甘蓝型黄籽油菜自交系转化体系的建立
作物学报 ACTA AGRONOMICA SINICA 2012, 38(12): 2185?2191 https://www.sodocs.net/doc/c413145838.html,/zwxb/
ISSN 0496-3490; CODEN TSHPA9
E-mail: xbzw@https://www.sodocs.net/doc/c413145838.html,
本研究由高等学校学科创新工程计划“111”项目(B12006)和国家自然科学基金项目(31071450)资助。
*
通讯作者(Corresponding author): 李加纳, E-mail: ljn1950@https://www.sodocs.net/doc/c413145838.html,
Received(收稿日期): 2011-12-01; Accepted(接受日期): 2012-07-05; Published online(网络出版日期): 2012-10-08. URL: https://www.sodocs.net/doc/c413145838.html,/kcms/detail/11.1809.S.20121008.1258.006.html
DOI: 10.3724/SP.J.1006.2012.02185
甘蓝型黄籽油菜自交系转化体系的建立
林 呐 刘列钊 殷家明 王 瑞 柴友荣 李加纳*
西南大学农学与生物科技学院 / 重庆市油菜工程技术研究中心 / 南方山地农业教育部工程研究中心, 重庆 400716
摘 要: 利用黄籽甘蓝型油菜自交系建立和优化了遗传转化系统。首先构建了由质粒pCNR 与Δ6-脂肪酸脱氢酶基因插入到植物的高效表达载体pCAMBIA2301G 。利用在Murashige 和Skoog 培养基(含有200 μmol L –1乙酰丁香酮)培养5~7 d 的下胚轴外植体与农杆菌株LBA4404共培养63~69 h (pCNR), 再于芽诱导培养基上培养3个月诱导芽再生。在最佳条件下, 平均转化效率约为1.3%。转化植株的GUS 分析和PCR 分析结果表明, 外源基因成功导入甘蓝型油菜。Southern 杂交表明, 这些转化子含有目标基因1~2个拷贝。用气相色谱分析转基因植物种子的脂肪酸, γ-亚麻酸含量达8.2%。
关键词: 甘蓝型油菜; Δ6-脂肪酸脱饱和酶; 转化
Establishment of Transformation System Using Inbred Line of Yellow-Seeded Brassica napus
LIN Na, LIU Lie-Zhao, YIN Jia-Ming, WANG Rui, CHAI You-Rong, and LI Jia-Na *
College of Agronomy and Biotechnology, Southwest University / Chongqing Rapeseed Engineering & Technology Research Center / Engineering Research Center of South Upland Agriculture, Ministry of Education, Chongqing 400716, China
Abstract: In this study, we established a transformation system using an inbred line of yellow-seeded Brassica napus . Hypocotyl explants precultured for 5–7 d on Murashige and Skoog medium containing 200 μmol L –1 acetosyringone were cocultured with Agrobacterium tumefaciens strain LBA4404 (pCNR) for 63–69 hours. The plasmid pCNR was constructed by inserting Δ6-fatty acid desaturase gene from Rhizopus stolonifer into plant high-efficient expression vector pCAMBIA2301G. Kanamycin -tolerant shoots were regenerated on shoot induction medium for three months after Agrobacterium inoculation. The average transforma-tion efficiency was about 1.3% under optimal conditions. Results from GUS assay and PCR analysis of transformed plants indi-cated that the introduced gene was integrated into B. napus genomes. The result of Southern blot revealed that those transformants carried one or two copies of the goal gene. The fatty acids of the transgenic plant seeds were analyzed by GC, and the γ-linolenic content was 8.2%.
Keywords: Brassica napus ; Δ6-fatty acid desaturase; Transformation
甘蓝型油菜是世界上重要的油料作物, 应用遗传工程技术能有效地将新基因导入油菜[1]。尽管已报道了很多转基因油菜, 但不同品种转化效率都表现出不同且普遍偏低, 这在很大程度上限制了转基因技术的使用[2-3]。油菜中农杆菌介导转化受供体植株年龄、外植体类型[4]、培养条件等的影响。即使目前的遗传转化方法对大多数主要作物类型可行, 但也仅仅应用于每一类少数再生频率很高的品种。
目前应用于转化实验的芸薹属栽培种的数目很
有限[4]。
过去, 甘蓝型油菜转化方法主要应用在加拿大低芥酸油菜特性的春油菜品种(Westar)[5]中, 但该品种生长期太短, 在田间已经被高产量的栽培种替代。黄籽油菜栽培种具有较低皮壳纤维素含量、较高含油量及较高田间产量, 在中国将会替代许多黑籽栽培种。因此, 未来新的栽培种需要从细胞质导入新基因的材料中寻找。
本研究的主要目标是获得高效的再生体系和利用黄籽品系GH01优化参数建立一个有效的转化体
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系。自交系材料GH01通过含双元载体pCNR 的农杆菌品种LBA4404进行转化, 含Δ6-脂肪酸脱氢酶基因(GenBank 登录号为AY795076)[6]的质粒pCNR 由我们实验室构建, Δ6-脂肪酸脱氢酶基因来源于匍枝根霉, 能产生一种限制性内切酶(Δ6-脂肪酸脱氢酶), 它能使亚油酸转化成α-亚麻酸和γ-亚麻酸, γ-亚麻酸对人体非常有益。我们的最终目标是使本身不带Δ6-脂肪酸脱氢酶基因的甘蓝型黄籽油菜转基因后带有此基因。
1 材料与方法
1.1 菌种和质粒
实验中的根癌农杆菌菌种是含pCNR [7]的LBA4404 [8]。pCNR 是个含卡拉霉素基因和GUS 基因的双元载体[9](图1)。
1.2 植株材料
2个来源于甘蓝型黄籽的自交系材料GH01和SH01, 作为外植体进行愈伤组织培养, 检测下胚轴的再生频率, 3次重复。下胚轴为5~7日龄, 作为外植体被切成5 mm 长的切段(每个品系100切段)培养在分化培养基中。2周后, 考察芽和愈伤组织形成的频率。
1.3 农杆菌的培养和与外植体的共培养
在含50 mg L –1卡拉霉素的50 mL 液体培养基YEP [10]的无菌培养瓶中培养农杆菌的单克隆菌株,
28, ℃于200~210转 min ?1的摇床上, 暗培养振荡过夜。转化培养基可见表1。
弱光下, 下胚轴切段被预培养在Y1培养基(表1)上5~7 d, 过夜培养的农杆菌菌液浓度(OD 600)达到0.4~1.5时, 将以1∶1比例稀释的液体MS 培养基转入装有100~200 μmol L –1乙酰丁香酮的小培养皿, 将植物材料浸渍在菌液中5~10 min 并不断振荡。外植体收集后用干燥的无菌滤纸去掉多余的菌液, 再把清洗后的外植体接入含Y1培养基的培养皿中。用封口膜密封培养皿, 并在22~28℃黑暗条件下共培养2~3 d 。
1.4 压力筛选
用300 mg L –1羧苄青霉素的MS 培养基清洗感染的外植体, 防止附着的农杆菌继续生长, 并将其转入F1-Cab-Km 培养基中。经过15~20 d 培养后, 下胚轴长出的愈伤组织被筛选后移入含10~100 mg L –1的卡拉霉素和100~300 mg L –1羧苄青霉素的F2-Km- Cab 培养基中再生芽, 经过40~60 d 培养后, 将再生芽转入生根培养基中长成完整植株。
大约培养12周后, 绿色愈伤组织形成。绿色愈伤组织形成率(%)=带绿色愈伤的外植体数/外植体数× 100, 芽形成效率(%)=芽的数目/外植体数目×100。
1.5 β-葡萄糖苷酸酶基因(GUS )活动的检测
按Jefferson [11]的方法进行组织化学GUS 染色。
图1 转化载体pCNR 的T-DNA 区域部分线性图
Fig. 1 Schematic diagram of a part of the T-DNA region of transformation vector pCNR
RB: 右端; LB: 左端; P-napin: 编码种子贮存蛋白的启动子; Npt II: 新霉素磷酸转移酶基因; T-nos: 根癌农杆菌Ti 质粒胭脂碱合酶基因的终止子; P-35S: 花椰菜花叶病毒35S 启动子; GUS : β-葡萄糖苷酸酶基因。
RB: right border; LB: left border; P-napin: promoter of encoding seed storage protein; Npt II: gene for neomycin phosphotransferase; T-nos:
terminator of nopaline synthase; P-35S: promoter of Cauliflower mosaic virus ; GUS : gene for β-glucuronidase.
表1 组织培养和转化的培养基
Table 1 Medium used for tissue culture and transformation
培养基 Medium
成分
Composition
培养时间 Cultured time (d)
预培养基 Pre-cultured medium (Y1) MS medium, 6-BA 1.0 mg L –1, 2,4-D 2 mg L –1 4–7
共培养基 Co-cultured medium Y1 medium, ACS 200 μmol L –1 2–3 筛选培养基 Selected medium (F1) MS medium, 6-BA 4.0 mg L –1, 2,4-D 0.5 mg L –1, Km 100–200 mg L –1,
Cab 300 mg L –1, AgNO 3 6 mg L –1
15–30
分化培养基 Differentiation medium (F2) MS medium, 6-BA 2.0 mg L –1, NAA 0.1mg L –1, Km 60 mg L –1, Cab 100
mg L –1, AgNO 3 6 mg L –1
40–60
生根培养基 Rooting medium
MS medium, NAA 0.5 mg L –1, Km 60 mg L –1 15–20
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将下胚轴和叶片组织浸入X-gluc水溶液中(含0.5 mg L–1 5-溴-4-氯-3-吲哚基-β-D-葡糖苷酸环己胺盐, 0.5%聚乙二醇辛基苯基醚, 20%甲醇和50 mmol L–1磷酸钠, pH 7.0)。反应的混合液在37℃培养过夜。为去掉叶绿素, 把外植体浸入酒精中脱色。
有些重要的因素会影响转基因植物再生, 例如外植体预培养时间、农杆菌浓度、乙酰丁香酮浓度、共培养时间等。为测试农杆菌转化的效率, 用组织化学GUS染色法检测不同预培养时间(设定5个时间)、共培养时间(设定6个时间)、乙酰丁香酮浓度(设定4种浓度)以及农杆菌浓度(设定6种浓度)的影响, 通过数据分析, 确定最佳条件。此方法也用于卡拉霉素抗性植株的愈伤组织、根、花和角果的检测。
1.6PCR和Southern杂交分析
按CTAB法[12]从转基因植株和非转基因对照植株的叶片组织中把基因组DNA提取出来。设计编码基因RnD6D区域的2条特异引物, 用于基因组DNA 扩增这个长1.4 kb的基因片段。RnD6D基因扩增的正向引物序列5′-ATCTAGAATGAGTACATTAGAT CGTCCTAT-3′有30个碱基的寡核苷酸, 反向引物序列5′-AGAGCTCGAAAGATTTTATTTTATGCTTTCT AAAAGG-3′有37个碱基的寡核苷酸。PCR的总体积是25 μL, 含10 ng的模板DNA、2.5 μL 10×PCR 缓冲液、1.5 μL 25 mmol L–1 MgCl2、0.5 μL 10 mmol L–1 dNTPs混合液、5 μmol L–1正反引物各1 μL、0.25 μL Taq酶以及一些无菌水。PCR反应30个循环, 94℃预变性2 min, 循环包括94 1
℃ min, 54 1
℃ min, 72 2
℃ min。以0.8%琼脂糖胶电泳扩增DNA片段, 紫外透射仪显像, 数码相机拍照。
用Hin d III酶降解约55 μg基因组DNA, 用含TAE缓冲液的0.8% (W/V)琼脂糖胶电泳, Hin d III在某一点切下了pCNR的T-DNA区域, 将DNA片段转移到尼龙膜上, 以RnD6D基因编码区域为探针, 通过构建地高辛引物和地高辛荧光检测试剂进行杂交和检测(Roche Diagnostics, 瑞士), 按地高辛检测试剂盒(Roche Diagnostics)说明书进行冲洗和检测。1.7GC脂肪酸分析
按Rücker和R?bbelen [13]的方法, 将每个转化株自交种子(50 mg)放入气相色谱仪中分析脂肪酸成分, 以含γ-亚麻酸的月见草(Oenothera erythrosepala Borb.)种子作为对照。使用日本岛津公司带有DEGS 0.125毫米×30柱和FID检测器的GC-2010仪器进行色谱分析。运行参数为: 分流比100∶1, 柱温度180℃, 柱速度50 mL min–1, 气化室温度250℃。
将1~2颗样品种子放入5 mL离心管, 加入1∶1的石油醚: 乙醚溶液3 mL后研磨、破碎, 磨0.5 min。吸出混合溶液后放入5 mL另一离心管(耐有机溶剂的材料)中, 在超声波清洗器中室温水浴10~20 min。吸2 mL澄清透明液体于另一5 m离心管, 并添加1 mL 0.4 mol L?1甲醇溶液混合, 然后在室温静置30 min。加2 mL蒸馏水后振荡, 然后10000×g离心1~2 min备用。从样品中吸出澄清透明液体放入气相色谱仪的样品瓶, 并把瓶子放在自动注入器中进行测试。
脂肪酸含量用脂肪酸总和的百分比表示。检测到的脂肪酸有棕榈酸(C16:0)、油酸(C18:1)、亚油酸(C18:2)、亚麻酸(C18:3)、二十碳烯酸(C20:1)和芥酸(C22:1)。
2 结果与分析
2.1甘蓝型黄籽油菜的再生频率
表2表明, 自交系SH01有较低的芽形成频率, 而黄籽自交品系GH01有较高的芽形成频率, 因此, GH01被用于进一步实验。
2.2组织化学GUS染色检测
2.2.1 预培养时间预培养时间对转化效率的影响通过农杆菌侵染外植体GH01下胚轴(图2-a)来检测。外植体预培养5~7 d会产生大量具有GUS阳性表现的愈伤组织(图2-b)。按照卡平方测验(P<0.01)[14], 所有预培养时间都差异显著(表3)。最低GUS阳性表现在没有预培养的外植体上。结果表明, 预培养时间显著影响农杆菌侵染油菜的效率(表4)。
表2 甘蓝型黄籽油菜的芽再生频率
Table 2 Shoot regeneration frequency in yellow-seeded B. napus(%)
芽再生频率Shoot regeneration frequency
材料
Material 重复1 Repeat No. 1 重复2 Repeat No. 2 重复3 Repeat No. 3
平均Average
SH01 18.24 16.36 20.38 18.33 GH01 38.69 51.28 61.35 50.44
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图2 外植体下胚轴(a)和愈伤组织(b) GUS基因的表达Fig. 2 Expression of GUS gene in hypocotyls explants (a) and
callus (b)
所有共培养时间按卡平方测验也表现极显著差异(P<0.01)。
2.2.2 共培养基上的乙酰丁香酮浓度乙酰丁香酮能提高农杆菌转入寄主植株的能力并被放入各种培养基中用于细菌和植物组织共培养[15-17]。共培养基中检测了乙酰丁香酮的4种浓度(0~300 μmol L–1), 结果含有200 μmol L–1乙酰丁香酮的培养基有最高的侵染能力(表 5), 并且按卡平方测验(P<0.01), 这个浓度和其他较低浓度比较差异极显著。尽管侵染GH01的这个浓度和其他较高浓度间没有显著差异, 但下胚轴切段在较高浓度乙酰丁香酮存在下有褐变的趋势, 影响芽的再生。
2.2.3 农杆菌浓度农杆菌浓度是提高侵染力很重要的因素。通常情况下, 对数期生长的农杆菌具有最高的侵染力。4种MS培养基稀释后的农杆菌浓度(OD600值0.2~1.2)中, OD600值1.0~1.2有利于外植体的侵染(表 6), 并且按卡平方测验(P<0.01), 农杆菌浓度对下胚轴转化效率影响差异极显著。这也表明农杆菌浓度直接影响浸染效率。
2.3 转化
在含100~200 mg L–1卡拉霉素的筛选培养基上培养外植体2个月后, 大量卡拉霉素抗性的愈伤组织再生出来。转入含60 mg L–1卡拉霉素的芽分化培养基4个月后获得卡拉霉素抗性植株。经3次重复实验, 最终有775个愈伤组织、26个绿色愈伤组织
表3预培养时间对农杆菌侵染后GH01下胚轴转化效率的影响
Table 3 Effect of preculture periods on transformation efficiency in hypocotyls of GH01 with Agrobacterium tumefaciens strain
预培养时间Preculture time
外植体数
No. of explants
GUS阳性外植体数
Number of GUS+ explants
GUS阳性外植体效率
Frequency of GUS+ explants (%)
χ2χ20.01,4
0 d 87 22 25.29
3 d 99 30 30.30
5d ? 108 78 72.22
?
7d ? 94 84 89.36
?
8 d 99 43 43.43
116.774 13.28
LBA4404是用作浸染培养液。外植体在25℃, 黑暗条件下被共培养3 d。?表示较好的结果和较好的实验条件(下同)。
LBA4404 was used as inoculum. Explants were cocultured for 3 days at 25°C in the dark. ? denotes better results and better experimental con-dition (the same below).
表4 共培养时间对GH01下胚轴转化效率的影响
Table 4 Effect of coculture periods on transformation efficiency in hypocotyls of GH01
共培养时间Co-culture time
外植体数
No. of explants
GUS阳性外植体数
No. of GUS+ explants
GUS阳性外植体效率
Frequency of GUS+ explants (%)
χ2χ20.01,5
12 h 80 0 0
24 h 90 0 0
48 h 99 44 44.44
63 h ? 92 76 82.61
?
69 h ? 90 73 81.11
?
72 h 90 22 24.44
256.742 15.09
表5 乙酰丁香酮浓度对GH01下胚轴转化效率的影响
Table 5 Effect of acetosyringone concentration on transformation efficiency in hypocotyls of GH01
乙酰丁香酮浓度Concentrations of acetosyringone
外植体数
No. of explants
GUS阳性外植体数
No. of GUS+ explants
GUS阳性外植体效率
Frequency of GUS+ explants (%)
χ2χ20.01,3
0 μmol L–1 98 20 20.40
100 μmol L–1 88 34 38.64
200 μmol L–1 ? 94 72 76.60
?
300 μmol L–1 87 40 45.98
63.26911.34
第12期
林 呐等: 甘蓝型黄籽油菜自交系转化体系的建立
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表6 农杆菌浓度对GH01下胚轴转化效率的影响
Table 6 Effect of Agrobacterium concentration on transformation efficiency in hypocotyls of GH01
农杆菌浓度
Concentration of Agrobacterium (OD 600) 外植体数 No. of explants GUS 阳性外植体数 No. of GUS + explants GUS 阳性外植体效率
Frequency of GUS + explants (%)
χ2 χ20.01,4
0.2 87 10 11.49 0.4 99 31 31.31 0.6 84 50 59.52
0.8 76 48 63.16
1.0 ? 110
86 78.18 ?
1.2 ? 98
65 66.33 ? 118.17115.09
和13株芽从971个外植体中再生出来。经PCR 扩增和组织化学GUS 染色证实这13株芽都是RnD6D 基因的转化株。
组织培养和农杆菌培养的最佳条件是: 下胚轴被预培养5~7 d, 农杆菌菌株LBA4404培养后加入200 μmol L –1乙酰丁香酮与之共培养63~69 h 。在这些条件下, 转化的平均效率是1.3% (即每300个外植体有4个转化株)。在GH01转化株和非转化株的根和叶的GUS 表达有显著差异(图3)。同时, 转化植株的PCR 揭示每一株都插入了目的基因(图4-a), 且RnD6D 基因长度为1 419 bp 。
图3 在不同时期GH01的T 0代转化株和野生型GH01的GUS
检测
Fig. 3 T 0 generation transformants of GH01 and wild type
GH01 GUS stain in different periods
a: 转化株的幼根; b:转化株的角果; c: 野生型GH01的角果; d: 转化株的幼叶; e:转化株的花; f: 野生型GH01的叶。
a: transformant young root; b: transformant young pod; c: wild type GH01 young pod; d: transformant young leaf; e: transformant
flower; f: wild type GH01 leaf.
转化苗移植到大田生长后, 我们观察了整个植株的生长状况。花和角果的GUS 表达揭示了转化植株与对照植株的不同(图3)。叶片DNA 的Sourthern 杂交反应这些转化株都带有1~2个目的基因拷贝 (图4-b)。对转基因植株、对照植株和月见草(Oenothera erythrosepala Borb., 包含γ-亚麻酸)的气相色谱分析(图5)表明, 与γ-亚麻酸浓度达10.85%的月见草(滞留时间为5.838 min)(图5-c)比较, 在转基因油菜(图
图4 PCR 和Southern 杂交对T 0代转基因甘蓝型黄籽油菜中
RnD6D 基因的检测
Fig. 4 Detection of RnD6D gene in T 0 generation transgenic
yellow seeded B. napus with PCR and Southern blot
a : 1: DNA 标记; 2~3: 质粒的PCR 产物(阳性对照); 5, 7: 非转化
植株的PCR 产物(阴性对照); 4, 6: 2个Km 抗性植株的PCR 产物。 b : 2, 3, 9: 对照(非转化株); 1, 4~8: 独立实验获得的转化株。 a : 1: DNA marker; 2–3: PCR products of plasmid (positive control); 5, 7: PCR products of untransformed control plant (negative con-trol); 4, 6: PCR products of two Km-resistant plants. b : 2, 3, 9: control (non-transformant); 1, 4–8: transformants obtained by in-dependent experiments.
5-a)中, γ-亚麻酸(滞留时间 5.922 min)的浓度达到8.20%。
从图5可看到油菜籽中含有几种脂肪酸, 即棕榈酸(C16:0)(滞留时间约3.7 min)、油酸(C18:1)(滞留时间约 5.0 min)、亚油酸(C18:2)(滞留时间约 5.2 min)、亚麻酸(C18:3)(滞留时间约5.8 min)、二十碳烯酸(C20:1)(滞留时间约7.3 min)和芥酸(C22:1)(滞留时间约10.0 min)。同对照植株相比较, 转化株的油酸含量减少及亚油酸含量增加。结果表明, Δ6-脂肪酸脱氢酶基因(RnD6D )不仅使亚油酸脱氢成为亚麻酸而且使油酸脱氢成为亚油酸。脂肪酸含量发生了很多变化。
3 讨论
不同种类甚至同种类不同基因型的材料有利于转化的条件都是不同的。在本实验中, GH01作为导入基因的受体, 不仅因它有黄籽油菜的优势, 而且组织培养时它有很高的再生频率。
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作 物 学 报 第38卷
图5 GC 脂肪酸曲线表明γ-亚麻酸在转基因植株中表达
Fig. 5 GC fatty acids profile showing the γ-linolenic acid expressed in the transgenic plant
a: 转基因植株(T 1); b: 对照植株; c: 月见草。灰色垂直箭头标示-亚麻酸滞留时间。
a: transgenic plant (T 1); b: control plant; c: evening primrose. The gray vertical arrow indicated the γ-linolenic acid retention time.
培养条件很大程度上影响了转化效率, 例如预培养时间、共培养时间、乙酰丁香酮浓度、农杆菌浓度等等。所有共培养时间按卡平方测验(P <0.01)均表现显著差异。同样的结果在西兰花[18]和白菜型油菜[19]上也有报道。同时, Godwin 等[15]和Takasaki 等
[19]
在白菜型油菜上使用200 μmol L –1
乙酰丁香酮
获得了较高效率的农杆菌侵染力。Henzi 等[20]在发根农杆菌侵染西兰花上用200 μmol L –1乙酰丁香酮也获得同样的结果。本实验与别的实验不同处是: 以OD 600为1.0~1.2的根癌农杆菌侵染预培养5~7 d 的外植体并且在含200 μmol L –1乙酰丁香酮的培养基中共培养2~3 d 会产生最高的转化效率, 表明经过较长预培养的外植体能承受较高选择压, 而其他的因素则直接影响侵染效率。平均的转化效率仍很低, 只有1.3%。Metz 等[18]报道在白菜型油菜和西兰花上直接用芽转化可获得较高的(卡拉霉素抗性株)转化效率。但我们用该法未能获得黄籽品种的转化株。
另外, 通过我们实验室构建的载体能成功地把目的基因转入到甘蓝型油菜。GUS 基因的表达能有 效地检测转基因植株, 因它连接有35S 启动子, 又
能在转基因植株的任何部位表达。PCR 和Southern 杂交证实GUS 表达的植株含有RnD6D 基因。
Southern 杂交中观察到植株中含1~2个目的基因拷贝。大多数的转基因品系含单拷贝或单个简单插入点, 多拷贝插入经常会导致不寻常的表达或分离模式[21]。不少于一个拷贝数目的基因导入植株的许多研究证实有基因沉默的现象[22]。与单拷贝基因品系比较, 在基因表达上含不只一个拷贝的转基因品系可能更不稳定。我们的研究也发现含2个目的基因拷贝的转基因植株GUS 表达不稳定。这就是育种上利用多拷贝转基因植株仍有很多问题的原因。在转基因植株脂肪酸表达图谱中γ-亚麻酸的含量达到8.2%, 同时脂肪酸含量(油酸和亚油酸)的变化证实Δ6-脂肪酸脱氢酶基因能加速脱氢反应。Δ6-脂肪酸脱氢酶基因的其他功能和T 3代分离模式会通过以后转基因植株的生长过程及分子生物学方法检测出来。
4 结论
建立了甘蓝型黄籽油菜转化体系。接种农杆菌
第12期林呐等: 甘蓝型黄籽油菜自交系转化体系的建立2191
后, 卡拉霉素抗性芽在芽诱导培养基上生长3个月获再生芽。转化株籽粒的γ-亚麻酸含量达8.2%。
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油菜的三种类型
油菜的品种及分类 农学0903 朱晨熹2009301200305 油菜，又叫油白菜，苦菜，是十字花科植物油菜的嫩茎叶，原产我国，颜色深绿，帮如白菜，属十字花科白菜变种。凡是十字花科芸苔属中栽培作为油用的植物，统称为油菜。其中包括很多种类。我国栽培的油菜，按其形态和特性可分为三大类型：芥菜型，白菜型，甘蓝型。 1、芥菜型油菜 该类型通称高油菜、苦油菜、辣油菜或大油菜，原产于我国西部和西北部。植株高大，株型松散，分枝纤细，分枝部位高，分枝多，主根发达。幼苗基部叶片小而窄狭，披针形，有明显的叶柄，叶面皱缩，且具刺毛和蜡粉，叶缘一般呈琴状，并有明显的锯齿，叶片和种子都有浓郁的辛辣味，这是从芥菜演化而来的残留遗迹。。薹茎叶具短叶柄，叶面稍有皱缩。花瓣较小，不重叠，四瓣分离，角果细而短，种子有辣味，呈黄、红、褐色或黑色，籽粒小，种皮多呈黄色或棕红色，千粒重l～2克，含油率30％左右，油的食味较差。含油量低，一般在30％～35％，高的达60％以上，且油分品质较差，不耐藏，生育期较长，产量低，但抗旱、耐瘠性较强。代表品种有牛尾梢、涟水小油菜、新油1号等。在我国西南、西北和华北等地种植较多。 2、白菜型油菜 油菜三大类型之一。学名Brassia campestris L.。包括原产中国的芸薹和油白菜。染色体组为aa,n=10。 白菜型油菜是原产于我国西北地区的大白菜演化来的，植株矮小，分枝较小，茎秆纤细，有薄而光滑的椭圆形叶片。边缘有明显的琴状缺刻，上有刺毛，覆被一层薄薄的腊粉，又称为小油菜、矮油菜和甜油莱，我国大部分地区都能种植。另一种白菜型油菜是从小白菜演化来的，在古籍中称为油青菜。它的特点是株型高大，分枝性强，茎秆粗壮，基叶发达，半直立的。宽大的叶片呈随圆形成或卵圆形，全缘或波状，无琴状缺刻。我国各地称为白油菜、油白菜、油菜白等。白菜型油菜籽粒变异极大，千粒重2～3克，有些品种可达4～5克，含油量在40％以上。籽粒大小不一，种皮多为棕红色、褐色或黑色，千粒重2～3克，含油率在35～45％之间。 该类型又称小油菜或甜油菜。其植株矮小，幼苗生长较快，须根多；基叶椭圆、卵圆或长卵型，叶上举，有多刺毛或少刺毛，被有蜡粉或不被蜡粉，苞茎而生；分枝少或中等，花大小不齐，花瓣两侧相互重叠，自交结实性很低。种子有褐色、黄色或五花子色，大小不一，千粒重3g；含油量中等，一般在35％～38％，高的达45％以上。该类型生育期短，成熟较早，耐瘠薄，抗病力弱，生产潜力小，稳产性差。该类型还可分为两个种： （1）北方小油菜：古代文献中称为芸薹，株型矮小，分枝少，茎秆细，基叶不
甘蓝型油菜黄籽高含油量育种资源遗传多样性分析二审通过后改
甘蓝型油菜黄籽高含油量育种资源遗传多样性分析 范志雄1,2，雷伟侠1，江莹芬1，李强生1，吴新杰1，陈凤祥1，王汉中2 （1安徽省农业科学院作物研究所，230031，安徽合肥；2 中国农业科学院油料作物研究所，430062， 湖北武汉） 摘要以2份白菜型油菜为对照，我们用SRAP标记研究了57份甘蓝型油菜黄籽高油育种资源的遗传关系。在遗传相似系数0.682处，可将59份材料分为3类：两份白菜型油菜聚为一类；甘蓝型油菜除选系Y58单独聚为一类外，其它所有选系归为另一类，显示黄籽高油育种资源遗传基础较窄。在遗传相似性系数0.738处，又可将57份甘蓝型油菜分为6个亚类，其中53份材料归为两个大的亚类，系谱或亲缘关系较近的材料一般聚在同一亚类，且按系谱关系比地理来源划分明显，提示地理来源配制强优势黄籽高油杂交组合可靠性可能不如按系谱来源。 关键词甘蓝型油菜黄籽高含油量遗传多样性SRAP标记 长期以来，我国油菜育种主要追求单纯的产籽量，对含油量则未予足够重视，导致我国菜籽的平均含油量在过去20年中仅提高了1-2%，占我国油菜生产面积90%的长江流域主产区菜籽含油量长期徘徊在40%左右[1]，而加拿大和欧洲等各国菜籽的含油量可达45％甚至50％。另一个问题是育种实践中利用的强优势材料一般都是先配制大量杂交组合，再经多年多点比较、鉴定才获得，该育种过程太繁琐耗时[2]。一般来说，亲本间遗传差异越大，杂种优势越强[3]。因此，利用分子标记研究高油育种资源间的遗传差异，可为选配高含油量强优势组合提供依据，减少配组合时的盲目性。 由于同一遗传背景甘蓝型油菜黄籽含油量比黑籽高1.52% -4.26%，因此现有甘蓝型油菜高含油量的遗传改良多集中于黄籽育种途径上[4-6]。然而自然界中并不存在天然的甘蓝型黄籽油菜，目前培育出的黄籽甘蓝型油菜品种黄籽性状来源十分复杂，原始亲本多为白菜型油菜等近缘种，如宁油10号[7]，渝黄1号[8，9]等。通过田间育种施加一定选----------------------------------------- 作者简介：范志雄，博士后在站，从事甘蓝型油菜高含油量分子育种。 陈凤祥，通讯作者，博士后指导老师，研究方向为油菜遗传育种； 王汉中，通讯作者，博士后指导老师，研究方向为油菜遗传育种。 基金项目：安徽省自然科学基金（090411021），安徽省农科院院长创新基金（11B0201），“863计划”课题（2011AA10A104）
甘蓝型油菜矮杆基因Bnrgads的克隆和功能分析
甘蓝型油菜矮杆基因Bnrgads的克隆和功能分析
华中农业大学学位论文独创性声明及使用授权书 学位论文 是否保密否如需保密，解密时间年月日 独创性声明 本人声明所呈交的论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究 成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已 经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得华中农业大学或其他教育机构的学位 或证书而使用过的材料，指导教师对此进行了审定．与我一同工作的同志对本研究 所做的任何贡献均已在论文中做了明确的说明，并表示了谢意． 研究蝴：到怨帆汐／，9年乡月罗日 学位论文使用授权书 本人完全了解华中农业大学关于保存、使用学位论文的规定，即学生必须按照学校要求提交学位论文的印刷本和电子版本；学校有权保存提交论文的印刷版和电子版，并提供目录检索和阅览服务，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。本人同意华中农业大学可以用不同方式在不同媒体上发表、传播学位论文的全部或部分内容，同时本人保留在其他媒体发表论文的权力．注：保密学位论文(即涉及技术秘密、商业秘密或申请专利等潜在需要提交保密的论文)在解密后适用于本授权书． 学位敝作者签名：割超导师张壕、趁 签名日期：．zofo牟-、乡月9日签名日期如p年彳月，6日。 注；请将本表直接装订在学位论文的扉页和目录之间
一—————————————————————————————————————————————一——一—— 甘蓝型油菜矮杆基因Bnrga．ds的克隆和功能分析 目录 摘；要．I Abstract ．．．III 缩略语表VI 第一章文献综述．1 1．1禾本科作物矮杆突变体的遗传研究和应用1 1．1．1水稻矮杆突变体的遗传研究和应用l 1．1．2小麦矮杆突变体的遗传研究和应用2 1．2油菜矮杆突变体遗传研究现状．3 1．3高等植物矮杆性状的机理研究5 1．3．1赤霉素与植物矮化5 1．3．1．1 GA生物合成途径与植物矮化．5 1．3．1。2 GA信号转导途径与植物矮化7 1．3．2油菜素内酯和植物矮化12 1．3．2．1 BR生物合成和植物矮化．．13 1．3．2．2 BR信号转导途径和植物矮化．．15 1．3．3生长素与植物矮化．．1 5 1．3．3．1生长素生物合成和植物矮化15 1．3．3．2束缚型生长素的形成和植物矮化16 1．33．3生长素的极性运输与植物矮化16 1．3．3．4生长素信号转导途径和植物矮化．17 1．4本研究的目的和意义．．17第二章材料和方法一19 2．1植物材料．1 9 2．2矮杆基因的定位19 2．2．1定位群体的构建19 2．2．2基因组DNA的提取．．19 2．2．3 BSA法和SSR分析．．20 2．2．4 PAGE凝胶制备和电泳检测．．21