生化科技学系微生物学组专题讨
生化科技學系微生物學組專題討論
題目：Latent Membrane Protein 1 of Epstein-Barr Virus Activates the hTERT Promoter and Enhances Telomerase Activity in B Lymphocytes
作者：Liliana Terrin, Jessica Dal Col, Enrica Rampazzo, Paola Zancai, Moreno Pedrotti, Grazia Ammirabile, Stefano Bergamin, Silvana Rizzo, Riccardo Dolcetti, and
Anita De Rossi
文章來源：Journal of Virology, 82:10175-10187, 2008
演講人：Yi-Ting Lin 林怡廷 B94B02013
指導老師：Li-Kwan Chang PhD 張麗冠博士
演講日期：December 16th, 2008
演講地點：The 6th classroom
摘要
Epstein-Barr Virus (EBV)為疱疹病毒科gamma亞科的病毒，接近九成的人類受其感染，與淋巴及上皮細胞組織的惡性腫瘤有密切相關。當EBV進入人體細胞後，絕大部分都以潛伏的狀態存在於細胞中，但有少部分的病毒會自發性的進入溶裂循環 (lytic cycle)，產生大量的EB病毒顆粒並釋放到宿主細胞外，感染其它細胞。LMP1 (latent membrane protein 1)為EBV潛伏期基因產物，是一種很強的oncoprotein，也是EBV使B細胞進入不死化 (immortalization)的重要蛋白質。端粒子酵素 (telomerase)是一種反轉錄酶，分成RNA部分 (hTR)和蛋白質部分(hTERT)，可以在染色體末端的端粒子 (telomere)重複接上TTAGGG片段，被認為與細胞壽命長短相關。本研究首先證實LMP1可以增加hTERT的轉錄活性和端粒子酵素活性，接著發現LMP1可以促使ERK1/2磷酸化，證實LMP1藉由p42/p44 MAPK路徑誘導hTERT的mRNA表現和增加端粒子酵素活性。最後，作者以BAY 11-7082抑制NF- B表現，發現在含有LMP1的BJAB/LMP1細胞中，其抑制效果比沒有LMP1的BJAB細胞差，證實LMP1是藉由NF- B調控hTERT的表現。
Keywords: LMP1, telomerase, hTERT, ERK1/2, MAPK pathway
前言
本研究之重要性
EBV感染了逾九成的人類族群，與鼻咽癌等癌症有重要關聯，LMP1為EBV潛伏期基因產物，位於細胞膜上，具有6個穿膜區，是一種很強的oncoprotein，可以使B細胞進入不死化 (immortalization)。而端粒子酵素 (telomerase)的活性也被認為與細胞壽命長短有關，藉由研究LMP1和hTERT的關聯性，可以建構出EBV的致癌機制，並且從中尋找癌症的治療方法。
前人作過的研究
先前的研究指出LMP1具有6個穿膜區 (transmembrane domains)，其功能與TNF 受器(如：CD40)相似[1, 2]，可以藉由活化TNF receptor-associated factor 訊息傳遞路徑誘導NF- B表現[3, 4]。除此之外，LMP1還可以活化其它訊息路徑，包括c-Jun NH2-terminal kinase [5]、p38 mitogen-activated protein kinase (MAPK)
[6]、extracellular signal-regulated kinase (ERKs) [7, 8]、Janus kinase [9]和
phosphatidylinositol 3-kinase [10]，是一種具有多型性的oncoprotein。另外，也有研究指出EGF可以藉由MAPK signaling pathway活化端粒子酵素[11]。
作者為何要作本研究
作者由文獻中發現端粒子酵素可以藉由MAPK路徑活化，而LMP1可以藉由MAPK路徑調控下游的轉錄因子 (transcription factor)，推論LMP1也許可以藉由MAPK路徑調控端粒子酵素的活性。而作者在先前的研究中指出在細胞中大量表現hTERT時會抑制EBV複製並且促進B細胞生長，證實hTERT會以多種訊息傳遞路徑促使B細胞轉形，但是詳細的調控機制還不清楚。因此作者希望在此研究中探討LMP1、hTERT與端粒子酵素活性之間的關係，並了解其中的作用機制。
本研究欲完成之項目
作者用可以表現LMP1的細胞偵測hTERT和端粒子酵素活性，證實LMP1會增加hTERT的轉錄活性和端粒子酵素的活性後，接著用西方點墨法觀察LMP1是否藉由p42/p44 MAPK傳導路徑影響hTERT表現。最後再觀察LMP1藉由該傳導路徑影響哪一個轉錄因子 (transcription factor)，進而影響hTERT表現。藉由上述實驗，作者建構出LMP1與hTERT表現的相關性以及調節機制。
材料與方法
細胞株
BJAB和Ramos為不含EBV的細胞株，BJAB/LMP1和Ramos/LMP1細胞可以表現LMP1。4134 LCL細胞由感染B95.8 EB病毒株的健康宿主的血液取得。
BJAB、BJAB/LMP1和4134 LCL細胞以含有10%牛血清(fetal calf serum, FCS)的RPMI 1640培養液培養；Ramos和Ramos/LMP1以含有10%牛血清的Iscove’s modified Dulbecco’s medium培養。
反轉錄PCR，real-time PCR
1 g的mRNA以廠商提供的SuperScript III RNase reverse transcriptase assay (Invitrogen)反轉錄成cDNA。PCR以10 l的cDNA、700nM的引子、總體積50 l的混合物，以90℃三十秒、55℃三十秒、72℃三十秒重複35個循環。 端粒子酵素活性偵測 (PCR-based telomeric repeat amplification protocol, TRAP assay)
以1 g的細胞萃取端粒子酵素 (telomerase)，加入M2引子作為基質，端粒子酵素可以在該基質接上TTAGGG片段，之後將產物經由PCR放大，進行電泳，
以Sybergreen 偵測，即可看到許多相差6 bp的DNA片段。
RNA干擾
以4.5×105個細胞送入抑制LMP1的siRNA (siLMP1)或控制組siRNA
(siScramble)。
免疫點墨法
細胞加入lysis buffer在冰上作用一小時打破，離心收取上清液，以Bio-Rad Bradford protein assay偵測蛋白質濃度。
結果與討論
LMP1可以增加B細胞中hTERT的表現
利用real-time PCR偵測BJAB、BJAB/LMP1、Ramos和 Ramos/LMP1四種細胞中hTERT-AT與hTERT-FL的含量，可以發現在含有LMP1的BJAB/LMP1和Ramos/LMP1細胞中hTERT-AT與hTERT-FL的含量皆比沒有LMP1的細胞(BJAB與Ramos)多(圖一B)。利用TRAP assay偵測端粒子酵素活性，結果發現可以表現LMP1的BJAB/LMP1與Ramos/LMP1細胞有較高的端粒子酵素活性(圖一C)。
利用siRNA抑制LMP1表現導致hTERT轉錄降低
利用針對LMP1的siRNA (siLMP1)使4134 LCL細胞中的LMP1不表現(圖二
A、B)，再以real-time PCR偵測hTERT-FL的含量，結果發現經過siLMP1處理
過的4134 LCL細胞，其hTERT-FL的表現量降低(圖二C)。
LMP1藉由p42/p44 MAPK路徑誘導hTERT mRNA表現和增加端粒子酵素活性
將BJAB與BJAB/LMP1細胞在10%的牛血清(fetal calf serum, FCS)和沒有牛血清的情況下培養24小時，用西方點墨法以pERK1/2、ERK1/2與 -tubulin抗體偵測，結果發現不論在有牛血清或是沒有牛血清的環境下，LMP1皆可以增加ERK1/2的磷酸化(圖三A)。BJAB與BJAB/LMP1細胞加入ERK1/2的抑制物UO126 (10 M或20 M)培養24小時後，用西方點墨法以pERK1/2、ERK1/2與 -tubulin抗體偵測，發現BJAB與BJAB/LMP1細胞中的pERK1/2皆明顯降低(圖三B)；再以real-time PCR偵測hTERT-FL和hTERT-AT的含量，結果可以看到以UO126作用後，BJAB與BJAB/LMP1細胞中的hTERT-FL和hTERT-AT 的含量都有減少，但是在BJAB/LMP1細胞中其減少的幅度較BJAB細胞小(圖三C、D)。另外，以TRAP assay偵測BJAB與BJAB/LMP1細胞加入UO126後的端粒子酵素活性，可以發現BJAB/LMP1細胞的端粒子酵素活性比BJAB細胞高(圖三E)。以上結果證實了LMP1是藉由p42/p44 MAPK路徑誘導hTERT mRNA表現和增加端粒子酵素活性。
LMP1藉由NF- B調控hTERT mRNA表現和增加端粒子酵素活性將BJAB與BJAB/LMP1細胞加入NF- B抑制物BAY 11-7082 (1 或10 M)培養1到3天，以real-time PCR和TRAP assay偵測hTERT-FL、hTERT-AT
含量與端粒子酵素活性，實驗結果指出BJAB與BJAB/LMP1細胞中hTERT的含量都有減少，但是BJAB/LMP1細胞中hTERT減少的幅度比BJAB細胞低(圖四C、D)，而BJAB與BJAB/LMP1細胞中的端粒子酵素活性皆降低，但是BJAB/LMP1細胞中端粒子酵素活性減少的幅度比BJAB細胞低(圖四E)，推論是因為LMP1增加了NF- B的活化和hTERT的表現，證實LMP1藉由NF- B調控hTERT mRNA表現和增加端粒子酵素活性。
參考文獻
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圖表
圖一、LMP1可以增加B細胞中hTERT的表現。(B)以real-time PCR偵測BJAB、BJAB/LMP1、Ramos與Ramos/LMP1細胞中hTERT-FL和hTERT-AT的含量。(C)以TRAP assay偵測BJAB、 BJAB/LMP1、Ramos與Ramos/LMP1細胞的端粒子酵素活性。TL：telomerase ladder；ITAS：internal telomerase assay standard。
圖二、siRNA抑制LMP1表現導致hTERT轉錄降低。將抗LMP1的siRNA (siLMP1) (200nM和400nM)或控制組siRNA (siScramble)送入4134 LCL細胞中培養48和72小時。(A)以反轉錄PCR偵測LMP1與GAPDH的mRNA含量。(B)以西方點墨法偵測LMP1的含量， -tubulin作為樣品對照組。(C)以real-time PCR偵測hTERT-FL 含量。
圖三、LMP1參與ERK1/2 pathway，活化hTERT。BJAB與BJAB/LMP1細胞在10%的牛血清(fetal calf serum, FCS)和沒有牛血清(A)或加入UO126 (10 M或20 M) (B)的情況下培養24小時，用西方點墨法以pERK1/2、ERK1/2與 -tubulin 抗體偵測。BJAB與BJAB/LMP1細胞加入UO126後培養7、24和48小時，以real-time PCR偵測hTERT-AT (C)及hTERT-FL (D)的含量；以TRAP assay偵測端粒子酵素活性(E)。TL：telomerase ladder；ITAS：internal telomerase assay standard。
圖四、LMP1藉由NF- B活化hTERT。BJAB與BJAB/LMP1細胞以1 和
10 M的BAY 11-7082培養24、48與72小時後，以real-time PCR偵測hTERT-AT
(C)及hTERT-FL (D)的含量，圖表以相對於未加藥處理的細胞之百分比表示；以以TRAP assay偵測端粒子酵素活性(E)。TL：telomerase ladder；ITAS：internal telomerase assay standard。
八种常用生化实验步骤
实验一基因的PCR扩增技术 一、实验目的与原理简介 聚合酶链式反应（polymerase chain reaction）是体外克隆基因的重要方法，它可在几个小时内使模板分子扩增百万倍以上。因此能用于从微量样品中获得目的基因，同时完成了基因在体外的克隆，是分子生物学及基因工程中极为有用的研究手段。 常规PCR反用于已知DNA序列的扩增，具体可分为三个主要过程：一、变性。通过升高温度使DNA双链模板分子中氢断裂，形成单链DNA分子，温度为94℃，时间1min。二、复性。降低温度使DNA单链分子同引物结合。温度为55℃，时间1min。三、延深。升高温度，在DNA聚合酶最佳活性的条件下在引物3端加入dNTP，实现模板的扩增，温度为72℃，时间2min。同时第一步变性前要在94℃下预变性5分钟，使DNA双链完全解开。经过 25-35个循环之后，在72℃下继续延伸10分钟。 PCR反应包含的七种基本成分： 1）热稳定性DNA聚合酶：Taq DNA聚合酶是最常适用的酶，商品化Taq DNA酶的特异性活性约为80000单位/mg. 2）寡核苷酸引物：寡核苷酸引物的设计是影响PCR扩增反应的效率与特异性的关键因素。 3）脱氧核苷三磷酸（dNTP）：标准的PCR反应体系应包括4种等摩尔浓度的脱氧核苷三磷酸，即dATP、dTTP、dCTP和dGTP。每种dNTP的浓度一般在200-250μl之间，高浓度的dNTP对扩增反应会起抑制作用，可能是dNTP与Mg2+螯合有关。 4）二价阳离子：一般需要Mg2+来激活热稳定的DNA聚合酶，由于dNTP与寡聚核酸结Mg2+合，因而反应体系中阳离子的浓度一般要超过dNTP和引物来源的磷酸盐基团的摩尔浓度。Mg2+的最佳浓度为1.5mmol/L。 5）维持PH值的缓冲液：用Tris-Cl在室温将PCR缓冲液的PH值调至8.3-8.8之间，标准PCR缓冲液浓度在10mmol/L。在72℃温育时，反应体系的温度将下降1个多单位，致使缓冲液的PH值接近7.2。 6）一价阳离子：标准PCR缓冲液内含有50mmol/L的KCl，它对扩增大于500bp长度的DNA是有益的。 7）模板DNA：含有靶序列的模板DNA可以以单链或双链形式加入到PCR混合液中，闭环DNA的及增效率略低于线性DNA。 学习PCR反应的基本原理和基本技术。 了解引物设计的一般要求。 二、材料和试剂 10Х扩增缓冲液 4种dNTP贮存液（20mmol/L，PH 8.0） Tap DNA 聚合酶 5端引物（20μmol/L）及3端引物（20μmol/L） 模板DNA 琼脂糖凝胶 PCR仪（Bio-Rad公司）移液枪（0.5-10μL 5-50μL）枪头微量移液管 一、实验操作 1）按照以下次序，将各成分加到微量离子管内混合： 10Х扩增缓冲液2.5μl M g2+1.5μl 5端引物1μl
《生物制药技术》实验指导-实验三、四
《生物制药技术》实验指导 实验三四环素、金霉素的薄层层析鉴定（验证型） 实验目的： 掌握薄层层析的原理，四环素族抗生素的定性鉴定方法。 实验原理： 层析（色谱，chromatograpby）是相当重要、且相当常见的一种技术，在把微细分散的固体或是附着于固体表面的液体作为固定相，把液体（与上述液体不相混合的）或气体作为移动相的系统中（根据移动相种类的不同，分为液相层析和气相层析二种），使试料混合物中的各成分边保持向两相分布的平衡状态边移动，利用各成分对固定相亲和力不同所引起的移动速度差，将它们彼此分离开的定性与定量分析方法，称为层析，亦称色谱法。用作固定相的有硅胶、活性炭、氧化铝、离子交换树脂、离子交换纤维等，或是在硅藻土和纤维素那样的无活性的载体上附着适当的液体。将作为固定相的微细粉末状物质装入细长形圆筒中进行的层析称为柱层析（column chromatography），在玻璃板上涂上一层薄而均的支持物（硅胶、纤维素和淀粉等）作为固定相的称为薄层层析（thin layer chromatography），或者用滤纸作为固定相的纸上层析。层析根据固定相与溶质（试料）间亲和力的差异分为吸附型、分配型、离子交换型层析等类型。但这并不是很严格的，有时常见到其中间类型。此外，近来也应用亲和层析，即将与基质类似的化合物（通常为共价键）结合到固定相上，再利用其特异的亲和性沉淀与其对应的特定的酶或蛋白质。 分配层析在支持物上形成部分互溶的两相系统。一般是水相和有机溶剂相。常用支持物是硅胶、纤维素和淀粉等亲水物质，这些物质能储留相当量的水。被分离物质在两相中都能溶解，但分配系数不同，展层时就会形成以不同速度向前移动的区带。一种溶质在两种互不混溶的溶剂系统中分配时，在一定温度下达到平衡后，溶质在固定相和流动相溶剂中的浓度之比为一常数，称为分配系数。当欲被分离的各种物质在固定相和流动相中的分配系数不同时，它们就能被分离开。分配系数大的移动快（阻力小）。 薄层层析是以薄层材料为支持物，在密闭容器中，样品在其上展开。当斑点不易为肉眼观察时，可利用适当的显色剂，或通过紫外灯下产生荧光的方法进行观察。通过这种展开操作，各成分呈斑点状移动到各自的位置上，再根据Rf值的测定进行鉴定。薄层色谱法具有分离与鉴定的双重功能，通过薄层图谱与对照品的图谱相比较，除了能鉴出有效成分或特征成分外，还以完整的色谱图作为一个整体对制剂加以鉴别。薄层色谱分析法由于简便、快速，能有效地、直观地反映药品地真实性、稳定性，现已成为药物制剂的鉴别和质量控制的行之有效的方法之一。薄层层析是鉴别抗生素的方法之一，层析后进行显色，并绘制层析图谱，根据层析图谱对抗生素进行鉴定。本实验以四环素、金霉素标准品溶液作为对照对发酵液进行鉴定。 材料、试剂和器材： 仪器和设备： 玻璃层析缸；层析板（薄层层析硅胶烟台芝罘区黄务硅胶开发实验厂有售）；吹风机；紫外投射仪；离心机（1.5ml转子） 试剂：
2015高级生物化学及实验技术试题答案
高级动物生化试题 问答题： 1. 简述非编码RNA（non-coding RNA）的种类、结构特点及其主要功能。 非编码RNA的种类结构和功能 1tRNA转运RNA（transfer RNA，tRNA） 结构特征之一是含有较多的修饰成分，核酸中大部分修饰成分是在tRNA中发现的。修饰成分在tRNA分子中的分布是有规律的，但其功能不清楚。5’末端具有G（大部分）或C。3’末端都以ACC的顺序终结。有一个富有鸟嘌呤的环。有一个反密码子环，在这一环的顶端有三个暴露的碱基，称为反密码子（anticodon）.反密码子可以与mRNA链上互补的密码子配对。有一个胸腺嘧啶环。tRNA具有三叶草型二级结构以及“L”型三级结构，tRNA 的不同种类及数量可对蛋白质合成效率进行调节。tRNA负责特异性读取mRNA中包含的遗传信息，并将信息转化成相应氨基酸后连接到多肽链中。 tRNA为每个密码子翻译成氨基酸提供了结合体，同时还准确地将所需氨基酸运送到核糖体上。鉴于tRNA在蛋白质合成中的关键作用，又把tRNA称作第二遗传密码。tRNA还具有其他一些特异功能，例如，在没有核糖体或其他核酸分子参与下，携带氨基酸转移至专一的受体分子，以合成细胞膜或细胞壁组分；作为反转录酶引物参与DNA合成；作为某些酶的抑制剂等。有的氨酰-tRNA还能调节氨基酸的生物合成。 2rRNA核糖体RNA（ribosomal RNA, rRNA） 核糖体RNA是细胞中最为丰富的RNA，在活跃分裂的细菌细胞中占80%以上。
他们是核糖体的组分，并直接参与核糖体中蛋白质的合成。核糖体是rRNA 提供了一个核糖体内部的“脚手架”，蛋白质可附着在上面。这种解释很直接很形象，但是低估了rRNA在蛋白质合成中的主动作用。较后续的研究表明，rRNA并非仅仅起到物理支架作用，多种多样的rRNA可起到识别、选择tRNA以及催化肽键形成等多种主动作用。例如：核糖体的功能就是,按照mRNA的指令将氨基酸合成多肽链。而这主要依靠核糖体识别tRNA 并催化肽键形成而实现。可以说核糖体是一个大的核酶( ribozyme)。而核糖体的催化功能主要是由rRNA来完成的,蛋白质并没有直接参与。 3 tmRNA tmRNA主要包括12个螺旋结构和4个“假结”结构，同时还包括一 个可译框架序列的单链RNA结构。tmRNA中H1由5’端和3’端两个末端形成，与tRNA的氨基酸受体臂相似。H1和H2的5’部分之间有一个由10-13nt 形成的环，类似tRNA中的二氢尿嘧啶环，称为“D”环。H3和H4，H6和H7，H8和H9，H10和H11之间分别形成Pk1，pK2，pK3，pK4。H4和H5之间则由一段包含编码标记肽ORF的单链RNA连接。H12由5个碱基对和7nt 形成的环组成，类似tRNA中的TΨC臂和TΨC环，称为“T”环。tmRNA 结构按照功能进行划分可分为tRNA类似域（TLD）和mRNA类似域（MLD），TLD主要包括H1,H2,H12,“D”环和“T”环，MDL则包括ORF和H5，这两部分分别具有类似tRNA和mRNA的功能。tmRNA是一类普遍存在于各种细菌及细胞器（如叶绿体，线粒体）中的稳定小分子RNA。它具有mRNA分子和tRNA分子的双重功能，它在一种特殊的翻译模式——反式翻译模式中发挥重要作用。同时，它与基因的表达调控以及细胞周期的调控等生命过程密切相关，是细菌体内蛋白质合成中起“质量控制”的重要分子之一。识别翻译或读码有误的核糖体，也识别那些延迟停转的核糖体，介导这些有问
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污水处理生化调试技术方案 一污泥的培养 方法有同步与异步培养与接种,同步是培奍与驯化同时进行或交替进行，异步是先培后驯化，接种是利用类似污水的剩余污泥接种。 活性污泥可用糞便水经曝气培养而得，因为粪便污水中，细菌种类多，本身含有的营养丰富，细菌易于繁殖。?通常为了缩短培菌周期，我们会选择接种培养。?先说粪便水培菌?具体步骤:?将经过过滤的粪便水投入曝气池,再用生活污水或河水稀释，至BOD约为3００-400，进行连续曝气。这样过二,三天后,为补充微生物的营养物质和排除由微生物产生的代谢产物,应进行换水,换水根据操作情况分为间断和连续操作。?１.间断操作：?当第一次加料曝气并出现模糊的活性污泥绒絮后,就可停止曝气，使混合液静止沉淀，经1－１.５小时后排放上清液,把排放的上清液约占总体积的60-７0%。?然后再加生活污水和粪便水,这时的粪便水可视曝气池内的污泥量来调整,这样一直下去，直至ＳV达到30%。一般需2周，水温低时时间要延长。 在每次换水时，从停止曝气,沉淀到重新曝气的总时间要控制在２小时之内为宜?成熟的污泥应具有良好的混凝，沉降性能，污泥内有大量的菌胶菌和终生?纤毛类原生动物，如钟虫,等枝虫,盖纤虫等,并可使污水的生化需氧量去除率达90%左右 2.连续操作：?在第一次加料出现绒絮后,就不断地往曝气池投加生活污水或河水,添加粪便水的控制原则与间断投配相同。往曝气池的投加的水量,应保证池内的水量能每天更换一次,随着培奍的进展，逐渐加大水量使在培养后期达到每天更换二次。在曝气池出水进入二次沉淀池后不久(0．5-1）就开始回流污泥,污泥的回流量为曝气池进水量的5０%?驯化的方法：可在进水中逐渐增加被处理的污水的比例，或提高浓度,使生物逐渐适应新的环境开始时，被处理污水的加入量可用曝气池设计负荷的20-３0%，达到较好的处理效率后,再继续增加，每次以增加设计负荷的１0-20％为宜，每次增加负荷后，须等生物适应巩固后再继续增加，直至满负荷为止。?如果被处理工业污水中,缺氮和磷以及其它营养物时，可根据BOD：N：P为100:5:1的比例来调整。?个人认为在此阶段，必要的超赿管路要具备，工艺没设计的可用消防管代替。 而且各种分析要跟上去,和种参数需及时测定,特别是镜检,因为有经验的人可能通过镜检和数据就可以很好的完成任务,另外良好的心理素质也比较重要,有些现象要果断处理,有些则需等侍再认定上面是异步法,同步就是在污泥培养过程中，不断加入工业污水，使污泥在增长过程中逐渐适应工业污水的环境，这样虽可缩短培养和驯化的时间,但在这一过程中发生的问题，又缺实践经验则难以判断问题出在哪一个环节上。 若有条件,就是接种培养，这样可缩短时间，若是相似的污水的污泥,更可提高驯化效果。 二、试运行
生化实验报告资料
生物化学实验报告 姓名：吴瑞 学号： 3120016004 专业年级： 2012级临床医学（妇幼保健) 组别：第四实验室 生物化学与分子生物学实验教学中心
一、实验室规则 1．实验前应认真预习实验指导，明确实验目的和要求，写出预实验报告。 2．进入实验室必须穿白大衣。严格遵守实验课纪律，不得无故迟到或早退。不得高声说话。严禁拿实验器具开玩笑。实验室内禁止吸烟、用餐。 3．严格按操作规程进行实验。实验过程中自己不能解决或决定的问题，切勿盲目处理，应及时请教指导老师。 4．严格按操作规程使用仪器，凡不熟悉操作方法的仪器不得随意动用，对贵重的精密仪器必须先熟知使用方法，才能开始使用；仪器发生故障，应立即关闭电源并报告老师，不得擅自拆修。 5．取用试剂时必须“随开随盖”，“盖随瓶走”，即用毕立即盖好放回原处，切忌“张冠李戴”，避免污染。 6．爱护公物，节约水、电、试剂，遵守损坏仪器报告、登记、赔偿制度。 7．注意水、电、试剂的使用安全。使用易燃易爆物品时应远离火源。用试管加热时，管口不准对人。严防强酸强碱及有毒物质吸入口内或溅到别人身上。任何时候不得将强酸、强碱、高温、有毒物质抛洒在实验台上。 8．废纸及其它固体废物严禁倒入水槽，应倒到垃圾桶内。废弃液体如为强酸强碱，必须事先用水稀释，方可倒入水槽内，并放水冲走。 9．以实事求是的科学态度如实记录实验结果，仔细分析，做出客观结论。实验失败，须认真查找原因，而不能任意涂改实验结果。实验完毕，认真书写实验报告，按时上交。 10．实验完毕，个人应将试剂、仪器器材摆放整齐，用过的玻璃器皿应刷洗干净归置好，方可离开实验室。值日生则要认真负责整个实验室的清洁和整理，保持实验整洁卫生。离开实验室前检查电源、水源和门窗的安全等，并严格执行值日生登记制度。
华中科技大学2003级五年制2002级德医专业生物化学期末考试试题A
华中科技大学2003级五年制2002级德医专业生物化学期末考试试题A 华中科技大学2003级五年制、2002级德医专业生物化学试卷（A） 班级：学号：姓名： 一、选择题 （一）单选题（从四个备选答案中选出一个最佳答案，并在答卷纸上把相应的英文字母涂黑。 每小题0.5分，共20分。） 1.下列描述血红蛋白概念正确的是： A. 血红蛋白氧解离曲线为S形 B. 血红蛋白不属于变构蛋白 C. 1个血红蛋白可与1个氧分子可逆结合 D. 血红蛋白是单亚基球蛋白 2.有关蛋白质三级结构的描述，错误的是： A. 具有三级结构的多肽链都有生物学活性 B. 亲水基团多位于三级结构的表面 C. 三级结构的稳定性由次级键维持 D. 三级结构是单体蛋白质或亚基的空间结构 3.常出现于肽链转角结构中的氨基酸为： A. 半胱氨酸 B. 脯氨酸 C. 丙氨酸 D. 谷氨酸 4.核酸对紫外线的吸收是由哪一种结构产生的 A. 碱基 B. 核糖 C. 磷酸 D. 脱氧核糖 5.含有稀有碱基比例较多的核酸是： A. rRNA B. 线粒体DNA C. tRNA D. mRNA 6.磺胺类药物的类似物是： A. 四氢叶酸 B. 二氢叶酸 C. 对氨基苯甲酸 D. 叶酸
7.已知某种酶的K m值为0.05mol/L，试问要使此酶所催化的反应速度达最大反应速度 的80%时底物浓度应是多少？ A. 0.04mol/L B. 0.05mol/L C. 0.1mol/L D. 0.2mol/L 8.在血糖偏低时，大脑仍可摄取葡萄糖而肝脏则不能，其原因是： A. 胰岛素的作用 B. 己糖激酶的K m低 C. 葡萄糖激酶的K m低 D. 血脑屏障在血糖低时不起作用 9.下列哪种物质缺乏可引起血液丙酮酸含量升高？ A. 硫胺素 B. 叶酸 C. 吡哆醛 D. 维生素B12 10.在糖酵解过程中，下列哪个酶催化的反应是不可逆的？ A. 醛缩酶 B. 烯醇化酶 C. 丙酮酸激酶 D. 磷酸甘油酸激酶 11.下列哪种糖代谢途径既不生成ATP或UTP也不消耗ATP或UTP？ A. 糖酵解 B. 糖原合成 C. 糖异生 D. 糖原分解 12.不能使甘油磷酸化的组织器官是： A. 肝脏 B. 肾脏 C. 小肠 D. 脂肪组织 13.脂酸合成的限速酶是： A. HMG-CoA合成酶 B. HMG-CoA还原酶 C. 乙酰CoA羧化酶 D. 肉碱脂酰转移酶 14.合成前列腺素的前体是： A. 软脂酸 B. 硬脂酸 C. 亚油酸 D. 花生四烯酸 15.脂蛋白脂肪酶的激活剂是： A. apoAI B. apoB100 C. apoCⅡ D. apoE 16.脂肪酸β-氧化、酮体生成及胆固醇合成的共同中间产物是：
生化实验基本原理及技术
生物化學實習 1 緒論 (一) 原理 1. 光依據其波長來分類： (1) 200nm~400nm 短波屬於紫外光 (2) 400nm~700nm 可見光波長 (3) 700nm~900nm 長波屬於近紅外光 2. 光通過溶液時，特定波長的光被吸收，眼睛察覺到的是沒有被吸收的波長。 核黃素會吸收450nm 的光，紅光與黃光會通過溶液而被肉眼所見。
第一單元 生化實驗基本原理及技術 2 圖1-1光譜儀 光譜儀可用來鑑定及定量純或不純的溶液中所含有的特定化合物，主要原理是基於兩個物理定律：1.柏朗定律；2.比爾定律 。 1. 柏朗定律：每單位厚度溶液其吸收入射光的比率為定值，被溶液吸收的入射光量與入射光強度無關。被每單位厚度溶液吸收的入射光比率為定值，每一單位厚度溶液若吸收10%的光，則光經過每一單位厚度溶液時，其強度即減少10%。 I ＝I 0 ? e -αι I ：穿透光強度 I 0：入射光強度 α ：溶液吸光係數 ι：光路徑長度 柏朗定律中以對數為底轉換公式，將吸光係數α轉換成比例常數K → log 10 I 0 / I ＝K ι log 10 I 0 / I ＝ 吸光值(absorbance ；A) 或光密度值(optical density ； OD)
生物化學實習 3 2. 比爾定律：光經過吸光物質所產生的吸光值，與溶液中每單位面積所含的吸光物質數目成比例。 比爾定律描述比例常數K 與待測吸光溶液中溶質的濃度有關。 K ＝εc ε：消光指數 c ：吸光物質濃度 I ＝ I 0? 10-εc ι log 10 I 0 / I ＝ A ＝log 1010εc ι＝ εc ι 當ι（光路徑長度）＝1 cm 時 log 10 I 0 / I ＝ A ＝log 1010εc ＝ εc 特定溶質在特定波長下，消光係數ε為一常數。因此，當吸光物質的濃度變成兩倍，於相同的光路徑下，被吸收的光量也會變成兩倍。 圖1-2 22 μM 溶於0.1M 磷酸鈉，pH 7.06，1公分 光路徑(light path)的條件下測定 波長 吸 光 值
《分子生物学检验技术》实验指导
《分子生物学检验技术》实验指导 【实验目的】 把握动物组织DNA提取的方法； 把握紫外分光光度法检测、鉴定DNA浓度和纯度的方法。 【实验原理】 获得相当纯度和完整性的基因组DNA，可用于DNA酶切图谱、多态性分析、基因诊断、构建基因组文库等。因此，DNA样品质量的好坏将直截了当关系到实验的成败。较理想的DNA样品应达到以下三点要求：①不应存在对酶有抑制作用的有机溶剂和过高浓度的金属离子；②最大程度地降低蛋白质、多糖和脂类分子的污染；③排除RNA分子的污染和干扰。 DNA以核蛋白形式存在于细胞中，提取DNA的原则是即要将DNA与蛋白质、脂类和糖类等成分分离，又要保持DNA分子的完整。本实验中，用阴离子去垢剂十二烷基磺酸钠（SDS）消化破裂细胞膜、核膜，并使组织蛋白变性沉淀，DNA从核蛋白中游离分开；为操纵组织中脱氧核糖核酸酶（DNase）对DNA的降解，加入柠檬酸钠或乙二胺四乙酸二钠（EDTA－Na2）以除去兴奋该酶的金属离子，SDS也能使DNase变性失活；蛋白酶K可水解蛋白质，消化D NA酶；分离后的DNA用饱和酚/氯仿抽提除去蛋白质，接着用氯仿抽提以除去DNA溶液中微量酚的污染；最后用无水乙醇沉淀DNA，得到欲提取的基因组DNA。
260nm处DNA有最大吸取峰，测DNA的A260，可运算其浓度。而蛋白质在280nm处有最大吸取峰，可测定A260nm/A280nm比值，检测DNA的纯度，该比值介于1.8~2.0之间。 【实验器材和试剂】 1、动物 小白鼠 2、设备 移液器、台式离心机、水浴箱、陶瓷研钵等；751紫外分光光度计、石英比色皿、洗瓶、滤纸等。 3、试剂 （1）基因组DNA提取试剂盒（北京康为世纪生物科技公司）：包括Buffer CL、Buffer PP、Buffer GE、RNase A、Proteinase K （7）生理盐水，4℃贮存 （8）无水乙醇、70%乙醇 【操作步骤】 1、制备肝匀浆 迅速处死小白鼠，称取新奇肝脏组织50 mg，用预冷生理盐水洗去血液，滤纸吸干后剪碎组织，将剪碎组织放于组织匀浆器或研钵中研磨，同时加入300 μl Buffer CL。将肝匀浆液放入EP管，加入1.5 μl蛋白酶K，漩涡震荡10 s，55℃孵育直到组织溶解（约1小时）。 2、提取DNA （1）加入1.5 μl RNase A，颠倒混匀，37℃孵育15-60 min。
生化实验报告模版
生物化学实验报告 姓名：郭玥 学号： 3120100021 专业年级： 2012级护理本科 组别：第8实验室 生物化学与分子生物学实验教学中心
【实验报告第一部分（预习报告内容）：①实验原理、②实验材料（包括实验样品、主要试剂、主要仪器与器材）、③实验步骤（包括实验流程、操作步骤和注意事项）；评分（满分30分）：XX】 实验目的：1、掌握盐析法分离蛋白质的原理和基本方法 2、掌握凝胶层析法分离蛋白质的原理和基本方法 3、掌握离子交换层析法分离蛋白质的原理和基本方法 4、掌握醋酸纤维素薄膜电泳法的原理和基本方法 5、了解柱层析技术 实验原理：1、蛋白质的分离和纯化是研究蛋白质化学及其生物学功能的重要手段。 2、不同蛋白质的分子量、溶解度及等电点等都有所不同。利用这些性质的差别， 可分离纯化各种蛋白质。 3、盐析法：盐析法是在蛋白质溶液中，加入无机盐至一定浓度或达饱和状态，可 使蛋白质在水中溶解度降低，从而分离出来。蛋白质溶液中加入中性盐后，由 于中性盐与水分子的亲和力大于蛋白质，致使蛋白质分子周围的水化膜减弱乃 至消失。中性盐加入蛋白质溶液后由于离子强度发生改变，蛋白质表面的电荷 大量被中和，更加导致蛋白质溶解度降低，蛋白质分子之间聚集而沉淀。
4、离子交换层析:离子交换层析是指流动相中的离子和固定相上的离子进行可逆 的交换，利用化合物的电荷性质及电荷量不同进行分离。 5、醋酸纤维素薄膜电泳原理：血清中各种蛋白质的等电点不同，一般都低于pH7.4。 它们在pH8.6的缓冲液中均解离带负电荷，在电场中向正极移动。由于血清中 各种蛋白质分子大小、形状及所带的电荷量不同，因而在醋酸纤维素薄膜上电 泳的速度也不同。因此可以将它们分离为清蛋白（Albumin)、α1-球蛋白、α 2-球蛋白、β-球蛋白、γ-球蛋白5条区带。 实验材料：人混合血清葡聚糖凝胶（G-25)层析柱 DEAE纤维离子交换层析柱饱和硫酸铵溶液 醋酸铵缓冲溶液 20%磺基水杨酸 1%BaCl 溶液氨基黑染色液 2 漂洗液 pH8.6巴比妥缓冲溶液 电泳仪、电泳槽 实验流程：盐析（粗分离）→葡聚糖凝胶层析（脱盐）→DEAE纤维素离子交换层析（纯化）→醋酸纤维素薄膜电泳（纯度鉴定） 实验步骤： （一）盐析+凝胶柱层析除盐：
高级生化实验讲义
实验一、转录增强因子在DNA转录中的调控作用– 16学时 一.目的和要求 1. 掌握转录增强因子对启动子控制下报告基因调控的工作原理，了解常见的报告基因种类及启动子种类。 2. 学习PCR克隆转录增强因子CRE，构建报告基因表达载体、细胞培养、细胞转染和荧光素酶活性检测技术。 二.基本原理 报告基因 (reporter gene)是一种编码可被检测的蛋白质或酶的基因。把它的编码序列和其它基因相融合形成嵌合基因，当在调控序列控制下进行表达时，利用报告基因的表达产物可以来标定目的基因的表达调控。 作为报告基因，在遗传选择和筛选检测方面必须具有以下几个条件：(1)已被克隆和全序列已测定；(2)表达产物在受体细胞中不存在，即无背景，在被转染的细胞中无相似的内源性表达产物；(3)其表达产物能进行定量测定。 在动物基因表达调控的研究中，常用的报告基因有氯霉素乙酰转移酶基因(cat)、β-半乳糖苷酶基因、荧光蛋白、荧光素酶基因等。荧光素酶(Luciferase) 是生物体内催化荧光素或脂肪醛氧化发光的一类酶的总称。自然界有许多发光生物, 1956年, McElroy 等首次从萤火虫中提取到荧光素酶, 此后各国研究人员相继报道了对各种发光生物中荧光素酶的研究。萤火虫荧光素酶是分子量为60～64kD的多肽链,在Mg2+、ATP、O2存在时,催化D-荧光素(D-Luciferin)氧化脱羧,发出光(λ=550～580nm)。荧光素酶作为新型报告基因，与传统报告基因相比，具有检测速度快、灵敏度比cat基因高30～1000倍、费用低、不需使用放射性同位素等优点，因此在基因工程方面得到了广泛的采用，同时荧光素酶在发光免疫分析及环境监测、微生物检测等方面的应用也愈来愈受到关注。 调控元件的选择依赖于特定的信号转导途径。很多情况下，GPCRs的活化信号可通过特定的信号转导途径将信息传递至细胞核，调控特定基因的转录。多种自然和合成的调控元件都广泛用于报告基因系统。自然启动子，如c-fos启动子，含有Serum inducible element(SIE)、Serum response element（SRE）、cAMP response element（CRE）等一系列转录因子结合位点，这些调控元件使得该启动子同时受多重信号转导事件的调控。人工合成的启动子中可加入多个单一调控元件，如cAMP反应元件（CRE）。
华中科技大学2017年《细胞生物学》考试大纲
华中科技大学2017年《细胞生物学》考试大纲 一、考试性质 《细胞生物学》入学考试是为华中科技大学生命科学与技术学院招收生物化工、微生物、生物物理等专业的硕士研究生而设置的。细胞生物学入学考试在考查基本知识、基本理论的基础上，注重考查考生的综合分析问题的能力。考生应能：准确地掌握细胞生物学方面的基础知识和实验方法；对近期国内外有关细胞生物学杰出成果应有所了解。 考试的对象为报考我校硕士研究生入学考试的准考考生。 二、评价目标 细胞生物学入学考试在考查基本知识、基本理论的基础上，注重考查考生的综合分析问题的能力。 三、考试形式与试卷结构 1.答卷方式：闭卷，笔试。 2.答题时间：180分钟 3.各部分内容的考试比例（满分为150分）：基础知识约60%，综合约40% 4.题型比例 名词解释约20％ 填空题约10％ 简答题约40％ 分析论述约30％ 四．考查要点 1.绪论 细胞生物学的主要研究内容，当前细胞生物学研究的总趋势与重点领域。 2.细胞的统一性与多样性 细胞的基本概念、特征、原核细胞与古核细胞、真核细胞基本知识概要及其异同点。 3.细胞生物学研究方法 光学、电子显微镜的应用、细胞及其组分的分析方法、细胞培养、细胞融合、模式生物与功能基因组的研究方法。 4.细胞质膜 细胞膜的基本组成成分、特点，细胞膜的基本功能。 5.物质的跨膜运输 物质跨膜运输的主要方式，各种运输的基本过程。膜运输导致的电位变化。胞吞与胞吐的方式。 6.线粒体和叶绿体。 线粒体和叶绿体的结构、功能（氧化磷酸化与光合作用），线粒体和叶绿体是半自性细胞器，线粒体和叶绿体的来源。 7.细胞质基质与细胞内膜系统 细胞质基质基本知识，内质网、高尔基复合体的基本结构以及功能。溶酶体与过氧化物酶体的结构特点，形成、功能。 8.蛋白质分选与膜泡运输 信号假说与蛋白质分选信号。蛋白质分选的基本途径与类型。膜泡运输的方式。 9.细胞信号转导 细胞通讯与细胞识别的基本知识，信号传递的类型及其作用机制。细胞内受体介导的信号传递、细胞
生化制品技术实验指导
《生化制品技术》实验大纲 一、实验目的 本实验是《生化制品技术》课程的配套实验，目的是增加学生对生物药物及生物技术制药的感性认识及提高学生的实验操作能力。要求学生熟悉并掌握生物药物的制备过程和生物技术制药的基本操作方法。 二、适用专业及层次 适用于生物制药技术专业学生 三、实验内容和学时分配
实验一牛奶中酪蛋白和乳蛋白素粗品的制备 一、实验目的 1.掌握盐析法的原理和操作。 2.掌握等电点沉淀法的原理和基本操作。 二、实验原理 乳蛋白素是一种广泛存在于乳品中，合成乳糖所需要的重要蛋白质。牛奶中主要的蛋白质是酪蛋白（caseins），酪蛋白在pH4.8左右会沉淀析出，但乳蛋白素在pH3左右才会沉淀。利用此一性质，可先将pH降至4.8，或是在加热至40℃的牛奶中加硫酸钠，将酪蛋白沉淀出来。酪蛋白不溶于乙醇，这个性质被利用来从酪蛋白粗制剂中除去脂类杂质。将去除掉酪蛋白的滤液的pH调至3左右，能使乳蛋白素沉淀析出，部分杂质即可随澄清液出去。在经过一次pH沉淀后，即可得粗乳蛋白素。 三、实验器材 烧杯（250ml和100ml）、玻璃试管（10mm×100mm）、离心管（50ml）、磁力搅拌器、pH计、离心机、水浴锅。 四、试剂和材料 脱脂牛乳或低脂牛乳、无水硫酸钠、0.1mol/L HCL、0.1mol/L NaOH、滤纸、pH试纸、浓盐酸、乙酸缓冲溶液0.2mol/L （pH4.6）、乙醇。 五、操作步骤
1.盐析或等电点沉淀制备酪蛋白 （1）将50ml牛乳倒入250ml烧杯中，于40℃水浴中加热并搅拌。 （2）向上述烧杯中缓缓加入（约10min内分次加入）10g无水硫酸钠，再继续搅拌10min（或加热到40℃，再在搅拌下慢慢地加入50ml40℃左右的乙酸缓冲液，直到pH达到4.8左右，将悬浮液冷却至室温，放置5min）。 （3）将溶液用细布过滤，分别收集沉淀和滤液。沉淀悬浮于30ml乙醇中，倾于布氏漏斗中，过滤出去乙醇溶液，抽干。将沉淀从布氏漏斗中移出，在表面皿上摊开以除去乙醇，干燥后得到的是酪蛋白。准确称重。 2.等电点沉淀法制备乳蛋白素 （1）将制备酪蛋白操作步骤（3）所得滤液置于100ml烧杯中，一边搅拌，一边利用pH计以浓盐酸调整pH至3±0.1。 （2）将溶液倒入离心管中，6000r/min离心15min，倒掉上层液。 （3）在离心管内加入10ml去离子水，振荡，使管内下层物重新悬浮，并以0.1mol/L氢氧化钠溶液调整pH至8.5～9.0（以pH试纸或pH计判定），此时大部分蛋白质均会溶解。 （4）将上述溶液以6000r/min离心10min，上层液倒入50ml烧杯中。 （5）将烧杯置于磁搅拌加热板上，一边搅拌，一边利用pH计以0.1mlo/L 盐酸调整pH至3±0.1。 （6）将上述溶液以6000r/min离心10min，倒掉上层液。取出沉淀干燥，并称重。 六、结果与讨论 1.计算出每100ml牛乳所制备出的酪蛋白数量，并与理论产量（3.5g）相
2011华中科技大学环境微生物学考研试题及答案
2011环境微生物学考研试题及答案 判断题 1原噬菌体是整合在宿主DNA上的DNA片段,它不能独立进行繁殖。( ) 2细菌的异常形态是细菌的固有特征。（） 3真核微生物比原核微生物更能在高温下生长。（） 4芽孢是芽孢细菌的繁殖器官。（） 5光合细菌和蓝细菌都是产氧的光能营养型微生物。( ) 6用来固化细菌培养基的多糖是琼脂。( ) 7微生物生长的衰亡期，细胞死亡速率超过细胞分裂速率。( ) 8碱基腺嘌呤、鸟嘌呤和胞嘧啶存在于RNA或DNA，但只RNA中有胸腺嘧啶。( ) 9真菌最适的生长条件是有点碱性的。( ) 10凡是影响微生物生长速率的营养成分均称为生长限制因子。( ) 选择题 1．大部分微生物___。 (a）是原生动物(b）帮助改善生活质量 (c)生活在海洋的底层(d)发现于外层空间 2.噬菌体是一种感染____的病毒。 （a）酵母菌（b）霉菌 （c）放线菌和细菌（d）原生动物 3.G＋菌由溶菌酶处理后所得到的缺壁细胞是___ （a）支原体(b)L型细菌(c)原生质体(d)原生质球 4.下列微生物中，______属于革兰氏阴性菌 （a）大肠杆菌(b)金黄葡萄球菌(c)巨大芽孢杆菌(d).肺炎双球菌 5.下列能产游动孢子的霉菌是____。 （a）腐霉(b)毛霉 (c)赤霉(d)青霉 6.硝酸细菌依靠____方式产能。 （a）发酵作用(b)有氧呼吸(c)无氧呼吸(d)光合磷酸化 7.酵母菌适宜的生长pH值为____ (a)5.0-6.0(b)3.0-4.0(c)8.0-9.0(d)7.0-7.5 8.进人三羧酸循环进一步代谢的化学底物是____。
(a)乙醇(b)丙酮酸（c）乙酰CoA(d)三磷酸腺苷 9.称为微好氧菌的那些细菌能___生长。 (a）在高浓度盐中(b)在低浓度氧中 （c）没有ATP或葡萄糖（d）只在有病毒时 10.深层穿刺接种细菌到试管固体培养基中____。 (a)提供厌氧菌生长条件（b）除去代谢废物的一个机会 (c)增加氧气(d)增加钾和钠离子的数目 11.微生物分批培养时，在延迟期_____ (a)微生物的代谢机能非常不活跃(b)菌体体积增大 (c)菌体体积不变(d)菌体体积减小 12.下面所有特征皆适用于胞嘧啶和胸腺嘧啶，除了___之外。 (a)两者皆为含氮碱基(b)两者皆为嘧啶分子 （c）两者皆可在RNA中发现（d）两者皆可在DNA中发现 13.研究不同微生物群落及其环境之间的关系的是____。 (a)微生物进化（b）微生物生理学 （c）微生物生态学（d）微生物生物化学微生物学 14.发生在土壤中的氨化过程的主要产物是____。 (a)尿素（b）氨基酸（c）蛋白质（d）氨 15.在正进行代谢的细胞中合成蛋白质，下面的因子是需要的，除了____之外。 (a)ATP分子(b)酶(c)信使RNA分子(d)脂肪酸分子 16.下列能产子囊孢子的霉菌是____。 (a)．毛霉和根霉(b)．青霉和曲霉 (c)．赤霉和脉孢霉(d)．木霉和腐霉 17.适合细菌生长的C/N比为____ (a)5：1(b)25：1(c)40：1(d)80：1 18.自然发生说的理论认为_____。 （a）微生物来自无生命的物质（b）大动物中发现有系统发育 （c）人类是从类人猿进化的（d）病毒是从细菌退化的 19.实验室常用的培养细菌的培养基是____。 (a)牛肉膏蛋白胨培养基(b)马铃薯培养基 (c)高氏一号培养基(d)麦芽汁培养基 20.放线菌具吸收营养和排泄代谢产物功能的菌丝是____.
运动生物化学实验指导
运动生物化学实验指导 实验一实验基本技术操作 一、实验目的 （一）了解实验室规则及注意事项。 （二）学习运动生物化学实验常用仪器的使用及清洗方法。 （三）学习721型分光光度计的使用方法。 二、实验原理 运动生物化学是研究人体运动时体内的化学变化。运动生物化学的实验方法基本上是化学的方法，用定量及定性的分析方法来观察机体内物质代谢的规律，所以实验时必须做到定性的洁净及定量的精确，因此实验取样要准确、样品要无污染。 对于相同物质和相同波长的单色光来说，溶液的光密度和溶液的浓度呈正比。配制各种浓度的CuSO4溶液，然后在780nm波长下比色，测定各种浓度的CuSO4溶液吸光度值，并制作曲线图。 三、实验器材 试管、CuSO4溶液、蒸馏水、721分光光度计、移液管、吸耳球等。 四、实验步骤 （一）玻璃仪器的清洗。 （二）使用移液管的移液操作及721分光光度计的使用。 取4支大试管，编号，按表7-1进行操作： 表7-1 CuSO4溶液的测定 以CuSO4溶液浓度为横坐标，吸光度值为纵坐标，将3种不同浓度的CuSO4溶液的光密度值分别点在坐标纸上，通过3点绘制成曲线图，并对实验结果进行分析。 五、注意事项 （一）玻璃仪器清洗后注意检查，管壁不能留有水珠。 （二）使用移液管吸取液体时一定要缓慢平稳，不要太快、太猛。 六、作业与思考 （一）玻璃仪器的清洗有哪些基本要求？ 实验二血红蛋白的测定 血红蛋白（Hb）是红细胞中的一种重要蛋白质，1分子的Hb是由4分子的亚铁血红素和1分子的珠蛋白结合而成的。 Hb的主要生理功能是运输氧气（O2）、二氧化碳（CO2）和对酸性物质（H+）起缓冲作用，参与体内的酸碱平衡调节。运动时机体需氧增加，故血红蛋白增加，有利于为组织提供氧气，促进物质的有氧代谢和带走CO2，而且也能起中和酸性的作用。如果血红蛋白下降，氧供应减少，影响运动能力。 运动员安静时血红蛋白值与正常人没有明显差异。一般人Hb的正常值男性为120-160g/L；女性110-150g/L。临床上常用判断贫血的标准，即成年男性低于120 g/L；成年女性低于110 g/L；而14岁以下的少年、儿童，不论男女，均以低于120 g/L作为贫血。
实验1-常规生化实验仪器的使用及基本操作
生物化学与分子生物学实验技术 实验安全与实验基本操作 2实验室安全规则 3实验室安全事故案例 ●1995年9月香港科技大学化学系大四学生梁同学因吸入别的同学泼洒的酸 酐而不治身亡。 ●1997年香港科技大学物理系访问学者因未按规定使用通风橱造成他人肺部 伤害而永不被香港各大学录用。 4推行实验室安全规则的目的 1.为了达到研究所研究学习安全之目的。 2.为了满足人性安全感的基本需要。 3.为了人性的尊严─生命是无价的。 4.减少工作中产生灾害，确保全教职工和学生之安全及健康。 5. 保护大家共同的环境。 5安全事故原因分类分析 天灾 占2％ 凡不知、不顾、不理、不能、粗心、迟钝、疲劳、失检、情绪各种内在外在的行为 不安全行为 人为因素 占98% 工作场所中，工作环境、设备设施对人所产生之危险因素 不安全环境 6专业性实验室安全工作守则 ●化学药品的操作 ●放射性物质（另有专门培训） ●废料处理 ●紫外线的接触 ●化学药品溢泼的处理 7实验室常用化学试剂的使用安全 8二甲苯 ●无色液体，有芳香气味，易挥发。用来制造、染料、塑料和药物。属低毒类， 对皮肤和黏膜有刺激作用，高浓度有麻醉作用。神经系统会受损害，还会使肾和肝受时性损伤。
●眼毒性：蒸气会刺激眼睛，液体导致严重刺激，发红肿胀和灼伤。通常影响 是暂时性的。皮肤毒性：产生灼伤感、干燥。可以用微温的缓慢流水冲洗至少20分钟，用无摩擦性的肥皂从皮肤上洗去二甲苯。 ●易燃，有爆炸危险。属于甲类防火危险物质。用二氧化碳或干粉或泡沫灭火 剂，不宜用水。 9三氯甲烷 ●无色透明易挥发液体，有特殊的香甜气味。沸点：61.2℃，医药上用作麻醉 剂。也用作萃取剂和溶剂。 ●有很强的麻醉作用，在光的作用下，能被空气中的氧反应生成氯化氢和剧毒 的光气。通常加入1—2%乙醇，使生成的光气与乙醇作用而生成碳酸乙酯，以消除其毒性。 ●吸入高浓度蒸汽时，开始刺激眼、口腔、鼻孔粘摸，发生流泪、感觉麻醉、 呕吐、痉挛、直到昏睡、不省人事。 ●在空气、水分和光的作用下，酸度增加，因而对金属有强烈的腐蚀性 10乙醚 ●透明、无色、易挥发有芳香刺激性气味的液体。沸点：34.6℃；对人体有麻 醉性能。当吸入含量为3.5%时，30~40分钟就可失去知觉。 ●人体过量吸入，会引起严重的急性中毒。呼气中带醚味，并出现呕吐、出汗、 喷嚏、咳嗽、头痛、记忆力减退、无力、兴奋。 ●微溶于水，易溶于盐酸，能与醇、醚、石油醚、苯、氯仿等有机溶剂混溶。 应储存于阴凉、干燥、通风的低温库房内，库温最好控制在25℃以下。远离热源、火种，避免阳光直射。 ●本品易燃。与强氧化剂反应能起火爆炸。在空气中与氧长期接触或受光照会 生成不稳定的过氧化物，受热能自行着火爆炸。着火时，可用干粉、泡沫、二氧化碳、沙土灭火。用水灭火无效，但可用水保持火场容器冷却。 11乙醇 ●无色有酒味，易挥发的澄清液体。沸点78.5℃：用于溶剂、清洗剂、分析 试剂等。属微毒类，对眼睛黏膜有轻微刺激作用。 ●乙醇可使皮肤发干，长期受大剂量作用时，可使神经系统、消化器官等发生 严重的器质性疾病。 ●易燃，手热或遇明火有燃烧爆炸危险，燃烧时，发出兰色火焰。蒸气能与空 气形成爆炸性混合物，在火场中，受热的容器有爆炸的危险。着火时，用二氧化碳、雾状水、干粉、1211或抗泡沫灭火。用水冷却火场中的容器，驱散蒸气，赶出溢出液体，使其稀释成为不燃性混合物
生化实验五大技术
生化实验五大技术 一.分光光度技术 1.定义:根据物质对不同孩长的光线具有选择性吸收,每种物质都具有其特异的吸收光语。而建立起来的一种定t 、定性分析的技术。 2.基本原理:（图1-1光吸收示意） 透光度T=It/lo 吸光度A=lg(lo/ I1) 朗伯-比尔(lambert-Beeri)定律:A=KLc K 为吸光率，L 为溶液厚度(em), c 为溶液浓度 (mol/L)] 摩尔吸光系数日ε:1摩尔浓度的溶液在厚度为 I.cm 的吸光度。 c=A/ε 3. 定量分析: (1)标准曲线(工作曲线)法 (2) 对比法元-KCLCx (3)计算法: e=A/ε (4)差示分析法(适用于浓度过浓成过稀) (5) 多组分湖合物测定 4.技术分类 分子吸收法&原子吸收法:
可见光(400-760 nm) &紫外光(200~ 40m) &红外光(大于760 nm)分光光度法； 5.应用方向 有机物成分分析&结构分析红外分光光度法测定人体内的微量元囊原子吸收分光光度法 二电脉技术 1.定义:带电荷的供试品在情性支持介质中，在电场的作用下，向其对应的电 极方向按各自的速度进行脉动。使组分分离成族窄的区带，用透宜的检洲方法记录其电泳区带图请或计算其百分含量的方法。 2.基本原理: 球形质点的迁移率与所带电成正比，与其半径及介质粘度成反比。v=Q/6xrη 3.影响电泳迁移率的因素: 电场强度电场强度大，带电质点的迁移率加速 溶液的PH值: 溶液的pH离pl越远，质点所带净电荷越多，电泳迁移幸越大 溶液的离子强度:电泳液中的高子浓度增加时会引起质点迁移率的降低 电渗:在电场作用下液体对于固体支持物的相对移动称为电渗 4:技术分类: 自由电泳(无支持体) 区带电泳(有支持体):法纸电泳(常压及高压)，博层电泳(薄膜及薄板).凝波电泳(琼脂，琼脂糖、淀粉胶、柔丙烁配胶凝胶)等 5. 电泳分析常用方法及其特点: 小分子物质滤纸、纤维素、硅胶薄膜电泳复杂大分子物质凝胶电泳 ⑴醋酸纤维素薄膜电泳 ①这种薄顺对蛋白质样品吸阴性小，消除纸电沫中出现的“拖尾”现象 ②分离理应快，电泳时间短 ③样品用最少: ④经过冰最酸乙醉溶液或其它看明液处理后可使膜透明化有利丁对电泳图潜的光吸收措测店和爱的长期保 ------别适合于病理情况下微量异常蛋白的检测(胰岛素、游菌酶、胎儿甲种球
生化制品技术实验指导教学内容
生化制品技术实验指 导
《生化制品技术》实验大纲 一、实验目的 本实验是《生化制品技术》课程的配套实验，目的是增加学生对生物药物及生物技术制药的感性认识及提高学生的实验操作能力。要求学生熟悉并掌握生物药物的制备过程和生物技术制药的基本操作方法。 二、适用专业及层次 适用于生物制药技术专业学生 三、实验内容和学时分配
实验一牛奶中酪蛋白和乳蛋白素粗品的制备 一、实验目的 1.掌握盐析法的原理和操作。 2.掌握等电点沉淀法的原理和基本操作。 二、实验原理 乳蛋白素是一种广泛存在于乳品中，合成乳糖所需要的重要蛋白质。牛奶中主要的蛋白质是酪蛋白（caseins），酪蛋白在pH4.8左右会沉淀析出，但乳蛋白素在pH3左右才会沉淀。利用此一性质，可先将pH降至4.8，或是在加热至40℃的牛奶中加硫酸钠，将酪蛋白沉淀出来。酪蛋白不溶于乙醇，这个性质被利用来从酪蛋白粗制剂中除去脂类杂质。将去除掉酪蛋白的滤液的pH 调至3左右，能使乳蛋白素沉淀析出，部分杂质即可随澄清液出去。在经过一次pH沉淀后，即可得粗乳蛋白素。 三、实验器材 烧杯（250ml和100ml）、玻璃试管（10mm×100mm）、离心管（50ml）、磁力搅拌器、pH计、离心机、水浴锅。 四、试剂和材料 脱脂牛乳或低脂牛乳、无水硫酸钠、0.1mol/L HCL、0.1mol/L NaOH、滤纸、pH试纸、浓盐酸、乙酸缓冲溶液0.2mol/L （pH4.6）、乙醇。 五、操作步骤 1.盐析或等电点沉淀制备酪蛋白
（1）将50ml牛乳倒入250ml烧杯中，于40℃水浴中加热并搅拌。 （2）向上述烧杯中缓缓加入（约10min内分次加入）10g无水硫酸钠，再继续搅拌10min（或加热到40℃，再在搅拌下慢慢地加入50ml40℃左右的乙酸缓冲液，直到pH达到4.8左右，将悬浮液冷却至室温，放置5min）。 （3）将溶液用细布过滤，分别收集沉淀和滤液。沉淀悬浮于30ml乙醇中，倾于布氏漏斗中，过滤出去乙醇溶液，抽干。将沉淀从布氏漏斗中移出，在表面皿上摊开以除去乙醇，干燥后得到的是酪蛋白。准确称重。 2.等电点沉淀法制备乳蛋白素 （1）将制备酪蛋白操作步骤（3）所得滤液置于100ml烧杯中，一边搅拌，一边利用pH计以浓盐酸调整pH至3±0.1。 （2）将溶液倒入离心管中，6000r/min离心15min，倒掉上层液。 （3）在离心管内加入10ml去离子水，振荡，使管内下层物重新悬浮，并以0.1mol/L氢氧化钠溶液调整pH至8.5～9.0（以pH试纸或pH计判定），此时大部分蛋白质均会溶解。 （4）将上述溶液以6000r/min离心10min，上层液倒入50ml烧杯中。 （5）将烧杯置于磁搅拌加热板上，一边搅拌，一边利用pH计以 0.1mlo/L盐酸调整pH至3±0.1。 （6）将上述溶液以6000r/min离心10min，倒掉上层液。取出沉淀干燥，并称重。 六、结果与讨论 1.计算出每100ml牛乳所制备出的酪蛋白数量，并与理论产量（3.5g）相比较。求出实际获得率（%）。