RNAi片段siRNA设计原则

RNAi片段siRNA设计原则

https://www.sodocs.net/doc/db9881369.html, 生物谷网站

====================================

相似一篇

General Guidelines

1.siRNA targeted sequence is usually 21 nt in length.

2.Avoid regions within 50-100 bp of the start codon and the termination codon

3.Avoid intron regions

4.Avoid stretches of 4 or more bases such as AAAA, CCCC

5.Avoid regions with GC content <30% or > 60%.

6.Avoid repeats and low complex sequence

7.Avoid single nucleotide polymorphism (SNP) sites

8.Perform BLAST homology search to avoid off-target effects on other genes or seq

uences

9.Always design negative controls by scrambling targeted siRNA sequence. The cont

rol RNA should have the same length and nucleotide composition as the siRNA but hav

e at least 4-5 bases mismatched to the siRNA. Make sure the scrambling will not create

new homology to other genes.

Tom Tuschl's rules

1.Select targeted region from a given cDNA sequence beginning 50-100 nt downstre

am of start condon

2.First search for 23-nt sequence motif AA(N19). If no suitable sequence is found, t

hen,

3.Search for 23-nt sequence motif NA(N21) and convert the 3' end of the sense siR

NA to TT

4.Or search for NAR(N17)YNN

5.Target sequence should have a GC content of around 50%

A = Adenine; T = Thymine; R = Adenine or Guanine (Purines); Y = Thymine or Cytosi ne (Pyrimidines); N = Any.

Rational siRNA design

By experimentally analyzing the silencing efficiency of 180 siRNAs targeting the mRNA of two genes and correlating it with various sequence features of individual siRNAs, Reyn olds et al at Dharmacon, Inc identified eight characteristics associated with siRNA functio nality. These characteristics are used by rational siRNA design algorithm to evaluate poten tial targeted sequences and assign scores to them. Sequences with higher scores will have higher chance of success in RNAi. The table below lists the 8 criteria and the methods o f score assignment.

A sum score of 6 defines the cutoff for selecting siRNAs. All siRNAs scoring higher tha n 6 are acceptable candidates.

*Tm = 79.8 + 18.5*log10([Na+]) + (58.4 * GC%/100) + (11.8 * (GC%/100)2) - (820/Leng th)

For example, the Tm can be calculated as follows for the siRNA UUCUCCAGCUUCUA AAAUA

Tm = 79.8 + 18.5*log10(0.05) + (58.4 * 31.6/100) + (11.8 * (31.6/100)2) - (820/19)

Tm = 32.19

There are two siRNA design tools which implement this siRNA design algorithm: one is offered by Dharmacon, Inc; the other is a downloadable Excel template, written by Mauric e Ho at https://www.sodocs.net/doc/db9881369.html,t.hk/RNAi/siRNA.

References

1.Elbashir SM et al. (2001) Duplexes of 21-nucleotide RNAs mediate RNA interfere

nce in cultured mammalian cells. Nature. 411:494-498.

2.Elbahir SM et al. (2001). Functional anatomy of siRNAs for mediating efficient R

NAi in Drosophila melanogaster embryo lysate. EMBO J. 20:6877-6888.

3.Elbashir SM et al. (2002). Analysis of gene function in somatic mammalian cells

using small interfering RNAs. Methods. 26:199-213.

4.Reynolds A, Leake D, Boese Q, Scaringe S, Marshall WS, Khvorova A. Rational

siRNA design for RNA interference. Nat Biotechnol. 2004 Mar;22(3):326-30.

5.https://www.sodocs.net/doc/db9881369.html,/biotools/oligocalc.html

6.Maurice Ho, Rational siRNA Design

RNAi片段siRNA设计原则

2006-12-17 21:42:20信息来源：本站原创

RNAi片段siRNA设计原则

https://www.sodocs.net/doc/db9881369.html, 生物谷网站

RNAi target selection rules:

1.Targeted regions on the cDNA sequence of a targeted gene should be located 50-

100 nt downstream of the start codon (ATG).

2.Search for sequence motif AA(N19)TT or NA(N21), or NAR(N17)YNN, where N is

any nucleotide, R is purine (A, G) and Y is pyrimidine (C, U).

3.Avoid targeting introns, since RNAi only works in the cytoplasm and not within t

he nucleus.

4.Avoid sequences with > 50% G+C content.

5.Avoid stretches of 4 or more nucleotide repeats.

6.Avoid 5URT and 3UTR, although siRNAs targeting UTRs have successfully induc

ed gene inhibition.

7.Avoid sequences that share a certain degree of homology with other related or unr

elated genes.

How to obtain a cDNA sequence for target selection

Before finding a RNAi target on the gene of your interest, first you have to get its mRN A sequence or sequence accession number as some siRNA design tools can take accession

number as input. It is recommended to use the gene's RefSeq from NCBI, since the Ref Seq represents non-redundant, curated and validated sequences. RefSeq mRNA sequences h ave unique accession numbers which start with NM or XM, followed by 6 digits. For exa mple, NM_123456 (curated mRNA sequence) or XM_0123456 (model mRNA sequence pr edicted by genome sequence analysis). There are several ways of querying RefSeq.

1.Search LocusLink by gene name or symbol at https://www.sodocs.net/doc/db9881369.html,/LocusLi

nk/. Once the locus of your gene is found, scroll down to the "NCBI Reference Sequen ce (RefSeq)" section and look for mRNA.

2.Search Entrez Gene at https://www.sodocs.net/doc/db9881369.html,/entrez/query.fcgi?db=gene, and s

elect the right gene of desired organism. Once the page for the gene is shown, scroll d own to the "NCBI Reference Sequence (RefSeq)" and look for mRNA.

3.Search Nucleotide database using Entrez query tool at https://www.sodocs.net/doc/db9881369.html,/

entrez/query.fcgi?db=Nucleotide and use Entrez Limits settings to restrict your query to t he RefSeq database only

o select "RefSeq" from the "Only from" menu, this restricts the query to the RefSeq collection

o select "mRNA" from the "Molecule" menu, this restricts the query to mR NA RefSeq records

Homology search

The RNAi targeted region on the mRNA sequence of a gene should not share significant homology with other genes or sequences in the genome, therefore, homology search is ess ential to minimize off-target effects. Although most siRNA design tools provide BLAST o ption, some simply use NCBI BLAST tools which sometimes are quite slow. Here are so me BLAST tools for homology search.

?NCBI Blast tool: Nucleotide-nucleotide BLAST (blastn) or Search for short, nearly exact matches

?Blat tool on UCSC Genome Website https://www.sodocs.net/doc/db9881369.html,/cgi-bin/hgBlat

?Ensembl Blast https://www.sodocs.net/doc/db9881369.html,/Multi/blastview

Examples of RNAi target selection

References

1. Elbashir SM, Harborth J, Lendeckel W, Yalcin A, Weber K, Tuschl T. Duplexes of 21-nucl eotide RNAs mediate RNA interference in cultured mammalian cells. Nature. 2001 May 24;411 (6836):494-8.

2. Elbashir SM, Lendeckel W, Tuschl T. RNA interference is mediated by 21- and 22-nucleoti de RNAs. Genes Dev. 2001 Jan 15;15(2):188-200.

RNAi 目标序列的选取原则应遵循以下几个方面的原则：

(1)从转录本（mRNA）的AUG起始密码开始，寻找“AA”二连序列，并记下其3'端的19个碱基序列，作为潜在的siRNA靶位点。有研究结果显示GC 含量在45%-55%左右的siRNA 要比那些GC 含量偏高的更为有效。Tuschl 等建议在设计siRNA 时不要针对5'和3'端的非编码区（untranslated regions，UTRs），原因是这些地方有丰富的调控蛋白结合区域，而这些UTR结合蛋白或者翻译起始复合物可能会影响siRNP 核酸内切酶复合物结合mRNA从而影响siRNA 的效果。

(2)将潜在的序列和相应的基因组数据库（人，或者小鼠，大鼠等等）进行比较，排除那些和其他编码序列/EST 同源的序列。例如使用BLAST

(3)选出合适的目标序列进行合成。通常一个基因需要设计多个靶序列的siRNA，以找到最有效的siRNA序列。

(4)一个目标基因至少设计3-5个以上的siRNA，平行实验以期提高成功率。据评估，随机

设计的siRNA有25%的机会有效沉默基因表达（减少75%-95%以上的mRNA），一半以上的几率能达到50%的沉默效果。

(5) siRNA的反义链3’端最好以UU结尾，这被公认是最有效的siRNA结构。现在以其他碱基结尾的siRNA也有报道能成功引发RNAi。

引物设计原则(必看)

mi引物设计原则 1. 引物的长度一般为15-30 bp，常用的是18-27 bp，但不应大于38，因为过长会导致其延伸温度大于74℃，不适于Taq DNA聚合酶进行反应。 2. 引物序列在模板内应当没有相似性较高，尤其是3’端相似性较高的序列，否则容易导致错配。引物3’端出现3个以上的连续碱基，如GGG或CCC，也会使错误引发机率增加。 3. 引物3’端的末位碱基对Taq酶的DNA合成效率有较大的影响。不同的末位碱基在错配位置导致不同的扩增效率，末位碱基为A的错配效率明显高于其他3个碱基，因此应当避免在引物的3’端使用碱基A。另外，引物二聚体或发夹结构也可能导致PCR反应失败。5’端序列对PCR影响不太大，因此常用来引进修饰位点或标记物。 4. 引物序列的GC含量一般为40-60%，过高或过低都不利于引发反应。上下游引物的GC含量不能相差太大。 5. 引物所对应模板位置序列的Tm值在72℃左右可使复性条件最佳。Tm值的计算有多种方法，如按公式Tm＝4(G+C)＋2(A+T)，在Oligo软件中使用的是最邻近法(the nearest neighbor method)。 6. ΔG值是指DNA双链形成所需的自由能，该值反映了双链结构内部碱基对的相对稳定性。应当选用3’端ΔG值较低（绝对值不超过9），而5’端和中间ΔG 值相对较高的引物。引物的3’端的ΔG值过高，容易在错配位点形成双链结构并引发DNA聚合反应。 7. 引物二聚体及发夹结构的能值过高（超过4.5kcal/mol）易导致产生引物二聚体带，并且降低引物有效浓度而使PCR反应不能正常进行。 8. 对引物的修饰一般是在5’端增加酶切位点，应根据下一步实验中要插入PCR 产物的载体的相应序列而确定。 引物序列应该都是写成5-3方向的， Tm之间的差异最好控制在1度之内， 另外我觉得扩增长度大一些比较好，500bp左右。 要设计引物首先要找到DNA序列的保守区。同时应预测将要扩增的片段单链是否形成二级结构。如这个区域单链能形成二级结构，就要避开它。如这一段不能

品牌战略规划的五个核心

品牌战略规划的五个核心 品牌规划是建立以塑造强势品牌为核心的企业战略，将品牌建设提升到企业经营战略的高度，其核心在于建立与众不同的品牌识别，为品牌建设设立目标、方向、原则与指导策略，为日后的具体品牌建设战术与行为制定"宪法"。 一、提炼品牌的核心价值，作为企业的灵魂，贯穿整个企业的所有经营活动 品牌的核心价值的提炼，必需要进行全面科学的品牌调研与诊断，充分研究市场环境、行业特性、目标消费群、竞争者以及企业本身情况，为品牌战略决策提供详细、准确的信息导向，并在此基础上，提炼高度差异化、清晰的、明确的、易感知、有包容性、能触动和感染消费者内心世界的品牌核心价值，一旦核心价值确定，在传播过程中，把它贯穿到整个企业的所有经营活动里。比如，白沙集团的品牌核心价值是“飞翔”，广告口号是“鹤舞白沙、我心飞翔”，它给人们一种美好的向往。它把企业的理想、文化、产品和消费者追求的境界连在一起，容易得到人们心灵的共鸣。在品牌传播和营销活动中，白沙集团积极打造品牌个性，以白鹤飞舞的样子作为象征鸟，结合体育事件，以体育新星刘翔作为形象代言人，把品牌核心价值“飞翔”的概念，表现的淋漓尽致，从而达到提升品牌价值的目的。 二、规范品牌识别系统，并把品牌识别的元素执行到企业的所有营销传播活动中去 以品牌核心价值为中心，规范品牌识别系统，使品牌识别与企业营销传播活动的对接具有可操作性；使品牌识别元素执行到企业的所有营销传播活动中，使每一次营销传播活动都演绎和传达出品牌的核心价值、品牌的精神与追求，确保企业的每一次营销广告的投入都为品牌做加法，从而为品牌资产作累积。同时，还要制定一套品牌资产提升的目标体系，作为品牌资产累积的依据。比如，麦当劳的“M”形标志，我们随处所见，特别醒目，你会被它的“M”字所吸引，当你走到麦当劳餐厅里面时，“M”形无处不在，小到纸巾、杯子，大到招牌、墙报，无形中给你视觉的记忆；同时，它们在进行互动促销活动时，你同样感受到“M”形的存在，随处可见。当然，品牌识别系统包含许多元素，不是LOGO的简单重复；麦当劳公司不但是品牌识别系统执行到位的典型代表，而且是我们学习的榜样。 三、建立品牌化模型，优选品牌化战略；通过整合所有的资源，实现品牌价值的提升 建立品牌化模型，是品牌战略规划中一项重要的工作。它不但规划好品牌的属性、结构、模式、内容及品牌愿景等问题，而且在营销策略决策中，提供具有前瞻性、指导性、科学性和操作性的依据。 规划好科学合理的品牌化战略,并且考虑和优选品牌化战略,是品牌战略规划中重要的环节。在单一产品格局下，营销传播活动都是围绕提升同一个品牌的资产而进行的，而产品种类增加后，就面临着很多难题。 对大企业而言，有关品牌化战略与品牌化决策中一项小小决策都会体现在企业经营的每一环节中，并以乘数效应加以放大；品牌化战略与品牌化决策水平高低，将会有不同的结果；如果

引物设计原则(含Realtime引物)

1.引物最好在模板cDNA的保守区内设计。 DNA序列的保守区是通过物种间相似序列的比较确定的。在NCBI上搜索不同物种的同一基因，通过序列分析软件（比如DNAman）比对（Alignment），各基因相同的序列就是该基因的保守区。 2.引物长度一般在15~30碱基之间。 引物长度（primer length）常用的是18-27 bp，但不应大于38，因为过长会导致其延伸温度大于74℃，不适于Taq DNA 聚合酶进行反应。 3.引物GC含量在40%~60%之间，Tm值最好接近72℃。 GC含量（composition）过高或过低都不利于引发反应。上下游引物的GC含量不能相差太大。另外，上下游引物的Tm值（melting temperature）是寡核苷酸的解链温度，即在一定盐浓度条件下，50%寡核苷酸双链解链的温度。有效启动温度，一般高于Tm值5~10℃。若按公式Tm= 4（G+C）+2（A+T）估计引物的Tm值，则有效引物的Tm为55~80℃，其Tm 值最好接近72℃以使复性条件最佳。 4.引物3′端要避开密码子的第3位。 如扩增编码区域，引物3′端不要终止于密码子的第3位，因密码子的第3位易发生简并，会影响扩增的特异性与效率。 5.引物3′端不能选择A，最好选择T。 引物3′端错配时，不同碱基引发效率存在着很大的差异，当末位的碱基为A时，即使在错配的情况下，也能有引发链的合成，而当末位链为T时，错配的引发效率大大降低，G、C 错配的引发效率介于A、T之间，所以3′端最好选择T。 6. 碱基要随机分布。 引物序列在模板内应当没有相似性较高，尤其是3’端相似性较高的序列，否则容易导致错误引发（False priming）。降低引物与模板相似性的一种方法是，引物中四种碱基的分布最好是随机的，不要有聚嘌呤或聚嘧啶的存在。尤其3′端不应超过3个连续的G或C，因这样会使引物在GC富集序列区错误引发。 7. 引物自身及引物之间不应存在互补序列。 引物自身不应存在互补序列，否则引物自身会折叠成发夹结构（Hairpin）使引物本身复性。这种二级结构会因空间位阻而影响引物与模板的复性结合。引物自身不能有连续4个碱基的互补。 两引物之间也不应具有互补性，尤其应避免3′ 端的互补重叠以防止引物二聚体（Dimer与Cross dimer）的形成。引物之间不能有连续4个碱基的互补。 引物二聚体及发夹结构如果不可避免的话，应尽量使其△G值不要过高（应小于4.5kcal/mol）。否则易导致产生引物二聚体带，并且降低引物有效浓度而使PCR 反应不能正常进行。 8. 引物5′ 端和中间△G值应该相对较高，而3′ 端△G值较低。 △G值是指DNA 双链形成所需的自由能，它反映了双链结构内部碱基对的相对稳定性，△G 值越大，则双链越稳定。应当选用5′ 端和中间△G值相对较高，而3′ 端△G值较低（绝对值不超过9）的引物。引物3′ 端的△G 值过高，容易在错配位点形成双链结构并引发DNA 聚合反应。（不同位置的△G值可以用Oligo 6软件进行分析） 9.引物的5′端可以修饰，而3′端不可修饰。 引物的5′ 端决定着PCR产物的长度，它对扩增特异性影响不大。因此，可以被修饰而不影响扩增的特异性。引物5′ 端修饰包括：加酶切位点；标记生物素、荧光、地高辛、Eu3+等；引入蛋白质结合DNA序列；引入点突变、插入突变、缺失突变序列；引入启动子序列等。引物的延伸是从3′ 端开始的，不能进行任何修饰。3′ 端也不能有形成任何二级结构可能。 10. 扩增产物的单链不能形成二级结构。

商标设计的原则

商标设计(Trademark Design)必须符合商品销售国家和地区的法律规定和风俗习惯，尊重其国家主权和民族特点，这已成为各国企业商标设计的原则。商标设计不单纯是一般工艺美术问题，不能只追求商标的美观与实用，同时要严密地考虑设计的合法性、使用后的法律后果及其对企业国际市场营销活动的影响。 ■ 商标设计的法律要素 商标设计的法律要素包括以下几个方面： ● 商标的构成。 各国法律对商标构成的规定不尽相同。 如独联体国家规定，商标构成要素可以是文字、图形、立体，组合或其他各种形式，美国商标法规定，任何文学，符号或标志，或者这类事物的组合都可以作为商标的构成要素。目前，国际上有少数国家把包装和容器的特殊式样也列为商标的构成要素，允许注册。 由于商标竞争越来越激烈，国外一些厂家在商标设计上千方百计地标新立异，招徕顾客，他们推出了气味商标、音响商标。电子数据商标、传输商标等等，有的国家如罗马尼亚的商标法已规定颜色，产品形状或其包装，音响等都可作为法定的商标构成要素。但绝大多数国家尚未对上述形式的商标实行法律保护。 中国商标法规定，商标应当由文字。图形或其组合构成，除此之外，其他形式都不能作为中国商标构成要素。 ●商标的显著特征。

商标所具有的独特性或可识别性就是显著特征，无论是文字．图形．还是文字、图形的组合，都要立意新颖、独具风格，具有足以与其他同类商标相区别的特点。 ● 商标的颜色。 商标的颜色对于商标来说具有不可忽视的意义。颜色不是商标的法定构成要素，一般不能独立作为商标构成的要素。但是颜色是商标整体的一部分，是一种商标区别于他种商际的重要标志之一。 商标在注册后如需变更颜色，则视为变更商标图形，必须重新申请注册。由于商标色彩对提高广告宣传效率有重要意义，许多驰名商标在注册时对颜色都作了指定。 ● 商标的文字、图形 一些文字、图形是禁止用作商标的，各国在禁用商标方面有不同的规定．应注意其差别性。 由于各国风土人情、社会文化背景不同，有些在一国常用或为消费者所喜爱的商标，在另一些国家就未必适宜使用。在商标设计方面，似乎已形成一种国际规范，即在选择商标的文字、图形和色彩时，避免采用销售国禁用的或消费者忌讳的东西． 如瑞典的国旗为蓝色，该国禁用蓝色作为商标，如果用蓝色作商标就会被认为是对他们国家的不尊重，自然就难以获准注册：阿拉伯国家禁忌黄色，法国人认为黑桃是死人的象征．采用这一图形的商标将不能获准注册，意大利人把菊花当作国花，

荧光定量PCR引物设计原则.

1.引物应用核酸系列保守区内设计并具有特异性。最好位于编码区5’端的300-400bp区域 内，可以用DNAman,Alignment 软件看看结果。 2. 产物不能形成二级结构（自由能小于58.61KJ/mol）。 3.引物长度一般在17-25碱基之间,上下游引物不能相差太大。 4.G+C含量在40%~60%之间，45-55％最佳。 5.碱基要随机分布，尽量均匀。 6.引物自身不能有连续4个碱基的互补。 7.引物之间不能有连续4个碱基的互补。 8.引物5′端可以修饰。 9.3′端不可修饰，而且要避开AT,GC rich的区域，避开T/C,A/G连续结构（2-3个）。 10. 引物3′端要避开密码子的第3位。 11.引物整体设计自由能分布5‘端大于3’端，且3‘端自由能最好小于9KJ/mol。 可用oligo 6 软件进行比对看结果的情况。 12.做荧光定量产物长度80-150bp最好，最长是300bp. 13.引物设计避免DNA污染，最好跨外显子接头区。 14.引物与非特异性扩增序列的同源性最好小于70％或者有8个互补碱基同源。 15.查看有无假基因的存在。假基因就是无功能的DNA序列，与需要扩增的目的片段长 度相似。 16.TM值在58-62度之间。 17.引物设计的软件Primer 5.0 有专门针对荧光的。 设计的目的是在两个目标间取得平衡：扩增特异性和扩增效率。引物分析软件将试图通过使用每一引物设计变化的预定值在这两个目标间取得平衡。设计引用有一些需要注意的基本原理： ①引物长度 一般引物长度为18~30碱基。总的说来，决定引物退火温度（Tm值）最重要的因素就是引物的长度。有以下公式可以用于粗略计算引物的退火温度。 在引物长度小于20bp时：[4(G+C)+2(A+T)]-5℃ 在引物长度大于20bp时：62.3℃+0.41℃(%G-C)-500/length-5℃ 另外有许多软件也可以对退火温度进行计算，其计算原理会各有不同，因此有时计算出的数值可能会有少量差距。为了优化PCR反应，使用确保退火温度不低于54℃的最短的引物可获得最好的效率和特异性。

简并引物设计原则

The central role of UDPGDH played in capsule and other polysaccharides synthesis. KPS, capsule polysaccharide; LPS,lipopolysaccharide 简并引物设计方法 （1）利用NCBI搜索不同物种中同一目的基因的蛋白质或cDNA编码的氨基酸序列因为密码子的关系，不同的核苷酸序列可能表达的氨基酸序列是相同的，所以氨基酸序列才是真正保守的。首先利用NCBI的Entrez检索系统，查找到一条相关序列即可。随后利用这一序列使用BLASTP（通过蛋白查蛋白），在整个NR数据库中查找与之相似的氨基酸序列。 （2）对所有的序列进行多序列比对将搜索到的同一基因的不同氨基酸序列进行多序列比对，可选工具有Clustal W/X，也可在线分析。所有序列的共有部分将会显示出来。“*”表示保守，“：”表示次保守。 （3）确定合适的保守区域设计简并引物至少需要上下游各有一个保守区域，且两个保守区域相距50~400个氨基酸残基为宜，使得PCR产物在150~1200bp 之间，最重要的是每一个保守区域至少有6个氨基酸的保守区，因为每条引物至少18bp左右。 若比对结果保守性不是很强很可能找不到6个氨基酸序列的保守区，这时可以根据物种的亲缘关系，选择亲缘关系近的物种进行二次比对，若保守性仍达不到要求，则需进行三次比对，总之，究竟要选多少序列来比对，要根据前一次的结果反复调整。最终目的就是有两个6个氨基酸且两者间距离合适的保守区域。 （4）利用软件设计引物当得到保守区域后，就可以利用专业的软件来设计引物了，其中Primer 5.0 支持简并引物的设计，将参与多序列比对的序列中的任一条导入Primer 5.0 中，将其翻译成核苷酸序列，该序列群可用一条有简并性的核苷酸链来表示（其中R=A/G，Y=C/T，M=A/C，K=G/T，S=C/G，W=A/C/T，B=C/G/T，V=A/C/G，D=A/G/T，N=A/C/G/T，该具有简并性的核苷酸链必然包含上一步中找到的氨基酸保守区域的对应部分，在Primer 5.0 中修改参数，令其在两个距离合适的保守的nt区域内寻找引物对，总之要保证上下游引物都落在该简并链的保守区域内，结果会有数对，分数越高越好。 （5）对引物的修饰若得到的引物为： 5-NAGSGNGCDTTANCABK-3 则简并度=4×2×4×3×4×3×2=2304，很明显该条引物的简并度很高不利于PCR，可以通过次黄嘌呤代替N（因为次黄嘌呤可以很好的和4种碱基配对）和根据物种密码子偏好这两种方法来降低简并度。 这样设计出来的简并引物对，适用于比对的氨基酸序列所属物种及与这些物种分类地位相同的其他物种。 简并引物设计原则

PCR引物设计原则

PCR引物设计原则 引物(Primer)是人工合成的两段寡核苷酸序列。 1、引物的长度一般为15-30bp，常用的是18-27bp，但不应大于38，因为过长会导致其延伸温度大于74℃，不适于Taq DNA聚合酶进行反应。 2、G十C含量：应在40%-60%之间，PCR扩增中的复性温度一般是较低Tm 值引物的Tm值减去5-10度。引物长度小于20时，其Tm恒等于4(G十C)十2(A十T)。 3、碱基分布的随机性：应避免连续出现4个以上的单一碱基。尤其是不应在其3’端出现超过3个的连续G或C，否则会使引物在G十C富集序列区错误引发. 4、引物自身：不能含有自身互补序列，否则会形成发夹样二级结构. 5、引物之间：两个引物之间不应有多于4个的互补或同源碱基，不然会形成引物二聚体，尤应避免3’端的互补重叠。引物3’端最好选T，错配的几率与A 相比大大的降低了。G、C之间错配的概率小于A、T. 6、引物的5’端可以修饰，而3’端不能进行修饰。5’端的修饰包括：加酶切位点，标记生物素，荧光，地高辛、Eu3+等，引入蛋白质结合的DNA序列，引入点突变，插入突变、缺失突变序列、引入启动子序列。因为引物的延伸是从3’端开始的，因而3’端不能进行任何修饰，另外3’端也不能有形成任何二

级结构的可能。 如何设计引物 不同的核苷酸序列表达的氨基酸氨基酸序列是相同的，所以氨基酸序列才是真正保守的。 引物最好在模板cDNA的保守区域内设计（DNA的保守区是通过物种间相似序列的比较确定的，在NCBI上搜索不同物种的同一基因，通过序列分析软件比对（Alignment）,各基因相同的序列就是该基因的保守区）。 PCR引物设计 PCR反应中有两条引物，即5′端引物和3′引物。设计引物时以一条DNA单链为基准（常以信息链为基准），5′端引物与位于待扩增片段5′端上的一小段DNA序列相同；3′端引物与位于待扩增片段3′端的一小段DNA序列互补。 引物设计软件 Primer Premier5.0 （自动搜索）* vOligo6 （引物评价） vVector NTI Suit vDNAsis vOmiga vDNAstar vPrimer3 （在线服务）

引物设计原则必看

mi引物设计原则 1、引物的长度一般为15-30 bp,常用的就是18-27 bp,但不应大于38,因为过长会导致其延伸温度大于74℃,不适于Taq DNA聚合酶进行反应。 2、引物序列在模板内应当没有相似性较高,尤其就是3’端相似性较高的序列,否则容易导致错配。引物3’端出现3个以上的连续碱基,如GGG或CCC,也会使错误引发机率增加。 3、引物3’端的末位碱基对Taq酶的DNA合成效率有较大的影响。不同的末位碱基在错配位置导致不同的扩增效率,末位碱基为A的错配效率明显高于其她3个碱基,因此应当避免在引物的3’端使用碱基A。另外,引物二聚体或发夹结构也可能导致PCR反应失败。5’端序列对PCR影响不太大,因此常用来引进修饰位点或标记物。 4、引物序列的GC含量一般为40-60%,过高或过低都不利于引发反应。上下游引物的GC含量不能相差太大。 5、引物所对应模板位置序列的Tm值在72℃左右可使复性条件最佳。Tm值的计算有多种方法,如按公式Tm＝4(G+C)＋2(A+T),在Oligo软件中使用的就是最邻近法(the nearest neighbor method)。 6、ΔG值就是指DNA双链形成所需的自由能,该值反映了双链结构内部碱基对的相对稳定性。应当选用3’端ΔG值较低(绝对值不超过9),而5’端与中间ΔG值相对较高的引物。引物的3’端的ΔG值过高,容易在错配位点形成双链结构并引发DNA聚合反应。 7、引物二聚体及发夹结构的能值过高(超过4、5kcal/mol)易导致产生引物二聚体带,并且降低引物有效浓度而使PCR反应不能正常进行。 8、对引物的修饰一般就是在5’端增加酶切位点,应根据下一步实验中要插入PCR产物的载体的相应序列而确定。 引物序列应该都就是写成5-3方向的, Tm之间的差异最好控制在1度之内, 另外我觉得扩增长度大一些比较好,500bp左右。 要设计引物首先要找到DNA序列的保守区。同时应预测将要扩增的片段单链就是否形成二级结构。如这个区域单链能形成二级结构,就要避开它。如这一段不

品牌设计概述

什么是品牌设计 品牌设计(brand designing) 当世界进入品牌竞争的时代，当品牌成为中华大地上商界的热点时，品牌设计也成为企业发展中不可缺少的一部分，企业界更是对品牌设计趋之若鹜。那么，品牌设计究竟是什么？其魅力来自何处？ 品牌设计与品牌形象 翻开品牌丛书，几乎所有的书上都会谈及品牌形象和品牌设计，但几乎没有一本书试图将它们区分开来，而是笼统地冠之以“品牌形象设计”、“品牌形象策划”等标题。的确，品牌设计和品牌形象紧密相关，因为设计的便是形象，而形象也离不开设计，要准确地将二者区别开来几乎是不可能的，但这并不是说二者可以混为一谈。通过多年的品牌形象设计经验，原始设绘就此针对品牌设计与品牌形象进行必要区分。 如果说品牌是一未经雕凿的女子，我们希望她展现给“上帝”——消费者是年轻、热情奔放、充满现代气息的都市女郎形象，那么现在要做的是对她进行从内到外的包装和设计，就像时装设计师按照他们的理想装扮模特一样，我们需要做的是提升她的内在素质：知识的熏陶、才艺的训练以及现代精神的灌输，提高她的着装和审美品味：休闲的健康的运动的高品质的审美情趣；必要的话还要进行眼睛、鼻子等五官的整形手术等等，最后把她的美丽动人、风情万种表现给消费者。品牌形象就像这个女子的形象，是企业和消费者想要看到的、感受到的，是他们对品牌的认知和评价，是静态的。而品牌设计就是按照确实的品牌形象所进行的一系列的包装设计，是塑造品牌形象的工具、方法和途径，是一个过程。 品牌设计和企业形象设计 不同的人对品牌设计有不同的理解。广义品牌设计包括战略设计、产品设计、形象设计和CI设计。企业形象设计是品牌设计的一个方面，这个内涵比较宽泛。狭义的品牌设计则认为品牌设计主要是指品牌名称、商标、商号、包装装潢等方面的设计，基本上等同于企业的视觉系统设计。在此观念中，品牌设计是企业形象设计的一个方面。 后一种品牌设计的定义过于狭窄，仅仅把品牌设计理解为对牌子的设计，不符合现代营销对品牌的理解，而前者更为全面地涵盖了品牌设计的内容。 以下主要以CI设计为主阐明品牌设计 品牌设计的原则 企业进行品牌设计的目的是将品牌个性化为品牌形象，为了更好地实现这一目标，在进行品牌方案设计和实施时，应遵循下列原则： （一）全面兼顾的原则 企业导入品牌战略，会涉及到企业的方方面面，因此，品牌设计必须从企业内外环境、内容结构、组织实施、传播媒介等方面综合考虑，以利于全面地贯彻落实。具体而言，就是说品牌设计要适应企业内外环境；符合企业的长远发展战略；在实施时具体措施要配套合理，以免因为某一环节的失误影响到全局。 （二）以消费者为中心的原则 品牌设计的目的是表现品牌形象，只有为公众所接受和认可，设计才是成功的，否则，即便天花乱坠也没有意义。以消费者为中心就要做到以下几点：

PCR引物设计原理及原则

PCR引物设计原理及原则 PCR引物设计原理 PCR引物设计的目的是为了找到一对合适的核苷酸片段，使其能有效地扩增模板DNA序列。因此，引物的优劣直接关系到PCR的特异性与成功与否。 要设计引物首先要找到DNA序列的保守区。同时应预测将要扩增的片段单链是否形成二级结构。如这个区域单链能形成二级结构，就要避开它。如这一段不能形成二级结构，那就可以在这一区域设计引物。 现在可以在这一保守区域里设计一对引物。一般引物长度为15~30碱基，扩增片段长度为100~600碱基对。 让我们先看看P1引物。一般引物序列中G+C含量一般为40%~60%。而且四种碱基的分布最好随机。不要有聚嘌呤或聚嘧啶存在。否则P1引物设计的就不合理。应重新寻找区域设计引物。 同时引物之间也不能有互补性，一般一对引物间不应多于4个连续碱基的互补。 引物确定以后，可以对引物进行必要的修饰，例如可以在引物的5′端加酶切位点序列；标记生物素、荧光素、地高辛等，这对扩增的特异性影响不大。但3′端绝对不能进行任何修饰，因为引物的延伸是从3′端开始的。这里还需提醒的是3′端不要终止于密码子的第3位，因为密码子第3位易发生简并，会影响扩增的特异性与效率。 PCR引物的设计原则： ①引物应用核酸系列保守区内设计并具有特异性。 ②产物不能形成二级结构。 ③引物长度一般在15~30碱基之间。 ④G+C含量在40%~60%之间。 ⑤碱基要随机分布。 ⑥引物自身不能有连续4个碱基的互补。 ⑦引物之间不能有连续4个碱基的互补。 ⑧引物5′端可以修饰。 ⑨引物3′端不可修饰。 ⑩引物3′端要避开密码子的第3位。 PCR引物设计的目的是找到一对合适的核苷酸片段，使其能有效地扩增模板DNA序列。如前述，引物的优劣直接关系到PCR的特异性与成功与否。对引物的设计不可能有一种包罗万象的规则确保PCR的成功，但遵循某些原则，则有助于引物的设计。 1.引物的特异性 引物与非特异扩增序列的同源性不要超过70%或有连续8个互补碱基同源。 2.避开产物的二级结构区 某些引物无效的主要原因是引物重复区DNA二级结构的影响，选择扩增片段时最好避开二级结构区域。用有关计算机软件可以预测估计mRNA的稳定二级结构，有助于选择模板。实验表明，待扩区域自由能（△G°）小于58.6lkJ/mol时，扩增往往不能成功。若不能避开这一区域时，用7-deaza-2′-脱氧GTP取代dGTP对扩增的成功是有帮助的。 3.长度 寡核苷酸引物长度为15~30bp，一般为20~27mer。引物的有效长度：Ln=2（G+C）+（A+T+，Ln值不能大于38，因为>38时，最适延伸温度会超过Taq DNA聚合酶的最适温度（74℃),不能保证产物的特异性。 4.G+C含量

PCR引物的设计原则

PCR引物的设计原则： ①引物应用核酸系列保守区内设计并具有特异性。 ②产物不能形成二级结构。 ③引物长度一般在15~30碱基之间。 ④G+C含量在40%~60%之间。 ⑤碱基要随机分布。 ⑥引物自身不能有连续4个碱基的互补。 ⑦引物之间不能有连续4个碱基的互补。 ⑧引物5′端可以修饰。 ⑨引物3′端不可修饰。 ⑩引物3′端要避开密码子的第3位。 1.引物的特异性 引物与非特异扩增序列的同源性不要超过70%或有连续8个互补碱基同源。 2.避开产物的二级结构区 某些引物无效的主要原因是引物重复区DNA二级结构的影响，选择扩增片段时最好避开二级结构区域。用有关计算机软件可以预测估计mRNA 的稳定二级结构，有助于选择模板。实验表明，待扩区域自由能（△G°）小于58.6lkJ/mol时，扩增往往不能成功。若不能避开这一区域时，用7-deaza-2′-脱氧GTP取代dGTP对扩增的成功是有帮助的。 3.长度

寡核苷酸引物长度为15~30bp，一般为18~27mer。引物的有效长度：Ln=2（G+C）+（A+T），Ln值不能大于38，因为>38时，最适延伸温度会超过Taq DNA聚合酶的最适温度（74℃),不能保证产物的特异性。 4.G+C含量 G+C含量一般为40%~60%。其Tm值是寡核苷酸的解链温度，即在一定盐浓度条件下，50%寡核苷酸双链解链的温度，有效启动温度，一般高于Tm值5~10℃。若按公式Tm=4（G+C）+2（A+T）估计引物的Tm 值，则有效引物的Tm为55~80℃，其Tm值最好接近72℃以使复性条件最佳。上下游引物的GC含量不能相差太大。 5.碱基随机分布 引物中四种碱基的分布最好是随机的，不要有聚嘌呤或聚嘧啶的存在。尤其3′端不应超过3个连续的G或C，因这样会使引物在G+C富集序列区错误引发。 6.引物自身 引物自身不应存在互补序列，否则引物自身会折叠成发夹状结构引物本身复性。这种二级结构会因空间位阻而影响引物与模板的复性结合。若用人工判断，引物自身连续互补碱基不能大于3bp。 7.引物之间 两引物之间不应具有互补性，尤应避免3′端的互补重叠以防引物二聚体的形成。一对引物间不应多于4个连续碱基的同源性或互补性。

品牌标识logo设计的条规则

品牌标识（logo）设计的12条规则 logo是品牌的“面子”――第一印象，所以极其重要。一个设计优秀的logo是品牌的重要资产。然而，仅仅靠优秀的平面设计并不能保证设计出来的logo是令人印象深刻且形象生动的品牌标识。正如不同的行业有其特定的技能，logo设计也要求设计师不断学习，积累经验才能获得成功;对所有平面设计师来说，知识便是能力。 基于此，我们总结出要设计好的logo必须遵循的12条规则以供参考： 1、初期工作不可少 初期草图是设计logo的重要开始步骤。你可以简单的用铅笔在纸上手绘，或者用Illustrator软件中的矢量工具绘出草稿。一旦你跳过或者草草结束这一步骤，就会影响最后的设计结果。 准备20到30张草图或者想法，由此拓展开来，创造出原始构想的各种引申想法。如果这些草图都没起到作用，你就需要重新开始，根据新想法再绘出草图。 一个优秀的平面设计师在初期工作上所花的时间比接下来的任何一个步骤都要多。

2、协调性 协调性在logo设计中也十分重要，因为在人的感受里，平衡协调的设计是令人愉快的，有魅力的。当图形、颜色、大小的“比重”在各个部分均等时，整个设计就能达到平衡协调。 尽管协调性原则偶尔可以打破，但要记住你所设计的logo是给大众看的，而不是着眼于伟大艺术的那些人，所以保持设计的协调性是最安全的方法。 3、尺寸大有关系 对于logo设计，尺寸相当重要。一个logo必须在缩放到任何尺寸时都能看起来清晰可阅。 如果一个logo被缩小后用于信头、信封或其他小型的推广物上时清晰度过低，那么这个logo就是不成功的。同样logo在放大后用于海报、广告牌或电子格式出现在电视、网络上时，也必须十分清晰容易辨认。 要判定一个logo是否缩放到所有尺寸下都可用，最可靠的办法就是自己试验一下。

标识标牌设计原则

标识标牌设计原则 来源: 标示网发布时间: 2014-11-20 18:07 12 次浏览大小: 16px14px12px 导向标牌既不能设得太少导致找不到该去的地方，也不能太多导致干扰或浪费。目前我国城市有越来越乱的趋势，导向标牌与商店招牌、各类广告牌挤在一起，难以辨认，可能已到了必须花大气力清理的时候了。我国城市相当一部分，有些地区甚至是大部分导向标牌需要更换。 1、看得见、可阅读原则 目前国内城市道路上的导向标牌，大小很不规范，经常是不把它当作让人阅读的牌子，而是当作美术作品，起不到指引路径的作用。 2、无歧义原则 导向标牌与其所标示的功能属性、位置、路径方向应该是一一对应的，不能有歧义。国内道路上有许多指地点的标牌，如前方是什么城市，广州华南快速上有块牌子写前方北京，了解的人知道因为前方连着京珠高速，它的意思是京珠高速那一端的起点是北京，可是又有多少人能在极端的时间内如此浮想联翩。更严重的是，若是对中国地理环境不了解的人来看，还以为北京挨着广州，这差得就大了，岂不知北京在数千里之外。导向标牌是给陌生人看的，如果对地理环境很熟凭记忆就可行车走路。另外，导向标牌应指路少指地点甚至不指地点，导向标牌是和地图配合使用的，不能把地图上的东西搬到标牌上去。 3、数量适中、简洁明了原则 导向标牌既不能设得太少导致找不到该去的地方，也不能太多导致干扰或浪费。目前我国城市有越来越乱的趋势，导向标牌与商店招牌、各类广告牌挤在一起，难以辨认，可能已到了必须花大气力清理的时候了。我国城市相当一部分，有些地区甚至是大部分导向标牌需要更换。 4、标牌系统体系连续闭合

导向标牌作用在于让出行者或司机，明确自己所处的位置根据标牌导引进入所选择的路径，所以其引导是连续的。在国内不少城市开车会有一个经历，就是顺着引导标志走，到交汇处或分叉点标牌突然没了或标注和前面引导不一致的路或地点，让人很烦恼，就这么点事，但却大大降低了道路使用的安全性和使用效率。

引物设计的原理与方法

引物设计的原理与方法 The latest revision on November 22, 2020

PCR引物设计的原理及方法 阎振鑫S111666(四川大学生命科学学院细胞生物学成都 610014) 摘要：自20世纪后期发展了PCR技术以来，PCR已经改变了整个生物学研究的进程。而PCR反应的第一步就是设计引物，引物设计的好坏直接关系到PCR的成败。PCR引物设计有许多的原则必须要遵循：引物与引物之间避免形成稳定的二聚体或发夹结构，引物与模板的序列要紧密互补。引物不能在模板的非目的位点引发DNA聚合反应等。另外，引物的设计方法也越来越多，出现了许多专门的设计软件和网站，如：PrimerPremier5.0等。 关键词：PCR 引物原理方法 NCBI PrimerPremier5.0 PCR primer design principle and method YanZhenxin (sichuan Univercity, Life science college cell biology chengdu 610014 ) Abstract: When PCR technology was find, PCR has changed all of the program in research of biology. The design of primer is the frist step of PCR. It is relation to the fate of PCR. There are some principals must be obey: dipolymer and hairpin structure must be avoid between different primers. The DNA polymerization reaction should not be triggered at the wrong site. Therefore, there are more and more methods of design primer, include the professional softwares and professional web site. Key word: PCR primer principle NCBI PrimerPremier5.0 聚合酶链式反应(Polymerase chain reaction。PCR)是20世纪后期发展起来的 一种体外扩增特异DNA片断的技术。具有快速、简便及高度敏感等优点，能极大地缩短目的基因扩增时间[1]。因此，其一直是生物学者们致力于构建cDNA文库、基因克隆以及表达调控研究的必要前提和基础[2]。PCR的第一步就是引物设计。引物设计的好坏，直接影响了PCR的结果，因此这一步很关键。成功的PCR反应既要高效，又要特异性扩增产物，因此对引物设计提出了较高的要求。引物设计需要注意的地方很多，在大多数情况下，我们都是在知道已知模板序列时进行PCR扩增的。在某些情况比如构建文库的时候也会在不知道模板序列的情况下进行设计。这个时候随机核苷酸序列

引物设计原则

引物设计原则： 引物的3’端决定着PCR反应产物的特异性，而5’端限定着PCR产物的长度。 （1）引物序列应位于基因组DNA的高度保守区，且与非扩增区无同源序列。这样可以减少引物与基因组的非特异结合，提高反应的特异性。 在模板内最好具有单一性，也就是说在模板内部没有错配，特别是3’ 端，一定要避免连续4个以上的碱基互补错配。 （2）引物的长度一般为15-30 bp，最好在18~24 bp，因为太短易形成错配，降低特异性，而太长也会降低特异性，并且影响PCR反应效率。 引物之间也不能有互补性，一般一对引物间不应多于4个连续碱基的 互补。 （3）引物的碱基应尽可能随机分布，避免出现数个嘌呤或嘧啶的连续排列，G+C含量在40%~75%之间，且上下游引物序列GC含量的差异不要 太大，3’端最后5个碱基最好不要富含GC，特别是连续3个的G或 C。DNA双链形成所需的自由能AG，应该以5’端向3’端递减 （4）引物的内部应避免形成稳定的引物二聚体和发夹结构，特别是引物的末端应无回文结构。上下游引物不应有互补序列，特别是3’端应避免 互补，以免形成引物二聚体。 （5）如果以DNA为模板设计引物，产物长度在100—600 bp比较理想。 而以mRNA为模板设计引物时，产物长度在150—300 bp比较理想。（6）5’ 端对PCR影响不太大，可以引进修饰位点和标记物。 （7）引物3’端的头1~2个碱基会影响T aqDNA聚合酶的延伸效率，从而影响PCR反应的扩增效率及特异性。一般的PCR反应中，引物3’末端 的碱基最好选T、C、G而不选A，A错配时会影响合成效率。 （8）引物3’端应为保守氨基酸序列，即采用简并密码子少的氨基酸如Met、Trp，且避免三联体密码第三个碱基的摆动未知位于引物的3’端。3’ 端不应终止于密码子的简并碱基。

logo设计的五大基础原则

一个logo设计的好坏，能够推动一个品牌的发展，好的LOGO设计依然是遵循一些最基本的原则的。当你在构思新的LOGO之时，可以试着从下面5个关键设计原则的角度来思考 1、简单 优质的LOGO通常都力图追求经典和简单，这样会不受时间和潮流的影响 LOGO设计应当具备整体性的思维。现在将一个品牌使用一个单独的图标或者字母来表示，是一个相当流行的做法（流行，但是也可以很经典）。当然，这是一种很酷的设计，前提是用户熟知这个品牌，这也是这种设计的局限性 2.色彩 每个LOGO都应该能够以全彩、白色或者黑色的样式存在，如果不行，那么它就不算过关

3.持久的生命力 一个好的LOGO设计应当拥有持久的生命力。所以，你的LOGO设计应当坚持最基本的四种设计： （1）文本：只是用字母文本来构建 （2）徽标：文本和名称被融入到整个徽章和LOGO设计当中 （3）形象：没有文字，使用图片来代表品牌 （4）图标/名称组合：一个图标，一个文本名称 4.灵活 LOGO一但被设计出来，那么在推广的时候就会出现在不同的网站、宣传单、海报上，那么它的位置、观感效果如何？ （1）它需要是矢量的（你需要让它适应大尺寸和高分辨率的场合） （2）它的外轮廓需要是接近于方形或者圆形的。对于应用程序而言，图标是强制要求是圆角矩形的，如果你的LOGO的比例不是太奇怪，

通常都能很方便地适配APP和各种社交媒体场合的。 （3）它需要包含可供选择的格式。为了适配不同的场合，它需要能够搭配白底、黑底，能够以单LOGO、LOGO+文字、单文字的形式存在。 （4）它应当在不同的背景下具备可读性。 （5）它应当在小尺寸的时候具备良好的可读性，并且在缩放的时候不会让人觉得比例失调。 （6）它的设计应当的得体的，其中的文字最好不要引起歧义（某澳大利亚服装品牌名为SB）。 它应当具备能够随着时间沉淀或者发展的特质。 5.品牌和故事 一个好的LOGO设计能够让用户更好的了解这个品牌，能够从某个角度呈现出这个公司的故事，让用户明白他们是如何走到今天的。也体现了品牌的历史和韵味

引物设计原则(最全汇总)

引物设计原则（汇总） 普通引物设计（适用于从载体上扩增模板）： 1. 普通引物长度一般在20-30bp之间，常用24-28bp左右以保证基因特异性； 2. 下载基因序列到Vector NTI； 3. 找到所需安装载体序列； 4. 将基因序列的CDS高亮标记； 5. 寻找载体序列中常用酶切位点，一般为EcoRI、BamHI、HindIII、XhoI等等，比对检测基因序列中是否有这些位点，有的话舍弃，最后选择两个酶切位点，最好离得远一点，并且最好buffer用一样的。酶切位点一般是6bp的回文序列； 6. 从基因ATG开始往后选择10-20bp均可（我的习惯是27bp-6bp酶切位点-2bp保护碱基-xbp 补齐序列），但最好保证最后两个是G或者C，以减少错配率； 7. 将上游酶切位点序列补在A TG前方，并根据载体对框情况补足两者之间的空缺，再根据序列的GC含量和TM值在酶切位点前补足保护碱基，以保证GC和AT的含量不能过高。注意，所有的补齐不能用到终止密码子； 8. 检测上游序列的结构情况，理论上不要太多二级结构以及3’端匹配即可；不过重复的序列也不能太多，以免移码； 9. 从下游终止密码子开始向前选择10-20bp均可，但最好保证最后两个是G或者C，以减少错配率； 10. 选择complementary sequence，在N端补齐下游酶切位点，如果tag在C端（即下游），则在第9点中应该从终止密码子前开始选择（即舍弃终止密码子），并且下游引物也要对框，如果tag在N端，则下游引物不需要对框，只要在N端加上下游酶切位点，再根据情况加上2个保护碱基，然后检测二级结构，原则上3’端部匹配即可。不过重复的序列也不能太多，以免移码； 11. 将设计好的上下游引物放在一起检测二级结构，原则上3’端部匹配即可。不过重复的序列也不能太多，以免移码； 12. 最后在NCBI的primer Blast网站上比对引物序列，看是否基因特异性的。 2011年10月18日左洁 1. 引物的长度一般为15-30 bp，常用的是18-27 bp，但不应大于38，因为过长会导致其延伸温度大于74℃，不适于Taq DNA聚合酶进行反应。 2. 引物序列在模板内应当没有相似性较高，尤其是3’端相似性较高的序列，否则容易导致错配。引物3’端出现3个以上的连续碱基，如GGG或CCC，也会使错误引发机率增加。 3. 引物3’端的末位碱基对Taq酶的DNA合成效率有较大的影响。不同的末位碱基在错配位置导致不同的扩增效率，末位碱基为A的错配效率明显高于其他3个碱基，因此应当避免在引物的3’端使用碱基A。另外，引物二聚体或发夹结构也可能导致PCR反应失败。5’端序列对PCR影响不太大，因此常用来引进修饰位点或标记物。 4. 引物序列的GC含量一般为40-60%，过高或过低都不利于引发反应。上下游引物的GC含量不能相差太大。 5. 引物所对应模板位置序列的Tm值在72℃左右可使复性条件最佳。Tm值的计算有多种方法，如按公式Tm＝4(G+C)＋2(A+T)，在Oligo软件中使用的是最邻近法(the nearest neighbor method)。

引物设计原则

引物设计 一、软件使用： ●推荐软件：Primer Premier 5.0 ●优点：操作简单、显示各种参数改变和可能的二聚体、异二聚体、发夹结构等 ●缺点：没有明显缺点 ●本地同类软件：DNAClub；Oligo 6.22；Vector NTI Suit；Dnasis；Omiga；Dnastar； DNAMAN (Lynnon Biosoft, Quebec, Canada). ●网上同类软件：Primer3（Whitehead Institute 开发）；JaMBW（European Molecular Biology Laboratory of Heidelberg 开发）。http://210.72.11.60网站已引进并调试好 这两种软件。独特之处在于：对全基因组PCR的引物设计，可以将设计好的引物 对后台核酸数据库进行比对，发现并排除引发错配的引物。因此建议经常做全基 因组PCR的用户试用。 二、推荐操作： ●引物搜索：Primer Premier 5.0 ●引物评价：Oligo 6.22 三、引物设计的原则: 首先引物要跟模板紧密结合，其次引物与引物之间不能有稳定的二聚体或发夹结构存在，再次引物不能在别的非目的位点引起DNA聚合反应（即错配）。围绕这几条基本原则，设计引物需要考虑诸多因素，如引物长度（primer length）、产物长度（product length）、序列Tm值(melting temperature)、ΔG值(internal stability)、引物二聚体及发夹结构（duplex formation and hairpin）、错误引发位点（false priming site）、引物及产物GC 含量（composition），有时还要对引物进行修饰，如增加限制酶切点，引进突变等。以使用Oligo 软件分析设计引物为例，笔者总结出以下的要点：