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绿色荧光蛋白标记的表达载体pHis-EGFP的构建

绿色荧光蛋白标记的表达载体pHis-EGFP的构建
绿色荧光蛋白标记的表达载体pHis-EGFP的构建

荧光素标记抗体方法

荧光素标记抗体技术 (一) 原理 目前用于抗体标记的荧光素主要有异硫氰酸荧光素(Fluorescein isothiocy nate,FITC)或罗达明(Lissamine rhodamine B200, RB200)。在硷性条件下FITC 的碳酰胺键可与抗体赖氨酸的ε氨基共价结合,标记后的抗体仍保持与相应抗原结合的能力。在荧光灯源紫外线或兰紫光激发下产生黄绿色荧光,通过在荧光显微镜下观察或流式细胞仪分析可对相应抗原进行定性、定位或定量的检测。 (二) 操作步骤 将纯化的IgG抗体对PH9~9.5碳酸盐缓冲液透析过夜, 透析后抗体液移入小烧杯中 ↓ 称取适量IFTC,加入二甲亚砜(DMSO)(FITC~1mg/1ml DMSO) 使终浓度为1mgFITC/1mlDMSO FITC/IgG比例:如IgG浓度为1mg/ml,FITC/IgG比例约为50μgFI TC/mgIgG; 如IgG为5~10mg/ml,则比例为25μgFITC/ml IgG 在10ml小烧杯中先放入抗体 ↓ 按上述比例将FITC-DMSO溶液逐滴加入透析后的抗体溶液中 ↓ 将标记物用PBS加至2.5ml,磁力搅拌器室温下避光搅拌2h ↓ 用PD10柱(Sephadex G25柱)除去游离荧光素,先用25ml PBS淋洗G2 5柱 ↓

收集PBS洗脱第一个荧光素结合蛋白峰,测定F/P 比值。第二个荧光素峰为游离荧光素 计算: 2.87×A495 F/P=──────── A280-0.35×A495 合适的F/P值为2~4。 (三) 试剂器材 1. 纯化的多克隆抗体或单克隆抗体。 2. FITC(Fluorescein-5-Lsothiocyanalte)或其它荧光色素。 3. PBS、DMSO 4. PH9~9.5碳酸盐缓冲液: Na 2CO 3 4.3g,NaHCO 3 8.6g加蒸馏水至500ml。 5. PD10柱(Sephadex G25柱) 6.磁力搅拌器,紫外分光光度计等 (四) 注意事项 1. FITC保存于4℃暗处,使用前待试剂瓶升至室温时开盖称取,以避免潮解。 2. FITC-DMSO液要临用时配制。 3. 碳酸盐缓冲液要新鲜配制。 如有侵权请联系告知删除,感谢你们的配合!

荧光蛋白(整理)

荧光 一、定义 荧光(fluorescence )又作“萤光”,是指一种光致发光的冷发光现象。当某种常温物质经某种波长的入射光(通常是紫外线或X射线)照射,吸收光能后进入激发态,并且立即退激发并发出比入射光的的波长长的出射光(通常波长在可见光波段);而且一旦停止入射光,发光现象也随之立即消失。具有这种性质的出射光就被称之为荧光。 二、原理 光照射到某些原子时,光的能量使原子核周围的一些电子由原来的轨道跃迁到了能量更高的轨道,即从基态跃迁到第一激发单线态或第二激发单线态等。第一激发单线态或第二激发单线态等是不稳定的,所以会恢复基态,当电子由第一激发单线态恢复到基态时,能量会以光的形式释放,所以产生荧光。 荧光是物质吸收光照或者其他电磁辐射后发出的光。大多数情况下,发光波长比吸收波长较长,能量更低。但是,当吸收强度较大时,可能发生双光子吸收现象,导致辐射波长短于吸收波长的情况发射。当辐射波长与吸收波长相等时,既是共 荧光强度:荧光强度与该种物质的荧光量子产率、消光系数以及含量等因素有关。荧光量子产率Q:量子产率表示物质将吸收的光能转化为荧光的本领,是荧光物质发出光子数与吸收光子数的比值。荧光蛋白分子的亮度由其量子产率与消光系数的乘积决定,与成像检测灵敏度密切相关。 三、荧光蛋白 1、绿色荧光蛋白(green fluorescent protein,GFP )

在光谱的绿光区(500nm-525nm)已经发现了多种荧光蛋白,而且来源广泛,包括不同种属的Aequorea 、桡足类动物、文昌鱼以及珊瑚。然而多数有齐聚反应,即使最好的荧光蛋白与EGFP相比,也没有明显的优点。或许目前活细胞成像最好的选择是GFP 衍生的Emerald(祖母绿),它与EGFP的特性相似。Emerald包含F64L 和S65T突变,另外还有四个点突变从而改进了折叠、37℃时的突变率以及亮度。虽然Emerald比EGFP更有效,但含有快速光漂白成分,可能在某些环境下其定量成像会受到影响。 下面主要介绍GFP及其衍生型荧光蛋白: (1)来源绿色荧光蛋白最早由美籍日裔科学家下村修于1962年在水母中发现。这种蛋白质在蓝色波长范围的光照激发下发出绿色荧光,其发光过程需要冷光蛋白质 Aequorin 的帮助,而且,这个冷光蛋白质可与钙离子(Ca2+)相互作用。在水母中发现的野生型绿色荧光蛋白的分子量较小,仅为27~30kDa,而编码GFP的基因序列也很短,为2.6kb 。 (2)性质 GFP由238个氨基酸残基组成。GFP序列中的65-67 位残基(Ser65-Tyr66-Gly67 )可自发形成荧光发色基团——对羟基苯咪唑啉酮GFP的激发光谱在400nm附近有一个主激发峰,在470nm附近有一个次激发峰。发射光谱在505nm附近有一尖锐的主发射峰,在540nm附近有一肩峰GFP的化学性质相当稳定,无光漂白现象(Photobleaching ),用甲醛固定和石蜡包埋亦不影响其荧光性质。在细胞生物学与分子生物学领域中,绿色荧光蛋白基因常被用作报告基因。 (3)野生型 野生型GFP(wild type GFP, wtGFP )从一开始就引起了人们极大的兴趣,而且被用作新型的简单报告基因及体内标记,但GFP在异源生物体中的表达并非那么简单。例如,研究人员很早就发现需要在较高的温度下孵育才能在细胞或生物体中表达GFP,并且wtGFP在37℃的热稳定性差。这些都阻碍了它在转基因中的应用。这些难题促使人们进一步筛选分离wtGFP的变体。现在,人们已经找到了荧光强度更强且更耐热的变体。 这些变体多数为经突变的脱辅基蛋白,它们可防止高温导致的错误折叠。近年来出现的新型wtGFP基因突变体的激发和发射谱发生了改变,热稳定性和荧光强度得到了提高,GFP报告基因在小鼠中的应用就是以这些变体作为基础的。 (4)增强型绿色荧光蛋白(EGFP)现在,应用最为广泛的是红移变体增强型GFP (EGFP)。诸如EGFP这些红移变体的最大激发峰发生红向移动,大约为490nm,这一波长也恰好是多数分光设备、流式细胞仪及共聚焦显微镜的常用波长。EGFP有两个氨基酸突变,当被蓝光激发时,它发出的荧光要比wtGFP亮30-40 倍。wtGFP和包括EGFP在内的多数变体半衰期长,所以不适合精确追踪表达的减少或损耗。 (5)不稳定增强型绿色荧光蛋白(dEGFP) 为克服这一问题,人们在1998年构建了不稳定增强型绿色荧光蛋白(dEGFP)。原理就是将EGFP的cDNA融合到小鼠鸟氨酸脱羧酶(Ornithine decarboxylase, ODC)基因的C-末端。ODC含有一个PEST序列,这个序列可促进该蛋白在细胞内的降解。虽然,目前这些不稳定变体还没有在小鼠中应用,但这些变体有利于实时追踪基因表达动力学的研究。 (6)增强型黄色荧光蛋白(EYFP)另一种红移变体是增强型黄色荧光蛋白(EYFP),该变体有四个氨基酸突变。在527nm时,EYFP的发射光从绿色变为黄绿色。EYFP荧光的亮度水平与EGFP相当。EYFP 抗酸性差、对卤化物敏感,使它的应用受到限制。在EYFP 基础上改进的突变体mCitrine[21] 和mVenus[22]是目前应用

同位素示踪与荧光标记技术

同位素示踪与荧光标记技术 [热考解读] 1.同位素示踪法 (1)同位素示踪法:用示踪元素标记的化合物,可以根据这种化合物的放射性,对有关的一系列化学反应进行追踪。这种科学的研究方法叫做同位素示踪法,也叫同位素标记法。(2)应用:可用于研究细胞内的元素或化合物的来源、组成、分布和去向等,进而了解细胞的结构和功能、化学物质的变化、反应机理等。还可用于疾病的诊断和治疗,如碘的放射性同位素可以用来治疗甲状腺肿大。 (3)使用注意事项:一次只能使用一种同位素标记 2.荧光标记法 荧光标记法(Fluorescent Labeling)是利用荧光蛋白或荧光蛋白基因作为标志物对研究对象进行标记的分析方法。 (1)常用的荧光蛋白为绿色和红色两种 ①绿色荧光蛋白(GFP)常用的是来源于发光水母的一种功能独特的蛋白质,分子量为27 kD,具有238个氨基酸,蓝光或近紫外光照射,发射绿色荧光。 ②红色荧光蛋白来源于珊瑚虫,是一种与绿色荧光蛋白同源的荧光蛋白,在紫外光的照射下可发射红色荧光,有着广泛的应用前景。 (2)人教版教材中用到荧光标记法的地方 ①《必修1》P66“细胞融合实验”:这一实验很有力地证明了细胞膜的结构特点是具有一定的流动性。 ②《必修2》P30“基因在染色体上的实验证据”:通过现代分子生物学技术,运用荧光标记的手段,可以很直观地观察到某一基因在染色体上的位置。 (3)荧光标记法特别是在免疫学研究中也有重要的作用,例如免疫荧光抗体标记法。将已知的抗体或抗原分子标记上荧光素,当与其相对应的抗原或抗体起反应时,在形成的复合物上就带有一定量的荧光素,在荧光显微镜下就可以看见发出荧光的抗原抗体结合部位,检测出抗原或抗体。 [命题设计] 1.(2018·山东青岛一模)同位素标记法常用于追踪物质运行和变化规律的研究,下列相关叙述不正确的是() A.给小鼠供应18O2,其呼出气体中可能含有C18O2 B.用含3H标记的尿嘧啶核糖核苷酸的营养液培养洋葱根尖,只能在分生区细胞中检测到放射性 C.用15N标记DNA分子,可用于研究DNA分子的半保留复制 D.用32P标记的噬菌体侵染大肠杆菌,保温、搅拌、离心后可检测到沉淀物中放射性很高

荧光标记技术在蛋白质定位及功能研究中的应用

荧光标记技术在蛋白质定位及功能研究中的应用 Feb 20, 2010No Comments 随着分子生物学、有机化学以及材料科学等学科的进展,最近我们又获得了好几种新型的荧光蛋白标签,这些标签可以用于细胞生物学成像研究。本文将对荧光标志物在蛋白质研究中的优势及劣势进行一番详细的介绍,文章中将重点介绍如何使用荧光标志物研究活体细胞(而不是固定细胞)中的靶蛋白。使用该方法可以对靶蛋白的表达情况、细胞中的定位情况、活性状态等指标进行研究,还将介绍将荧光显微镜与电子显微镜技术相结合的可行性问题。小分子荧光标志物染料、纳米晶体材料,即所谓的“量子点(quantum dots)”材料、自发荧光蛋白、小分子蛋白质标签等等这些材料都可以作为荧光标志物,而且将这几种材料“混合”起来是一种非常有前途的荧光标志物研究新思路。 我们使用荧光技术来研究细胞生物学已经好多年了,而且在从微小的分子层面到完整的有机体层面等各个层面都可以使用荧光技术进行研究。最开始使用的方法是将小分子有机染料与各种抗体相连接,来研究各种目的蛋白。不过这种使用抗体的方法如果需要对细胞内的蛋白质进行研究时,还需要对细胞进行固定和透化操作。因此后来又发展出可以直接在活体细胞内标记某种细胞器、核酸分子或某些离子的荧光标志物。在最近这10年里,荧光蛋白的出现使得进行非侵入性的活体细胞成像成为了可能。使用这种荧光蛋白标志物,我们可以研究目的基因的表达情况,蛋白质运输情况以及各种细胞内动态的生物化学信号通路。使用经过遗传修饰的小分子有机荧光标志物构建的混合系统,我们还可以对蛋白质的寿命进行研究,如果再结合电镜技术和快速光淬灭技术(rapid photoinactivation)还可以对蛋白质的定位情况进行研究。与此同时,半导体纳米晶体材料技术也得到了高度的发展,现在,这种新型的材料在亮度和光稳定性方面都要比传统的荧光标志物好得多,只不过现在这种材料的靶向性还不是很好。本文中我们将对目前荧光标志物及其相关技术的发展进行介绍,同时还将介绍荧光标志物在蛋白质表达、蛋白质活性以及蛋白质功能研究工作中的作用进行介绍。 ?0?2 荧光标志物 小分子有机染料 小分子有机染料是指分子量小于1KD的小分子物质,这种小分子有机染料可以通过与生物大分子共价连接的方式对其进行标记,我们现在对这种染料的最佳检测波长范围、亮度,即吸光系数、光稳定性和自我淬灭特性都有了比较详尽的了解。利用荧光染料的分子策略包括扩展共轭双键、额外添加环状结构增强其刚性、用氟或磺酸盐这类吸电子性的或带电荷的物质进行修饰等。现在市面上已经有数百种这类荧光染料的商业化产品可供选择,而且还在不断增加之中。不过由于这类染料对蛋白质缺乏特异性,因此多与抗体联用(图1A~C)。?0?2 荧光蛋白 第一批用于细胞生物学的荧光蛋白包括藻胆蛋白(phycobiliproteins)和从蓝藻

实验绿色荧光蛋白

生物技术实验报告 姓名:张龙龙 学号:2011506066 班级:11级生技02班

前言:绿色荧光蛋白(green fluorescent protein,GFP)是一类存在于包括水 母、水螅和珊瑚等腔肠动物体内的生物发光蛋白。当受到紫外或蓝光激发时,GFP 发射绿色荧光。它产生荧光无需底物或辅因子发色团是其蛋白质一级序列固有的。GFP 由3 个外显子组成,长2.6kb;GFP 是由238 个氨基酸所组成的单体蛋白,相对分子质量为27. 0kMr,其蛋白性质十分稳定,能耐受60℃处理。1996 年GFP 的晶体结构被解出,蛋白质中央是一个圆柱形水桶样结构,长420 nm,宽240 nm,由11 个围绕中心α螺旋的反平行β折叠组成,荧光基团的形成就是从这个螺旋开始的,桶的顶部由 3 个短的垂直片段覆盖,底部由一个短的垂直片段覆盖,对荧光活性很重要的生色团则位于大空腔内。发色团是由其蛋白质内部第65-67位的Ser-Tyr-Gly自身环化和氧化形成. 一.实验目的 1、了解表达用基因克隆引物设计的原理和方法。 2、了解利用原核表达系统表达外源基因的原理、流程及方法。 3、掌握PCR、DNA片段的酶切与连接、细菌转化、阳性克隆筛选、质粒提取、DNA样品的纯化、核酸电泳等分子生物学基本技术。 二.实验原理 基因工程一般包括四个步骤:一是取得符合人们要求的DNA片段,这种DNA片段被称为“目的基因”;二是将目的基因与质粒或病毒DNA连接成重组DNA;三是把重组DNA引入某种细胞;四是把目的基因能表达的受体细胞挑选出来。 本实验根据绿色荧光蛋白(GFP)的基因序列设计一对引物,用该引物将GFP基因从含GFP基因的质粒中扩增出来。再利用双酶切切开表达载体pET23b 和目的基因的两端接头,通过T4连接酶GFP基因与表达载体重组。将含GFP 基因的重组表达载体导入宿主菌BL21(DE3),在IPTG的诱导下,使GFP基因表达 三.实验材料及仪器 1、实验材料:含有GFP的质粒;DNA Marker;DH5α;BL21; 2、仪器:恒温培养箱、超净工作台、恒温摇床、制冰机、台式离心机、涡旋振荡器、冰箱、电泳仪、透射仪、PCR仪、PCR管、刀片、玻璃涂棒、酒精灯、无菌牙签、吸水纸、微型离心管、台式冷冻离心机、塑料手套、1.5ml离心管。 四.实验内容 4.1 质粒的提取、酶切及电泳鉴定: 1)实验试剂:LB培养基;溶液Ⅰ;Tris-HCl(pH=8);溶液Ⅱ;溶液Ⅲ; 酚/氯仿抽提液;无水乙醇;电泳缓冲液;加样缓冲液;GoldView核酸 DNA 染色剂;1%的琼脂糖凝胶;XhoⅠ(10U/μl);NdeⅠ(10U/μl);T 4 lisase。 2)实验步骤: 质粒的提取与鉴定

绿色荧光蛋白

绿色荧光蛋白GFP的研究与应用 摘要:绿色荧光蛋白(GFP)是一种极具潜力的标记物,有着广泛的应用前景。通过阅读吴沛桥的《绿色荧光蛋白GFP的研究进展及应用》这篇文献,对GFP有了进一步了解。 关键词:绿色荧光蛋白(GFP);性质;原理;应用 1 引言 发光是海洋无脊椎动物中普遍存在的现象,一些腔肠动物包括水母、水螅和珊瑚等受到机械性干扰时都可发射绿色荧光,而栉水母类发射蓝色荧光。绿色荧光蛋白(green fluorescent protein,GFP)是一类存在于这些腔肠动物体内的生物发光蛋白。1962 年,Shimomura 等从维多利亚多管水母(Aequoria victoria)中分离纯化生物发光蛋白质——水母蛋白, 并观察到一个在紫外光下发出“非常明亮, 浅绿色荧光”的副产物。1974 年,Shimomura等纯化得到了这种自发荧光的蛋白(即GFP)。 2008年10月8日,瑞典皇家科学院诺贝尔奖委员会将2008年度诺贝尔化学奖授予日裔美国科学家下村修(Osamu Shimomura)、美国科学家马丁·查尔非(Mratin Chalfie)以及美国华裔科学家钱永健(Rorge Y.Tsien),他们三人因为在绿色荧光蛋白的发现以及改造方面做出了突出成就。 2 GFP的理化性质 从水母体内分离到的GFP基因,长达2.6kD,由3个外显子组成,分别编码69、98和71个氨基酸。GFP本身是一种酸性,球状,可溶性天然荧光蛋白。 GFP性质极其稳定,耐高温,甲醛固定和石蜡包埋不影响其荧光性质。其变性需在90℃或pH<4.0或pH>12.0的条件下用6mol/L盐酸胍处理,一旦恢复中性环境或去除变性剂,虽然变性的蛋白质并不能完全复性,但是复性蛋白质同天然蛋白质对温度、pH变化的耐受性、抗胰蛋白酶消解的能力是相同的。更重要的是,它们在pH7.0~pH12.2的范围内的吸收、发射光谱也是相同的。 3 GFP的荧光原理

绿色荧光蛋白的应用及发展前景汇总

学士学位论文文献综述题目绿色荧光蛋白的应用及发展前景 姓名周紫嫣学 号014010110349 专业生物工程 指导教师周小萍职 称教师 中国·武汉二○一二年四月

目录 摘要······················································································ II 关键词 ···················································································· II Abstract ··················································································· II Key words ················································································ II 1 GPF的发现 (1) 2 GFP的结构及发光原理 (1) 2.1 GFP的结构 (1) 2.2 GFP的发光原理 (2) 3 GFP在生物技术中的应用 (2) 3.1 GFP作为报告基因 (2) 3.2 GFP用于研究病毒与宿主的关系 (3) 3.3 GFP用于药物筛选 (3) 3.4 GFP作为生物传感器 (3) 3.5 GFP用于融合抗体 (4) 3.6 GFP用于计算细胞生长速度 (4) 3.7 GFP用于基因表达调控 (4) 4 GFP存在问题及发展前景 (4) 参考文献 (5) 致谢 (5)

绿色萤光蛋白

绿色萤光蛋白(green fluorescent protein),简称GFP,这种蛋白质最早在一种学名Aequorea victoria的水母中发现。其基因所产生的蛋白质,在蓝色波长范围的光线激发下,会发出绿色萤光。这个发光的过程中还需要冷光蛋白质Aequorin的帮助,且这个冷光蛋白质与钙离子(Ca+2)可产生交互作用。 由水母Aequorea victoria中发现的野生型绿色萤光蛋白,395nm和475nm分别是最大和次大的激发波长,它的发射波长的峰点是在509nm,在可见光绿光的范围下是较弱的位置。由海肾(sea pansy)所得的绿色萤光蛋白,仅有在498nm有一个较高的激发峰点。 在细胞生物学与分子生物学领域中,绿色萤光蛋白基因常被用作为一个报导基因(reporter gene)。一些经修饰过的型式可作为生物探针,绿色萤光蛋白基因也可以克隆到脊椎动物(例如:兔子上进行表现,并拿来映证某种假设的实验方法。 我们这边细胞组的基本上都在用这个东东。标记细胞 GFP的分子结构和发光机制 绿色荧光蛋白为一个由238个氨基酸残基组成的单链,GFP有两个吸收峰,主峰在395nm,次峰在470nm,其荧光发射峰在509nm。GFP 的化学性质相当稳定,其变性需要在90℃或pH<4或pH>12的条件下用6mollL盐酸胍处理,这一性质与GFP的结构特性相关。 Yang等的研究表明,GFP是由两个相当规则的内含一个α-螺旋和外面包围l1个β-折叠的β-桶状结构组成的二聚体,β-桶状结构直径约3nm,高约4nm。β折叠彼此紧密结合,象桶板一样形成桶状结构的外围,并且形成了一个规则的氢键带。桶状结构和位于其末端的短α螺旋以及环状结构一起组成一个单独的致密结构域,没有可供扩散的配体进入缝隙。这种坚实的结构保证了其稳定和抗热、抗变性的特点。 GFP的生色基团附着于α-螺旋上,几乎完美的包被于桶状结构中心。位于圆桶中央的α-螺旋含有一个由六肽组成的发光中心,而发光团是由其中的三肽Ser65-Tyr66-Gly67经过环化形成了对羟基苯咪唑啉酮。GFP的生色基团是蛋白质自身催化环化的结果,环化是一个有氧过程,在严格厌氧条件下GFP不能形成荧光,因为GFP的生色团形成需要O2使Tyr66脱氢氧化。生色基团通过Tyr66的脱质子(酚盐)和质子化状态(羟酚基)的转换决定荧光发射,此模型为Yang等的晶体学证据所支持。 GFP在生物技术中的应用研究 1.分子标记 作为一种新型的报告基因,GFP已在生物学的许多研究领域得到应用。利用绿色荧光蛋白独特的发光机制,可将GFP作为蛋白质标签(protein tagging),即利用DNA重组技术,将目的基因与GFP基因构成融合基因,转染合适的细胞进行表达,然后借助荧光显微镜便可对标记的蛋白质进行细胞内活体观察。由于GFP相对较小,只有238个氨基酸,将其与其他蛋白融合后不影响自身的发光功能,利用GFP的这一特性已经加深了我们对细胞内一些过程的了解,如细胞分裂、染色体复制和分裂,发育和信号转导等。1996年,Ehrdardt等人首次报道了利用GFP的特性研究细胞分化蛋白FtsZ的定位。研究显示FtsZ在细胞分裂位点形成了一个环状物,且至少有9种蛋白在细胞分裂中起重要作用,尽管对这些蛋白功能仍然不是很清楚,但是利用GFP融合蛋白已经搞清楚了它们聚合的顺序以及在蛋白定位中的一些特征。利用GFP来检测目标蛋白的定位已为我们提供了一种对细胞内的一些基本的生理过程进行更详尽观察的新方法。 除用于特定蛋白的标记定位外,GFP亦大量用于各种细胞器的标记如细胞骨架、质膜、细胞核等等。Shi等人曾报道将GFP融合到大肠杆菌细胞膜表面用作标记蛋白,这一技术将有助于提高多肽库的筛选效率、疫苗的研制、构建细胞生物传感器用作环境检测以及探测信号转导过程等等。这些都为传统生物学研究提供了新思路和新方法,成为交叉学科研究的热点。 2.药物筛选 许多新发展的光学分析方法已经开始利用活体细胞来进行药物筛选,这一技术能从数量众多的化合物中快速筛选出我们所感兴趣的药物。基于细胞的荧光分析可分为三类:即根据荧光的密度变化、能量转移或荧光探针的分布来研究目标蛋白如受体、离子通道或酶的状态的变化。荧光探针分布是利用信号传导中信号分子的迁移功能,将一荧光蛋白与信号分子相偶联,根据荧光蛋白的分布情况即可推断信号分子的迁移状况,并推断该分子在迁移中的功能。由于GFP分子量小,在活细胞内可溶且对细胞毒性较小,因而常用作荧光探针。 在细胞体内分子之间的相互作用非常复杂,其中很多涉及到信号分子在细胞器之间的迁移。例如当信号分子和某一特殊受体结合后常会导致配体-受体复合物从某一细胞区域迁移到另一区域,而这一迁移过程通常会介导一重要的生理功能。因而,这些受体常常被用作药物筛选的目标,若某一药物具有与信号分子类似的功能,那么该药物即具有潜在的医药价值。利用GFP荧光探针,将很容易从数量众多的化合物中判断出那些化合物具有与信号分子相似的能引起配体一受体复合物迁移并介导生理反应的功能,且这一筛选过程简单方便,所需成本也很低。利用这一原理,已经成功构建了一个筛选模型用于研究药物介导的糖皮质激素受体(hGR)的迁移过程。在一96孔板中培养细胞,并以一编码hGR GFP蛋白的质粒转染该细胞。当细胞用待筛选的药物处理后,hGR-GFP从细胞质迁移人细胞核的过程可实时或在某一时段

荧光技术

https://www.sodocs.net/doc/c311842248.html,/?p=21977 首页专题译述会议展览技术方法教学视频热点话题生命百态研究前沿科研综述电子杂志RSS 订阅当前位置: 生命奥秘> 技术方法> 文章正文荧光标记技术在蛋白质定位及功能研究中的应用 cyq 发表于2010-02-20 14:48 | 来源:| 阅读 随着分子生物学、有机化学以及材料科学等学科的进展,最近我们又获得了好几种新型的荧光蛋白标签,这些标签可以用于细胞生物学成像研究。本文将对荧光标志物在蛋白质研究中的优势及劣势进行一番详细的介绍,文章中将重点介绍如何使用荧光标志物研究活体细胞(而不是固定细胞)中的靶蛋白。使用该方法可以对靶蛋白的表达情况、细胞中的定位情况、活性状态等指标进行研究,还将介绍将荧光显微镜与电子显微镜技术相结合的可行性问题。小分子荧光标志物染料、纳米晶体材料,即所谓的“量子点(quantum dots)”材料、自发荧光蛋白、小分子蛋白质标签等等这些材料都可以作为荧光标志物,而且将这几种材料“混合”起来是一种非常有前途的荧光标志物研究新思路。 我们使用荧光技术来研究细胞生物学已经好多年了,而且在从微小的分子层面到完整的有机体层面等各个层面都可以使用荧光技术进行研究。最开始使用的方法是将小分子有机染料与各种抗体相连接,来研究各种目的蛋白。不过这种使用抗体的方法如果需要对细胞内的蛋白质进行研究时,还需要对细胞进行固定和透化操作。因此后来又发展出可以直接在活体细胞内标记某种细胞器、核酸分子或某些离子的荧光标志物。在最近这10年里,荧光蛋白的出现使得进行非侵入性的活体细胞成像成为了可能。使用这种荧光蛋白标志物,我们可以研究目的基因的表达情况,蛋白质运输情况以及各种细胞内动态的生物化学信号通路。使用经过遗传修饰的小分子有机荧光标志物构建的混合系统,我们还可以对蛋白质的寿命进行研究,如果再结合电镜技术和快速光淬灭技术(rapid photoinactivation)还可以对蛋白质的定位情况进行研究。与此同时,半导体纳米晶体材料技术也得到了高度的发展,现在,这种新型的材料在亮度和光稳定性方面都要比传统的荧光标志物好得多,只不过现在这种材料的靶向性还不是很好。本文中我们将对目前荧光标志物及其相关技术的发展进行介绍,同时还将介绍荧光标志物在蛋白质表达、蛋白质活性以及蛋白质功能研究工作中的作用进行介绍。 荧光标志物 小分子有机染料 小分子有机染料是指分子量小于1KD的小分子物质,这种小分子有机染料可以通过与生物大分子共价连接的方式对其进行标记,我们现在对这种染料的最佳检测波长范围、亮度,即吸光系数、光稳定性和自我淬灭特性都有了比较详尽的了解。利用荧光染料的分子策略包括扩展共轭双键、额外添加环状结构增强其刚性、用氟或磺酸盐这类吸电子性的或带电荷的物质进行修饰等。现在市面上已经有数百种这类荧光染料的商业化产品可供选择,而且还在不

试验设计——绿色荧光蛋白的表达

分子生物学实验设计报告 绿色荧光蛋白的克隆表达 ——闵霞(2013141241165)李彩云(2013141241095) 一、引言 基因标记技术是近年来发展起来的分子生物学技术。荧光蛋白基因在标记基因方面由于具有独特的优点而广受科学家们的关注。荧光蛋白是海洋生物体内的一类发光蛋白,分为绿色荧光蛋白、蓝色荧光蛋白、黄色荧光蛋白和红色荧光蛋白。 绿色荧光蛋白(green fluorescent protein,GFP)是一类存在于包括水母、水螅和珊瑚等腔肠动物体内的生物发光蛋白。当受到紫外或蓝光激发时,GFP发射绿色荧光。它产生荧光无需底物或辅因子,发色团是其蛋白质一级序列固有的。 基因克隆技术包括把来自不同物的基因同有自主复制能力的载体DNA在体外人工连接,构建成新的重组DNA,然后送入受体生物中去表达,从而产生遗传物质和状态的转移和重新组合。采用重组DNA技术,将不同来源的DNA分子在体外进行特异性切割,重新连接,组装成一个新的杂合DNA 分子。在此基础上,这个杂合分子能够在一定的宿主细胞中进行扩增,形成大量的子代分子。 本次实验中,分子克隆质粒载体所携带的外源基因是EGFP绿色荧光蛋白,实验的最终目的是将EGFP基因插入表达载体pET-28a中,组成重组子,并导入到大肠杆菌细胞中并诱导其表达,培养出绿色的大肠杆菌菌落。为此,我们要利用碱变性法将大肠杆菌中的质粒DNA提取出来,并通过Bam HI和NotⅠ两种酶的双酶切作用,从而获得目的外源基因片段EGFP和表达载体pET-28a质粒的DNA,然后通过连接酶连接后形成重组子,并通过氯化钙法导入大肠杆菌感受态细胞中,让其在含有Amp和IPTG的LB琼脂平板上生长繁殖,最后通过观察大肠杆菌能否在含有Amp和IPTG的LB平板上长出绿色的菌落,来判断EGFP基因工程菌的构建效果 二、主要路线: 1、质粒DNA的提取 2、琼脂糖凝胶电泳检测质粒DNA 3、酶切连接重组质粒 4、重组质粒的扩增 5、菌落PCR法鉴定阳性克隆 6、目的荧光蛋白基因的表达 1、质粒DNA的提取 实验原理: 1)质粒是一种染色体外的遗传因子,大小在1kb~200kb之间,是具有双链闭合环状结构的DNA分子,主要发现于细菌、放线菌和真菌细胞中。质粒具有自主复制能力,,能使子代保持他们恒定的复制数,可表达它携带的遗传信息。它可以独立游离于细胞质内,也可以整合到细菌染色体中,它离开宿主细胞就不能复制,而它控制的许多生物学功能也是对宿主细胞

绿色荧光蛋白

绿色荧光蛋白(GFP)的转化表达及免疫印迹检测 王媛0811142 南开大学生命科学学院生物技术08级 一、摘要: 本实验利用酶切方法检测载体中所含GFP片段后,通过转化的方法把绿色荧光蛋白(GFP)外源基因转入大肠杆菌进行表达,通过免疫印记杂交方法(western blotting)分析GFP在大肠杆菌中的表达,在分离检测的全过程中(转化平板,细胞裂解,电泳,电转移),均可通过紫外灯清晰地检测到颜色亮丽的绿色荧光蛋白。 关键词:绿色荧光蛋白免疫印记杂交 二、引言: 绿色荧光蛋白是一种源于水母(Aequorea Victoria)等海洋无脊椎动物的蛋白,分子量为26.9KD。GFP的开放阅读框架长度约为740bp,编码238个氨基酸残基。GFP表达后折叠环化,在氧存在下,由65~67位的氨基酸残基环化,形成发色基团,无需添加任何酶和底物,在长紫外或蓝光激发下就能发荧光,荧光性质稳定,可保持10分钟。GFP能在不同的细胞内稳定表达,无种属、组织和位置特异性,对细胞无毒性且检测方法简单,将其作为报告基因已广泛应用于细胞生物学和分子生物学领域。 免疫印记又称蛋白质印记,是在凝胶电泳技术和固相免疫测定技术基础上发展起来的一种免疫检测技术。其原理是将膜与胶放在中间,上下加滤纸数层,做成“Sandwich”样的转移单位,并且保证带负电的蛋白质向阳极转移,即膜侧连接阳极或面向阳极,从而将电泳分离的蛋白从凝胶转移至固相载体上。 三、实验材料、仪器及方法: 3.1 实验材料 3.1.1 菌种 E.coli DH5α(pETH)菌株 E.coli DH5α(pETH-GFP)菌株 E.coli BL21菌株 E.coli BL21 (pETH)菌株E.coli BL21 (pETH-GFP))菌株 3.1.2 试剂与材料 LB培养基(自己配置灭菌)Amp(100mg/ml)IPTG(10mg/ml) CaCl2(1M) 50*TAE Acry/Bis 贮存液分离胶缓冲液浓缩胶缓冲液泳动缓冲液(5*)上扬缓冲液(5*)转移缓冲液PBS 1.5% A.P.S 质粒小量提取试剂盒Eco RI限制性内切酶DNA Maker Protein Maker pH试纸 3.1.3 仪器 紫外检测仪、超声波细胞粉碎机、垂直板式电泳系统、半干式蛋白质印迹电转移系统等。3.2 实验方法 1、配置LB培养基,包括液体、固体培养基后灭菌;分别接种pETH-GFP/DH 5α(LA 4ml)一支,pETH/DH 5α(LA 4ml)一支,BL21(LB 4ml)四支 2、按照protocal,利用tiangen质粒提取试剂盒分别提取pETH-GFP/DH 5α、pETH/DH 5α质粒后,按照酶切体系混匀后,至于37℃温箱酶切2h。 3、制备0.8%琼脂糖凝胶,20ml每块,加入适量EB,按照点样顺序点样后,60V恒压电泳,约0.5~1h.后,凝胶自显影拍照(胶图见后面实验结果) 4、取40μlBL21菌液接种于4mlLB,37℃,200rpm,约2.5h,此时OD600=0.3~0.5,利用氯化钙法制备感受态细胞,制备完成至于冰上备用。 5、铺制平板,1块LB,4块LA,冷却凝固后于37℃倒置烘干备用。其中两块LA平板上面涂布IPTG(100μl+100μl水),正置备用。 6、按照阴性对照、空白对照、GFP基因转化表达、GFP基因的转化四组分别进行转化,涂板,37℃倒置过夜培养,紫外灯下观察,呈绿色荧光的单菌落即为转化子。记录各板菌落数

荧光定量检测细胞绿色荧光蛋白技术的建立与应用

第47卷 增刊2 2008年12月 厦门大学学报(自然科学版) Journal of Xiamen University (Natural Science ) Vol .47 Sup.2Dec .2008 收稿日期:2008209225 基金项目:国家基础科学人才培养基金项目(J0630649),国家自然 科学基金(30670408,30572077),福建省自然科学基金 (2008J0108)资助 3通讯作者:liurz@x mu .edu .cn 荧光定量检测细胞绿色荧光蛋白技术的建立与应用 张 垲,余冰菲,陈瑞川,刘润忠 3 (厦门大学生命科学学院,福建厦门361005) 摘要:绿色荧光蛋白是在生化与分子生物学研究领域中普遍使用的一种基因表达报告系统显色物.对于细胞内绿色荧 光蛋白表达水平的定量检测,目前尚缺乏一套准确﹑简便﹑易行的技术.本文以增强型绿色荧光蛋白(EGFP )为报告基因,用分子量为25ku 的线性聚乙烯亚胺介导进入He La 细胞并表达.利用多功能酶标仪测定细胞裂解液的荧光强度,结果显示:这种新方法测定的荧光强度能很好反映细胞中EGFP 的蛋白表达水平,并在短时间内完成对EGFP 表达水平的定量检测.该方法简单有效,且不依赖于大型仪器设备,具有较高的准确性与灵敏度,在实际应用中简便可靠,具有推广应用的意义. 关键词:绿色荧光蛋白;定量检测;He La 细胞;表达水平 中图分类号:Q 786 文献标识码:A 文章编号:043820479(2008)S220264204 细胞转染被广泛地应用于生物科学研究的各个领域,是各种研究方法中不可或缺的技术手段之一.近年来,越来越多的实验室加入到开发新型转染试剂的行列中,各种各样的转染方法也应运而生,非病毒载体聚乙烯亚胺(polyethyleni m ine,PE I )就是其中之一.作为一种阳离子多聚物,PE I 具有毒性低,转染效率高等优点,其中25ku 线性PE I 被认为是最有望用于基因治疗的载体之一[122] . 随着转染技术的不断发展,如何准确、快速的检测外源蛋白表达水平逐渐成为科学家们所关注的问题.从水母体内提取的绿色荧光蛋白(GFP )是一种重要的显色物质,其突出的优点是在紫外线或蓝光的激发下可发出绿光,而不需要任何底物或辅助因子[3] .而且GFP 具有表达稳定、无种间特异性等优点,因此被广泛地应用于基因表达的检测.增强型绿色荧光蛋白(EG 2 FP )是一种最佳化的GFP 突变型[4] ,在体外转染后,可通过荧光显微镜直接观察或用流式细胞仪定量检测[5] .但是,这两种检测方法都有其局限性,荧光显微镜检测存在主观性强、无法定量检测等缺陷,而流式细胞仪检测则存在对仪器设备要求高,操作程序繁琐等缺点. 本研究的目的在于建立一套快速﹑准确﹑简便的EGFP 定量检测技术. 1 材料与方法 1.1 材 料 线性PE I (25ku,Polysicences 公司)用pH 7.9的 Hepes 缓冲液(25mmol/L,含150mmol/L NaCl )配制成2.5mg/mL 的贮存液,无菌过滤后于220℃保存.pEGFP 2N1质粒为Cl ontech 公司产品,DME M 和新生小牛血清等为Gibco 产品,抗GFP 和β2Actin 抗体购自Santa Cruz 公司,苯甲基磺酰氟(P MSF )、乙基苯基聚乙二醇(NP 240)以及其它试剂均为Merk 或Am resco 分析纯级试剂.荧光测定采用Spectra maxM2型多功能酶标仪(美国),荧光观察采用DM I RB 型荧光显微镜(Leica ),He La 细胞为本实验室保存.PE I/DNA 反应缓冲液A 配方为150mmol/L NaCl;PE I/DNA 反应缓冲液B 配方为25mmol/L Hepes,150mmol/L NaCl,pH 7.1;PE I/DNA 反应缓冲液C 配方为25mmol/L Hepes,150mmol/L NaCl,10mmol/L KCl,pH 7.1;PE I/DNA 反应缓冲液D 配方为DME M.1.2 细胞培养与转染 He La 细胞用含10%胎牛血清的DME M 培养基,在37℃及5%二氧化碳条件下培养.转染前,将细胞(6 ×105细胞/孔)接种于六孔板中,培养24h 后用于转 染,细胞密度为70%~90%.转染前换加2mL 新鲜培养基.2μg DNA 与一定量PE I (按PE I :DNA =5μg:1μg 的比例添加,特殊说明除外)各用50μL PE I/DNA 反应缓冲液(如没有特殊说明,配方均为25mmol/L Hepes,150mmol/L NaCl,pH 7.1)稀释,将稀释后的PE I 逐滴加入DNA 溶液中,立即振荡混匀.室温静置

荧光素FITC标记抗体的方法

荧光素FITC标记抗体的方法 当FITC在碱性溶液中与抗体蛋白反应时,主要是蛋白质上赖氨酸的r氨基与荧光素的硫碳胺键(thiocarbmide)结合,形成FITC-蛋白质结合物,即荧光抗体或荧光结合物。一个IgG分子中有86个赖氨酸残基,一般最多能结合15~20个,一个IgG分子可结合2~8个分子的FITC,其反应式如下 FITC-N=C=S + N-H2-蛋白质→ FITC-NS-C-N-H2-蛋白质 常用Marsshall(1958)法标记荧光抗体,也可以根据条件采用Chadwick等标记法或Clark等(1963)的透析标记法。 1.Marsshall法 (1)材料抗体球蛋白溶液、0.5mol/L(pH9.0)碳酸盐缓冲液、无菌生理盐水、异硫氰酸荧光 素、1%硫柳汞水溶液、50ml小烧杯、4℃冰箱、电磁搅拌器、透析袋、玻棒、pH7.2或 3.0的0.01mol/LPBS等。 (2)方法及步骤①抗体的准备取适量已知浓度的球蛋白溶液于烧杯中,再加人生理盐水及碳酸盐缓冲液,使最后免疫球蛋白浓度为

20mg/ml,碳酸盐缓冲液容量为总量的1/10,混匀,将烧瓴置电磁搅拌器上(速度适当以不起泡沫为宜)5~10min。 ②荧光素的准备根据欲标记的蛋白质总量,按每毫克免疫球蛋白加0.01mg荧光色素,用分析天平准确称取所需的异硫氰酸荧光素粉末。也可用下述公式计算出免疫球蛋白、荧光素的量,还可以算出需加缓冲液的量。 a.蛋白溶液:含量Amg/m1;容积Bml。 b.总蛋白量(AXB)=Crag。 c.C/20~C/10=Dmg(如蛋白含量低于20mg/ml,用C/10;如高于20mg/ml,用C/20)。 d.荧光素FITC的量:(1/50~2/100)XC=Emg。 e.巳0.5mol/L(pH9.5)碳酸盐缓冲液D/10=Fml。 f.PBS量D-(B+F)=Gml。 注:A为蛋白含量,mg/ml;B为蛋白质溶液的容积;C为蛋白总量,mg;D为常数,mg;正为荧光素的量,mg;F为碳酸盐缓冲液的容积,ml;G为PBS的容积,ml。 ③结合(或标记) 边搅拌边将称取的荧光色素渐渐加入球蛋白溶液中,避免将荧光素粘于烧瓶壁(大约在5—10min内加完),加完后,

蛋白标记技术详解

蛋白标记技术详解 蛋白质标记的主要目的是监测生物过程、辅助检测(例如化合物的可靠定量、蛋白质修饰的特异性检测)或者纯化蛋白及其结合对象。蛋白质的标记能够提高检测灵敏度以及简化检测工作流程。 目前有多种蛋白质标记技术来帮助我们研究感兴趣的蛋白质的丰度、位置、相互作用、翻译后修饰、功能,乃至监测活细胞中的蛋白质运输等问题。目前有多种类型的标记物和标记方式可供选择,但是针对特定的应用应当选择适合的标记策略。 1.代谢标记策略 代谢标记策略是一种体内标记方法,在这种方法中,细胞被“喂养”了化学标记的营养物,然后这些标记物被掺入新合成的蛋白质、核酸或代谢物中。然后,我们可以收集细胞并分离这些分子以获得细胞生物过程的全局视图。 蛋白同位素标记 原理 蛋白同位素标记是一种经典的蛋白示踪和蛋白组学定量技术,用天然同位素(轻型)或稳定同位素(重型)标记的必需氨基酸取代细胞培养基中相应氨基酸,这样细胞新合成的蛋白质可以在细胞生长期间通过掺入含有不同同位素的氨基酸进行标记。 应用举例 蛋白质组学研究方向流行的代谢标记方法是SILAC(Stable Isotope Labeling with Amino acids in Cell culture),即细胞培养中氨基酸的稳定同位素标记。结合质谱技术,SILAC 通过使用重型氨基酸(例如,15N-或13C-赖氨酸)标记其中一组培养物或细胞系,而向另一组添加正常的轻型氨基酸,从而量化两种培养物或细胞系之间蛋白质丰度的差异。然后将在这两种条件下生长的细胞的裂解蛋白按细胞数或蛋白量等比例混合,经分离、纯化后进行质谱鉴定,根据一级质谱图中两个同位素型肽段的

荧光标记PCR

主要需要考察的方面: ?加热方式 ?升降温速度 ?准确性 ?均一性 ?激发光源 ?检测元件 ?检测通路 ?监测系统 详情请参考全文…… 回顾分子生物学的发展历程,PCR技术的发明和普及无疑是最重要的篇章之一。而PCR技术在近20年的不断发展创新中,最受瞩目当属荧光实时定量PCR技术(real-time quantitative PCR, or qPCR)。定量PCR技术真正实现了PCR从定性到定量的飞跃,通过对PCR过程的实时监控,专一、灵敏快速、可重复地精确定量起始模版浓度,已经在科研和临床诊断领域得到了越来越广泛的应用。本文从荧光定量PCR的原理入手,详细介绍荧光定量PCR仪的类型和技术,为定量PCR仪的选择提供详细参考。 一、背景 本来,PCR是为了将样本中微量的DNA模版放大以便研究模版特性,随着研究的深入,要了解样本中基因的表达模式与疾病的关系,就需要了解标本中的DNA 原始拷贝数。理论上PCR过程中反应产物是以指数规模增长的,但实际的PCR 扩增曲线并不是标准的指数曲线,而是S形曲线——因为随着PCR循环数的增加,扩增规模迅速增大,Taq酶、dNTP、引物,甚至DNA模板等各种PCR要素逐渐不敷需求,PCR的效率降低,产物生成的速度逐渐减缓,最终进入平台期。由于各种环境因素的复杂相互作用,不同的PCR反应体系进入平台期的时间和平台期的高低都有很大变化,即使是重复实验,各种条件基本一致,最后得到的DNA拷贝数也往往不同。因此经过PCR扩增的DNA产物量不能反映起始模板量的真实情况。通过传统凝胶电泳EB染色或者同位素标记只能定量PCR的终产物量,而不能定量起始DNA模版的拷贝数。 荧光实时定量PCR技术是指在PCR反应体系中加入荧光基团,利用荧光信号累积实时监测整个PCR进程,最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。借助于荧光信号来检测PCR产物,一方面提高了灵敏度,另一方面可以在每次PCR 循环收集数据,建立实时扩增曲线,准确地确定域值循环数(CT值),计算起始DNA拷贝数,做到了真正意义上的DNA定量。根据最终得到的数据不同,定量PCR 可以分为相对定量和绝对定量两种。相对定量常见于比较两个样本中基因表达水平的高低变化,得到的结果是百分比;绝对定量则需要使用标准曲线确定样本中基因的拷贝数或浓度。

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