利用酵母单杂交文库技术筛选银杏端粒结合蛋白

Botanical Research 植物学研究, 2016, 5(2), 55-65 Published Online March 2016 in Hans. https://www.sodocs.net/doc/c413731982.html,/journal/br https://www.sodocs.net/doc/c413731982.html,/10.12677/br.2016.52009

文章引用: 蒋璐瑶, 李丽红, 要笑云, 张强, 撖静宜, 王莹, 李慧, 陆海, 刘頔. 利用酵母单杂交文库技术筛选银杏端

Screening Telomere Binding Proteins from Ginkgo biloba L. Using Yeast One-Hybrid Library

Luyao Jiang, Lihong Li, Xiaoyun Yao, Qiang Zhang, Jingyi Han, Ying Wang, Hui Li, Hai Lu, Di Liu College of Biological Sciences and Biotechnology, Beijing Forestry University, Beijing

Received: Mar. 5th , 2016; accepted: Mar. 22nd , 2016; published: Mar. 29th

, 2016 Copyright ? 2016 by authors and Hans Publishers Inc. This work is licensed under the Creative Commons Attribution International License (CC BY). https://www.sodocs.net/doc/c413731982.html,/licenses/by/4.0/

Abstract

Objective: To provide a powerful experimental basis for the research of telomere binding proteins and telomeres in woody plants especially in Ginkgo, we investigated the telomere-binding pro-teins that bind with telomere sequence in ginkgo. Methods: Using Ginkgo leaves as experimental material, we obtained some gene sequences encoding telomere-binding proteins through yeast one-hybrid library screening technology, then verified their binding specificity by GFP yeast one- hybrid experiments. Results: We did not get any desired DNA sequences using bait vector contain telomere specificity sequence (TTTAGGG)3. However, we obtained 52 DNA sequences using bait carrier contain telomere specificity sequence (TTTAGGG)5 successfully. Our results suggested that the telomere specificity sequence (TTTAGGG)3 might be too short to binding any proteins. After removing repeat sequences, we found that 10 genes were encoded by these 52 DNA sequences through sequences analysis. One gene among them was confirmed that could bind with Ginkgo te-lomere specificity sequence. Through GFP yeast one-hybrid technology. Conclusion: Our study es-tablished a screening method to investigate telomere binding proteins in Ginkgo through yeast one-hybrid library screening and GFP yeast one-hybrid technology, and obtained a telomere binding protein which binding with Ginkgo telomere specificity sequence specifically. Keywords

Ginkgo biloba L., Telomere Binding Protein, Yeast One-Hybrid Library, Yeast One-Hybrid

利用酵母单杂交文库技术筛选银杏端粒结合蛋白 蒋璐瑶，李丽红，要笑云，张 强，撖静宜，王 莹，李 慧，陆 海，刘 頔

蒋璐瑶等

北京林业大学生物科学与技术学院，北京

收稿日期：2016年3月5日；录用日期：2016年3月22日；发布日期：2016年3月29日

摘要

目的：为了获得与银杏端粒结合序列相结合的端粒结合蛋白，为木本植物端粒结合蛋白的研究提供实验依据，从而丰富对银杏端粒的研究。方法：以银杏叶片为实验材料，利用酵母单杂交文库筛选获得可能为银杏端粒结合蛋白的基因片段，并通过GFP酵母单杂交实验验证获得基因片段与端粒序列的结合特异性。结果：使用端粒特异性结合序列(TTTAGGG)3的诱饵载体没有获得合适大小的扩增片段，而使用端粒特异性结合序列(TTTAGGG)5的诱饵载体成功获得52个扩增片段，这说明端粒DNA序列(TTTAGGG)3

过短，不利用蛋白质的结合。比较这些扩增片段序列并去除相同序列，结果显示这52个扩增片段分别属于10个基因片段。对这10个基因片段进行进一步序列分析，并使用酵母单杂交技术验证，结果显示其中一个基因能够与银杏端粒序列特异性结合。结论：本研究通过酵母单杂交文库筛选，GFP酵母单杂交验证等实验方法建立了银杏端粒结合蛋白的筛选方法，并成功获得了一个和银杏端粒重复序列特异性结合的端粒结合蛋白。

关键词

银杏，端粒结合蛋白，酵母单杂交文库，酵母单杂交

1. 引言

【研究意义】银杏(Ginkgo biloba L.)是现存最古老的种子植物，被称为植物中的活化石，在遗传学上有重要的地位[1]。端粒是位于真核生物染色体末端的特殊DNA-蛋白复合结构，具有保护染色体的作用。

其中端粒结合蛋白作为端粒的重要组成部分，在维持端粒结构、调控端粒长度和端粒保护功能方面起十分重要的作用。在木本植物端粒相关蛋白的研究还很空缺[2]，只在少部分木本植物中如毛果杨(Populus trichocarpa Torr. & Gray)中克隆得到一些可能的端粒结合蛋白，关于这些可能的端粒结合蛋白的作用机制少见报道。银杏作为我国特有的珍稀名贵树种，其分子生物学、发育生物学及遗传学等领域的研究价值日益重要[3]。【前人研究进展】从模式生物拟南芥中首次克隆得到植物端粒序列TTTAGGG。目前已发现的植物端粒双链结合蛋白有水稻中的OsRTBP1 [4]，拟南芥中的AtTRP1、AtTRB1、AtTRB2 [5]，玉米中的Smh1等[6]，单链结合蛋白有烟草中的NtGTBP1等[7]。【本研究切入点】近几年，酵母单杂交系统被广泛用于模式植物转录因子的克隆研究[8] [9]。杏作为一种长寿树种，在我国各地普遍存在几百年至数千年的银杏树。这暗示了银杏能存在特殊的端粒保护结构。因此深入比较研究银杏端粒结合蛋白对端粒的保护机制，在植物端粒生物学研究领域意义重大。【拟解决的关键问题】本研究以银杏为材料，尝试使用酵母单杂交文库筛选端粒结合蛋白，并进一步利用酵母单杂交技术，验证其结合特异性。

2. 材料与方法

2.1. 试验材料与试剂

试验材料为银杏叶片，取自北京林业大学校园内。筛库用酵母单杂交体系Matchmaker Gold Yeast One-Hybrid Library Screening System、Aureo-basidin A(AbA)、Matchmaker Insert Check PCR Mix 1、

蒋璐瑶等

Matchmaker Insert Check PCR Mix 2均购自Clontech公司；GFP酵母单杂交体系The Grow’n’Glow G FP One-Hybrid Kit购自Mo Bi Tec公司；Easyspin Plus植物RNA快速提取试剂盒购自北京艾德莱生物科技有限公司；mRNA分离试剂盒PolyATtract mRNA Isolation Systems购自Promega公司；反转录试剂盒FastQuant RT Kit购自天根生化科技(北京)有限公司；高保真DNA聚合酶TransStart? FastPfu DN A Polymerase、E. coil DH5а感受态细胞均购自北京全式金生物技术有限公司；限制性内切酶均购自NE B公司；DNA序列合成由生工生物工程股份有限公司完成；DNA测序由北京六合华大基因科技股份有限公司完成。

2.2. 银杏酵母单杂交体系建立

2.2.1. 诱饵酵母载体pBait-AbAi构建

为了提高端粒序列与端粒结合蛋白的识别率和结合率，合成端粒序列(TTTAGGG)的3次和5次串联重复序列与诱饵载体pAbAi进行连接。由于合成片段过短和载体连接效率较低，本研究以载体pBI121为模板，利用PCR扩增其部分GUS基因片段，延长与诱饵载体的连接序列，从而提高连接成功率。根据GUS基因序列设计上、下游引物(表1)。反应体系25 μL，包括上、下游引物(10 μmol/L) 1 μL、pBI121载体(20 ng/μL)稀释100倍取1 μL、2 × Taq Mix 12.5 μL、ddH2O 9.5 μL。扩增程序：94℃5 min，94℃30 s，55℃30 s，72℃1 min，30个循环，72℃延伸10 min。经1%琼脂糖凝胶电泳检测回收纯化与载体pMD-18T连接，16℃连接3 h，转化大肠杆菌DH5α，用含氨苄西林的LB固体培养基筛选阳性克隆，并测序鉴定。载体pAbAi和测序正确的T载体同时用限制性内切酶HindⅢ和XhoⅠ进行双酶切，酶切产物胶回收纯化进行连接，转化大肠杆菌DH5α。阳性克隆单菌落提取质粒，并以限制性内切酶KpnⅠ进行酶切，去除GUS基因片段，剩余片段16℃自连接过夜转化大肠杆菌DH5α。阳性克隆单菌落测序鉴定。

2.2.2. 诱饵载体转化酵母获得诱饵酵母

pAbAi载体(图1(a))含有尿嘧啶报告基因URA3和AUR1-C，其中AUR1-C基因使载体对金担子素A(AbA)具有抗性，在AUR1-C上游的多克隆位点插入诱饵序列，如有顺式作用元件与诱饵序列结合，激活AUR1-C 基因表达，诱饵酵母便可在含有AbA培养基上生长，故可利用AbA筛选获得阳性酵母单菌落。

游离的pAbAi载体不能在酵母细胞中表达，只有经限制性酶切位点BstB I或Bbs I线性化的pAbAi 载体与Y1HGold酵母基因ura3-52位点进行同源重组，整合到酵母基因组中，才能在酵母中稳定表达。同时使酵母细胞具有编码Ura的能力，可用SD-Ura筛选培养基筛选阳性诱饵酵母单菌落。

参照Yeastmaker Yeast Transformation System 2说明制备酵母菌Y1HGold感受态细胞。用经BstBⅠ酶切线性化的pBait-AbAi 1μg转化Y1HGold感受态细胞，涂布于SD/-Ura固体培养基上，30℃培育3 d，挑取直径在2~3 mm单菌落，利用Matchmaker Insert Check PCR Mix 1进行菌落PCR鉴定，如获得长度为1.35 kb加上三次或五次端粒重复序列产物，则说明诱饵载体正确整合到酵母基因中。

2.2.

3. 测定报告基因本底表达水平

为了排除酵母内源转录因子与目的顺式元件相互作用的干扰，需要在筛库之前确定AbA最低使用浓度。挑取在SD/-Ura固体培养基上正常生长的诱饵酵母，悬浮在0.9% NaCl中，将OD600调整至0.002并分别涂布在含0、100、300、500、800、1000和1500 ng/mL AbA的SD/-Ura固体培养基上，根据酵母生长情况，确定筛库所需AbA的最低浓度。

2.2.4. cDNA文库合成

采用TRIzol法提取银杏叶片总RNA。使用PolyATtract mRNA Isolation Systems试剂盒分离出mRNA。以0.5 μg mRNA为模板，采用SMART技术合成单链cDNA，并利用LD-PCR扩增技术获得双链cDNA。

蒋璐瑶等

Table 1.PCR primer sequences used for amplifying GUS fragments

表1.扩增GUS基因片段的引物序列

引物名称引物序列

上游引物1 5’CCCAAGCTT(TTTAGGG)3GGTACCACGAACTGAACTGGCAGAC-3’

上游引物2 5’CCCAAGCTT(TTTAGGG)5GGTACCACGAACTGAACTGGCAGAC-3’

下游引物5’CCGCTCGAGGGTACCATCTCTTCAGCGTAAGGGT-3’

(a) (b) (c)

Figure 1. The structure chart of pAbAi, pGNG2 and pJG4-5 vector

图1. pAbAi、pGNG2和pJG4-5载体示意图

取7 μL扩增产物用1%琼脂糖凝胶电泳检测，其余使用CHROMA SPINTE-400树脂层析柱(Clontech公司)纯化。

2.2.5. 酵母单杂交文库构建及初步筛选

将20 μL经过纯化的双链cDNA(2~5 μg)和3 μg经Sma I线性化的pGADT7-Rec载体混合，参照Yeastmaker Yeast Transformation System 2方法共转化诱饵酵母感受态细胞。将酵母细胞悬浮液分别稀释至1/10、1/100、1/1000和1/10000，各取100 μL分别涂布在SD/-leu和SD/-leu/AbA固体培养基上，以便计算建库的总克隆数，总克隆数小于1.0 × 106会降低结果的可信度。将剩余的菌液涂布在SD/-leu/AbA 固体培养基上，30℃培育3 d，挑取直径在2~3 mm单菌落，利用Matchmaker Insert Check PCR Mix 2进行菌落PCR鉴定，对cDNA插入片段进行测序和初步的鉴定和分析。

2.3. GFP酵母单杂交鉴定

2.3.1. 诱饵载体pGNG2-bait构建

为了保持研究一致性，仍设计端粒序列(TTTAGGG) 5次串联重复序列与诱饵载体pGNG2 (图1(b))进行连接，方法同pBait-AbAi载体的构建，限制性酶切位点为Not I、Spe I和Nru I。构建好的载体测序鉴定。

2.3.2. 诱饵酵母构建

诱饵载体pGNG2含有选择标记URA3和报告基因GFPuv，其中URA3能使酵母细胞在SD/-Ura培养基上生长。GAL1,10启动子启动GFPuv基因，在GAL1,10启动子上游的多克隆位点插入诱饵序列，如待鉴定序列所表达蛋白能正确结合诱饵序列，则能使GFPuv基因表达，酵母细胞在紫外(360~400 nm)下发绿色荧光。故可以通过酵母细胞是否发绿色荧光鉴定待测序列和端粒重复序列的结合特异性。

蒋璐瑶等

采用LiAc法制备酵母菌EGY48感受态细胞，将构建好的pGNG2-bait诱饵载体转化到EGY48酵母细胞中，涂布在SD/-Ura(Glu)固体培养基上，30℃培养3 d，挑取单克隆提取质粒，通过PCR鉴定并测序。

2.3.3. 表达载体pJG4-5构建

载体pJG4-5 (图1(c))含有GAL1诱导型启动子，控制融合蛋白的表达，在含有半乳糖的培养基中正常表达，抑制其在含葡萄糖的培养基上的表达。载体上的TRP1标记基因使酵母细胞能在缺少色氨酸培养基上生长。

在待鉴定序列首尾两端分别添加限制性酶切位点EcoR I和Xho I，并与pMD18-T载体连接，转化大肠杆菌DH5α，阳性克隆单菌落测序鉴定。构建好的T载体与载体pJG4-5同时用EcoR I和Xho I进行双酶切，1%琼脂糖凝胶电泳检测并回收纯化，回收产物连接，转化大肠杆菌DH5α，双酶切鉴定。

2.3.4. 构建GFP酵母单杂交体系

采用LiAc法制备诱饵酵母感受态细胞。将构建好的含有待鉴定序列的表达载体pJG4-5转化到诱饵酵母细胞中，涂布在SD/-TRP-URA(GAL/RAF)固体培养基上，30℃培养3 d。挑取单菌落置于荧光显微镜下观察，发绿色荧光即可认为待测序列能与端粒序列(TTTAGGG)特异性结合。

3. 结果与分析

3.1. 构建酵母单杂交文库

3.1.1. 诱饵载体pBait-pAbAi构建

在本实验室课题组的前期研究中已鉴定银杏端粒序列为拟南芥型TTTAGGG序列。为了增加可能的端粒结合蛋白与端粒的结合能力，在构建诱饵载体pBait-pAbAi时，分别使用了两个特异性结合序列(TTTAGGG)3和(TTTAGGG)5构建两个诱饵载体pBait-pAbAi。此外，由于特异性结合序列片段较小，为了增加构建成功率，使用了GUS基因片段作为引导序列(图2)。

以载体pBI121为模板，表一的序列为引物扩增GUS基因片段，获得GUS片段加端粒序列(TTTAGGG)三次及五次重复序列的长度约640 bp的条带(图3(a))，与载体pMD-18T连接后测序鉴定正确。

以Hind III和Xho I分别酶切质粒pMD-18T-(TTTAGGG)3/5-GUS和载体pAbAi，分别得到长度约为640 bp和5000 bp的片段，进行连接，转化到大肠杆菌DH5α，Hind III和Xho I双酶切鉴定(图3(b))。

使用限制性内切酶Kpn I对质粒pAbAi-(TTTAGGG)3/5-GUS进行酶切，获得约5000 bp和600 bp两个片段，对长度约5000 bp的片段利用T4连接酶进行自连。经测序鉴定，(TTTAGGG)3/5序列成功连接到载体pAbAi上。

Figure 2. Construction of target-reporter pBait-pAbAi

图2. 诱饵载体pBait-pAbAi构建示意图

蒋璐瑶等

3.1.2. 诱饵载体转化酵母Y1HGold

经Bst b I线性化的两个pBait-pAbAi转化酵母感受态细胞，涂布于SD/-Ura固体培养基上，30℃培养3 d，挑取2~3 mm单菌落进行PCR检测。获得长度约1.4 kb的片段(图3(c))，说明诱饵载体成功转入酵母Y1HGold中。

同时将经过0.9% NaCl稀释的酵母菌液涂布于含AbA梯度浓度的SD/-Ura培养基上，当AbA浓度达到1000 ng/mL时完全抑制了酵母单菌落生长，如图4所示，确定本研究所需AbA浓度为1000 ng/mL。

3.1.3. 银杏酵母单杂交文库构建

提取银杏RNA并进行1%琼脂糖凝胶电泳检测，由图5(a)可知，其中28S和18S条带比例约为2:1，总RNA浓度为1200 ng/μL，OD260/280为1.92，说明RNA纯度质量好，可以用于构建文库。

(a) (b) (c)

A: (TTTAGGG)3/5-GUS片段PCR扩增电泳检测图, M:DM 2000 Plus DNA Marker;1-2: (TTTAGGG)3-GUS片段电泳结果;3-4:(TTTAGGG)5-GUS片段电泳结果;B:质粒pMD-18T-(TTTAGGG)5-GUS和载体pAbAi双酶切电泳图, M:DL 15000 DNA Marker;1: 质粒pMD-18T-(TTTAGGG)5-GUS;2: pMD-18T-(TTTAGGG)5-GUS双酶切;3:载体pAbAi;4: pAbAi双酶切线性化;C: 诱饵酵母菌落PCR电泳检测图, M:DL2000 DNA Marker;1:诱饵酵母菌落PCR扩增结果

Figure 3. PCR detection results of vector construction in yeast one-hybrid library

图3. 酵母单杂交文库载体构建电泳检测图

(a) (b)

A：不含AbA的SD/-Ura培养基上诱饵酵母生长情况；B：AbA浓度为1000 ng/mL

的SD/-Ura培养基完全抑制诱饵酵母生长

Figure 4. The minimal inhibitory concentration of Aureobasidin A

图4. AbA最低使用浓度筛选结果

蒋璐瑶等

(a) (b)

A：银杏总RNA电泳检测结果；B：酵母单杂交文库筛选片段电泳检测结果，M：DL15000 DNA Marker；

1-18：酵母单菌落PCR电泳结果

Figure 5. Total RNA detection result of Ginkgo biloba L. and PCR detection results of yeast

one-hybrid library

图5. 银杏总RNA及酵母单杂交文库筛选片段电泳检测图

总RNA利用磁珠分离出mRNA，浓度为20 ng/μL，OD260/280为1.90。以3 μL mRNA为模板，通过反转录及LD-PCR获得双链cDNA，最后通过CHROMASPINTE-400树脂层析柱进行纯化。

cDNA文库与经Sma I线性化的pGADT7-Rec载体共转化诱饵酵母感受态细胞。将经过转化的酵母细胞稀释1000倍后涂布在SD/-Leu培养基上，共长出20个单菌落，经过计算可知总克隆数即转化效率为3.0 × 106，大于构建文库最低限度1.0 × 106。转化效率= (菌落个数/涂布菌液体积) × 稀释倍数× 总体积。

剩余酵母转化产物在SD/-Leu/AbA (1000 ng/mL)培养基上30℃培养3 d，挑取单克隆进行菌液PCR 检测(图5(b))，并对其中大于250 bp的扩增片段进行测序。

3.1.

4. 可能的银杏端粒结合蛋白的鉴定

结果显示，使用端粒特异性结合序列(TTTAGGG)3的诱饵载体没有能够获得合适大小的扩增片段，显示该端粒特异性结合序列难以有效结合端粒结合蛋白。而使用端粒特异性结合序列(TTTAGGG)5的诱饵载体成功获得52个扩增片段，显示该端粒特异性结合序列能够有效结合端粒结合蛋白。

对52个扩增片段的进行测序，并进行序列比对，去除序列相同的结果，得到10个cDNA序列可能为银杏端粒结合蛋白基因序列片段。进一步利用NCBI的BLAST分析，其中有3个序列显示为功能未知蛋白，7个为无对应序列，这可能是由于缺乏有效的银杏基因组序列的结果。进一步通过DNAMAN等软件分析，这10个序列中有7个序列中存在较多的终止子，不能翻译成相对应的蛋白。说明这7个序列可能是银杏cDNA文库构建过程中的干扰序列。该结果在已报道的酵母单杂交文库筛选技术研究中也时有报道，显示该技术存在一定的假阳性现象。其余3个序列为端粒结合蛋白的相应序列的可能性较大。为了方便区分，暂以A-C来标明该3个基因片段(图6)。由于酵母单杂交文库不能有效鉴定蛋白质与DNA 的结合的一一对应关系，为了进一步这3个序列是否独立与端粒序列特异性结合，研究组进一步使用酵母单杂交技术进行分析。

3.2. GFP酵母单杂交鉴定

3.2.1.诱饵载体pGNG2-bait构建

诱饵载体pGNG2-bait构建方法同诱饵载体pBait-pAbAi的构建，此处不再详述。仅将限制性酶切位点改为Not I、Spe I和Nru I。以序列5’-GCCCAATACGCAAACCGCCT-3’为引物，测序鉴定。

蒋璐瑶等

3.2.2.诱饵载体转化酵母EGY48

将构建好的诱饵载体pGNG2-bait转化到酵母EGY48感受态细胞中，涂布在SD/-URA(Glu)培养基上，30℃培养3 d。挑取单克隆置于SD/-URA(Glu)液体培养基中震荡培养，提取质粒，转化大肠杆菌DH5α，在含氨苄西林的LB培养基上生长，根据挑取阳性单菌落提取质粒电泳检测验证诱饵载体已成功转化入酵母EGY48中。

3.2.3.表达载体A/B/C-pJG4-5构建

A、B、C三个序列使用DNAMAN软件分析确定碱基翻译序列，分别在上下游添加限制性酶切位点

EcoR I和Xho I设计引物，以载体A/B/C-pGADT7-Rec为模板，通过PCR扩增获得长度约1000bp的条带，与载体pMD-18T连接。测序鉴定。

以EcoR I和Xho I酶切A/B/C-pMD-18T与表达载体pJG4-5，获得长度约1000 bp和6500 bp的条带，利用T4连接酶连接。转化大肠杆菌DH5α，EcoR I和Xho I双酶切鉴定(图7)。

3.2.

4. GFP酵母单杂交体系建立

将构建好的A/B/C-pJG4-5载体转化到诱饵酵母细胞中，并涂布于SD-TRP-URA(GAL/RAF)固体培养基，30℃培养3 d。挑取单菌落用0.9% NaCl稀释，通过在荧光显微镜下观察，其中A-pJG4-5转化的酵母细胞发绿色荧光(图8)，其余未见绿色荧光。说明A序列可以与银杏端粒序列(TTTAGGG)特异性结合。

Figure 6. The nucleotide sequences of (a) (b) (c) gene

图6. (a) (b) (c)基因序列片段

蒋璐瑶等

(a) (b) (c)

Figure 7. Double enzyme digestion results of A/B/C-pJG4-5 expression vector

图7. 表达载体A/B/C-pJG4-5双酶切电泳检测图

左图为蛋白与端粒序列特异性结合，细胞发绿色荧光；右图为阴性对照。

Figure 8. Fluorescent detection of GFP yeast one-hybrid

图8. GFP酵母单杂交荧光显示图

而B，C两个基因与银杏端粒序列(TTTAGGG)特异性结合能力较弱或不能独立与银杏端粒序列(TTTAGGG)特异性结合。

4. 讨论

端粒位于真核生物染色体末端，是一种具有保护染色体作用的特殊DNA-蛋白复合结构。端粒的功能在于防止染色体DNA降解、非正常重组和染色体缺失等，从而起到保护染色体基因完整性的功能，因此端粒功能的发挥为生命活动的正常运作提供了重要保障[10]。绝大多数真核生物的端粒DNA序列是由富含TG的重复序列组成，在脊椎动物中为TTAGGG，大多数植物中为TTTAGGG [11]。

端粒结合蛋白不仅在维持端粒结构上非常重要，且在调控端粒长度和端粒保护功能方面起十分重要作用[12]。端粒结合蛋白主要分两类：一类是在哺乳动物中被称为端粒重复结合因子(TRF)，其结合于端粒双链区域[13]。其中TRF1和TRF2均结合在端粒Myb区域，以二聚体形式存在[14]。TRF1控制端粒长度，TRF2参与维持染色体的稳定[15]。另一类蛋白以端粒保护蛋白(POT1)为代表，通过寡糖/寡核苷酸结合在端粒单链序列上[16]。

蒋璐瑶等

端粒在植物学领域的研究还比较缺少。通过凝胶迁移实验，首次在拟南芥中发现了端粒结合蛋白[17]

[18]。在目前的研究中可以看出，对植物端粒及端粒结合蛋白的相关研究主要集中于草本模式植物，例如

拟南芥、水稻、玉米等。对于木本植物端粒的相关研究还少有报道。

一般来说，在酵母单杂交文库筛选过程中，可能存在载体构建时因合成片段过短导致和载体连接效率较低的问题，本研究以载体pBI121为模板，利用PCR扩增其部分GUS基因片段，延长与诱饵载体的连接序列，从而提高连接成功率，后期再通过切除GUS基因片段，载体自我连接即可完成载体构建。目前酵母单杂交文库筛选一般使用植物总RNA来构建cDNA文库，但是存在大量的tRNA和rRNA会对筛选产生干扰，造成过多的假阳性产生。本研究采用磁珠法从总RNA中分离出mRNA来构建cDNA文库，可以有效降低假阳性率。在构建重组酵母时，应确保OD600在0.4~0.6之间，否则易造成转化效率低或者不能成功转化。为了排除酵母内源转录因子与目的顺式元件相互作用的干扰，在筛库之前须确定AbA的最低使用浓度。

总之，本研究通过酵母单杂交文库筛选，GFP酵母单杂交验证等实验方法建立了银杏端粒结合蛋白的筛选技术，并获得了一个和银杏端粒重复序列特异性结合的端粒结合蛋白。本研究丰富了对银杏端粒的研究，为木本植物端粒结合蛋白的研究提供了有力的实验依据。

5. 结论

本研究通过酵母单杂交文库筛选和GFP酵母单杂交等实验方法获得一个与银杏端粒重复序列(TTTAGGG)特异性结合的基因片段。

基金项目

国家自然科学基金项目(31370590, J1103516)。

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CLONTECH酵母双杂中文版

目录 （一）介绍 4 （二）试剂盒物品清单 7 （三）额外附加物品列表9 （四）酵母菌株11 （五）酵母载体14 （六）方法简述：单杂交文库的构建和筛选16 方法简述：双杂交文库的构建和筛选17 （七）构建用于酵母单杂交的报告质粒载体18 （八）构建用于酵母双杂交的DNA-BD融合载体19 （九）构建生成cDNA文库21 （十）构建和筛选酵母单杂交和双杂交文库（简述）27 （十一）酵母单杂交文库的构建和筛选28 （十二）酵母双杂交文库的构建和筛选30 方法A:通过酵母配对（Yeast Mating）来筛选目的蛋白30 方法B:通过共转化的方法筛选目的蛋白35 （十三）分析阳性相互作用结果38 （十四）问题解决指南44 （十五）参考文献47 （十六）相关产品50 附录A: 双链 cDNA合成的典型结果51 附录B: 酵母感受态的制备—LiAc 法52 附录C：单杂交对照载体信息53 附录D：双杂对照载体信息54 表格列表 Table I． BD Matchmaker酵母菌株的基因型11 Table II． BD Matchmaker酵母菌株的表型11 Table III．单杂交系统的载体14 Table IV．双杂交系统的载体15 Table V．各BD-Matchmaker DNA-BD 载体的比较19 Table VI． RNA起始浓度和PCR扩增循环数之间的关系24 Table VII．单杂交共转化的对照实验的设置29 Table VIII．单杂共转化对照实验：期望的结果29 Table IX．双杂交转化的对照实验的设置33 Table X．双杂交配对筛选的对照实验的设置 Table XI．双杂交共转化的对照实验的设置 Table XII．双杂交共转化的对照实验：期望的结果 Table XIII．用于PCR筛选菌落的Assembling Master Mixs

酵母双杂交技术

酵母双杂交系统 1．原理 酵母双杂交系统的建立得力于对真核细胞调控转录起始过程的认识。研究发现，许多真核生物的转录激活因子都是由两个可以分开的、功能上相互独立的结构域(domain)组成的。例如，酵母的转录激活因子GAL4，在N端有一个由147个氨基酸组成的DNA结合域(DNA binding domain,BD)，C端有一个由113个氨基酸组成的转录激活域(transcription activation domain,AD)。GAL4分子的DNA结合域可以和上游激活序列(upstream activating sequence，UAS)结合，而转录激活域则能激活UAS下游的基因进行转录。但是，单独的DNA结合域不能激活基因转录，单独的转录激活域也不能激活UAS 的下游基因，它们之间只有通过某种方式结合在一起才具有完整的转录激活因子的功能。 2．试验流程 酵母双杂交系统正是利用了GAL4的功能特点，通过两个杂交蛋白在酵母细胞中的相互结合及对报告基因的转录激活来捕获新的蛋白质，其大致步骤为: 2．1、视已知蛋白的cDNA序列为诱饵(bait)，将其与DNA结合域融合，构建成诱饵质粒。 2．2、将待筛选蛋白的cDNA序列与转录激活域融合，构建成文库质粒。2．3、将这两个质粒共转化于酵母细胞中。 2．4、酵母细胞中，已分离的DNA结合域和转录激活域不会相互作用，但诱饵蛋白若能与待筛选的未知蛋白特异性地相互作用，则可激活报告基因的转录；反之，则不能。利用4种报告基因的表达，便可捕捉到新的蛋白质。 3．特点 优点 蛋白--蛋白相互作用是细胞进行一切代谢活动的基础。酵母双杂交系统的建立为研究这一问题提供了有利的手段和方法。 缺点

酵母单杂交

酵母单杂交 —研究蛋白质与特定DNA序列之间的相互作用 酵母单杂交技术最早是从酵母双杂交技术发展而来的，酵母双杂交技术通过对报告基因的表型进行检测以实现对蛋白质间相互作用的研究，而酵母单杂交技术则通过对报告基因的表型检测，分析DNA与蛋白之间的相互作用，以研究真核细胞内的基因表达调控。 ●顺式作用元件 存在于基因旁侧序列中能影响基因表达的序列，本身不编码任何蛋白质，仅仅提供一个作用位点，与反式作用因子相互作用参与基因表达调控。 ●反式作用因子 是指能直接或间接地识别或结合在顺式作用元件核心序列上参与调控靶基因转录效率的蛋白质。 酵母单杂交(Yeast one-hybrid)是根据DNA结合蛋白(即转录因子)与DNA顺式作用元件结合调控报道基因表达的原理，克隆与靶元件特异结合的转录因子基因(cDNA)的有效方法。 其理论基础是：许多真核生物的转录激活子由物理和功能上独立的DNA结合区(DNA-binding domain BD)和转录激活区(Activationdomain AD)组成。BD可识别DNA上的特异序列，并使转录激活结构域定位于所调节的基因的上游；AD可同转录复合体的其他成分作用，启动它所调节的基因的转录。两个结构域各据功能，互不影响。 (单独的BD虽然能和启动子结合，但是不能激活转录。) 这两个结构域各具功能，互不影响,单独存在时没有转录激活的功能，只有两者通过共价或非共价键连接建立起来的空间结构方可表现出一个完整的激活特定基因表达的激活因子的功能。 用于酵母单杂交系统的酵母GAL4蛋白即是一种典型的转录因子。研究表明GAL4 的DNA结合结构域靠近羧基端，含有几个锌指结构，可激活酵母半乳糖苷酶的上游激活位点(UAS)；而转录激活结构域可与RNA 聚合酶或转录因子TFIID相互作用，提高RNA 聚合酶的活性。在这一过程中，DNA 结合结构域和转录激活结构域可完全独立地发挥作用。 据此，我们可将GAL4 的DNA结合结构域置换为其他蛋白，只要他能与我们想要了解的目的基因相互作用，就照样可以通过其转录激活结构域激活RNA聚合酶，从而启动对下游报告基因的转录。

酵母单杂交-实验步骤总结

1 pBait-AbAi载体的构建（酵母报道子的构建） 注：酵母报道子（pBait-AbAi）包含目的顺式作用元件的一个或多个拷贝，且插入到pAbAi载体AbAi r报告基因的上游。大量研究表明最有效的构建应包含目的DNA三个以上的首尾连接的拷贝。首尾连接的拷贝产生方式很多，但对于长度小于20 bp的调控元件，人工合成寡核苷酸是最方便可靠的途径。 （1）设计并合成包含目的序列的两条反向平行的寡核苷酸序列，且两端加上与pAbAi载体酶切产物一致的粘性末端（建议合成一个目的序列的突变序列作为对照，以排除可能的假阳性）。 （2）用TE buffer溶解寡核苷酸至终浓度100 μmol/L。 （3）将正向链和反向链按照1:1的比例混合（退火后的双链寡核苷酸最大浓度为50 μmol/L）。 （4）95 ?C保温30 s，去除二级结构。 （5）72 ?C保温2 min，37 ?C保温2 min，25 ?C保温2min。 注：缓慢退火，有助于双链寡核苷酸的形成。 （6）冰上放置。退火后的产物可贮存在-20 ?C冰箱备用。 （7）酶切1 μL pAbAi载体，用凝胶回收纯化或柱纯化的方式纯化酶切产物。 注：回收前，可用琼脂糖凝胶检测是否酶切完全。 （8）将退火后的寡核苷酸稀释100倍至终浓度为0.5 μmol/L。 （9）在连接反应管中加入如下成分： pAbAi载体（50 ng/μL） 1.0 μL annealed oligonucleotide （0.5 μmol/L） 1.0 μL 10×T4 DNA ligase buffer 1.5 μL BSA（10 mg/mL）0.5 μL Nuclease-free H2O 10.5 μL T4 DNA ligase （400 U/μL）0.5 μL 总体积15 μL 注：如果有必要，可用1 μL nuclease-free H2O代替寡核苷酸作为阴性对照。 （10）将反应体系室温放置连接3 h，转化E coli，采用常规方法检测阳性克隆。

酵母单杂交技术

酵母单杂交技术 1．酵母单杂交的基本原理 酵母单杂交技术是1993年由酵母双杂交技术发展而来的，其基本原理为：真核生物基因的转录起始需转录因子参与，转录因子通常由一个DNA特异性结合功能域和一个或多个其他调控蛋白相互作用的激活功能域组成，即DNA 结合结构域(DNA—bindingdomain，BD)和转录激活结构域(activationdomain，AD)。用于酵母单杂交系统的酵母GAL4蛋白是一种典型的转录因子，GAL4的DNA结合结构域靠近羧基端，含有几个锌指结构，可激活酵母半乳糖苷酶的上游激活位点(UAS)，而转录激活结构域可与RNA聚合酶或转录因子TFIID相互作用，提高RNA聚合酶的活性。在这一过程中，DNA结合结构域和转录激活结构域可完全独立地发挥作用。据此，我们可将GAL4的DNA结合结构域置换为文库蛋白编码基因，只要其表达的蛋白能与目的基因相互作用，同样可通过转录激活结构域激活RNA聚合酶，启动下游报告基因的转录。 酵母单杂交原理示意图 2．酵母单杂交技术的特点 酵母单杂交体系自1993年由Wang和Reed创立以来，在生物学研究领域中已经显示出巨大的威力。应用酵母单杂交体系已经验证了许多已知的DNA与蛋白质之间的相互作用，同时发现了新的DNA与蛋白质的相互作用，并由此找到了多种新的转录因子。近来，已有应用酵母单杂交体系进行疾病诊断的研究报道。随着酵母单杂交体系的不断发展和完善，它在科研、医疗等方面的应用将会越来越广泛。采用酵母单杂交体系能在一个简单实验过程中，识别与DNA特异结合的蛋白质，同时可直接从基因文库中找到编码蛋白的DNA序列，而无需分离纯化蛋白，实验简单易行。由于酵母单杂交体系检测到的与DNA结合的蛋白质是处于自然构象，克服了体外研究时蛋白质通常处于非自然构象的缺点，因而具有很高的灵敏性。目前，多种酵母单杂交体系的试剂盒和相应的cDNA文库已经商品化，为酵母单杂交体系的使用提供了有利的条件。 但酵母单杂交也存在以下缺点：有时由于插入的靶元件与酵母内源转录激活因子可能发生相互作用，或插入的靶元件不需要转录激活因子就可以激活报告基因的转录，因此往往产生假阳性结果。如果酵母表达的AD融合蛋白对细胞有毒性，或融合蛋白在宿主细胞内不能稳定地表达，或融合蛋白发生错误折叠，或者不能定位于酵母细胞核内，以及融合的Gal4AD封闭了蛋白质上与DNA相互作用的位点，则都可能干扰AD融合蛋白结合于靶元件的能力，从而产生假阴性结果。 3．酵母单杂交的基本操作过程

酵母单杂交

酵母单杂交 酵母单杂交技术最早是1993年由Li等从酵母双杂交技术发展而来，通过对报告基因的表型检测，分析DNA与蛋白之间的相互作用，以研究真核细胞内的基因表达调控。由于酵母单杂交方法检测特定转录因子与顺式作用元件专一性相互作用的敏感性和可靠性，现已被广泛用于克隆细胞中含量微弱的、用生化手段难以纯化的特定转录因子。酵母单杂交(Yeast one-hybrid)是根据DNA结合蛋白(即转录因子)与DNA顺式作用元件结合调控报道基因表达的原理，克隆与靶元件特异结合的转录因子基因(cDNA)的有效方法。其理论基础是：许多真核生物的转录激活子由物理和功能上独立的DNA结合区(DNA-binding domain BD)和转录激活区(Activation domain AD) 组成，因此可构建各种基因与AD的融合表达载体，在酵母中表达为融合蛋白时，根据报道基因的表达情况，便能筛选出与靶元件有特异结合区域的蛋白。理论上，在单杂交检测中，任何靶元件都可被用于筛选一种与之有特异结合区域的蛋白。(百度百科) 酵母单杂交法 酵母单杂交体系(yeast one-hybrid system)常用于研究DNA-蛋白质间的相互作用。 酵母单杂交体系可识别稳定结合于DNA上的蛋白质，可在酵母细胞内研究真核DNA-蛋白质间的相互作用，并通过筛选DNA文库直接获得靶序列相互作用蛋白的编码基因。也可用于分析鉴定细胞中转录调控因子与顺式作用元件相互作用。 酵母单杂交原理：将已知的顺式作用元件构建到最基本启动子(minimal promoter，Pmin)上游，把报告基因连接到Pmin下游。将待测转录因子的cDNA与酵母转录激活结构域(activation domain，AD)融合表达载体导入细胞，该基因产物如果能够与顺式作用元件结合，而激活Pmin启动子使报告基因表达。 酵母单杂交体系主要用于分离编码结合于特定顺式调控元件或其他DNA位点的功能蛋白编码基因，验证反式转录调控因子的DNA结合结构域，准确定位参与特定蛋白质结合的核苷酸序列。

酵母单杂交

Two-hybrid assay of yeast transformation Qi's protocol (This method can be used for both laboratory and industrial yeast) Yeast strain we used for two-hybrid is S. cerevisiae HF7c (MATa ura3-52 his3-200 ade2-101 lys2-801 trp1-901 leu2-3,112 gal4-542 gal80-538 LYS2::GAL1UAS-GAL1TATA-HIS3 URA3::GAL4 17mers(x3)-CyC1TATA-LacZ), which contains the two reporter genes LacZ and HIS3, was used in two-hybrid analysis. Yeast can be co-transformation with plasmids carrying the different GAL4 DNA binding domain-target protein fusions (TRP1marker) and plasmid carrying the GAL4 activation domain (LEU2marker) to perform the protein-protein interaction study or two-hybrid screening. The transformation method is modified from Schiestl and Gietz (1989) GAL4 DNA binding domain vector (pGBT8 or pGBT9, difference only in polylinker, relatively low expression, TRP1 marker) GAL4 activation domain vector (pGAD424, low expression; pGADGH, high expression, LEU2 marker ) Transformation protocol for unique plasmid or for two known plasmids 1. From the stock (-70aC) the yeast were inoculated on YPAD plate for 2 days at 28-32aC 2. Inoculate 2-3 independent yeast colonies to 10 ml YPAD medium for the preinoculation, shaking at 28-32aC for 10 to 12 hours, check OD600. 3. Make an inoculation of the volume necessary for the transformation. (Usually 10 ml of OD600 0.3 cells or 5 ml of OD600 0.8 is used for each sample transformation. You can use the formula: OD -------- 2n ------------- x Vinoc. = Vpreinoc. ODpre OD is OD600 of cells you will use for transformation, 0.3-0.8 of OD600 is good for LiOAc transformation. ODpre is OD600 of the preinoculation. n is the generation time of yeast, different yeast strain has different generation time. The generation time for HF7C is 1.5 hours in rich medium and 2 hours in minimal medium. Vinoc. The volume you need for the transformation. Vpreinoc. is the volume you need take from preinoculation. Shaking at 28-32aC and an overnight inoculation is recommended

文库构建及酵母双杂交技术

第四章基因文库构建及酵母双杂交技术 1 基因组文库的构建 基因组文库（genomic library）将某种生物细胞的整个基因组DNA切割成大小合适的片断，并将所有这些片断都与适当的载体连接，引入相应的宿主细胞中保存和扩增。 理论上讲，这些重组载体上带有了该生物体的全部基因，称为基因文库。 1. 1构建基因文库的载体选用 载体能够容载的DNA片断大小直接影响到构建完整的基因文库所需要的重组子的数目。

第四章基因文库构建及酵母双杂交技术1.1.1对载体的要求：载体容量越大，所要求的DNA片断数目越少，所需的重组子越少。 1.1.2目前常用的载体： 载体系列（容量为24 kp ）、cosmid载体（容量为50 kb ）、YAC（容量为1 Mb ）、BAC （容量为300 kb） 1.2 基因文库构建的一般步骤 1.2.1染色体DNA大片段的制备：断点完全随机，片断长度合适于载体连接。不能用一般的限制性内切酶消化法，使用物理切割法或不完全酶切法。 1.2.2载体与基因组DNA大片段的连接：直接连接、人工接头或同聚物加尾。

噬菌体载体构建基因组文库

第四章基因文库构建及酵母双杂交技术2 cDNA文库的构建 cDNA克隆的基本过程是通过一系列，酶酶催作用，使poly(A) mRNA转变成双链cDNA群体并插入到适当的载体分子上，转化大肠杆菌寄主细胞，构建包含所有基因编码序列的cDNA基因文库。 2.1高质量mRNA的制备 应用Promega PolyAT tract mRNA Isolation System 分离Poly(A)RNA。将Biotinylated Oligo(dT)引物与细胞总RNA共温育，加入与微磁球相连的Streptavidin，用磁场吸附与PMP相连的SA-Biotinylated Oligo(dT)-mRNA。

酵母双杂交实验流程(精).doc

模块七蛋白质之间的相互作用 1.实验目的 本实验以重组质粒和酵母细胞为材料, 学习检测蛋白质相互作用的基本原理和 技术方法。主要介绍酵母双杂交的基本原理与操作技术 ; 让学生了解和掌握酵母双 杂交系统的应用 ; 掌握酵母感受态的制备的基本原理和主要的操作步骤。 2.实验原理 1989 年Fields 和Song 等人根据当时人们对真核生物转录起始过程调控的认 识(即细胞内基因转录的起始需要转录激活因子的参与,提出并建立了酵母双杂交系 统。该系统作为发现和研究活细胞体内的蛋白质与蛋白质之间的相互作用的技术平 台 ,近几年得到了广泛的运用和发展。 相比于其它蛋白质筛选系统,酵母双杂交系统具有以下优点:(1 检测在真核活细 胞内进行 ,在一定程度上代表细胞内的真实情况。(2 作用信号是在融合基因表达后, 在细胞内重建转录因子的作用而给出的 ,省去了纯化蛋白质的繁琐步骤。(3 检测结果是基因表达产物的积累效应,因而可检测存在于蛋白质之间的微弱或暂时的相互 作用。(4 酵母双杂交系统可采用不同组织、器官、细胞类型和分化时期材料构建cDNA 文库 ,能分析细胞质、细胞核及膜结合蛋白等多种不同亚细胞部位及功能蛋白。(5 通过mRNA 产生多种稳定的酶使信号放大。同时,酵母表型、X-Gal 及 HIS3 蛋白表达等检测方法均很敏感。 酵母双杂交系统也具有一定的局限性。首先 , 经典的双杂交系统分析蛋白间的 相互作用定位于细胞核内,因而限制了该系统对某些细胞外蛋白和细胞膜受体蛋白 的研究。酵母双杂交系统的另一个局限性是“假阳性”。在酵母双杂交系统建立的 初期阶段 ,由于仅仅采用β-半乳糖苷酶这一单一的报告基因体系,这种报告基因的表 达往往不能十分严谨地被控制,因此容易产生假阳性。由于某些蛋白本身具有激活 转录的功能或在酵母中表达时发挥转录激活作用, 使DNA 结合结构域融合蛋白在 无特异激活结构域的情况下也可被激活转录。另外某些蛋白表面含有对多种蛋白

(完整版)酵母双杂交原理

酵母双杂交系统原理 酵母双杂交系统(Yeast Two-hybrid System)由Fields和Song等首先在研究真核基因转录调控中建立。典型的真核生长转录因子，如GAL4、GCN4、等都含有二个不同的结构域: DNA 结合结构域(DNA-binding domain)和转录激活结构域(transcription-activating domain)。前者可识别DNA上的特异序列，并使转录激活结构域定位于所调节的基因的上游，转录激活结构域可同转录复合体的其他成分作用，启动它所调节的基因的转录。二个结构域不但可在其连接区适当部位打开，仍具有各自的功能。而且不同两结构域可重建发挥转录激活作用。酵母双杂交系统利用杂交基因通过激活报道基因的表达探测蛋白－蛋白的相互作用。主要有二类载体: a 含DNA -binding domain的载体; b 含DNA-activating domain的载体。上述二类载体在构建融合基因时，测试蛋白基因与结构域基因必须在阅读框内融合。融合基因在报告株中表达，其表达产物只有定位于核内才能驱动报告基因的转录。例如GAL4-bd具有核定位序列(nuclear-localization sequence)，而GAL4-ad没有。因此，在GAL4-ad氨基端或羧基端应克隆来自SV40的T-抗原的一段序列作为核定位的序列。 双杂交系统的另一个重要的元件是报道株。报道株指经改造的、含报道基因(reporter gene)的重组质粒的宿主细胞。最常用的是酵母细胞，酵母细胞作为报道株的酵母双杂交系统具有许多优点: 〈1〉易于转化、便于回收扩增质粒。〈2〉具有可直接进行选择的标记基因和特征性报道基因。〈3〉酵母的内源性蛋白不易同来源于哺乳动物的蛋白结合。一般编码一个蛋白的基因融合到明确的转录调控因子的DNA－结合结构域(如GAL4-bd，LexA-bd)；另一个基因融合到转录激活结构域(如GAL4-ad，VP16)。激活结构域融合基因转入表达结合结构域融合基因的酵母细胞系中，蛋白间的作用使得转录因子重建导致相邻的报道基因表达(如lacZ)，从而可分析蛋白间的结合作用。 酵母双杂交系统能在体内测定蛋白质的结合作用，具有高度敏感性。主要是由于：①采用高拷贝和强启动子的表达载体使杂合蛋白过量表达。②信号测定是在自然平衡浓度条件下进行，而如免疫共沉淀等物理方法为达到此条件需进行多次洗涤，降低了信号强度。③杂交蛋白间稳定度可被激活结构域和结合结构域结合形成转录起始复合物而增强，后者又与启动子DNA结合，此三元复合体使其中各组分的结合趋于稳定。④通过mRNA产生多种稳定的酶使信号放大。同时，酵母表型，X-Gal及HIS3蛋白表达等检测方法均很敏感。 酵母双杂交筛选原理 双杂交系统的建立得力于对真核生物调控转录起始过程的认识。细胞起始基因转录需要有反式转录激活因子的参与。80年代的工作表明, 转录激活因子在结构上是组件式的(modular), 即这些因子往往由两个或两个以上相互独立的结构域构成, 其中有DNA结合结构域(DNA binding domain, 简称为DB，？BD)和转录激活结构域(activation domain, 简称为AD), 它们是转录激活因子发挥功能所必需的。单独的DB虽然能和启动子结合, 但是不能激活转录。而不同转录激活因子的DB和AD形成的杂合蛋白仍然具有正常的激活转录的功能。如酵母细胞的Gal4蛋白的DB与大肠杆菌的一个酸性激活结构域B42融合得到的杂合蛋白仍然可结合到Gal4结合位点并激活转录。 Fields等人的工作标志双杂交系统的正式建立。他们以与调控SUC2基因有关的两个蛋白质Snf1和Snf2为模型, 将前者与Gal4的DB结构域融合, 另外一个与Gal4的AD结构域的酸性区域融合。由DB和AD形成的融合蛋白现在一般分别称之为“诱饵”(bait)和“猎物”或靶蛋白(prey or target protein)。如果在Snf1和Snf2之间存在相互作用, 那么分别位于这两个融合蛋白上的DB和AD就能重新形成有活性的转录激活因子, 从而激活相应基因的转

酵母双杂交试验流程

4月4日划线配培养基 TE/LIAC PEG/LIAC 配置培养基（YPD YPDA）取酵母细胞划线 30°生长3天。 需要用品：三角瓶灭菌封口膜酵母提取物蛋白胨 注：以下所有涉及菌的操作均需在超净台中完成。 4月6号星期三 （1）选择2-3mm的单克隆（枪头吸取）放入3-5ml的YPDA液体培养基，30°摇菌200rpm，8h 7号下午开始，过夜培养，次日若菌液浓度达到标准，可先置于4度冰箱保存。 需要用品：200ul灭菌枪头、50ml三角瓶、YPDA液体培养基、摇床。 4月7号星期四 （2）吸取2.5-10ul酵母培养液，加入25ml YPDA液体培养基，摇菌16-20h直到OD值0.15-0.3。 下午4点开始 8号 8点结束 Tips：由于第一次活化的菌夜浓度不一，此处建议设置梯度，分别取2.5、5、10 ul酵母培养液，加入25ml YPDA液体培养基（转化5个以下质粒的话，25ml菌量就够后续使用）。 4月8号星期五 （3）将菌液转移至灭菌的50ml离心管中，用天平配平后，室温下700g离心5分钟。 （4）弃掉上清，加入50ml新鲜的YPDA液体重悬菌体（由于离心转速较低，沉淀易悬起来，故倒掉上清液时要小心操作）。 （5）30°震荡培养，直到OD值达到0.4-0.5 （3-5h）。8号 8点开始下午一点结束进行以下操作之前，配置好TE/LiAc溶液，并准备好冰浴。 （6）将上述菌液转移至一个灭菌的50ml离心管中，用天平配平后，室温下700g离心5分钟。（7）弃掉上清，用30ml无菌水重悬菌体（小心操作）。 （8）再次用天平配平后，室温下700g离心5分钟，弃去上清，加入1.5ml 1.1xTE/LIAC重悬菌体。（9）将上述溶液转移到灭菌的1.5ml EP管中，高速离心15s。 （10）弃去上清，加入600ul 1.1x TE/LIAC，感受态细胞制备完成，置于冰上待用。 需要物品：50ml 灭菌离心管、50ml 三角瓶、1.5ml EP管、5ml灭菌枪头、1ml灭菌枪头、灭菌ddH2O、YPDA液体培养基、1.1x TE/LIAC。 1.1x TE/LIAC 10ML 10xTE 1.1ml 10xliac 1.1ml Dh2O 8.8ml

酵母双杂交的优势及关键点

酵母双杂交的优势及关键点 分子生物学研究尤其是人类基因组计划的迅速发展，为适应对众多基因或蛋白进行功能研究的发展趋势，已出现了很多新技术，酵母双杂交就是其中的一种。酵母双杂交可以简要概括为：基因转录所需的转录因子的两个结构域在两个互作蛋白的吸引下位置靠近，诱导了基因的表达。 蛋白的酵母双杂交实验是以酵母的遗传分析为基础，研究反式作用因子之间的相互作用，具有其独特优势。 1、融合体蛋白之间的相互作用是在真核酵母细胞内进行，蛋白质保持天然的折叠状态，蛋白质间相互作用将更接近于体内的真实水平。 2、双杂交系统的敏感度非常高，蛋白质之间结合常数低至1mmol/L时都可以被侦测。 3、在筛选文库时，双杂交系统能够得到编码互作蛋白的基因序列，省略了其它体外检测蛋白互作方法所必须的蛋白抽提、纯化等繁琐步骤。 经典的酵母双杂交技术的建立的主要关键点在于酵母双杂系统的转录因子和报道株。 一、转录因子 典型的转录因子含有DNA结合区 (DNA-binding domain)、转录调控区 (activation domain)、寡聚化位点(oligomerization site) 以及核定位信号 (nuclear localization signal) 等功能区域。DNA结合区带共性的结构主要有：1）HTH 和 HLH 结构：由两段α-螺旋夹一段β-折叠构成，α-螺旋与β-折叠之间通过β-转角或成环连接，即螺旋-转角-螺旋结构和螺旋-环-螺旋结构。2）锌指结构：多见于 TFIII A 和类固醇激素受体中，由一段富含半胱氨酸的多肽链构成。每四个半光氨酸残基或组氨酸残基螯合一分子 Zn2+，其余约 12-13个残基则呈指样突出，刚好能嵌入 DNA 双螺旋的大沟中而与之相结合。3）亮氨酸拉链结构：多见于真核生物 DNA 结合蛋白的 C 端，与癌基因表达调控有关。由两段α - 螺旋平行排列构成，其α - 螺旋中存在每隔 7 个残基规律性排列的亮氨酸残基，亮氨酸侧链交替排列而呈拉链状，两条肽链呈钳状与 DNA 相结合。 1、酵母双杂系统的转录因子 酵母双杂交技术的建立要归功于Fields对酵母转录因子GAL4的研究，GAL4包括两个彼此分离的结构域.。位于N端1-147位氨基酸残基区段的DNA结合域（DNA binding domain，DNA-BD）和位于C端768-881 位氨基酸残基区段的转录激活域（Activation domain,AD)。DNA-BD能够识别位于GAL4效应基因（GAL4-responsivegene）的上游激活序列(Upstream activating sequence,UAS)，并与之结合。而AD则是通过与转录机构

酵母双杂交实验流程

模块七蛋白质之间的相互作用 1. 实验目的 本实验以重组质粒和酵母细胞为材料，学习检测蛋白质相互作用的基本原理和技术方法。主要介绍酵母双杂交的基本原理与操作技术；让学生了解和掌握酵母双杂交系统的应用；掌握酵母感受态的制备的基本原理和主要的操作步骤。 2. 实验原理 1989年Fields和Song等人根据当时人们对真核生物转录起始过程调控的认识（即细胞内基因转录的起始需要转录激活因子的参与），提出并建立了酵母双杂交系统。该系统作为发现和研究活细胞体内的蛋白质与蛋白质之间的相互作用的技术平台，近几年得到了广泛的运用和发展。 相比于其它蛋白质筛选系统，酵母双杂交系统具有以下优点：（1）检测在真核活细胞内进行，在一定程度上代表细胞内的真实情况。（2）作用信号是在融合基因表达后，在细胞内重建转录因子的作用而给出的，省去了纯化蛋白质的繁琐步骤。（3）检测结果是基因表达产物的积累效应，因而可检测存在于蛋白质之间的微弱或暂时的相互作用。（4）酵母双杂交系统可采用不同组织、器官、细胞类型和分化时期材料构建cDNA文库，能分析细胞质、细胞核及膜结合蛋白等多种不同亚细胞部位及功能蛋白。（5）通过mRNA产生多种稳定的酶使信号放大。同时，酵母表型、X-Gal 及HIS3 蛋白表达等检测方法均很敏感。 酵母双杂交系统也具有一定的局限性。首先，经典的双杂交系统分析蛋白间的相互作用定位于细胞核内，因而限制了该系统对某些细胞外蛋白和细胞膜受体蛋白的研究。酵母双杂交系统的另一个局限性是“假阳性”。在酵母双杂交系统建立的初期阶段，由于仅仅采用β-半乳糖苷酶这一单一的报告基因体系，这种报告基因的表达往往不能十分严谨地被控制，因此容易产生假阳性。由于某些蛋白本身具有激活转录的功能或在酵母中表达时发挥转录激活作用，使DNA结合结构域融合蛋白在无特异激活结构域的情况下也可被激活转录。另外某些蛋白表面含有对多种蛋白质的低亲和力区域，能与其他蛋白形成稳定的复合物，从而引起报告基因的表达，产生“假阳性”结果。产生“假阴性”结果的原因可能有许多蛋白质间的相互作用依赖于翻译后加工如糖基化、磷酸化和二硫键形成，还有些蛋白的正确折叠和功能有赖于某些非酵母蛋白的辅助等。 现在的酵母双杂交系统大都采用多种报告基因，如AH109酵母株含有三类报告基因—ADE2、HIS3、MEL1/lacZ，这三类报告基因受控于三种完全不同、异源性的GAL4-反应元件和三类启动子元件-GAL1、GAL2以及MEL1（如图6-1-1）。通过这种方法就消除了两类最主要的假阳性，一类是融合蛋白可以直接与GAL4结合位点结合或者是在结合位点附近结合所带来的假阳性；另一类是融合蛋白和某种转录因子结合后再结合到特定的TA TA盒上所带来的假阳性。ADE2一种报告基因就已经能够提供较强的营养选择压力，这时选择性地使用HIS3报告基因，一来可以降低假阳性率；二来可以控制筛选的严格性（如果需要筛选与诱饵蛋白具有较强结合的蛋白，就可以同时使用ADE2、HIS3两种报告基因；如果只需要筛选与诱饵蛋白具有中等强度或较弱结合的蛋白，就可以使用ADE2或HIS3两者中的一种）。MEL1和lacZ分别编码α-半乳糖苷酶和β-半乳糖苷酶，可以作用于相应的底物

酵母双杂交

酵母双杂交的原理 Fields 与Song于1989年首先创立。典型的真核生长转录因子（如GAL4），都含有二个不同的结构域: DNA结合结构域(DNA-binding domain)和转录激活结构域(transcription-activating domain)。前者可识别DNA上的特异序列，并使转录激活结构域定位于所调节的基因的上游，转录激活结构域可同转录复合体的其他成分作用，启动它所调节的基因的转录。二个结构域不但可在其连接区适当部位打开，仍具有各自的功能。而且不同两结构域可重建发挥转录激活作用。酵母双杂交系统利用杂交基因通过激活报道基因的表达探测蛋白－蛋白的相互作用。 酵母双杂交的应用 1研究已知蛋白质与蛋白质间的相互作用2确定蛋白质功能区：对基因进行系列突变，通过检测其蛋白质相互作用的变化，确定功能区3确定未知蛋白质间的相互作用：从cDNA文库中与已知蛋白结合的未知蛋白，将cDNA与AD结合，已知蛋白与BD结合，检测报告基因的转录4确定基因治疗中多肽药物的作用机理： 酵母双杂交系统优点 （1）快速、直接分析已知蛋白之间的相互作用及分离新的与已知蛋白作用的配体及其编码基因。（2）作用信号是在融合基因表达后，在细胞内重建转录因子的作用而给出的，省去了纯化蛋白质的繁琐步骤（3）检测在活细胞内进行，可以在一定程度上代表细胞内的真实情况（4）检测的结果可以是基因表达产物的积累效应，因而可检测存在于蛋白质之间的微弱的或暂时的相互作用。（5）酵母双杂交系统可采用不同组织、器官、细胞类型和分化时期材料构建cDNA文库，能分析细胞浆、细胞核及膜结合蛋白等多种不同亚细胞部位及功能的蛋白。6双杂交系统分析蛋白间的相互作用定位于细胞核内，优点： 根据兴趣蛋白的基因序列即可筛选与其作用的目的蛋白。蛋白质在真核细胞内，处于天然状态，蛋白质之间的相互作用符合细胞内情况，即使是两种蛋白质的瞬时结合也可被检测出来。可以直接获得目的蛋白的基因序列，从而可以初步判断目的蛋白的结构和功能。 酵母双杂交系统局限性 1许多蛋白间的相互作用依赖于翻译后加工如糖基化、二硫键形成等，这些反应在核内无法进行。2有些蛋白的正确折叠和功能有赖于其他非酵母蛋白的辅助，这限制了某些细胞外蛋白和细胞膜受体蛋白等的研究。3酵母双杂交系统的一个重要的问题是“假阳性”。4某些蛋白本身具有激活转录功能或在酵母中表达时发挥转录激活作用，使DNA结合结构域杂交蛋白在无特异激活结构域的情况下可激活转录。5某些蛋白表面含有对多种蛋白质的低亲和力区域，能与其他蛋白形成稳定的复合物，从而引起报告基因的表达，产生"假阳性"结果。局限性： ?表达的外源蛋白均为融合蛋白，可能与天然状态不符，造成结果的不准确 ?本身就具有转录激活活性的兴趣蛋白不适合于该系统 ?不能定位于核内的兴趣蛋白不适合于该系统 ?需要翻译后修饰的蛋白不适合该系统 LexA酵母双杂交实验的基本流程 1. 将报告基因p8op-LacZ转化酵母EGY48菌株，用培养基SD/-Ura筛选 2. 同时构建或扩增DNA文库，并纯化足够的质粒以转化酵母细胞 3. 构建DNA-BD/靶蛋白质粒pLexA-X，作为钓饵(bait) 4. 将上述钓饵质粒pLexA-X转化EGY48(p8op-LacZ)细胞株，用SD/-His/-Ura 筛选；并用固体诱导培养基SD/Gal/Raf/-His/-Ura检测此DNA-BD/靶蛋白是否具有直接激活报告基因的活性，以及对酵母细胞是否具有杀伤毒性4-1. 如果pLexA-X 能够自动激活报告基因，则设法去除其激活活性部位、或者将LacZ报告基因整合入基因组，减少半乳糖苷酶的信号作用4-2. 如果pLexA-X虽然不会自动激活报告基因，但对酵母宿主细胞有毒性，则需要与纯化的文库DNA同时转化酵母 5. 如果pLexA-X既不会自动激活报告基因，也不具有毒性，则可以与纯化的文库DNA同时、或顺序转化酵母细胞，并检测质粒转化效率。 5-1. 用SD/-His/-Trp/-Ura培养基选择阳性共转化子，并扩增，使宿主细胞中的质粒在诱导前达到最大拷贝数5-2. 上述重组子转至含X-gal的固体诱导培养基SD/Gal/Raf/-His/-Trp/-Ura/-Leu，观察LacZ及Leu报告基因的表达情形，蓝色克隆即为阳性。白色克隆为假阳性，说明Leu虽有表达，但半乳糖苷酶无表达。5-3. 同时用LacZ、Leu两个报告基因的目的，是为了尽可能消除实验的假阳性误差，譬如：AD融合蛋白不与目标蛋

生化复习资料：酵母单杂交技术

酵母单杂交技术（Yeast One-hybrid method） 一、原理 酵母单杂交方法是根据DNA结合蛋白（即转录因子）与DNA顺式作用元件结合调控报道基因表达的原理来克隆编码目的转录因子的基因（cDNA）。该方法也是在细胞内（in vivo）分析鉴定转录因子与顺式作用元件结合的有效方法。将已知的特定顺式作用元件构建到最基本启动子（minimal promoter，Pmin)上游，Pmin启动子下游连接报道基因。进行c DNA 融合表达文库筛选时，编码目的转录因子的c DNA 融合表达载体被转化进入酵母细胞后，其编码产物（转录因子）与顺式作用元件结合，就可以激活Pmin启动子，并促使报道基因表达。根据报道基因的表达，筛选出与已知顺式元件结合的转录因子。 二、实验步骤 ①构建报道子载体：将已知的特定顺式作用元件按同一方向随机串联到一个最小启动子（minimal promoter，Pmin）上游，其下游连有报道基因； ②将构建好的报道子载体转化酵母细胞筛选合适的3-AT浓度； ③提取总RNA，合成c DNA双链； ④将报道子、c DNA和融合表达载体共转化到酵母中，在相应的缺陷性SD培养基上进行筛选阳性克隆； ⑤对阳性克隆进行鉴定，去除假阳性克隆； ⑥对所获得的阳性克隆进行测序，为进一步分析打下基础。如可进一步分析DNA确切的结合位点。 三、图片分析 1、选择YM4271[ pHISi3NF4] 克隆株重复进行3-AT 梯度试验，在没有3-AT的SD/-His平板上生长状态很好，在15mM 3-AT存在下被明显抑制，而在30mM 3-AT存在下完全不能生长。故选择15mM为筛库实验的3-AT工作浓度。 2、经9天培养，在SD/-Leu/-His/ +15mM[3-AT]选择培养基上共长出351个大小不同的阳性候选克隆。取100个菌落划线于30mM 3-AT和60mM[3-AT]平板，仅有1个克隆被淘汰。证实15mM[3-AT]的选择是正确的。挑取阳性候选克隆菌落提取酵母质粒并转化E .coli Top 10F'后，酶切鉴定，共得到31个初筛阳性克隆。 四、严谨性分析 1、为了克服His3基因的渗漏表达对筛库实验结果的影响，我们选择克隆株重复进行3-AT 梯度试验。菌株在没有3-AT的SD/-His平板上生长状态很好，在15mM 3-AT下被明显抑制，

酵母双杂交操作步骤

（酵母菌储存在-70℃中，引物和质粒DNA储存在-20℃中） 概念： 1. 次序转化:指的是先将一种质粒转化进酵母中（常是DNA-BD/bait plasmid），在选择培养基中选择出阳性克隆，之后再将另外一个质粒（AD fusion library）转化进去。优点：就是比共转化使用更少的质粒DNA，也就是节约质粒DNA。 2. 共同转化：将两种质粒一起转化进酵母中。优点：比次序转化更容易操作。 pGBKT7----的选择物是：kanamycin（卡那霉素） pGADT7----的选择物是：ampicillin (氨苄西林) 各种SD培养基： 1)SD/-ade（腺嘌呤）/-leu（亮氨酸）/-trp（色氨酸）/-his （组氨酸）(1000 ml)（“四 缺”） 酵母氮源（YNB）： ; -ade/-leu/-trp/-his DO supplement 0.60g （购买来就配好的） ; 葡萄糖20g (即2%) 2)SD/-leu/-trp/-his (1000 ml) 酵母氮源（YNB）： ; -leu/-trp/-his DO supplement 0.62g ; （购买来就配好的） 葡萄糖 20g. (即2%) 3)SD/-leu/-trp (1000 ml) （“二缺”） 酵母氮源（YNB）： ; -ade/-leu/-trp/-his DO supplement 0.64g （购买来就配好的）; 葡萄糖 20g (即2%) 4)SD/-leu (1000 ml) 酵母氮源（YNB）： ; -leu DO supplement 0.69g ; （购买来就配好的） 葡萄糖 20g (即2%) 5)SD/-trp (1000 ml) 酵母氮源（YNB）： ; -ade/-leu/-trp/-his DO supplement 0.74g ; （购买来就配好的） 葡萄糖 20g (即2%) 注意：YNB有两种，一种含有硫酸胺，另外一种不含硫酸胺。我们这用的是含硫酸铵的。（买来就加进去了的）。如果不含硫酸铵，那么要在终浓度%的YNB中再加入%的硫酸铵，即最终在1000 ml溶液中加入总量为的YNB与硫酸铵。

酵母单杂交技术

酵母单杂交(yeast one hybrid)技术 (2013-03-23 05:24:00) 转载▼ 分类：分子生物学专业 标签： 酵母单杂交 gal4蛋白 酵母双杂交技术 报告基因 文化 酵母单杂交(yeast one hybrid)技术，是体外分析DNA与细胞内蛋白质相互作用的一种方法，通过对酵母细胞内报告基因表达状况的分析，来鉴别DNA结合位点并发现潜在的结合蛋白基因，或对DNA结合位点进行分析。 运用此技术，能筛选到与DNA结合的蛋白质，并可直接从基因文库中得到编码该蛋白质的核苷酸序列，而无需复杂的蛋白质分离纯化操作，故在蛋白研究中，具有一定的优势；而且，酵母属真核细胞，通过酵母系统得到的结果，比其他体外技术获得的结果，更能体现真核细胞内基因表达调控的真实情况。 1 酵母单杂交技术的原理 酵母单杂交技术，最早是1993年由Li et al从酵母双杂交技术发展而来，酵母双杂交技术通过对报告基因的表型进行检测以实现对蛋白质间相互作用的研究，而酵母单杂交技术则通过对报告基因的表型检测，分析DNA、蛋白之间的相互作用，以研究真核细胞内的基因表达调控。 目前认为真核生物的转录起始，需要转录因子的参与。这些转录因子通常由一个DNA 特异性结合功能域和一个或多个与其他调控蛋白相互作用的激活功能域组成，即DNA结合结构域(DNA-binding domain, BD)和转录激活结构域(activation domain, AD)。 用于酵母单杂交系统的酵母GAL4蛋白即是一种典型的转录因子。 研究表明GAL4的DNA结合结构域，靠近羧基端,含有几个锌指结构,可激活酵母半乳糖苷酶的上游激活位点(UAS);而转录激活结构域，可与RNA聚合酶或转录因子TFIID相互作用，提高RNA聚合酶的活性。 在这一过程中，DNA结合结构域和转录激活结构域可完全独立地发挥作用。据此，我们可将GAL4的DNA结合结构域置换为其他蛋白，只要它能与我们想要了解的目的基因相互作用，就照样可以通过其转录激活结构域激活RNA聚合酶，从而启动对下游报告基因的转录。 正是基于这一理论，酵母单杂交系统由2部分组成： (1)将文库蛋白片段，与GAL4转录激活域融合表达的cDNA文库质粒； (2)含有目的基因和下游报告基因的报告质粒。