菌及其毒素入血，形成一过性的菌血症引起并加重全身炎症反应；2、细菌的毒性产物直
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接引起的损伤，牙周致病菌及其毒性产物还可以刺激牙周组织局部表达IL-6、TNF-α、PEG2等，这些炎症介质释放入血后进一步加重全身反应，使血清CRP 水平升高；3、细菌感染引起的免疫损伤。
胰岛素抵抗是导致2型糖尿病和心血管疾病的主要危险因素，而肥胖又是胰岛素抵抗发生、发展的重要危险因素。随着社会经济的发展和生活水平的提高肥胖已经成为一种世界性流行病，脂肪组织增多和脂肪组织异常分布是导致胰岛素抵抗的重要原因。目前，普遍认为炎症是肥胖、胰岛素抵抗、糖尿病、等影响全身健康状态的发病机制之一，牙周炎和肥胖均为人群中最为广泛存在的疾病，因为共同的宿主炎症背景而发生关联，因此成为近年来牙周医学发展中的一个热点。此前已有很多研究表明，牙周炎与肥胖、甘油三酯增高、高密度脂蛋白胆固醇降低、高血压、高血糖之间存在不同程度的双向关联。但是关于牙周炎在预防糖尿病发生中的作用研究较少。在肥胖/胰岛素抵抗早期或者糖尿病前状态时牙周炎是否促进这些疾病的向糖尿病或心血管疾病发生发展？这些问题都尚未可知，因此，本实验建立肥胖动物模型探讨牙周炎影响肥胖大鼠向2型糖尿病发展的可能机制。从以下几个方面进行研究：1、分别建立牙周炎、肥胖及牙周炎复合肥胖大鼠模型。2、牙周炎对肥胖大鼠胰岛形态和功能的影响。
3、炎症因子在牙周炎促进肥胖大鼠胰岛素抵抗中的作用。
第一部分牙周炎、肥胖及牙周炎复合肥胖大鼠模型建立
目的：
分别建立牙周炎、肥胖及牙周炎复合肥胖大鼠模型。
方法：
（1）建模：大鼠出生后，将同窝的雄性幼鼠随机平均分为四组A组（正常对照组）：不施加任何干预措施，普通饲料喂饲；B组（牙周炎组）：待12周龄后，
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肥胖模型成模同期给予牙周炎干预，腹腔注射10%水合氯醛（0.3mL/100g）麻醉，取仰卧位，大鼠四肢与头固定于手术架上，将大鼠舌牵出丝线捆绑固定，以防止窒息。将3.0丝线分别结扎于左、右上颌第一磨牙（molar 2，M2）及第二磨牙（molar 1，M1）牙颈部行丝线（3-0丝线，上海泰丝）结扎并尽量置于龈沟内(见图1)，将浓度为109CFU/mL的4种标准菌混合悬液接种于龈沟内，普通饲料喂饲，每周检查丝线一次，有脱落者及时重新结扎。建模时间为8周左右；C组（肥胖组）：于出生后第1天至第10天隔天在皮下注射谷氨酸钠（sigma）（3mg/kg体重）；所有大鼠21天哺乳期后均以常规鼠饲料喂饲，自由饮食水；建模时间为12周左右；D组(复合组)：肥胖建模处理同C组，12周时肥胖成模后给予与B组相同的处理。
（2）牙周炎模型检测：外观观察牙龈组织炎症变化，组织学检测及Micro CT 扫描计算骨丧失水平，以上方法判断牙周炎模型。
（3）肥胖模型检测：测量体质量、体长、计算肥胖指数，检测血清血脂及血清空腹葡萄糖、空腹胰岛素，计算稳态模型下的胰岛素抵抗指数等。以上方法判断肥胖大鼠模型。
（4）牙周炎复合肥胖模型检测：综合牙周炎模型诊断及肥胖模型诊断方法判断牙周炎复合肥胖肥胖大鼠模型建立。
统计学处理（二级标题）
实验数据以均数±标准差来表示。应用SPSS? v13.0软件(SPSS Inc., Chicago, USA)进行统计分析。各指标先进行正态性及Levene’s test方差齐性检验。两因素两水平数据比较采用2×2析因设计，分析两种干预交互作用、单独效应及主效应，采用t检验进行单独效应分析。当P < 0.05时，被认为差异具有统计学意义。
结果：
（1）肥胖模型检测：乳鼠断乳后3个月，禁食12-15小时后，剪尾采血1-1.5ml 检测血清指标：空腹血糖、空腹胰岛素及瘦素水平。结果显示，注射MSG的肥胖组大鼠有明显瘦素，血糖，胰岛素升高及胰岛素抵抗（HOMA-IR=空腹血
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糖×空腹胰岛素/22.5，所得结果取自然对数值）（p<0.05）。这些血清指标具有MSG诱导的肥胖及胰岛素抵抗模型特征。肝脏组织切片，HE染色后可见正常组大鼠肝细胞以中央静脉为中心呈放射状排列。肝小叶的中央带临近中央静脉，中央带的供血较差，糖原较少，饥饿时最先分解，在病理条件下，细胞内先出现脂滴聚集。肥胖组大鼠肝脏内有脂肪异位沉积，肝细胞内有空泡状脂滴，肝细胞内有混合性大小泡性脂变是肥胖及其引起胰岛素抵抗在肝脏的典型表现。胰腺的组织学切片，HE染色后观察正常对照组小叶结构正常，有内外分泌腺组成，表面被覆薄层结缔组织膜，该膜伸入腺实质将腺体分为许多界限不明显的小叶。小叶内有腺泡、导管及胰岛，正常胰岛被薄层结缔组织包裹，与外分泌腺界限清晰。肥胖组胰腺外分泌腺萎缩，脂肪细胞异位沉积并取代外分泌腺泡细胞。
（2）牙周炎模型检测：牙周检查发现牙颈部结扎处有食物残留，去除丝线后可见实验牙牙龈呈暗红色，向冠方肿胀或发生退缩，龈乳头和龈缘水肿，质地松软，探诊出血多，部分牙齿松动明显，部分牙根暴露。HE染色有致牙周炎干预组即牙周炎组及牙周炎合并肥胖组，牙周膜间隙增宽，牙周膜中纤维排列紊乱，上皮钉突增生，血管扩张，牙周膜中有形成份减少，大鼠牙龈结合上皮向根方增殖，形成明显牙周袋，沟内上皮出现糜烂，呈网眼状，纤维结缔组织水肿明显，可见淋巴细胞，中性粒细胞浸润，牙槽嵴顶吸收组织学证实已成功建立大鼠慢性牙周炎模型。三维重建图像显示，与正常对照组相比较牙周炎组及复合组组两颗实验牙相邻面及颊舌面均有明显的骨高度下降，实验牙牙根面部分暴露。计算结果显示正常对照组骨吸收量与肥胖组相似，无差异。有牙周炎干预的牙周炎组及复合组组均有大量骨丧失，与前两组相比较有显著差异。说明牙周炎干预成功，造成明显骨吸收。
结论：
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采用新生小鼠皮下注射谷氨酸钠及牙周丝线结扎的方法成功建立了牙周炎复合肥胖的动物模型。该组大鼠具有明显的牙周炎症：牙周软组织破坏及骨组织吸收，骨高度降低，骨量减少。同时，也具有明显的肥胖，Lee’s指数均高于其余各组大鼠，腹内脂肪重量高于对照组2倍左右，血清葡萄糖及胰岛素也升高且有明显的胰岛素抵抗，这都符合肥胖伴胰岛素抵抗动物模型的特征。
关键词牙周炎肥胖动物模型
第二部分牙周炎对肥胖大鼠胰岛形态和功能的影响
目的：
牙周炎复合肥胖大鼠胰岛的形态和功能改变。
方法：
免疫组化染色采用自动显微镜，Image-Pro Plus 6.0拍摄系统，由不知实验内容及分组情况的病理医师读片，结果判定：胰岛素、Caspase-3及IRS-2阳性染色为褐棕色颗粒，定位于细胞质。各实验组分别与PBS代替一抗空白对照进行对比观察，并进行图像采集。
网格计数法计算胰岛β细胞相对量：用15×15条线将200倍镜下所采集的图片分割为方格得出225个交叉点，用Image J 软件计算位于交叉点的包浆胰岛素阳性的细胞核数量除以交叉点数量以该比例记为该视野下的阳性细胞率,（图2-1），每张切片取10-15个视野，平分胰腺不同的6个层次获得共18张切片/只大鼠。用β细胞相对量乘以胰腺的重量得出β细胞量（β-cell mass）。
光密度值计算：取每组8只大鼠胰岛组织切片，在胰腺胰尾处胰岛较集中的位置从不同的3个层次获得共12张切片/只大鼠，胰岛素受体底物-2（IRS-2）染色及细胞凋亡蛋白酶-3（caspase-3）免疫组化染色，在200倍光镜下，采用
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Image-Pro Plus 6.0图像系统采集所有胰岛数码照片，每只大鼠计算至少50个胰岛。打开Image-Pro Plus 6.0图像分析系统，首先对图片进行光密度校正，选取测量区域，然后选取测量项目综合光密度（Integrated optical density, IOD）及测量面积，输出数据，统计上述区域的平均IOD值，最后取均值作为代表每组切片染色强度的IOD值。
统计学处理（二级标题）
实验数据以均数±标准差来表示。应用SPSS? v13.0软件(SPSS Inc., Chicago, USA)进行统计分析。各指标先进行正态性及Levene’s test方差齐性检验。两因素两水平数据比较采用2×2析因设计，分析两种干预交互作用、单独效应及主效应，采用t检验进行单独效应分析。相关分析采用Pearson相关。当P < 0.05时，被认为差异具有统计学意义。
结果：
（1）HE染色光镜下观察四组大鼠胰岛形态：正常胰岛被薄层结缔组织包裹，与外分泌腺界限清晰。肥胖组胰腺外分泌腺萎缩，脂肪细胞异位沉积并取代外分泌腺泡细胞。牙周炎复合肥胖组，胰岛边界不清，不规则伸入外分泌腺内，是糖尿病时胰岛病变的特点。
（2）检测复合组与单纯肥胖β细胞量的差异，探讨两组大鼠β细胞的代偿能力。胰岛β细胞形态学测量结果显示，与正常对照组（9.367±0.324mg）相比，单纯肥胖组β细胞量增加（14.733±0.266mg，P=0.000）。单纯肥胖组与复合组比较，后者β细胞量显著减少（11.016±.438mg，P=0.000）。与单纯肥胖组大鼠相比，复合组大鼠胰岛病理改变的同时β细胞量减少，提示牙周炎促进了β细胞代偿机制的衰退。进一步对胰岛β细胞凋亡情况的检测显示，caspase-3在复合组的表达显著高于单纯肥胖组（t=10.651，P=0.000），交互作用分析胰岛caspase-3蛋白表达，结果显示，牙周炎处理与肥胖处理存在交互作用（F=99.865,P=0.000），提示牙周炎促进了肥胖大鼠胰岛内caspase-3表达。
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（3）检测胰岛内IRS-2蛋白相对量表达，初步分析牙周炎影响肥胖大鼠β细胞代偿功能可能的途径，结果显示，肥胖组表达显著高于复合组（t=-15.552，P=0.000）。IRS-2结果的析因分析显示，牙周炎处理与肥胖处理存在交互作用(F=16.714，P=0.000)，提示在复合组IRS-2表达的下降与牙周炎干预有关。IRS-2蛋白相对量与β细胞量相关性分析显示为正相关，IRS-2蛋白量减少时β细胞量也随之减少。提示β细胞量减少与IRS-2减少有关。
结论
（1）牙周炎加重了肥胖大鼠胰岛素抵抗，β细胞量减少，β细胞功能受损。（2）牙周炎可能通过促进肥胖β细胞caspase-3表达，下调胰岛素受体底物-2途径，进一步加重了肥胖时的胰岛素抵抗。
关键词胰岛β细胞β细胞量caspase-3 胰岛素受体底物-2 细胞凋亡
第三章牙周炎合并肥胖大鼠血清炎症因子水平升高
及其促胰岛素抵抗作用
目的：
本实验讨论牙周炎对肥胖大鼠血清中TNF-α、CRP及IL-1β表达与相关组织器官病变之间的关系，试探讨牙周炎可能通过这些炎症因子对肥胖大鼠产生的促胰岛素抵抗作用。
方法：
（1）ELISA方法检测血清TNF-α、CRP及IL-1β表达，分析及其胰岛素抵抗的相关性。
（2）取每组8只大鼠，牙周组织近远中向切片4张/只大鼠，分别进行TNF-α
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及IL-1β免疫组化染色。采用自动显微镜，Image-Pro Plus 6.0拍摄系统，由不知实验内容及分组情况的病理医师读片，结果判定：TNF-α及IL-1β阳性染色为褐棕色颗粒，定位于细胞质。TNF-α常见于成纤维细胞、角质形成细胞、炎症细胞。IL-1β常见于成纤维细胞及炎症细胞。各实验组分别与PBS代替一抗空白对照进行对比观察，并进行图像采集。光密度值计算：在200倍光镜下，采用Image-Pro Plus 6.0图像系统采集照片。采用Image-Pro Plus 6.0图像分析系统，首先对图片进行光密度校正，选取测量区域，然后选取测量项目综合光密度（Integrated optical density, IOD）及测量面积，输出数据，统计上述区域的平均IOD值，最后取均值作为代表每组切片染色强度的IOD值。
统计学处理（二级标题）
实验数据以均数±标准差来表示。应用SPSS? v13.0软件(SPSS Inc., Chicago, USA)进行统计分析。各指标先进行正态性及Levene’s test方差齐性检验。两因素两水平数据比较采用2×2析因设计，分析两种干预交互作用、单独效应及主效应，采用t检验进行单独效应分析。相关分析采用Pearson相关。当P < 0.05时，被认为差异具有统计学意义。
结果：
（1）各组牙周组织TNF-α及IL-1β免疫组化染色，在牙周炎组及复合组成纤维细胞、上皮内纤维化组织及少量角化上皮内见棕色颗粒TNF-α及IL-1β阳性表达。平均光密度值计算结果显示，有牙周炎干预的实验大鼠牙周组织TNF-α及IL-1β相对蛋白量显著高于其余两组。而肥胖大鼠牙周局部未检测到TNF-α及IL-1β表达升高。析因分析TNF-α及IL-1β在牙周局部的表达，结果显示，肥胖处理与牙周炎处理之间无交互作用，提示肥胖未对局部牙周组织产生促TNF-α及IL-1β表达的作用。
（2）血清ELISA检测结果显示，复合组TNF-α、CRP及IL-1β水平均显著高于其余各组，以上各指标的交互作用分析结果提示，牙周炎上调了肥胖大鼠血清中TNF-α、CRP及IL-1β水平。相关性分析显示，TNF-α、CRP及IL-1β均与
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胰岛素抵抗呈正相关性。
结论：
（1）大鼠牙周炎时，局部TNF-α及IL-1β表达增加。肥胖对于牙周局部TNF-α及IL-1β未见明显促进作用。
（2）与单纯肥胖组相比，复合组胰岛素抵抗加重可能与其血清TNF-α、CRP 及IL-1β水平升高有关。
关键词肿瘤坏死因子-α；C反应蛋白；白细胞介素1
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