交界型大疱性表皮松解症的LAMA3和LAMB3基因突变研究

目录

引言 (1)

第一部分七例隐性交界型大疱性表皮松解症患者基因突变研究 (2)

临床资料 (2)

知情同意 (3)

材料与方法 (4)

1主要仪器 (4)

2主要试剂 (4)

3实验方法 (4)

3.1提取基因组DNA (4)

3.2引物合成及保存 (4)

3.3PCR反应 (5)

3.4PCR产物电泳 (5)

3.5产物送测序 (5)

3.6分析测序结果 (5)

结果 (6)

第二部分体外实验检测LAMA3突变体蛋白对LOCs患者伤口愈合的影响 (7)

材料与方法 (7)

1主要仪器 (7)

2主要试剂 (7)

3质粒的构建 (8)

3.1载体准备 (8)

3.2引物设计 (8)

3.3T4多聚核苷酸激酶对引物5ˊ端进行磷酸化修饰 (8)

3.4PCR反应 (8)

3.5DPNI酶处理PCR产物消化甲基化模板 (9)

3.6T4连接酶连接 (9)

3.7转化 (9)

3.8鉴定突变型质粒 (9)

4稳转细胞系的筛选 (10)

4.1筛选培养基配制 (10)

4.2培养293细胞 (10)

4.3最佳筛选浓度确定 (10)

4.4筛稳转细胞系 (10)

5原代成纤维细胞与稳转细胞混合培养 (11)

5.1正常人皮肤成纤维细胞原代培养 (11)

5.2混合培养 (11)

6RNA的提取（Trizol法） (12)

7Q-PCR (12)

8Western Blot Analysis (13)

结果 (14)

第三部分体外实验预测剪切位点突变对LAMB3基因剪接的影响 (16)

材料与方法 (16)

1主要仪器 (16)

2主要试剂 (16)

3目的片段的分子克隆 (16)

3.1质粒准备 (16)

3.2设计引物 (17)

3.3PCR反应 (17)

3.4目的片段切胶回收 (18)

3.5酶切与再纯化 (18)

3.6目的片段与质粒载体连接 (19)

3.7转化 (19)

3.8表达质粒的大量扩增和提取 (19)

3.9培养Hela细胞 (20)

4重组质粒的转染 (20)

5RNA提取（Trizol法） (20)

6RT-PCR (21)

7琼脂糖凝胶电泳 (22)

8PCR产物测序 (22)

结果 (22)

讨论 (25)

结论 (28)

参考文献 (29)

综述 (31)

综述参考文献 (36)

攻读学位期间研究成果 (39)

缩略词表 (40)

致谢 (41)

学位论文独创性声明与知识产权权属声明 (42)