鲎法测定细菌内毒素影响因素的研究进

鲎法测定细菌内毒素影响因素的研究进展

董培智（山西省药品检验所太原 030001 peizhid@https://www.sodocs.net/doc/d711500246.html,）

鲎试剂法是利用鲎血细胞溶解物（Limulus Amebocyte Lysate, LAL;Tachypleus Amebocyte Lysate,TAL）与微量（pg/ml级）细菌(主要是革兰氏阴性细菌,G-)的内毒素反应,从而检出被检物中内毒素的一种生物体外检测新技术。因为其具有快速、简便、经济、灵敏度高、重现性好、一次可同时测几个样品等优点，自从一九六四年美国学者Levin 和Bang 发现此法以来[1]，鲎法正被日益广泛地应用于医药卫生、食品卫生、环境卫生、分子生物学、以及微生物学中。

鲎法大致可分为凝胶法（Gel-colt end point or Gel-colt method,Gelation Assay）、比浊法（Turbridimetric Assay）色原基质法（Chromogenic Substrate method）、以及免疫法（Immunology Assay）等。本文依据文献报道，总结了近年来国内外学者在用这些方法测定细菌内毒素时发现的一些影响因素及其消除方法的研究进展，以供试验者参考。

1 试验条件与操作

培养条件、操作环境可能引起各次实验之间、各实验室之间的结果差异[2]。

1.1 时间

鲎试剂在液态时极不稳定, 室温放置太久会影响反应灵敏度，故加样结束后,应立即放入恒温水浴中。[3]延长保温时间，可提高LAL的灵敏度。[4]

有研究者[5]发现细菌内毒素国家标准品和工作标准品的不同混合时间与相对活性之间具有一定的规律，即５分钟时混合点的活性最强，混合时间越长，活性反而降低，但在三十分钟以内的各混合点测定的灵敏度均在规定范围之内。

在显色法中灵敏度与时间有关，故实验过程中既要严格控制每个环节的保温时间，又要严格控制终止时间[2][6][7]。

1．2 温度

凝胶试验规定的孵化温度为37℃。但在夏季高温季节，如果同时作几个样，阳性对照不成立的现象时有发生，故应改为冰浴。[3]

郭录平[4]通过实验证明，保温在25-41℃内，随着温度的升高，LAL的灵敏度也随着升高；在41-46℃之间，对灵敏度无明显影响；≥48℃会破坏鲎试剂。

另外在显色法中的灵敏度也与控制温度有关[6][7]。

1.3 pH值

高国政等人[8]用动态浊度法详细研究了样品pH 值对细菌内毒素测定的影响，结果发

现：样品pH 在6-8间实验结果稳定；pH ≤3 或≥12时，实验受到抑制，平均回收率≤56.8%。最后得出结论：使用TAL 时，供试品pH 应预调在6.5-7.5 为好；使用LAL 时，pH 应预调在6.2±0.1或6.7-7.8为好。

也有人认为[4][7][9] 鲎试验的pH 应为6.5-8.5，以7.0-7.5为佳。必要时可用无内毒素的HCl 或NaOH 调节pH 值[2]。

1．4 试验器具

内毒素稀释不宜用注射器，而应用经过校正的刻度吸管。因为注射器刻度不准，而且,针栓壁磨沙面易吸附内毒素而使其浓度不够,造成凝胶反应不成立[3][10]。

普通玻璃及塑料管也会影响实验结果[2][9]，用硬的玻璃管及AR玻璃管较为合适。一般硼酸玻璃管测得的效价较低,而且LAL的灵敏度愈低，管对测定的结果影

响愈大。操作中常用的聚丙烯塑料管可能干扰结果。

1．5 操作程序

有实验者发现[3][11]：操作次序也影响试验结果。应该先吸取供试品、然后加入阴性对照及阳性对照液，最后按供试品管、阳性对照管、阴性对照的顺序逐一精确加入鲎试剂。未按此程序容易出现阳性反应不成立的现象。

1.6 处理作用

Pedersen MR和Hansen EW[12]将内毒素溶液用玻璃试管干燥，在氧丙环（Ethylene Oxide，EO）450或900mg/l中暴露1-46小时后，内毒素的LAL活性减少至百分之三十。将多粘菌素B（Polymyxin B，PB）加入到内毒素稀释液中会减少其活性百分之七十五。内毒素经过EO处理会减少LAL活性百分之七十，进一步加入PB会减少LAL的活性百分之九十九。EO对内毒素的反应会减少其LAL活性，也会减少其热源反应，增加与PB的亲和性。

Bamba T[13]等学者研究了平滑型G-细菌的内毒素（Smooth gram-negative bacteria ，S-form)经过高温蒸气处理后的灭活效果，观察到不同种细菌的抗热性显著地不同，减弱率与浓度有关。低浓度（10ng/ml）内毒素处理后的活性可降低至可测定的限度下。粗糙型（Rough strains，R-form)细菌的内毒素减弱时间曲线与个别平滑型相似。平滑型，尤其是Rc突变体（Rc mutant）细菌的内毒素灭活性能够被Mg2+，Ca2+等二价阳离子显著影响。

FDA认为不同的产品处理和储存条件可能会引起对某一样品试验的分析误差。Guilfoyle DE [14]等人通过实验发现培养细菌的培养基以及溶剂的储藏温度均不会引起任何问题。然而，因为溶液在瓶中没有充分震荡，溶剂与橡胶塞接触，约有百分之二十到四十的内毒素丢失。解决此问题的方法是应将试剂直立地存放在无污染的瓶中，并规定在内毒素试验之前统一的混合步骤。

姜素云等[15]通过考察细菌内毒素的稳定性后发现，溶解后的细菌内毒素应用液（0.5-1.0Eu/ml）在0-4 ℃放置一周活性不变；1.0-20Eu 应用液若置冰箱，可冷冻保藏20

天，但反复冻融活性会逐渐降低。

2 供试品

2.1 多糖[2]

我们已经知道每毫升含皮克级的内毒素会使鲎试剂呈阳性，而多于10pg/ml浓度的产碱杆菌多糖（1-3-β-D-葡聚糖）（curdlan，1-3-beta-D-glucan）也会使常规的内毒素实验呈阳性，因为LAL中含G因子[16]。

据报道[17][18]，能激活鲎试剂旁路（G 途径）的物质主要是（1-3）-β-D-葡聚糖（包括（1-4）-β-D-葡聚糖和（1-6）-β-D-葡聚糖）以及LAL-RM（LAL-Reaction Material）两类，如真菌多糖（Fugal polysaccharide）、中空纤维滤膜洗涤液、肾透析仪（人工肾，血液透析仪）洗涤液等。实验室常用的酒精，棉球等也含有较多的（1-3）-β-D-葡聚糖。低于一定浓度的（1-3）-β-D-葡聚糖或LAL-RM不

足以使鲎试剂的凝集反应产生阳性结果，但如果有细菌内毒素共同作用的情况下，凝集反应会变得更为激烈和迅速，很容易使反应出现阳性结果。我国已生产出含有能抑制或阻断鲎试剂G因子旁路反应物质的试剂—增抗液（Antienhancement Solution）。

Cooper JF 和Weary ME[19]等学者发现商品的LAL试剂对葡聚糖的反应存在很大的差异，所以实验室间LAL实验的结果可能出现矛盾。动态LAL方法（Kinetic LAL methods）对筛选可能被葡聚糖污染了的物质非常有用。葡聚糖在非口服制剂中不常见，只限于被微生物或纤维素物质污染的产品。并设计了一种能确定葡聚糖存在与否的LAL试验方法。

另外，丹麦科学家[20]发现，细菌内毒素与鲎试剂的凝集反应可被二甲亚砜与多粘菌素B（dimethyl sulfoxide and polymyxin B）合用,或抗鲎C因子的单克隆抗体（monoclonal antibody against Limulus factor C）所抑制。他们还发现β-葡聚糖（beta-glucan）激活途径能完全被昆布糖（laminarin）所阻碍，而不影响内毒素的激活途径。人血浆与LAL反应是通过β-葡聚糖途径激活的，而非内毒素途径。

八十年代后，日本最先研制成功只与内毒素起反应的特异鲎试剂，如：Endospecy，以及只与（1-3）-β-葡聚糖反应的鲎试剂：SLP试剂及Gluspecy。[21]

2.2蛋白

2.2.1阳离子蛋白

几位德国科学家[21]发现阳离子蛋白（Cationic proteins）如溶菌酶、核糖核酸酶A、以及人的免疫球蛋白G（lysozyme, ribonuclease A, and human IgG）能够与细菌内毒素形成细菌内毒素-蛋白复合体，对细菌内毒素有显著的屏蔽作用，从而影响用鲎法来测定细菌内毒素。试验证明，苯酚提取法、稀释加热法、以及高氯酸处理（phenol extraction, dilution heating, and perchloric acid treatment）等方法都不能够解除此作用。胰岛素、糜蛋白酶、链酶蛋白酶（trypsin, chymotrypsin, or pronase）等只能回收10%-20%的内毒素，然而如在测定之前，用蛋白酶K （proteinase K）来消化样品，可使细菌内毒素的回收率达到百分之百。进一步研究还发现，

多聚-L-赖氨酸及多聚二甲亚胺（poly-L-lysine and poly ethyleneimine）作为细菌内毒素选择性配位基能够将细菌内毒素从所研究的蛋白上脱去，从而有利于进一步的测定。

2.2.2 血蛋白

Roth R与IKaca W 证明[23][24]，血红蛋白能与LPS结合，这种结合会改变LPS的一些物理特性，从而增强了LPS的生物学活性及LPS与LAL的作用。

据报道[2][17][18]：人血白蛋白、球蛋白、抗凝血酶Ⅲ均可以激活G因子。有学者的研究表明用一般鲎试剂测定的人血白蛋白、球蛋白等血液制品的阳性检出率明显高于用去G因子LAL测定的阳性率,而后者与兔热源检查结果基本一致。

2.2.3 免疫蛋白

Baek L[25]等人通过免疫电泳方法表明，假单孢绿脓杆菌（Pseudomonas aeruginosa）及金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）细胞膜的一些可溶性抗原（Soluble antigens）与LAL能够反应。

有的学者[26]用鼠单克隆免疫球蛋白M抗体E5（mouse monoclonal IgM antibody E5）来测定其抗不同菌种LPS的活性。结果证明，由于细菌种类不同，经E5处理后，LPS活性减弱的程度也不同，一般地0.2mg/ml以上的E5能减少几乎所有被研究菌种的LPS对鲎试剂的活性。

另据报道[18], 抗血友病球蛋白、免疫球蛋白也可激活G 因子途径。

2.3 离子

离子对细菌内毒素测定结果影响较大[9]，因为一方面离子强度较大会引起内毒素的聚集，加重低浓度内毒素不易散的问题；另一方面LAL中的C因子必须在二价阳离子的参与下才能被激活形成活化C因子。

Guyomard S; Darbord JC [13][27]介绍了用五种内毒素，即2株大肠杆菌、1株沙门氏杆菌、1株灵杆菌、1株霍乱弧菌（Escherichia coli, Salmonella, Serratia marcescens and Vibrio cholerae)与FDA推荐的内毒素EC5作LAL实验的重现性。发现添加Mg2+增强了LAL显色反应（160mmol/l最佳），而Ca2+浓度大于5mmol/l时抑制了此反应，0.3mmol/l的Zn2+会强烈地抑制反应。由Zn2+的部分抑制作用能被增加Mg2+而减弱（160mmol/l）。当在反应的第一步（细菌内毒素与LAL孵育）时添加这些二价阳离子会改变LAL显色反应，而在反应的第二步，即加入生色底物（chromogenic substrate）时这些阳离子则不会改变LAL生色反应。

据报道[7]当鲎血被抽出后，用3% NaCl 充分稀释(1:500)能阻止变形细胞凝集，即使有内毒素存在也不凝聚，但当有钙或镁离子存在时则很快凝固，由此可知钙、镁离子对于鲎试验的作用，但是过量的钙离子又会影响凝聚作用的完成。因此,当溶液中有EDTA等络合剂或肝素钠、柠檬酸钠等抗凝剂存在时，Ca2+，Mg2+离子将失去作用[2][9]，从而影响本法的测定。

有人在研究内毒素的电催化特性对于鲎试验的影响时，证明钍与铁对内毒素的活性有

强烈的影响，但由于其在鲎血中的含量甚微，故并不干扰实际测定。[7]

生理盐水中的NaCl 对显色反应有干扰[28]，但关键在于稀释样品和标准品须用相同的无热源水或无热源生理盐水。

相反,许多药物中含有的阴离子会吸收鲎试剂中的Ca2+、Mg2+离子，使实验呈假阴性，可通过加入0.5mg/ml的氯化钙溶液，或22mg/ml的氯化镁溶液来排除干扰。[29]

2.4 有机盐

核酸钠（Sodium Nucleinate，NN）像细菌内毒素的LPS一样能够被LAL试验所检测，有学者[30]还比较了含有NN热原标准品的兔法与LAL法的测定结果。

2.5 透析液

Berland Y[31]总结了在文献报导中有关透析液细菌性污染的资料。透析液中的G-小分子热源物质能够透过正常的透析膜。纤维性透析膜(Cellulosic hemodialysis membranes)比合成膜(synthetic membranes)更容易通过内毒素。聚砜膜及聚酰胺膜(Polysulfone membranes and polyamide membranes)在透析液的那一面能够吸收内毒素。所以，鲎试验不能够检出污染透析液的所有细菌性物质。

Laude-Sharp M[32]等人的实验证明:在体内具有生物活性的多种LPS能够通过透析膜，尽管在血液中没有测到LAL反应物质，所以LAL法作为测定生物液(biological fluids)中是否存在LPS的标准不够充分。

日本学者Yoshioka T [33]等人通过使用无G因子的凝集系统证明了从铜氨人造纤维膜(cuproammonium rayon membranes)得到的LAL反应物质不是内毒素，而是通过另一种途径使LAL凝集，此物质在循环中滞留相当长的时间。并发现在急性及慢性血液透析中，此反应物质平均水平为100-400pg/ml。

仲卫华[34]等的实验证明，血液透析液有一定的干扰作用，但可通过稀释法消除。

以上研究结果说明用鲎试剂来测定透析液中的内毒素的方法还有待于进一步的考察。

2.6 中药成分[21]

许多种中草药成分能够干扰LAL试验[35]，特别是清热解毒类药物[29]。

2.7 生化药品[21]

姜素云[2][36]等证明，氨基酸对鲎试剂有较强的抑制作用。

孔祥文[28]通过实验证明，基因工程蛋白类药物生产中常用的2-巯基乙醇、2-巯疏糖醇和还原性谷胱甘肽对鲎试验呈色反应有干扰作用，当稀释到5.0μmol/l时,抑制作用近乎消除。

2.8 其它物质

另据报道[2][9][21][29]：人血中的多种凝血因子、可使蛋白质变性物质（乙醇、苯酚）或灭活的物质（如氧化剂、抗氧化剂、蛋白水解剂、专一失活剂等）、高糖溶液、络合物、电解质、维生素、添加剂、右旋糖酐-40、抗凝血剂如柠檬酸及肝磷脂等等，都可干扰鲎试剂形成凝胶。

3鲎试剂与标准品

3．1 鲎试剂内源性因子

Roth RI与T obias PS[37]在研究含有能被细菌内毒素激发引起凝集反应的内毒素敏感因子的鲎试剂色析组份（chromatographic fraction of Limulus lysate）时,用了一种光复活性的、易解离的、放射性同位素标记（photoreactive, cleavable, radiolabeled）的沙门氏菌LPS衍生物（derivative of Salmonella minnesota LPS），LPS-（P-叠氮水杨酰胺）-1，3-二硫丙胺（LPS-(p-Azidosalicylamido)-1,3'-Dithiopropionamide ，LPS-ASD），来确定LPS-结合蛋白。结果证明LAL组分中较大的82-kDa蛋白是LPS结合蛋白，充当凝集反应的负调节因子，LAL组分中较小的50-kDa蛋白是对LPS敏感的凝集蛋白的选择物。

日本科学家[38][39][40]发现在日本马蹄蟹（horseshoe crab (Tachypleus tridentatus)）血细胞中存在鲎胞间凝集抑制物（Limulus Intracellular Coagulation Inhibitor，LICI）1型、2型、及3型。LICI-1专一性抑制对鲎LPS-敏感的丝氨酸蛋白酶（limulus lipopolysaccharide-sensitive serine protease），C因子（K1=2.5×106 M-1，S-1）；而LICI-2显著抑制鲎凝集酶（limulus clotting enzyme）（K1=4.3×105M-1，S-1）；LICI-3强烈抑制对（1，3）-β-D葡聚糖敏感的丝氨酸蛋白酶（(1,3)-beta-D-glucan-sensitive serine protease），G因子（K1=3.9×105 M-1，S-1）。因此，鲎血淋巴凝结过程至少由三个内源性因子所调节：LICI-1 是Mr=48，000，有394个氨基酸的单链糖蛋白，其单一反应位点为-Arg-Ser-; LICI-2 是Mr=42，000，有386个氨基酸的单链糖蛋白，其单一反应位点为-Lys-Ser-; LICI-3 是Mr=53，000，有392个氨基酸的单链糖蛋白，其单一反应位点与LICI-1相同。

3．2 试剂质量

不同批号的鲎试剂标示值相同，但试验结果不尽相同，尤其是近效者的灵敏度有明显下降的趋势。所以在更换批号或者用近效期鲎试剂的时候，应对灵敏度进行复核。以确定本批鲎试剂的实际灵敏度。[3]

有的同志发现[11]：使用不同厂家生产的溶解水来溶解鲎试剂，结果会导致假阳性的出现，而使用同厂生产的鲎试剂及溶解水均符合规定。

另外，还有试验者发现[41][42][43]：不同厂家与批号的细菌内毒素工作标准品的灵敏度有很大的差别,有的竟低于50% 以下。支与支之间差异竟达50%。[10]

高丽云[44]在实验中发现如放置半年后重新标定, LAL灵敏度会下降,细菌内毒素工作标准品的效价低于标示量。这可能与细菌内毒素的处方、pH值、冷冻干燥过程以及冻干标准品中加入的如人清蛋白、乳糖、聚乙二醇等添加剂影响细菌内毒素的稳定性有关[2]。

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注：本文发表在《药物分析杂志》1999.19卷增刊

从事生物制药和生物制品的战友们应该都会碰到内毒素这个头疼的问题，它包括内毒素的检测和内毒素的去除。

我觉得经过解决热源问题每个人都是此方面的专家，我们可以进一步讨论一下与细菌内毒素相关的方方面面吧。

有份资料与大家共享：

凝胶法鲎试剂使用

用途：

鲎试剂是鲎阿米巴细胞的抽提液，用于通过凝胶法进行定性检测内毒素。

概述：

鲎试验是一种最灵敏和专一的内毒素检查方法，它是革兰氏阴性细菌细胞壁的产物，通常称为热原。鲎试验的原理是内毒素与LAL反应可形成易于分辨的凝胶。简单、经济的的鲎试验使得它已广泛应用于半成品、原材料以及药品、医疗器械和生物制品等产品的检查。美国药典的细菌内毒素检查法和美国FDA指南为有效验证鲎试验法代替兔热原法提供了标准方法。

凝胶法是一种简单、重现性好的检测方法，将等量的凝胶法试剂和检品混合并及时放在37℃下保温加热60分钟。阳性反应表明检品中的内毒素含量等于或超过试剂的标示灵敏度，用λ表示。

生物原理

代替兔热原法的可行方法的发展由Hopkins 大学的研究者们发起。Frederick Bang观察到细菌导致美洲鲎血管内的血液凝结。在协作研究中，Levin和Bang发现导致凝结现象的因素存在于鲎的阿米巴细胞中或循环血液细胞中，热原（细菌内毒素）触发浊度和凝胶形成酶促反应。在阿米巴细胞的溶解物中发现的丝氨酸酶由内毒素和二价阳离子激活后引起一系列酶促反应，这改变了大量的蛋白凝结物，产生蛋白酶凝胶。

由于放射性药品需要一种合适的热原检测法使得Cooper、Levin和Wagner将这一新方法扩大应用到药品中。1970年的一个比较研究显示鲎试验法比兔法更灵敏，而且试剂活性（凝胶和不断增加的浊度）与内毒素浓度相关联。鲎试剂的改善、标准方法的制定和自动系统的开发以及对鲎试剂的反应能力的进一步理解使得鲎试剂立即被广泛应用到各种生物制品、非经肠道药品和医疗器械的检查中。

鲎试剂反应要求中性的pH值并依赖于时间和内毒素浓度。鲎试验局限于使用检品的溶液或抽提液，大多数的鲎试验干扰都可用简单稀释来克服。

美国FDA终产品检测指南：

美国食品与药品管理局在1987年发布了一份准则，通知生产人用药品和生物制品、兽用药品和医疗器械的厂商，FDA认为有必要验证鲎试验作为终产品的内毒素检测方法，那些遵照鲎试验准则的厂商将被认为符合CGMPs有关规定。非经肠道药品的通用内毒素限值是5个内毒素单位（EU）每公斤剂量，但鞘内药品的限值是0.2EU/Kg，医疗器械浸取液不得超过0.5EU/ml；与脑脊髓接触的器械的限值为0.06EU/ml。

预防

鲎试剂只用于体内诊断，不用于检测内毒素血症，使用时须小心因为其毒性仍不为人所知。

所有与样品接触的材料或检测材料必须是无热原的，玻璃器皿必须经有效除热原，例如200℃干热3小时。标示已灭菌和处理过的塑料制品通常是无热原的，然而那些不能经高温灭菌的材料或销售时没有无热原标签的材料应小心检测其是否含内毒素。

可提供的试剂

可提供5.2ml/vial 50次管和1.2ml/vial 10次管的冻干的鲎试剂，试剂含有缓冲的阿米巴细胞溶解物并已用单价和二价阳离子加以稳定。

不提供的试剂和材料

必须用LAL检查用水（非LAL反应）复溶鲎试剂和制备内毒素对照，也就是说，要使用ENDOSAFE 的LAL检查用水来复溶鲎试剂。

内毒素工作标准品（CSE）或内毒素参考标准品（RSE）是制备阳性对照和内毒素标准品溶液所必需的。旋涡混合器最适合用于混合内毒素溶液和稀释液。

需要一水浴或加热区在37±1℃来为检测混合物保温。

所需的经灭菌的无热原的配套用品包括：10×75mm 燧石玻璃检测试管16×125mm或更大的可重复使用的硼硅酸试管，一校准的机械移液器带无菌的一次性塑料吸头，精确度不小于1ml，和用于移大容量的移液器，封口膜和复溶的鲎试剂，放反应试管的和标准内毒素稀释试管的试管架，用于测量恒温时间和内毒素混合阶段的定时器。

鲎试剂的制备和贮存

复溶：将试剂瓶在一坚固的表面轻弹使瓶中的鲎试剂粉末落到瓶底。在使用前立即用已标明用量的LAL检查用水复溶试剂，在移开盖子后用吸管将水直接加入瓶中，不立即使用时用无热原封口膜盖住瓶口，轻轻搅动直到鲎试剂溶解。

贮存：冻干的鲎试剂应存放在2-8℃下；避免长时间放置在高于25℃的温度条件下。已复溶的鲎试剂在间歇使用过程中最好放在一冰冷的表面上或2-8℃的冰箱里，可存放24小时以内，否则在复溶并冻结后将其存放在-20℃以下，可存放四个星期，鲎试剂只能冻融一次。

内毒素工作标准品（CSE）的制备

复溶：Endosafe提供的CSE E.coli，055:B5，可用于LAL标示的灵敏度的复核和制备阳性对照。Endosafe提供的CSE有已确定的内毒素含量并在分析证明（COA）中写明，且用EC-5标定。注意每批试剂和CSE都有一份COA，美国药典RSE可从美国药典委员会购买，Endosafe提供的冻干的内毒素必须根据包装和COA上说明制备。在进一步稀释前用5毫升的LAL检查用水复溶CSE 并用力旋涡混合5分钟，应作到1EU/ml的系列稀释，然后作两倍稀释，包括标示的鲎试剂灵敏度。

存放：复溶的内毒素在2-8℃下可存放一个月。每日必须稀释内毒素溶液除非已验证可有更长的间隔。

样品的采集和制备

必须使用无热原材料和无内毒素试剂采集和制备样品，由于鲎试剂-内毒素的反应是与pH值有关的，必须将等量的检品和鲎试剂混合并显示其pH值在6.0-8.0的范围内。如果需要调节pH 值，使用适当浓度（通常是小于等于0.1N）的无热原的HCL或NaOH缓冲液，不要随便调节未缓冲的盐水或水的pH值。在任何时候都要使用无菌技术。

如果检品含有干扰因素，如产品干扰一节所述，将样品稀释或缓冲到能消除干扰的范围。

检测程序

A. 检测程序和恒温加热的准备

1. 加0.1毫升的每个检测样品的稀释液到检测试管中，至少重复两管。

2. 加0.1毫升的复溶的鲎试剂到每个试管中，先加阴性对照，最后加最高内毒素浓度。接着用手或低速旋涡混合检测试管以避免混合了人工制品。

3. 将反应试管放在37℃的水浴或干浴中恒温60±2分钟，鲎试剂与内毒素的反应时间很关键，如果有很多样品待测，反应应以2-4分钟的间隔开始，以便在上述时间限制内读取每一个检测。由于鲎试剂的反应对温度很灵敏，应小心监测恒温器。还有，凝胶形成反应是很脆弱的，如果在保温期间受到干扰，凝胶会被改变。

B. 内毒素对照系列（阳性水对照）

1. 如果显示与标准终点一致，不需要每次检测都要做内毒素标准系列，做第一套实验时应至少每天做一次内毒素标准系列，如果鲎试剂有任何变化，应重新做一次。

2. 应用库存的溶液制备一套新鲜稀释的2倍稀释系列，包括试剂的标示灵敏度，将0.1ml每个浓度的内毒素加到10×75mm的反应试管中，至少重复两管检测，从阴性（水）对照开始。

3. 加0.1ml的鲎试剂至每支反应试管中，先从阴性对照开始，并按要求混合。

4. 将反应试管放在37℃下不受干扰保温一小时。

C. 检测对照

1. 将0.1ml用于检测的LAL检查用水加入重复两管中。

2. 阴性水（内毒素）对照：没有内毒素系列时，加0.1ml的2λ浓度的内毒素标准品。

3. 阳性样品对照：加0.1ml（双份）的含2λ浓度内毒素的混合物到检品中，可根据有效条件进行缓冲或稀释，这一对照可确保检测无干扰，它的制备是将内毒素加到一部分检品中，因此检品中有2λ浓度，浓缩的内毒素溶液可用来制备产品对照。

4. 最后，每支试管加入0.1ml的鲎试剂，如上所述将其混合并保温。

结果判断

使用凝胶法时，每支试管的检测结果不是阳性就是阴性，试管中形成坚实的凝胶，当试管翻转180°时凝胶仍保持完整的为阳性反应。无凝胶形成或形成一团粘性物质，但试管翻转后不能保持完整的为阴性反应。

当阳性水和样品对照在2λ内毒素浓度为阳性，阴性对照无凝胶形成时，检测结果才有效。

期望值

鲎试剂是根据美国标准内毒素EC-5来标定的，因此灵敏度用EU/ml来表示，标示值的复核是对照EC-5或标准的内毒素对照的一种鲎试验，它们产生一等于或在标示灵敏度的两倍稀释范围内的终点。

标示灵敏度（λ）为0.12EU/ml的鲎试剂的内毒素检测结果列于表I，制备5点内毒素稀释系列，包括标示的灵敏度。

表I：凝胶法检测结果

内毒素稀释（EU/ml）

0.5 0.25 0.12 0.06 0.03

重复两管终点

1 + + + + - 0.06

2 + + + - - 0.12

3 + + + - - 0.12

4 + + + + - 0.06

鲎试剂的灵敏度是通过确定终点的几何均值的重复四管检测的终点换算成常用对数，将常用对数值平均，则LAL灵敏度是该平均对数值的反对数。（见表II）

表二：终点几何均值的计算

终点（EU/ml）Log10终点

0.06 -1.222

0.12 -0.921

0.12 -0.921

0.06 -1.222

均值=-1.071

均值的反对数=0.085

检测实验室初次质量控制程序

在做任何正式检测前应评估检测实验室的变异性和分析实验人员，每个实验人员使用单一批LAL 和内毒素应圆满完成标示LAL灵敏度的复核检测，可接受的范围为0.5λ至2λ之间。

复核鲎试剂标示灵敏度的检测：

将一批新的LAL介绍给检测实验室之前应复核其标示的灵敏度，单一一批LAL内毒素（CSE或RSE）检测不少于4管重复检测，终点的几何均值必须在标示范围内，如上所述。

确定未知样品中的内毒素浓度，检测检品的两倍稀释系列直到达到一终点，内毒素水平的计算用LAL标示灵敏度除以终点几何均值。

表Ⅲ：

样品中内毒素浓度的确定

LAL灵敏度=0.12 EU/ml

样品稀释

重复试管1:2 1:4 1:8 1:16 1:32

1 + + + + -

2 + + + - -

终点检品稀释Log10终点

1:16(0.0625) -1.204

1:8(0.125) -0.903

均值= -1.054

均值的反对数= 0.088

0.088=1.36÷终点均值=0.12 EU/ml÷内毒素浓度=LAL灵敏度EU/ml

产品抑制

在日常鲎试验开始前,应排除潜在的产品抑制,抑制通常与浓度有关,可简单地用LAL检查用水稀释来克服,抑制的通常来源包括:1)酶介凝胶反应的干扰；和2)内毒素对照的分散性的改变。如果两倍内毒素稀释系列的检测终点与一个相同的内毒素系列（阳性水对照）的终点相差大于一个2倍稀释，则存在抑制。

产品抑制可如下辨认出：

标示的鲎试剂灵敏度（λ）=0.12 EU/ml

终点阳性水对照=0.12 EU/ml

终点阳性产品A对照=0.20 EU/ml

终点阳性产品B对照=0.50 EU/ml

产品A在规定范围内而产品B存在抑制。

确定无抑制产品浓度的最简单方法是制备含2λ内毒素浓度的产品系列，检测该系列以及用水稀释的产品系列，下列结果表明产品以1:20或更高稀释倍数稀释无抑制且无内毒素.

样品稀释1:4 1:10 1:20 1:40

产品和2λ内毒素-- -+ ++ ++

产品和LAL检查用水-- -- -- --

酸性或碱性产品可能要求调节pH值至中性以及稀释来解决产品抑制。

最大有效稀释：美国食品和药品管理局规定经静脉给药的药品的内毒素限值为5EU/kg，鞘内药品为0.2EU/ml。但对于一些简单的药品也采用特殊限值例如放射性药品为175EU/kg，这些限值可以用来确定稀释的范围以克服干扰问题而不会超过限定的内毒素浓度，最大有效稀释（MVD）是按照以前提到的文件和其它药典中提供的公式来计算的。

对于有公布限值的药品，MVD可按下列公式计算：

MVD＝内毒素限值×产品效价

灵敏度

例如，环磷酰胺的内毒素限值是0.17EU/mg，如果使用灵敏度为0.125EU/ml的鲎试剂来检测效价为20 mg/ml的产品，MVD等于1:27。

MVD＝0.17 EU/mg×20 mg/ml = 27.2

0.125 EU/ml

在这种情况下, 环磷酰胺最大稀释到1:27可解决可能出现的抑制。

局限性

除非检测条件有效，药品和医疗器械才能用鲎试验方法作为其终产品检验的放行方法。如果检品必须以大于MVD的倍数稀释才能克服抑制，则鲎试验不能作为终产品检测方法。

细菌内毒素检查

细菌内毒素检查 1、实验原理 2、实验试剂 3、试验器具 4、检查方法概述 5、供试品溶液的制备 6、内毒素限值的确定 7、最大有效稀释倍数（MVD）的确定 8、鲎试剂灵敏度复核 9、干扰试验 10、供试品的细菌内毒素检查 1、实验原理：利用鲎试剂与微量内毒素产生凝聚反应的现象，以判断供试品中细菌内毒素的限量是否符合规定的一种方法。 细菌内毒素的量用内毒素单位（EU）表示。 2、实验试剂： ①鲎试剂：从海洋无脊椎动物“鲎”的蓝色血液中提取的变形细胞溶解物，经低温冷冻干燥精制的生物制剂。 鲎试剂的生物活性以其能检出细菌内毒素的最低有效浓度表示，即鲎试剂的灵敏度，单位为EU/ml。当使用新批号的鲎试剂或试验条件发生可能影响检验结果的改变时，应进行鲎试剂灵敏度复核试验。 ②细菌内毒素国家标准品：系自大肠埃希菌提取精制得到的内毒素，用于标定细菌内毒素工作标准品和标定，仲裁鲎试剂灵敏度。 ③细菌内毒素工作标准品：系以细菌内毒素国家标准品为基准标定其效价，用于试验中鲎试剂灵敏度复核、干扰试验及各种阳性对照。 ④细菌内毒素检查用水：指内毒素含量少于0.015EU/ml（用于凝胶法）或0.005 EU/ml （用于光度测定法），且对内毒素试验无干扰作用的灭菌注射用水。 3、实验器具：刻度吸管、凝聚管（10×75mm）、三角瓶、小试管（10×100mm）、试管架、洗耳球、封口膜或金属试管帽、时钟、脱脂棉、吸水纸、剪刀砂轮。 耐热器皿常用干热灭菌法（250℃，30分钟以上）去除，塑料用具应选用无内毒素并且对试验无干扰的器械（目前多为无热源的一次性用品）。 4、检验方法概述 ①凝胶法：限量法、半限量法 ②光度测定法：浊度法（终点浊度法和动态浊度法）、显色基质法（终点浊度法和动态浊度法） 凝胶法：最简单、经济、应用广泛、中国药典的“仲裁”方法，对干扰相对不敏感，较光度测定法不灵敏。 5、供试品溶液的制备 某些供试品需进行复溶、稀释或在水性溶液中浸取制成供试品溶液。 一般要求供试品溶液的PH值在6.0～8.0的范围内。 可使用酸、碱溶液或适宜的缓冲液调节PH值。 6、内毒素限值的确定 一般按公式：L≡K／M 式中： L为供试品的细菌内毒素限量，以EU／ml，EU／mg、或EU／U（活性单位）表示。

中国药典2010年版《细菌内毒素检查法》

中国药典2010年版《细菌内毒素检查法》 ——凝胶法 凝胶法 凝胶法系通过鲎试剂与内毒素产生凝集反应的原理来检测或半定量内毒素的方法。 鲎试剂灵敏度复核试验在本检查法规定的条件下，使鲎试剂产生凝集的内毒素的最低浓度即为鲎试剂的标示灵敏度，用EU/ml表示。当使用新批号的鲎试剂或试验条件发生了任何可能影响检验结果的改变时，应进行鲎试剂灵敏度复核试验。 根据鲎试剂灵敏度的标示值（λ），将细菌内毒素国家标准品或细菌内毒素工作标准品用细菌内毒素检查用水溶解，在旋涡混合器上混匀15分钟，然后制成2λ、λ、0.5λ和0.25λ四个浓度的内毒素标准溶液，每稀释一步均应在旋涡混合器上混匀30秒钟。取分装有0.1ml鲎试剂溶液的10mm×75mm试管或复溶后的0.1ml/支规格的鲎试剂原安瓿18支，其中16管分别加入0.1ml不同浓度的内毒素标准溶液，每一个内毒素浓度平行做4管；另外2管加入0.1ml细菌内毒素检查用水作为阴性对照。将试管中溶液轻轻混匀后，封闭管口，垂直放入37℃±1℃恒温器中，保温60分钟±2分钟。 将试管从恒温器中轻轻取出，缓缓倒转180°，若管内形成凝胶，并且凝胶不变形、不从管壁滑脱者为阳性；未形成凝胶或形成的凝胶不坚实、变形并从管壁滑脱者为阴性。保温和拿取试管过程应避免受到振动造成假阴性结果。 当最大浓度2λ管均为阳性，最低浓度0.25λ管均为阴性，阴性对照管为阴性，试验方为有效。按下式计算反应终点浓度的几何平均值，即为鲎试剂灵敏度的测定值(λc). λc=1g-1(∑X/4)

式中 X为反应终点浓度的对数值（1g）。反应终点浓度是指系列递减的内毒素浓度中最后一个呈阳性结果的浓度。 当λc在0.5λ-2λ(包括0.5λ和2λ)时，方可用于细菌内毒素检查，并以标示灵敏度λ为该批鲎试剂的灵敏度。 干扰试验按表1制备溶液A、B、C和D，使用的供试品溶液应为未检验出内毒素且不超过最大有效稀释倍数（MVD）的溶液，按鲎试剂灵敏度复核试验项下操作。 只有当溶液A和阴性对照溶液D的所有平行管都为阴性，并且系列溶液C 的结果在鲎试剂灵敏度复核范围内时，试验方为有效。按下式计算系列溶液C和B的反应终点浓度的几何平均值（Es和Et）。 Es= 1g-1(∑Xs/4) Et= 1g-1(∑Xt/4) 式中，Xs、Xt分别为系列溶液C和溶液B的反应终点浓度的对数值（1g）。当Es在0.5λ—2λ(包括0.5λ和2λ)及Et在0.5Es—2Es (包括0.5Es 和2Es)时，认为供试品在该浓度下无干扰作用。若供试品溶液在小于MVD 的稀释倍数下对试验有干扰，应将供试品溶液进行不超过MVD的进一步稀释，再重复干扰试验。 表1 凝胶法干扰试验溶液的制备

内毒素法

细菌内毒素检查法标准操作规程 1 目的 建立细菌内毒素检查法的标准操作规程。规范细菌内毒素检验操作，确保检验数据的准确性。 2 范围 适用于细菌内毒素的检验操作。 3 职责 3.1 质量控制部检验人员对具体操作负责； 3.2 质量保证部负责监督本规程的执行。 4 定义 无 5 内容 5.1 概述与原理 本法系利用鲎试剂来检测或量化由革兰阴性菌产生的细菌内毒素，以判断供试品中内毒素的限量是否符合规定的一种方法。 细菌内毒素检查包括两种方法，即凝胶法和光度测定法，后者包括浊度法和显色基质法。供试品检测时，可使用其中任何一种方法进行试验。当测定结果有争议时，除另有规定外，以凝胶限度试验结果为准。 基本原理：鲎试剂是鲎血液细胞提取物的冻干品，主要包含4种成分，分别是C 因子、B因子、凝固酶原和凝固蛋白原。细菌内毒素检查法主要依靠细菌内毒素可以活化其中的C因子，使鲎试剂发生一系列的酶联反应，最终形成凝胶或使凝固酶活化某些外加的显色集团（显色法）的原理，来检测细菌内毒素的量。 细菌内毒素的活性单位有两种表达方式，即EU和IU。美国、中国和日本扥国家使用EU，欧洲地区使用IU。在活性量值上，1EU=1IU，计算是可以互换。 5.2 仪器与用具 5.2.1 电子天平、电热干燥箱、时钟、水浴锅、温度计、试管架、漩涡器、剪刀、无菌封口膜、无热原吸头、试管、砂轮、移液枪，75%乙醇、木棉等。 5.2.2 细菌内毒素标准品 细菌内毒素标准品按级别分为国际标准品、国家标准品和工作标准品。其中，国际标准品是由WHO制备，在世界范围内进行效价的协作标定，主要用于世界各国标定各自国家的标准品之用，细菌内毒素工作标准品系以细菌内毒素国家标准品为基准标定其效价。在细菌内毒素检查试验中，应使用细菌内毒素国家标准或细菌内毒素工作标准品。 5.2.3 细菌内毒素检查用水：内毒素含量小于0.015EU/mL（凝胶法），且对内毒素试验无干扰作用。 5.2.4 鲎试剂：一批新的鲎试剂在首次使用时要先进行灵敏度复核，结果符合药典规定后，方可用于后续试验。制备或试验条件发生了任何可能影响检验结果的改变时，应进行鲎试剂试验。

细菌内毒素检查法---------------操作规程

******有限公司 标准操作规程 目的 建立细菌内毒素检查操作规程，保证检测结果的准确性。 适用范围 所有原料、成品的细菌内毒素检查。 责任人 QC检验员 内容 1 简述 1.1 本法系利用鲎试剂来检测或量化由革兰阴性菌产生的细菌内毒素，以判断供试品中细菌毒素的限量是否符合规定的一种方法。 1.2 细菌内毒素检查包括凝胶法和光度测定法两种方法。供试品检测时可使用其中任何一种方法。当测定结果有争议时，除另有规定外，以凝胶法结果为准。 1.3 本规范适用于凝胶法检查。凝胶法系通过鲎试剂与内毒素产生凝集反应的原理来检测或半定量内毒素的方法。 1.4 细菌内毒素的量用内毒素单位(EU)表示 1.5 细菌内毒素国家标准品(NSE)系自大肠埃希菌提取精制而成，用于标定、复核、仲裁鲎试剂灵敏度和标定细菌内毒素工作标准品的效价。 1.6 细菌内毒素工作标准品(WSE)系以细菌内毒素国家标准品为基准标定其效价，用于试验中的鲎试剂灵敏度复核、干扰试验及各种阳性对照。 1.7 凝胶法细菌内毒素检查用水(BET水)系指内毒素含量小于0.015Eu/ml灭菌注射用水。光度测定法用的细菌内毒素检查用水，其内毒素的含量应小于0.005Eu/ml。 1.8 鲎试剂灵敏度复核试验在本检查法规定的条件下，使鲎试剂产生凝集的内毒素

******有限公司 标准操作规程 的最低浓度即为鲎试剂的标示灵敏度,用EU/ml表示。当使用新批号的鲎试剂或试验条件发生了任何可能影响检验结果的改变时，应进行鲎试剂灵敏度复核试验。 1.9 供试品干扰试验项用于建立新品种细菌内毒素检查方法以及供试品的配方和生产工艺或试验环境有变化，鲎试剂来源不同或供试品阳性对照结果呈阴性时确定供试品是否存在抑制或增强作用。 1.10 检查法项为供试品细菌内毒素检查方法。阴性对照、阳性对照和供试品阳性对照必须同时进行，否则试验结果无效。 2实验材料及用具 2.1 天平供试品称量用，感量为0.1mg以下。 2.2 电热干燥箱除外源性内毒素用，温度应能维持250℃以上至少一小时。 2.3 恒温水浴箱或适宜的恒温器，应能在37土1℃保持一小时。 2.4 水银温度计或酒精温度计，精度在1℃以下。 2.5 旋涡混合器 2.6 鲎试剂(应具有国家主管部门的批准文号)及细菌内毒素检查用水(符合规定)。2.7 细菌内毒素国家标准品(NSE)，细菌内毒素工作标准品(WSE)，除另有规定外应由中国药品生物制品检定所统一发放。 2.8 实验用具移液管(或刻度吸管，定量移液器)、凝集管(103 75mm)、三角瓶、小试管(163100mm)、试管架、洗耳球、封口膜或金属试管帽、时钟、脱脂棉、吸水纸、剪刀、砂轮所用玻璃器皿须经250℃干烤至少1小时。塑料用具应使用其它适宜的除细菌内毒素方法。 2.9 试剂 75%乙醇、蒸馏水、5%重铬酸钾硫酸洗液。 3 操作方法 3.1 试验准备 3.1.1 洗液的配制配制铬酸洗液或其他适宜的细菌内毒素灭活剂。 3.1.2 玻璃器皿的洗涤将被洗涤的玻璃器皿用洗涤剂和自来水洗净并空干水分后置洗液中浸泡4小时，取出将洗液滤干，用自来水将残余的洗液洗净，再用新鲜蒸馏水冲洗干燥后置适宜的密闭金属容器中，迅速置烤箱中。

中华人民共和国国家标准细菌内毒素检测方法

医用输液、输血、注射器具细菌内毒素检验方法 中华人民共和国国家标准 GB/T14233.2—93 1993-03-16发布 一、定义及适用范围:本法系列用鲎试剂与细菌内毒素产生凝集反应 的机理，以判断供试品中内毒素限量是否符合规定的一种方法。 用以代替家兔法对供试品进行热原初试。本法仅适用于一次性使用输液器、输血器。其他产品可参照使用。 二、主要设备:超净工作台、电热干燥箱、恒温水浴。 三、试剂 1、细菌内毒素国家标准品：用于仲裁鲎试剂灵敏度和试验中阳性对照。 2、细菌内毒素工作标准品：用于标定鲎试剂灵敏度和试验中阳性对照。 3、鲎试剂：灵敏度为0.25EU/ml，规格为0.5ml。 4、无热原水：内毒素含量小于0.05EU/ml。 四、试验前准备 1、器具除热原:与试验液接触的所有器具均应除热原。玻璃器具置电热干燥箱内250℃干烤至少60min；塑料器具置30%双氧水中浸泡 4h，再用无热原水冲洗后于60℃烘干备用。 2、鲎试剂灵敏度测定 （1）试验前应核对使用批号鲎试剂的灵敏度，应符合规定。 （2）灵敏度测定：根据标示的灵敏度范围，将细菌内毒素工作 标准品用无热原水以1→2等比稀释，选择能出现阳性和阴性结果的4个连续稀释液。取同一批号鲎试剂若干支，分别按标示量

加入无热原水溶解为鲎试剂溶解液。取10mm×75mm试管若干 支，分别加入0.1ml鲎试剂溶解液，加入内毒素稀释液0.1ml，每一稀释液平行操作4管，轻轻振动试管混匀内容物，封闭管 口，置37±1℃恒温水浴中保温60±2min观察结果。最高浓度的4管应均为阳性，最低浓度的4管应为阴性。 五、试验方法 1、供试品数量 :同一批号至少3个单位供试品。 2、浸提介质:无热原水。 3、供试液制备:在无菌条件下，每套输液器内腔注入10ml，输血器内腔注入15ml浸提介质，反复荡洗5次后两端密封，置37±1℃恒温箱中保温2h，取出后将供试液汇集至一无热原具塞玻璃容器内。供试液贮存应不超过2h。 4、试验步骤:将鲎试剂和细菌内毒素工作标准品分别按标示量加入无热原水溶解。细菌内毒素工作标准品逐次稀释至0.5Eu/ml，供作阳性对热。取10mm×75mm试管6支，其中供试品管2支各加入0.1ml 内毒素工作标准品稀释液，阴性对照管2支各加入0.1ml无热原水，阳性对照管2支各加入0.1ml内毒素工作标准品稀释液，再逐一加入0.1ml鲎试剂溶解液。轻轻混匀试管内容物，封闭管口，垂直放入37±1℃水浴中保温60±2min，轻轻取出，观察结果。 5、结果判定 1)、将试管缓慢倒转180°，管内容物呈坚实凝胶者为阳性，记录为（+），不呈凝胶状或虽呈凝胶状但不能保持完整者为阴性，记录为（-）。

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中国药典XXXX年版《细菌内毒素检查法》 ——凝胶法 凝胶法 凝胶法系通过鲎试剂与内毒素产生凝集反应的原理来检测或半定量内毒素的方法。 鲎试剂灵敏度复核试验在本检查法规定的条件下，使鲎试剂产生凝集的内毒素的最低浓度即为鲎试剂的标示灵敏度，用EU/ml表示。当使用新批号的鲎试剂或试验条件发生了任何可能影响检验结果的改变时，应进行鲎试剂灵敏度复核试验。 根据鲎试剂灵敏度的标示值（λ），将细菌内毒素国家标准品或细菌内毒素工作标准品用细菌内毒素检查用水溶解，在旋涡混合器上混匀15分钟，然后制成2λ、λ、0.5λ和0.25λ四个浓度的内毒素标准溶液，每稀释一步均应在旋涡混合器上混匀30秒钟。取分装有0.1ml鲎试剂溶液的10mm×75mm试管或复溶后的0.1ml/支规格的鲎试剂原安瓿18支，其中16管分别加入0.1ml不同浓度的内毒素标准溶液，每一个内毒素浓度平行做4管；另外2管加入0.1ml细菌内毒素检查用水作为阴性对照。将试管中溶液轻轻混匀后，封闭管口，垂直放入37℃±1℃恒温器中，保温60分钟±2分钟。 将试管从恒温器中轻轻取出，缓缓倒转180°，若管内形成凝胶，并且凝胶不变形、不从管壁滑脱者为阳性；未形成凝胶或形成的凝胶不坚实、变形并从管壁滑脱者为阴性。保温和拿取试管过程应避免受到振动造成假阴性结果。 当最大浓度2λ管均为阳性，最低浓度0.25λ管均为阴性，阴性对照管为阴性，试验方为有效。按下式计算反应终点浓度的几何平均值，即为鲎试剂灵敏度的测定值(λc). λc=1g-1(∑X/4)

式中 X为反应终点浓度的对数值（1g）。反应终点浓度是指系列递减的内毒素浓度中最后一个呈阳性结果的浓度。 当λc在0.5λ-2λ(包括0.5λ和2λ)时，方可用于细菌内毒素检查，并以标示灵敏度λ为该批鲎试剂的灵敏度。 干扰试验按表1制备溶液A、B、C和D，使用的供试品溶液应为未检验出内毒素且不超过最大有效稀释倍数（MVD）的溶液，按鲎试剂灵敏度复核试验项下操作。 只有当溶液A和阴性对照溶液D的所有平行管都为阴性，并且系列溶液C 的结果在鲎试剂灵敏度复核范围内时，试验方为有效。按下式计算系列溶液C和B的反应终点浓度的几何平均值（Es和Et）。 Es= 1g-1(∑Xs/4) Et= 1g-1(∑Xt/4) 式中，Xs、Xt分别为系列溶液C和溶液B的反应终点浓度的对数值（1g）。当Es在0.5λ—2λ(包括0.5λ和2λ)及Et在0.5Es—2Es (包括0.5Es 和2Es)时，认为供试品在该浓度下无干扰作用。若供试品溶液在小于MVD 的稀释倍数下对试验有干扰，应将供试品溶液进行不超过MVD的进一步稀释，再重复干扰试验。 表1 凝胶法干扰试验溶液的制备

细菌内毒素定量检测临床意义

细菌内毒素定量检测的临床意义 1.细菌内毒素的本质 细菌内毒素为革蓝氏阴性菌及某些阴性菌样微生物，如立克次体、螺旋体、衣原体细胞壁外膜中的一种脂多糖（Lipoplydscharide, LPS）成分，它往往在细菌生长时释放或细菌死亡时裂解出来。 2.细菌内毒素在机体内反应及临床表现 微量的细菌内毒素进入机体后即可引起机体内发热、血管扩张、血管通透性增加、中性粒细胞增多、补体激活、机体血压下降等一系列病理、生理反应，严重时可导致弥漫性血管内凝血（DIC）及多器官功能衰竭直至休克、死亡。细菌内毒素(内毒素)作为革蓝氏阴性菌细胞壁最外层中的脂多糖(LPS)，当严重细菌感染以及脓毒血症和多脏器功能衰竭时它在血浆中的浓度升高，而自身免疫过敏和病毒感染时内毒素水平不会升高，但局部有限的细菌感染，轻微的感染不会导致其升高。内毒素水平的升高一般出现在严重休克，全身性炎症反应综合症(SIRS)和多多脏器功能紊乱综合症(MODS)，无细菌性感染患者中水平通常低于那些有细菌性病灶的患者，而从肠道释放因子或细菌移位可能引起诱导。 3.细菌内毒素水平检测在临床上应用 体液细菌内毒素水平检测是诊断和监测细菌性(尤其是革蓝氏阴性菌)疾病感染的一个重要参数，通过内毒素水平的定量快速检测可以预示： (1)作为一个急性重要参数用来鉴别诊断细菌性和非细菌性感染和炎症。(2)监测有感染危险的患者(如外科术后和器官移植后免疫抑制期以及多处创伤后)以及需要重症监护患者，用来探测细菌感染的全身影响或检测脓毒性并发症。(3)评价严重炎性疾病临床进程及预后，如腹膜炎、脓毒症、SIRS和MODS。4.体液内毒素水平测定的临床意义 体液内毒素水平是严重细菌性炎症(尤其是革蓝氏阴性菌)的一个重要的特异性指，而且也是脓毒症和炎症活动有关的多脏器衰竭的可靠指标。内毒

细菌内毒素检查标准操作规程..

细菌内毒素检查标准操作规程 1 简述 1.1 本规范适用于中国药典2005年版附录中细菌内毒素检查法一凝胶法和光度测定法。后者包括浊度法和显色基质法。供试品检测时，可使用其中任何一种方法进行实验。当 测定结果有争议时，除另有规定外，以凝胶法结果为准。 1.2 供试品细菌毒素限值的确定。 （一）药典中有规定的，按供试品各论中规定限值； （二）尚无标准规定的，按以下公式确定供试品内毒素限值： L=K/M 式中 L为供试品的细菌内毒素限值，以EU/ml、EU/mg、EU/U表示。 K为按规定的给药途径，人用每公斤体重每小时最大可接受的内毒素剂量，以EU/kg/h表示。其中注射剂，K=5EU/kg/h；放射性药品注射剂，K=2.5EU/kg/h；鞘内用注射剂， K=0.2EU/kg/h。 M为人用每公斤体重每小时的最大供试品剂量，以ml/kg/h、ml/kg/h、U/kg/h表示。药品人用最大剂量可参阅国家批准的药品说明书和《临床用药须知》等权威著作，中国人 均体重按60kg计算，注射时间小于1小时的按1小时计。按人用剂量计算限值时，如遇特殊情况，可根据生产和临床用实际情况做必要调整，但需说明理由。 1.3 供试品最大有效稀释倍数的确定 供试品的最大有效稀释倍数（MV D）按下式计算： MV D=C?L/λ L为供试品的细菌内毒素限值；C为供试品溶液的浓度。当L以EU/ml表示时，C等于1.0ml/ml；当L的单位以EU/mg或EU/U表示时，C为供试品制备成溶液后的浓度，单位为mg/ml 或U/ml。如供试品为注射用无菌粉末或原料药，则MV D取1，可计算供试品的最小有效稀释浓度C: λ/L。

细菌内毒素检查方法

细菌内毒素检查方法综述 【关键词】细菌内毒素检查法；,,,机理；,,,预实验；,,,特殊值 细菌内毒素检查是静脉、鞘内给药药物以及放射性药物等质量检查的一个重要方面。以前，细菌内毒素检查用家兔热原法进行，自从1980年《美国药典》第20版收载了细菌内毒素实验以来，《英国药典》《欧洲药典》《日本药局方》《中国药典》等相继收载了该方法。1995年《美国药典》第23版已收载了471种药品进行细菌内毒素检查，而《中国药典》1995年版也收载了12种药品进行细菌内毒素检查［1］，2000版更收载有47种药品利用此方法进行热原检查。细菌内毒素检查法已逐渐代替家兔热原检查法，显示出其在检查热原方面的重要性。本文对细菌内毒素检查法作一综述。 1 方法、机理及影响因素 1.1 应用的方法目前，美国药品食品管理局（FDA）承认3种鲎试剂检测细菌内毒素含量的方法，即凝胶（gelclot）法、生色（chromogenic）法和动态浊度（keniticturbidimetry）法［2］。近年来较新的方法有水箭电泳免疫法（测残余蛋白）、酶联免疫吸附法（测残余酶）。后者所需鲎试剂仅相当于凝胶法的1/100，且灵敏度更高，抗干扰能力更好。《中国药典》1995年版只采用凝胶法。凝胶法是将等体积的供试品溶液和新配制的鲎试剂（TAL）溶液在试管中混匀，一般各0.1 ml，（37±1）℃反应（60±2）min。如果被检测的溶液不含干扰凝集反应的因素，且其含有内素素浓度等于或大于所用鲎试剂的灵敏度（λ）时，就会在试管中显示阳性反应，即形成凝胶；否则呈阴性反应，即呈澄明溶液或轻度混浊，视内毒素的浓度而定［1］。该反应极其灵敏，凝胶形成速率与内毒素浓度成正比，并受温度、反应物中Ca2 /Mg2 离子浓度和pH等因素的影响［3］。同样，《中国药典》2000年版也只采用凝胶法。淘金者https://www.sodocs.net/doc/d711500246.html, 1.2 凝胶法鲎试剂与内毒素反应的机理见图1。 图1 凝胶法鲎试剂与内毒素反应的机理（略） 2 影响细菌内毒素检查的因素 2.1 检品的干扰pH值、离子浓度以及某些干扰成分，都会影响到检查结果的准确性，得到所谓“假阳性”或“假阴性”结果。只有证实检品对凝集反应无干扰之后，检查的结果才是可信的。判断检品是否有干扰要做检品的干扰实验。

药典三部(2015版)-通则-1143细菌内毒素检查法

药典三部(2015版)-通则-1143细菌内毒素检查法

1143 细菌内毒素检查法 本法系利用鲎试剂来检测或量化由革兰阴性菌产生的细菌内毒素，以判断供试品中细菌内毒素的限量是否符合规定的一种方法。 细菌内毒素检查包括两种方法，即凝胶法和光度测定法，后者包括浊度法和显色基质法。供试品检测时，可使用其中任何一种方法进行试验。当测定结果有争议时，除另有规定外，以凝胶限度试验结果为准。 本试验操作过程应防止内毒素的污染。 细菌内毒素的量用内毒素单位（EU）表示，1EU与1个内毒素国际单位（IU）相当。 细菌内毒素国家标准品系自大肠埃希菌提取精制而成，用于标定、复核、仲裁鲎试剂灵敏度、标定细菌内毒素工作标准品的效价，干扰试验及检查法中编号B和C溶液的制备、凝胶法中鲎试剂灵敏度复核试验、光度测定法中标准曲线可靠性试验。 细菌内毒素工作标准品系以细菌内毒素国家标准品为基准标定其效价，用于干扰试验及检查法中编号B和C溶液的制备、凝胶法中鲎试剂灵敏度复核试验、光度测定法中标准曲线可靠性试验。 细菌内毒素检查用水应符合灭菌注射用水标准，其内毒素含量小于0.015EU/ml（用于凝胶法）或0.005EU/ml（用于光度测定法），且对内毒素试验无干扰作用。 试验所用的器皿需经处理，以去除可能存在的外源性内毒素。耐热器皿常用干热灭菌法（250℃、30分钟以上）去除，也可采用其他确证不干扰细菌内毒素检查的适宜方法。若使用塑料器皿，如微孔板和与微量加样器配套的吸头等，应选用标明无内毒素并且对试验无干扰的器具。 供试品溶液的制备某些供试品需进行复溶、稀释或在水性溶液中浸提制成供试品溶液。必要时，可调节被测溶液（或其稀释液）的pH值，一般供试品溶液和鲎试剂混合后溶液的pH值在6.0～8.0的范围内为宜，可使用适宜的酸、碱溶液或缓冲溶液调节pH值。酸或碱溶液须用细菌内毒素检查用水在已去除内毒素的容器中配制。缓冲液必须经过验证不含内毒素和干扰因子。 内毒素限值的确定药品、生物制品的细菌内毒素限值（L）一般按以下公

细菌内毒素检查验证方案

细菌内毒素检查验证方案文件编号：VP-QC-2015-06 起草人： 审核人： 批准人：

批准日期：年月日

目录 1 概述 1 2 验证目的及范围 1 3 验证小组人员组成及职责 1 4 验证依据 2 5 验证前准备 2 6 验证的实施 2 7 偏差处理 5 8 验证数据及评估 5 9验证报告及评审 5 10 再验证及周期 5 11 验证文件及归档 5 12 附件 5

1 概述 细菌内毒素检查法系利用鲎试剂来检测或量化由格兰阴性菌产生的细菌内毒素，以判断供试品中细菌内毒素的限量是否符合规定的一种方法。 细菌内毒素检查报告两种发放，即凝胶法和光度测定法，后者包括浊度法和显色基质法，供试品检测时，可使用其中任何一种方法进行实验。公司自行制备的注射用水需进行细菌内毒素的检查，本方案将采用凝胶法进行试验。 2 验证目的和方法 本验证方案适用于注射用水的细菌内毒素的检查，通过对鲎试剂灵敏度复核试验、干扰试验及凝胶限度试验，建立该产品的细菌内毒素检查方法，并对其有效性进行评价，确保检测方法的专属性、灵敏度，保证检测结果可符合质量标准要求。 3.验证小组人员组成及职责： 3.1验证小组由以下部门人员组成：质量部、QC、生产部。 3.2 验证小组组成及职责列表

4 验证依据 《中华人民共和国药典》2015版1143 细菌内毒素检查法 5.验证前准备 5.1验证人员培训：验证报告起草人有责任在方案批准后（且在验证实施前）对本次验证相关人员进行培训。培训人员记录见附件1。 5.2 确认仪器仪表设施经过确认和校验，并填写确认记录。 6 验证的实施 6.1实验材料及用具 6.1.1电子天平 6.1.2. 电热干燥箱

细菌内毒素检查验证方案设计

细菌毒素检查验证方案文件编号：VP-QC-2015-06 起草人： 审核人： 批准人： 批准日期：年月日

目录 1 概述 1 2 验证目的及围 1 3 验证小组人员组成及职责 1 4 验证依据 2 5 验证前准备 2 6 验证的实施 2 7 偏差处理 5 8 验证数据及评估 5 9验证报告及评审 5 10 再验证及周期 5 11 验证文件及归档 5 12 附件 5

1 概述 细菌毒素检查法系利用鲎试剂来检测或量化由格兰阴性菌产生的细菌毒素，以判断供试品中细菌毒素的限量是否符合规定的一种方法。 细菌毒素检查报告两种发放，即凝胶法和光度测定法，后者包括浊度法和显色基质法，供试品检测时，可使用其中任何一种方法进行实验。公司自行制备的注射用水需进行细菌毒素的检查，本方案将采用凝胶法进行试验。 2 验证目的和方法 本验证方案适用于注射用水的细菌毒素的检查，通过对鲎试剂灵敏度复核试验、干扰试验及凝胶限度试验，建立该产品的细菌毒素检查方法，并对其有效性进行评价，确保检测方法的专属性、灵敏度，保证检测结果可符合质量标准要求。 3.验证小组人员组成及职责： 3.1验证小组由以下部门人员组成：质量部、QC、生产部。 3.2 验证小组组成及职责列表 4 验证依据 《中华人民国药典》2015版1143 细菌毒素检查法 5.验证前准备 5.1验证人员培训：验证报告起草人有责任在方案批准后（且在验证实施前）对本次验证相关人员进行培训。培训人员记录见附件1。 5.2确认仪器仪表设施经过确认和校验，并填写确认记录。

6 验证的实施 6.1实验材料及用具 6.1.1电子天平 6.1.2. 电热干燥箱 6.1.3. 恒温恒湿箱 6.1.4.水银温度计 6.1.5. 旋涡混合器 6.1.6. 鲎试剂（具有国家主管部门的批准文号） 6.1. 7.细菌毒素工作标准品(由中国药品生物制品检定所统一发放的标准品) 6.1.8.细菌毒素检查用水：应符合灭菌注射用水标准，其毒素含量小于0.015EU/ml，且 对毒素试验无干扰作用。 6.1.9. 实验用具:移液管、凝集管、三角瓶、试管、试管架、洗耳球、时钟、75%酒精棉、剪刀、砂轮。 6.2实验准备 6.2.1玻璃器皿的洗涤将玻璃器皿放入铬酸洗液或其他热原灭活剂或清洗液中充分浸泡，然后取出将洗液空干，用自来水将残留洗液彻底洗净，再用蒸馏水反复冲洗三遍以上，空干后放入适宜的密闭金属容器中或用锡箔纸包好后再放入金属容器，放置入烤箱。

细菌内毒素检查标准操作规程

细菌内毒素检查标准操作规程

细菌内毒素检查标准操作规程 1 简述 1.1 本规范适用于中国药典附录中细菌内毒素检查法一凝胶法和光度测定法。后者包括浊度法和显色基质法。供试品检测时，可使用其中任何一种方法进行实验。当 测定结果有争议时，除另有规定外，以凝胶法结果为准。 1.2 供试品细菌毒素限值的确定。 （一）药典中有规定的，按供试品各论中规定限值； （二）尚无标准规定的，按以下公式确定供试品内毒素限值： L=K/M 式中 L为供试品的细菌内毒素限值，以EU/ml、EU/mg、EU/U表示。 K为按规定的给药途径，人用每公斤体重每小时最大可接受的内毒素剂量，以EU/kg/h表示。其中注射剂，K=5EU/kg/h；放射性药品注射剂，K=2.5EU/kg/h；鞘内用注射剂， K=0.2EU/kg/h。 M为人用每公斤体重每小时的最大供试品剂量，以ml/kg/h、ml/kg/h、U/kg/h表示。药品人用最大剂量可参阅国家批准的药品说明书和《临床用药须知》等权威著作，中国人 均体重按60kg计算，注射时间小于1小时的按1小时计。按人用剂量计算限值时，如遇特殊情况，可根据生产和临床用实际情况做必要调整，但需说明理由。 1.3 供试品最大有效稀释倍数的确定 供试品的最大有效稀释倍数（MV D）按下式计算： MV D=C?L/λ L为供试品的细菌内毒素限值；C为供试品溶液的浓度。当L以EU/ml表示时，C等于1.0ml/ml；当L的单位以EU/mg或EU/U表示时，C为供试品制备成溶液后的浓度，单位为mg/ml 或U/ml。如供试品为注射用无菌粉末或原料药，则MV D取1，可计算供试品的最小有效稀释浓度C: λ/L。 λ在凝胶法中为鲎试剂的标示灵敏度，在光度测定法中为所使用的标准曲线中的最低内毒素浓度。 1.4 在使用新一批号的鲎试剂前，必须进行鲎试剂灵敏度复核实验。 1.5 药典中已有规定的品种或有其它内毒素检验标准的品种，可直接进行内毒素检查，如在检验中出现干扰的情况需再进行干扰实验的验证；其它未建立内毒素检查的品种需 先进行干扰实验，确定不干扰浓度后再进行内毒素检查。 1.6 细菌内毒素检查过程中的阴性对照、阳性对照和供试品对照必须同时进行，否则实验结果无效。 2 实验材料及用具 2.1 天平供试品称量用，精度为0.1mg以下。

细菌内毒素检查方法建立中应注意的几个问题.

细菌内毒素检查方法建立中应注意的几个问题 摘要：本文对细菌内毒素检查方法的建立、限值的确定、方法学验证及常见问题进行了介绍。在建立细菌内毒素检查法之前，应尽可能多的收集有关该药品的基本信息，例如：有关样品的溶解性信息，推荐的稀释液，在水中的溶解度，以及最适溶剂；样品的pH范围；分子量大小；产品规格、体积或重量；拟用于临床的用法和用量等等。以便选择合适的样品处理方法和内毒素检查方法，对于早期研发阶段的药物，应选择合适的赋形剂，以有利于细菌内毒素检查中对样品的稀释处理。此外，在确定内毒素限值时还应尽可能采用最大人拟用剂量，为临床安全性和有效性研究中增加剂量留出空间。 一、细菌内毒素检查方法建立的主要步骤 对某一新化合物建立细菌内毒素检查方法时，首先应根据人体最大日给药剂量和给药途径，计算和确定样品的内毒素限值，选择合适的鲎试剂，根据临床规格，计算最大有效稀释倍数，稀释产品，并在低于最大稀释倍数的浓度下进行检查。可以采用凝胶法，也可以采用终点法或动态法。当测定结果有争议时，除另有规定外，以凝胶法为准。 1、细菌内毒素限值的确定 一个药品在投放市场前，它是否满足内毒素限值的要求？样品的内毒素含量具体是多少？这些问题不但关注用药安全，还应该最大限度的提供有关内毒素含量的准确信息，为药品生产过程中质量控制提供警戒信息。尽管细菌内毒素检查方法的建立是一个科学方法的研究过程，但其最终目的还是要为控制药品质量服务。因此，在方法建立时，不但要阐明限值的合理性，考虑技术可能达到的限值，同时还要满足相关药品管理法规的要求。 研究人员在建立方法的早期，一般会按照临床建议的最大人用剂量确定一个非正式的限值，这个限值可以根据实验室可以达到的最低检测水平，把限值订的相对比较严格，但往往由于早期的临床剂量会比最终上市的临床剂量高几倍，所以严格的限值，可能会使得正式生产时很多产品不能通过检查，从而造成不必要的浪费；因此参按照法规允许的最高水平，酌情确定样品的限值。 样品内毒素限值的确定一般与临床人体最大给药剂量有关，剂量越大，单位重量或体积的内毒素限值越低。一般按以下公式计算：内毒素限值L=K/M。式中内毒素限值L是以EU/ml、EU/mg或EU/u表示；K为按规定的给药途径，人体每公斤体重每小时最大可耐受的内毒素剂量，以EU/（kg.h）表示，注射剂K=5EU/（kg.h），其中放射性药品注射剂K=2.5EU/（kg.h），鞘内用注射剂K=0.2EU/（kg.h）。一般我国人群平均体重按60kg计算，人体对细菌内毒素的最大耐受量为300EU/h；另我国人体的平均体表面积按1.55m2计算，人体每平方米的最大耐受剂量为(300EU/h)/ 1.55m2 =（193EU/h）/ m2 。 M为人体每公斤体重每小时接受的最大给药剂量，以ml/（kg.h）、mg/（kg.h）或u/（kg.h）表示。 内毒素限值计算举例（一）：A注射剂的人体最大用量为每小时1.5g，每公斤每小时体重的剂量为1.5g/60kg=0.025g/kg=25mg/kg，内毒素限值L=K/M=(5EU/kg)/( 25mg/kg ) = 0.2EU/mg。在细菌内毒素检查法中，细菌内毒素标准品和鲎试剂常常以EU/ml表示，所以在具体实验中样品的内毒素的限量可以转换为EU/ml的表示方法，可使实验操作计算更为方便。假定产品A的浓度为100mg/ml（或原料药经溶解后的浓度为100mg/ml）, 那么，将产品A的限值从EU/mg转变为EU/ml时，内毒素限值L= 0.2 EU/mg 100 mg/ml = 20 EU/ml。内毒素限值计算举例（二）：B注射剂的临床最大用药剂量为1g/m2，规格为50mg/ml，内毒素限值L=（193 EU/ m2）/（1g/m2）=193 EU/g=0.193 EU/mg，转换为EU/ml 表示时，L = 0.193 EU/mg50 mg/ml=9.65EU/ml。 大输液品种的限值一般定为0.5EU/ml，灭菌注射用水则定为0.25EU/ml。内毒素限值没有考

细菌内毒素检查法操作规程

标准操作规程 目的 建立细菌内毒素检查操作规程，保证检测结果的准确性。 适用范围 所有原料、成品的细菌内毒素检查。 责任人 检验员 内容 1简述 1.1本法系利用鲎试剂来检测或量化由革兰阴性菌产生的细菌内毒素，以判断供试品中细菌毒素的限量是否符合规定的一种方法。 1.2 细菌内毒素检查包括凝胶法和光度测定法两种方法。供试品检测时可使用其中任何一种方法。当测定结果有争议时，除另有规定外，以凝胶法结果为准。 1.3 本规范适用于凝胶法检查。凝胶法系通过鲎试剂与内毒素产生凝集反应的原理来检测或半定量内毒素的方法。 1.4 细菌内毒素的量用内毒素单位（）表示 1.5 细菌内毒素国家标准品（）系自大肠埃希菌提取精制而成，用于标定、复核、仲裁鲎试剂灵敏度和标定细菌内毒素工作标准品的效价。 1.6 细菌内毒素工作标准品（）系以细菌内毒素国家标准品为基准标定其效价，用于试验中的鲎试剂灵敏度复核、干扰试验及各种阳性对照。 1.7 凝胶法细菌内毒素检查用水（水）系指内毒素含量小于0.015灭菌注射用水。光度

测定法用的细菌内毒素检查用水，其内毒素的含量应小于0.005。 1.8 鲎试剂灵敏度复核试验在本检查法规定的条件下，使鲎试剂产生凝集的内毒素 标准操作规程 的最低浓度即为鲎试剂的标示灵敏度，用表示。当使用新批号的鲎试剂或试验条件发生了任何可能影响检验结果的改变时，应进行鲎试剂灵敏度复核试验。 1.9供试品干扰试验项用于建立新品种细菌内毒素检查方法以及供试品的配方和生产工艺或试验环 境有变化，鲎试剂来源不同或供试品阳性对照结果呈阴性时确定供试品是否存在抑制或增强作用。 1.10 检查法项为供试品细菌内毒素检查方法。阴性对照、阳性对照和供试品阳性对照 必须同时进行，否则试验结果无效。 2实验材料及用具 2.1 天平供试品称量用，感量为0.1以下。 2.2 电热干燥箱除外源性内毒素用，温度应能维持250C以上至少一小时。 2.3 恒温水浴箱或适宜的恒温器，应能在37 土「C保持一小时。 2.4 水银温度计或酒精温度计，精度在1C以下。 2.5旋涡混合器 2.6 鲎试剂（应具有国家主管部门的批准文号）及细菌内毒素检查用水（符合规定）。 2.7细菌内毒素国家标准品（），细菌内毒素工作标准品（），除另有规定外应由中国药品生物制品检定所统一发放。 2.8 实验用具移液管（或刻度吸管，定量移液器）、凝集管（10 X 75）、三角瓶、小试管（16 X 100）、试管架、洗耳球、封口膜或金属试管帽、时钟、脱脂棉、吸水纸、剪刀、 砂轮所用玻璃器皿须经250C干烤至少1小时。塑料用具应使用其它适宜的除细菌内毒素方法。 2.9 试剂75%乙醇、蒸馏水、5师铬酸钾硫酸洗液。 3操作方法 3.1 试验准备 3.1.1 洗液的配制配制铬酸洗液或其他适宜的细菌内毒素灭活剂。 3.1.2 玻璃器皿的洗涤将被洗涤的玻璃器皿用洗涤剂和自来水洗净并空干水分后置

药典三部版通则细菌内毒素检查法

药典三部版通则细菌内 毒素检查法 标准化工作室编码[XX968T-XX89628-XJ668-XT689N]

1143 细菌内毒素检查法 本法系利用鲎试剂来检测或量化由革兰阴性菌产生的细菌内毒素，以判断供试品中细菌内毒素的限量是否符合规定的一种方法。 细菌内毒素检查包括两种方法，即凝胶法和光度测定法，后者包括浊度法和显色基质法。供试品检测时，可使用其中任何一种方法进行试验。当测定结果有争议时，除另有规定外，以凝胶限度试验结果为准。 本试验操作过程应防止内毒素的污染。 细菌内毒素的量用内毒素单位（EU）表示，1EU与1个内毒素国际单位（IU）相当。 细菌内毒素国家标准品系自大肠埃希菌提取精制而成，用于标定、复核、仲裁鲎试剂灵敏度、标定细菌内毒素工作标准品的效价，干扰试验及检查法中编号B和C溶液的制备、凝胶法中鲎试剂灵敏度复核试验、光度测定法中标准曲线可靠性试验。 细菌内毒素工作标准品系以细菌内毒素国家标准品为基准标定其效价，用于干扰试验及检查法中编号B和C溶液的制备、凝胶法中鲎试剂灵敏度复核试验、光度测定法中标准曲线可靠性试验。 细菌内毒素检查用水应符合灭菌注射用水标准，其内毒素含量小于 0.015EU/ml（用于凝胶法）或0.005EU/ml（用于光度测定法），且对内毒素试验无干扰作用。 试验所用的器皿需经处理，以去除可能存在的外源性内毒素。耐热器皿常用干热灭菌法（250℃、30分钟以上）去除，也可采用其他确证不干扰细菌内毒素检查的适宜方法。若使用塑料器皿，如微孔板和与微量加样器配套的吸头等，应选用标明无内毒素并且对试验无干扰的器具。 供试品溶液的制备某些供试品需进行复溶、稀释或在水性溶液中浸提制成供试品溶液。必要时，可调节被测溶液（或其稀释液）的pH值，一般供试品溶液和鲎试剂混合后溶液的pH值在6.0～8.0的范围内为宜，可使用适宜的酸、碱溶液或缓冲溶液调节pH值。酸或碱溶液须用细菌内毒素检查用水在已去除内毒素的容器中配制。缓冲液必须经过验证不含内毒素和干扰因子。 内毒素限值的确定药品、生物制品的细菌内毒素限值（L）一般按以下公式确定： L=K/M 式中 L为供试品的细菌内毒素限值，一般以EU/ml、EU/mg或EU/U（活性单位）表示； K为人每千克体重每小时最大可接受的内毒素剂量，以EU/（kg·h）表示，注射剂K=5 EU/（kg·h），放射性药品注射剂K=2.5 EU/ （kg·h），鞘内用注射剂K=0.2 EU/（kg·h）； M为人用每千克体重每小时的最大供试品剂量，以ml/（kg·h）、mg/（kg·h）或U/（kg·h）表示，人均体重按60kg计算，人体表面积 按1.62㎡计算。注射时间若不足1小时，按1小时计算。供试品每 平方米体表面积剂量乘以0.027即可转换为每千克体重剂量（M）。

细菌内毒素检测标准操作

细菌内毒素检测（凝胶法）标准操作 目的：规范细菌内毒素的检测操作，保证细胞质量。 范围：适用于所有从治疗中心发放的细胞（包括CIK、DC、干细胞等）内毒素限量检测。 责任人：质量检测人员 材料： 一、电热干燥箱除外源性内毒素用，温度应能达到180℃。 二、恒温水浴箱或适宜的恒温器（37℃±1℃）。 三、水银温度计，精度在1℃以下，量程不小于50℃。 四、旋涡混合器。 五、可调式移液器 六、0.25EU/ml鲎试剂。 七、细菌内毒素工作品。 八、凝胶法细菌内毒素检查用水。 九、实验用具无热原吸头（1000μl、200μl）、带铝盖的凝集管（10mm×75mm）、试管架、计时器、75%酒精棉球、封口膜、剪刀、镊子、砂轮。所用玻璃器皿使用前须经250℃干烤至少1小时或180℃干烤至少4小时。 操作方法 一、取样 1、细胞发放前3天，取细胞培养液约2ml，分装于2个带铝盖的凝集管中各约1ml左右，如不立即试验4℃存放（可存放多长时间）。 2、细胞发放当天，取细胞生理盐水混悬液约2ml，分装于2个带铝盖的凝集管中各约1ml左右，如不立即试验4℃存放。（可存放多长时间）。 3、取样应以无菌操作技术取样，所用器材在使用前应无热原或已去除热原。 二、鲎试剂灵敏度复核 鲎试剂灵敏度复核的目的是考察鲎试剂的灵敏度是否正确、考察检验人员操作方法是否正确及实验条件是否符合规定。 在使用一批新的鲎试剂或试验条件发生了任何可能影响检验结果的改变时，应进

行鲎试剂灵敏度复核实验。 （一）实验操作 1、细菌内毒素工作品溶液的制备 取细菌内毒素工作品一支，轻弹瓶壁，使粉末落入瓶底，然后用砂轮在瓶颈上部轻轻划痕，75%酒精棉球擦拭后启开，开启过程中应防止玻璃屑落入瓶内。 按照工作品说明书，加入规定量的细菌内毒素检查用水溶解其内容物，用封口膜将瓶口封严，置旋涡混合器上混合15分钟。然后用倍倍稀释方式进行稀释，即0.5ml各浓度工作品溶液+0.5ml检查用水（以下稀释方式同此法），制备成4个浓度的细菌内毒素标准溶液，即2.0λ、0.5λ、0.25λ（λ为所复核的鲎试剂的标示灵敏度），每稀释一步均应在旋涡混合器上混合30秒钟。 2、待复核鲎试剂的准备 取0.1ml/支的鲎试剂18支，轻弹瓶壁，使粉末落入瓶底，用砂轮在瓶颈轻轻划痕，75%酒精棉球擦拭后启开备用，防止玻璃屑落入瓶内。每支加入0.1ml检查用水溶解，轻轻转动瓶壁，使内容物充分溶解，避免产生气泡。若待复核鲎试剂的规格不是0.1ml/支时，取若干支按其标示量加入检查用水复溶，充分溶解后将鲎试剂溶液混合在一起，然后每0.1 ml分装到10mm×75mm凝集管中，要求至少分装18管备用。 3、加样 将已充分溶解的待复核鲎试剂18支（管）放在试管架上，排成5列，其中4列4支（管），1列2支（管）。4支（管）4列每列每支分别加入0.1ml的2λ、λ、0.5λ和0.25λ的内毒素标准溶液；另2支（管）加入0.1ml检查用水。 4、加样结束后，将鲎试剂用封口膜封口，轻轻振动混匀，避免产生气泡，连同试管架放入37℃±1℃水浴或适宜恒温器中，试管架保持水平状态，保温60±2分钟。 5、观察并记录结果。将试管架从水浴或适宜恒温器中轻轻取出，避免振动，将每管拿出缓缓倒转180°观察，管内形成凝胶，并且凝胶不变形，不从管壁滑脱者为阳性，记录为（＋）；未形成凝胶或凝胶不能保持完整并从管壁滑脱者为阴性，记录为（－）。 （二）实验结果计算