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病理切片染色

★常规病理送检注意事项★

1. 手术中切取的组织标本,应立即投入固定液中固定(手术室应备有标本瓶和固定液)。一般以10%中性福马林为固定液。固定液的量不得少于标本体积的5~10倍。标本瓶口宜大,便于标本固定后取出。标本与瓶壁、瓶底接触影响固定者,以脱脂棉衬垫;浮于液面者,以脱脂棉覆盖。如为传染性标本,应注意勿污染容器外面。

2. 标本容器上,应贴有患者姓名或送检单联号的标签。如同一患者同时取有数种组织,或同一组织由不同部位取出,应分装不同容器,并分别注明。不同患者的标本,不得放在同一容器内。

3.采取标本时,注意勿用有齿镊或钳夹取,勿挤压,以免发生人为的变形,影响诊断。标本送检前勿剖开,应保持原形全部送检。必须剖开时,最好邀请病理医师到场,否则应在病理检查申请单内详细描写标本剖开前后情况。送检的组织不可太小,以免影响诊断。

4.标本如为整个器官或其大部,或体积较大,可不固定,但应尽早送病理科处理(外地或远途标本,可参照第三节的方法处理后送检)。

5.各种体液、穿刺液细胞学检查标本,应立即送检。若不能立即送检,应随即离心沉淀,将沉渣做成均匀的涂片2~3张,及时放入乙醚和95%乙醇等量混合液或95%乙醇中固定,然后连同固定液,或在涂片表面涂以甘油后送检。阴道排出物、鼻咽或其他分泌物、穿刺物涂片,应于涂片制成后即放入上述固定液中固定,然后送检。

6. 送检标本时,应逐项详细填写病理检查申请单,字迹要清楚。临床科有特殊要求时,应在申请单上注明或事先联系。

★组织的脱水透明和浸蜡★

(一)工作中注意事项

1.标本未经充分固定,不得进入脱水处理的程序。

2. 在处理全过程中,每l标本均应附有编号。随时注意防止标本间相互混杂。细小标本应用拭镜纸包裹进行脱水,以免遗失。

3.标本多的单位,可根据标本的性质、大小、分类分批进行脱水,以便按组织的特点安排时间,保证质量,常规标本脱水和透明均应在室温进行。

4.一般以乙醇为组织脱水剂,自低浓度向高浓度渐进并多次更换,组织所含水分才能充分去除,透明、浸蜡才能顺利进行,对保证切片质量甚为重要。

5.组织块在二甲苯中的时间不宜过长,使组织透明即可。若较长时间后透明度仍不好,应检查原因,如因脱水不充分,应重行脱水。

6.经常注意所用试剂质量减退情况,根据需要及时更换新液,更换时乙醇可降级重复使用。试剂应经常过滤,以保持清洁

,避免混杂。

7.常规制片所用石蜡的熔点,以56℃左右为宜。在温热的地区或夏季,应用熔点较高的石蜡,在寒冷地区或冬季,则以熔点较低的石蜡为好。

8.硬脂酸-蜡可作为乙醇和石蜡间的中介剂,且可使组织硬度适中便于切片。

9.乙醇、二甲苯等为易燃品,使用过程中2m内不得有明火。加温脱水及浸蜡全过程,应用隔水温箱或无明火设备,提前一级加温,不得用干烤箱。熔蜡用水浴,并有专人守护。

贮存品保管于无火源房间内明亮易取处。实验室应通风良好,备有灭火器及砂箱。丙酮、乙醚、氯仿、氯乙烷、火棉胶等易燃、易爆物品,均应按上述原则处理。

(二)一般步骤和时间

参见表31-2-l。

表31-2-1 不同厚度组织块的脱水、透明与浸蜡的步骤与时间




处 理 步 骤 不同厚度组织块的处理时间(min)

2mm以下
2~4mm
4~5mm

80%乙醇
45~60
60~120
120~240

95%乙醇I
45~60
60~120
120~240

95%乙醇Ⅱ
45~60
60~120
120~240

无水乙醇I
45~60
60~t20
120~240

无水乙醇Ⅱ
45~60
60~120
120~240

二甲苯I*或
15~30
30
60

硬脂酸-蜡(3:2)
120
180
240

二甲苯Ⅱ或
15~30
30
60

硬脂酸-蜡(2:3)
60
90
120

蜡I**
60
60
60~120

蜡Ⅱ
60
120
120~240



* 使用硬脂酸—蜡时,不需二甲苯透明。** 有条件单位可负压浸蜡,以提高浸蜡效果,缩短时间。用时应装压力表和安全瓶。

(三)自动组织处理机的使用和维护

1.自动组织处理机产品有多种,其结构和性能各异,使用前应熟悉机器说明书中的使用说明及注意事项,按照说明书中的使用方法和程序操作。

2.组织处理的程序和时间参见表31-2-2。

表31-2-2 组织处理机处理活检组织的程序和时间(min)




处 理 程 序 处理时间(min)

80%乙醇
95%乙醇I、Ⅱ、Ⅲ
无水乙醇I、Ⅱ、Ⅲ
二甲苯I、Ⅱ*
蜡I/或硬脂酸-蜡(3:2)
蜡Ⅱ/或硬脂酸-蜡(2:3)
蜡Ⅲ/蜡
60
各90
各60
各60
90/180
90/120
60/60



* 用硬脂酸-蜡时不用二甲苯。

3.根据实际工作条件,设计脱水机运行程序、时间和温度等,机器调好后,不要随意变动。使用过程中,要经常注意运行情况,温度、时间控制是否准确。

4.机器应放置干燥、通风、平稳处,经常做好保洁,按说明书要求做好必要的维护。出现有故障时应请维修人员修理。

★石蜡切片HE染色法★

(一)染色注意事项

1.切片脱蜡应彻底,室温较低时更应注意,以切片在二甲

苯中呈透明状,或移入乙醇后,片上无白色斑点为佳。

2.特殊染色、组织化学反应、免疫组化染色,按各方法的要求进行组织固定处理,以保证效果。做酶反应的组织固定更应严格要求。凡用含升汞固定液固定的组织,于切片脱蜡后,应经脱汞处理,方可染色。其法为:切片经水洗2min,浸于0.5%碘酊溶液中10min,水洗,0.5%硫代硫酸钠水溶液5min,用水彻底冲洗,经蒸馏水洗后染色。在脱汞过程中,

慎防切片脱落。

3.各种染料试剂一般选用化学纯。各种染料着色效果常因生产厂和批号不同而异,启用任何新品,均应先试染。配成的染液、试液应盛于有色试剂瓶内,瓶签应写明名称、含量、配制年月日,顺序保存于避光橱中,必要者放冰箱内。凡须临用时配制者,配量应适当。

4.染色各步骤所需的时间,常受温度、切片厚度等影响,可根据镜下观察所见酌情予以调整。但对组织化学反应(尤其是酶),其时间、温度等因素务必恒定,且应做对照片。

染液着色力显著减退时应更新,染色反应不正常,应检查染液及试剂是否失效或误用。

5.染色过程中,勿使切片干燥,以免影响细胞形态。染色完毕后用显微镜检查染色结果,是否符合要求,并核对标本种类、号码、数量是否无误。

(二)染色步骤

1.二甲苯去蜡(经2次)5~10min。

2.无水乙醇、95%乙醇、80%乙醇、70%乙醇各1~2min,然后蒸馏水洗3min(换数次)。

3.苏木紫液染色约5rain(视染液种类和着色情况增减)。

4.水洗;l%酸性乙醇(盐酸1mI,70%乙醇99m1),或1%盐酸分化。显微镜下控制。

5.流水浸洗至少15min,至细胞核呈蓝色。也可短时水洗后,浸于40℃温水使核变蓝。显微镜观察,若核染色过深或不足,应再分化或重染。

6.伊红液染1~2min后,95%乙醇2次,无水乙醇2次,每次约1~2min。

7.苯酚二甲苯(1:3)5min。

8.二甲苯2次,每次3~5min。

9.用中性树胶或DPX以盖片封片,贴标签。
大概过程是先取材,脱水,浸蜡,包埋,切片,脱蜡,染色,脱水,透明,封片几个过程。取材要根据你的实验目的来决定,脱水浸蜡有专门的仪器,包埋是另外的仪器,然后上切片机切片,如果要按区域切片,建议分成几个蜡块包埋。切片好了要烘片,趁热放进二甲苯、梯度酒精脱蜡直至蒸馏水,然后将脱蜡好了的切片染苏木精,根据苏木精效果,一般染色2-3分钟即可,流水冲洗去除多余苏木精,盐酸酒精酸化15秒,弱碱水蓝化,然后染伊红,再梯度酒精脱水,二甲苯透明,树胶封片。

脱蜡和脱水的不能公用,需要染色缸23个左右。




染色缸用铜制的比较好。“灌流时组织缩水变形”你是指动物心脏灌注吗?那你注意一下灌洗用的PBS的渗透压和PH值对不对。










实验五 病理组织切片染色


实验五 病理组织切片染色
一、实验目的
任何切片,不经过染色,在显微镜下只能看到细胞和组织的轮廓,远不能满足观察和诊断的目的。染色是将染料配制成溶液,将组织切片浸入染色剂内,经过一定时间,使组织和细胞的成分被染上不同的颜色,产生不同的折射率,便于在光学显微镜下进行观察。因此,染色在组织形态学、病理学诊断、研究工作中,具有非常重要的实用价值。
二、实验原理
染色是染色剂和组织细胞的结合过程。使用不同的染色方法,其原理有差别。苏木素伊红染色法为病理组织切片最常用的染色方法。由于它对组织细胞的各种成分都可染出,便于对组织成分的全面观察,且以任何固定液固定的材料,各种切片法都可适用。用H.E染色的标本,不易褪色可以长期保存。
在常规的苏木素伊红染色中,苏木素经过氧化变成酸性染料苏木红,而苏木红和铝结合形成一种带正电荷的蓝色色精,带正电荷的蓝色色精和带负电荷的脱氧核糖核酸酸根,通过正、负电荷的极性吸着来完成结合,使细胞核染成蓝紫色。伊红是一种酸性红色胞浆性染料,它们的染色可能是通过渗透作用或弥散作用而完成的,使细胞浆染成红色。

三、主要仪器及试材
HE染色全套试剂,染色缸(卧式),摊片盘,搪瓷缸,盖玻片,中性树胶,牙签,显微镜。

四、实验方法与步骤
常规石蜡切片H.E染色程序
(一)脱蜡至水
1.二甲苯Ⅰ 5-15分钟
2.二甲苯Ⅱ 5-15分钟
3.无水乙醇 3分钟
4.95%酒精 3分钟
5.80%酒精 3分钟
6.70%酒精 3分钟
7.自来水洗

(二)染色
1.Harris苏木素液 5-7分钟
2.自来水洗 5分钟
3.1%盐酸溶液分化 30秒
4.自来水洗 5分钟
5.1%氨水返蓝 10秒
6.自来水洗 15-20分钟
7.95%酒精 3分钟
8.1%伊红酒精溶液 1-2分钟

(三)脱水、透明和封固
l.95%酒精 2分钟
2.无水酒精Ⅰ 2分钟
3.无水酒精Ⅱ 2分钟
4.二甲苯Ⅰ 5分钟
5.二甲苯Ⅱ 5分钟
6.中性树胶封固
结果:细胞核呈蓝色,细胞浆呈红色。

五、实验注意事项
1.任何石蜡切片必须经过二甲苯进行脱蜡后才能染色

,石蜡切片要求平板烘干,以便组织与玻片粘贴牢固。组织切片脱蜡的好坏,与二甲苯的温度及时间有关,二甲苯使用时间过长,应及时更换。
2.在H.E染色过程中,其成败的关键在于分化,如果分化不当致使应该分化脱色的部分末予脱去,或分化不足致染色不均匀,复染对也不能得到对比鲜明的色彩,另外流水冲洗时间的长短对组织返蓝色彩鲜艳与否也有一定的关系。须要提及的是,染色的成败除染色技术以外,组织材料的过分陈旧或长期固定在甲醛中的组织,由于过度酸化都会影响染色;或组织固定不当,固定不足组织发生自溶等均会使染色模糊。
3.伊红染色后必须经梯度酒精脱水,特别需要经过无水乙醇,脱水一定要彻底,否则,影响透明。
4.脱水后,经二甲苯进行透明,才能封固。透明应注意时间充足,才能达到良好效果。封片时,中性树胶不能滴加太多或太少。封固好的切片应平放在摊片盘上,及时放置于恒温箱中40-50℃烘烤15小时左右,有利于切片的保存。

六、实验结果处理
每人交2-3张质量良好的切片,并描述病理变化。

七、思考题
1.病理组织切片染色的原理和意义?
2.病理组织切片染色有哪些程序,应注意什么问题?








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