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western blot实验流程(自己整理)

western blot实验流程(自己整理)
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Western Blot实验步骤

1.制胶

2.细胞蛋白抽提步骤

1.提前预冷离心机,溶解lysis buffer;

2.将细胞沉淀置于冰上;1ml PBS重悬,4℃离心5min,(除去样中微量血清);

3.每107cells加裂解工作液100ul,轻轻重悬细胞沉淀;

4.置冰上10min,其间振荡2-3次;

5.13000rpm离心10min,4℃;

6.将上清转到小离心管中;

7.取出1ul,用于Bradford测定

蛋白浓度(ug/ul)=(样本OD值的平均值-对照OD值平均值)*斜率

100℃,5min;提前预热。中间打开盖子1~2次。

6.上样电泳(100V,90min)

向电泳槽中加入电泳缓冲液,使两块玻璃内侧电泳液高于上样孔,外侧电泳槽内电泳液浸没凝胶底部。玻璃板内侧液面高于外侧。然后开始上样,保证每孔总蛋白量在30-50ug,总上样量小于30ul,注意上样时间尽量短,避免样品扩散。

上样完毕,盖好电泳槽的盖子,注意正负极,并选择适当的电压进行电泳。通常在不连续的系统中,上层浓缩胶的电泳电压(建议70-80V)要低于分离胶电泳电压(建议90-110V),以达到更好的浓缩效果,使样品进入分离胶时被压缩在同一水平线上。电泳直至溴酚蓝染料前沿下至凝胶末端处停止电泳,电泳时间约2-3 小时。电泳时间根据具体情况定。

7.转膜(250mA,1h 30min)

转膜顺序:阴极碳板+海绵+三滤+胶+膜+三滤+海绵+阳极碳板

湿式电转膜

1. 电泳结束后取出凝胶,在转膜缓冲液中漂洗数秒。按“三明治”模式,打

开电转印夹,每侧垫上一块专用的用转膜液浸泡透的海绵垫,再各放一块转膜

液浸透的快速高效蛋白转移垫(定性滤纸),将凝胶平放在阴极侧滤纸上,

最后将转膜液浸透博士德硝酸纤维素NC 膜平放在凝胶上,去除气泡,夹好电

转印夹,注意NC 膜与胶,NC 膜与滤纸,滤纸与胶之间不可有气泡。

2. 转印槽加满转膜缓冲液,插入电转印夹,将转印槽放入冰箱内(-20℃),确保NC 膜最靠近正极,带负电的氨基酸和蛋白质向正极迁移。

3. 转膜选择恒流,每个转印槽建议电流为150-300mA,时间依据胶的浓度适当调整。

8.丽春红染色

转膜结束后,先用笔标记marker,再将NC 膜置于丽春红染色液中,室温5-10分钟即可见红色条带,用洗涤缓冲液洗数次可洗掉红色条带进行后续实验。拍照。根据marker剪膜。

9.封闭

用5%的牛奶(5g脱脂奶粉溶解于100ml Tris-PM中)室温封闭1 h;

10.一抗孵育

按说明书稀释一抗,加入稀释好的一抗,室温孵育2 h 或4 ℃过夜;孵育结束后,回收一抗。

11.洗膜

洗膜液洗4次,每次10min。

12.二抗孵育

二抗1:10000;eg. 5ml Tris-PM+0.5ul二抗。摇床孵育1h。

13.洗膜

洗膜液洗4次,每次10min。

14.曝光

A液和B液等体积混合。

15.数据分析

westernblot详细图解

Western免疫印迹(Western Blot)是将蛋白质转移到膜上,然后利用抗体进行检测的方法。对已知表达蛋白,可用相应抗体作为一抗进行检测,对新基因的表达产物,可通过融合部分的抗体检测。 与Southern或Northern杂交方法类似,但Western Blot采用的是聚丙烯酰胺凝胶电泳,被检测物是蛋白质,“探针”是抗体,“显色”用标记的二抗。 经过PAGE分离的蛋白质样品,转移到固相载体(例如硝酸纤维素薄膜)上,固相载体以非共价键形式吸附蛋白质,且能保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变。以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原,与对应的抗体起免疫反应,再与酶或同位素标记的第二抗体起反应,经过底物显色或放射自显影以

检测电泳分离的特异性目的基因表 达的蛋白成分。该技术也广泛应用 于检测蛋白水平的表达。 实验材料蛋白质样品 试剂、试剂盒丙烯酰胺SDS Tris-HCl β-巯基乙醇 ddH2O 甘氨酸Tris 甲醇PBS NaCl KCl Na2HPO4 KH2PO4 ddH2O 考马斯亮兰乙酸脱脂奶粉硫酸镍胺H2O2 DAB试剂盒 仪器、耗材 电泳仪电泳槽离心机离心管硝酸纤维素 膜匀浆器剪刀移液枪刮棒 实验步骤一、试剂准备 1. SDS-PAGE试剂:见聚丙烯酰胺凝胶电泳实验。 2. 匀浆缓冲液:1.0 M Tris-HCl(pH 6.8) 1.0 ml;10%SDS 6.0 ml;β-巯基乙醇0.2 ml;ddH2O 2.8 ml。 3. 转膜缓冲液:甘氨酸2.9 g;Tris 5.8 g;SDS 0.37 g;甲醇200 ml;加ddH2O定容至1000 ml。

Western超详细实验步骤

Western实验步骤 1. 电泳(Electrophoresis) (1)SDS-PAGE凝胶配制 SDS-PAGE凝胶进行配制,配方试剂去离子水,Arc-HCL(29:1),10%APS,SDS,TEMED。 一般按分子大小配胶,现实验分离胶配12%-15%的胶,浓缩胶10%的胶。 配胶步骤: 1.清洗玻璃板,装好(注意不要漏即玻璃板要对齐)。 2.按比例配分离胶(8ml-10ml) 3.加水压胶,待分离胶凝固后(可见有分离胶与水有分隔线,一般凝固时间30分钟-1小时左右),吸走上层水面 4.按比例配浓缩胶(3ml-4ml),加入分离胶上层,插入梳子,(注意别有气泡),待凝。(如果今日不上样可以放入4°C冰箱) 注意:玻璃板要洗得干净;玻璃板要装好,不要漏;制胶过程中,一定要充分混匀,而且避免有气泡;(2)样品处理 1.准备无菌EP管,向EP管内加入样品蛋白质体积的1/4体积的SDS缓冲液(5X的SDS-PAGE蛋白上样缓冲液,现样品加 3.5ul),之后加入相应蛋白样品(要制冰,蛋白质样品要放置在冰上),充分吹打混匀 2.100℃水浴加热5分钟,以充分变性蛋白。 3.12000r离心5分钟。 (3)上样与电泳 1.将玻璃板装入电泳槽中,加电泳缓冲液至泳槽的的2/3左右 2.蛋白质样品冷却到室温后,直接上样到SDS-PAGE胶加样孔内即可,样品两边加蛋白质Maker(6ul)(注意上样蛋白质顺序,一定不要弄错)。 3.通常把电压设置在100V,然后设定定时时间为100分钟(一般为90-120分钟)。设置定时可以避免经常发生的电泳过头。 通常电泳时溴酚蓝到达胶的底端处附近即可停止电泳,或者可以根据预染蛋白质分子量标准的电泳情况,预计目的蛋白已经被适当分离后即可停止电泳。(为了避免电泳过头,最好是在电泳设定时间的提前30分钟观察电泳) 注意:上样时尽量避免样本被上漏出孔外;注意电泳时间的把握;最重要的是一定要记录上样顺序,必要时记录在本子上。 3.转膜(Transfer) 1.物品准备,甲醇,转膜缓冲液,滤纸,转膜槽,玻璃皿3个,制冰。 2.取下胶板,用专门的板将玻璃板分离(务必不要将胶弄破,动作轻些,从下面和上面分离玻璃板),切适合大小的胶(不要切掉MAKER)。 3.用专门的板将胶转入事先放有转膜缓冲液的皿中,记录胶的顺序,剪与胶同等大小的滤纸和转膜纸PVDF膜,PVDF膜要放入甲醇中浸15秒(一般1-2分钟),胶要切角做标记(不要切到maker),一般一个切三个角,一个切一个角,记录顺序 4.铺膜,PVDF膜铺在胶上,在PVDF膜上铺三层滤纸,然后胶的对侧面铺三层滤纸即可(滤纸要大于等PVDF膜,PVDF膜要大于等胶),赶尽气饱。 5.再将铺好的膜胶滤纸,转入转膜夹中,有PVDF膜这面放在正极侧(即无色透明夹这面),再将夹子放入转膜槽里(电极不要放错,蛋白质带负电的)

WB实验步骤

Western blotting实验步骤 1.蛋白质的样品制备: 取心肌组织50mg,待组织块自行溶解,用滤纸吸去其表面水分,将组织块放入玻璃匀浆器球状部位,用组织剪尽量将其剪碎,将剪碎的心肌组织放入玻璃匀浆器的杆状部,按1mlRIPA+10ulPMSF/100mg心肌组织的比例加入RIPA和PMSF(先加RIPA再加PMSF),将玻璃匀浆器插入冰中,匀浆约30分钟。 将心肌组织匀浆转移到离心管中,4℃12000g离心5分钟,收集上清(如有粘稠物进一步用超声处理),样品分装冻存于-20℃备用。 2 .测定蛋白浓度: 2.1 按50:1配置BCA工作液。 2.2 10ulC液(蛋白标准)+90ulPBS液稀释成0.5mg/ml的蛋白标准液。 2.3 分别以0、1、2、4、8、12、16、20ul将蛋白标准液加入96孔板的第1~8标准孔中,在其他样品孔中加入10ul待测样品。 2.4 分别加PBS定容至20ul。 2.5 各孔中加入200ulBCA工作液,室温放置2小时。 2.6 用酶标仪测定蛋白浓度:测定A562,依标准曲线算出蛋白浓度。 3 SDS-PAGE电泳: 3.1 制胶: 按比例配制分离胶,缓缓地摇动溶液,使激活剂混合均匀,将凝胶溶液平缓地注入两层玻璃极中,再在液面上小心注入一层水,以阻止氧气进入凝胶溶液中,静置40min。同前按比例配制浓缩胶,但混匀溶液时不要过于剧烈以免引入过多地氧气。吸去不连续系统中下层分离胶上的水分,连续

平稳的注入凝胶溶液,然后小心插入梳子并注意不得在齿尖留有气泡,静制60min以上以保证完全聚合。 3.2 预电泳:将聚合好的凝胶安置于电泳槽中,小心拔去梳子,加入电泳缓冲液后低电压10-20V的预电泳20-30min。(目的是清除凝胶内的杂质,疏通凝胶孔径以保证电泳过程中电泳的畅通)。 3.3 样品准备:首先计算上样体积,然后按样品:上样buffer=4:1的比例加入上样bufer混匀,沸水煮10分钟,冰上5分钟。 3.4 加样:预电泳后依次加入标准品(Marker)和待分析样品。(加样时间要尽量短,以免样品扩散,可在未加样的孔中加入等量的样品缓冲液避免边缘效应。每个泳道加5ul。 3.5 电泳:加样完毕,选择80V恒压进行电泳,电泳直至溴酚蓝染料前沿到达两胶交界处(一般约20分钟),更换至100V恒压电泳,电泳直至溴酚蓝染料前沿下至凝胶末端处,即停止电泳(一般约为1小时20分钟)。 4.转膜: 4.1 切胶:将电泳完毕的胶完整的放在盛有电转液的玻璃皿中,将目的蛋白所在区域切下来,测量其长宽,并记录。 4.2 剪膜和滤纸:按胶的尺寸剪膜和滤纸(滤纸长宽较凝胶小0.5~1mm,PVDF 膜长宽较凝胶大0.5~1mm),滤纸浸入盛有电转液的玻璃皿中10秒钟,膜放入盛有10%甲醇的玻璃皿中10秒钟,然后将两者都放入盛有去离子水的玻璃皿中3分钟,进一步放入盛有电转液的玻璃皿中3分钟。 4.3 向电转槽中倒入部分电转液,将海绵浸入。按如下顺序制作“三明治”(注意避免两边滤纸相互接触,以免发生短路)。从正极到负极按如下顺序排列:

(完整版)WesternBlot(免疫印迹法)实验方法步骤

Western Blot(免疫印迹法)实验方法步骤 发布日期:2008-8-25 热门指数:4360 Western Blot(免疫印迹法) 主要包括以下4个基本步骤: n 样品制备 n 电泳分离 n 蛋白的膜转移 n 免疫杂交与显色――蛋白检测 溶液和试剂 n 1X 磷酸盐缓冲液(PBS) n Modified RIPA buffer Tris-HCl: 50 mM, pH 7.4 ; NP-40: 1% ;Na-deoxycholate: 0.25% ;NaCl: 150 mM ;EDTA: 1 mM ;P MSF: 1 mM ;Aprotinin, leupeptin, pepstatin: 1 microgram/ml each ;Na3VO4: 1 mM ;NaF: 1 mM n 1X SDS 样品缓冲液 62.5 mM Tris-HCl (pH 6.8 于25°C), 2% w/v SDS, 10%甘油,50 mM DTT, 0.01% w/v溴酚蓝 n 转移缓冲液 25 mM Tris base, 0.2 M 甘氨酸, 20%甲醇(pH 8.3) n 10X Tris缓冲盐(TBS) 准备1L 10X TBS: 24.2 g Tris base, 80 g NaCl;用1N HCl调pH为7.6 n 脱脂奶粉或BSA n 甲醇 n TBS/T缓冲液 1X TBS, 0.1% Tween-20 n 封闭缓冲液(TBS/T)

1X TBS, 0.1% Tween-20加5% w/v脱脂奶粉或BSA n 一抗的稀释 1X TBS, 0.1% Tween-20 加5% BSA (多抗)或5%脱脂奶粉(单抗) Note:一般来说, BSA被推荐用于多克隆抗体,脱脂奶粉用于单克隆抗体,这样可得到较高的信噪比。抗体的稀释度参考抗体说明书或根据实验确定。 n 预染的蛋白质Marker,可用于监测转膜的效率 样品制备 原始样品可为细胞、组织、培养上清、免疫沉淀或亲和纯化的蛋白,以下为定性检测目的蛋白时细胞样品的处理方法,其余的样品制备方法参阅相关文献。 1.培养细胞或药物处理。 2.弃培养基,用1X PBS漂洗细胞2次,去尽残留培养基。 3.加入1X SDS样品缓冲液(6-well plate, 100 μl /w或75 cm2plate, 500-1000 μl/瓶),刮落细胞,转移到Ep管。注意:冰上操作。 4.超声10~15秒剪切DNA以减低样品粘性。 5.煮沸样品5 minutes。 6.离心12000g, 5 min,取上清。 7.电泳分离:上样15μl~20 μl 至SDS-PAGE 胶(10 cm x 10 cm)电泳。 如要定量检测某蛋白的表达水平,应用RIPA裂解液(1 ml per 107cells/100 mm dish/150 cm2flask)裂解细胞,收集裂解液至离心管中,在振荡器上混匀4~15min,14000g离心15min(4℃),弃沉淀,用B radford法或其它蛋白质测定方法测定上清中蛋白浓度以调整上样体积和上样量,进行Western杂交时还需设置内或外参照,通常用beta-actin。 注意:一般上样20~30 μg已足够,如待检蛋白为低丰度蛋白,可加大上样量至100μg,但电泳条带易拖尾,可制备亚细胞组份或采用更敏感的检测方法。 电泳分离(参照SDS-PAGE电泳方法) 转膜 杂交膜的选择是决定Western blot成败的重要环节。应根据杂交方案、被转移蛋白的特性以及分子大小等因素,选择合适材质、孔径和规格的杂交膜。用于Western blot的膜主要有两种:硝酸纤维素膜(NC) 和PVDF膜。NC膜是蛋白印迹实验的标准固相支持物,在低离子转移缓冲液的环境下,大多数带负电荷的蛋白质会与膜发生疏水作用而高亲和力的结合在一起,但在非离子型的去污剂作用下,结合的蛋白还可以被

westernblot实验详细步骤(1)

Western Blot实验技术一、制胶 SDS-PAGE分离胶配方表 1、检查制胶器是否漏水,吸干玻璃中水分

2、配置分离胶,加入玻璃板中(注意:不能有气泡和杂物),距离玻璃上口1.5mL停止加胶。 3、再加ddH2O或异丁醇水封除去气泡,凝胶后倒掉水,吸干水到浓缩胶插梳。 二、上样 1、先在内槽加满电泳液才可以拔梳子。 2、拔梳子时垂直向上拔出,不可左右摇晃梳子。 3、拔完梳子后观察梳子孔,是否有缺口和歪,用针头拨正。 4、上样时从左到右依次上样。 5、若上样组不多时,左右第一孔不加样。 6、要预留Marker的上样孔。 三、电泳 四、转膜

PVDF膜即聚偏二氟乙烯膜(polyvinylidene fluoride)是蛋白质印迹法中常用的一种固相支持物。PVDF膜是疏水性的,膜孔径有大有小,随着膜孔径的不断减小,膜对低分子量的蛋白结合就越牢固。 (转膜缓冲液:需4度预冷,现配现用,不能放太久。) 1、转印滤纸:全胶长8.5cm,宽5.5cm,需剪裁成7层滤纸,压平后约3mm。需在转膜缓冲液中平衡浸泡备用。 2、海绵垫:在转膜液中平衡浸泡备用。 3、PVDF膜:剪裁8.5cm*5.5cm ,需在甲醇中浸润2min(活化膜上正电基团),然后在转膜缓冲液中平衡浸泡备用。 4、凝胶:凝胶也需要在预冷的转膜转膜缓冲液中平衡浸泡3-5分钟。否则在转膜过程中会出现皱缩,导致出现转移的条带变形。 三明治夹心法:负极(黑)-海绵垫-滤纸-胶-PVDF膜-滤纸-海绵垫-正极(白) 转膜时间:通电恒流,60V,一个槽100mA左右,1h

(注意:在操作过程中用玻棒赶走气泡。 装置转膜仪时注意黑对黑(负对负),白对红(正对正)。 装置运行时需冰浴。) 五、封闭 在进行抗体杂交之前,需要先对转印膜进行封闭,以防止抗体对非转印蛋白区域的非特异性吸附。 封闭一般采用异源性蛋白质或去污剂,本实验室常用的有5%BSA,10%脱脂奶等,至于选择哪一类封闭液,首先应考虑与检测目的相适应(做l酪氨酸磷酸化时不推荐non-fat milk 封闭)。 1、将脱脂奶粉封闭液(1xTBST:脱脂奶粉=20mL:2g一块膜用量。牛血清蛋白、5%BSA 效果更好)倒好。 2、将PVDF膜取出放入封闭液中,盖子改好。 3、封膜一般常温1-2小时即可,也可4℃封闭过夜。 六、一抗 抗体反应主要采用间接法: 即先加入未标记特异性一抗与膜上抗原结合后,再加入标记的二抗进行杂交检测,标记二

蛋白印迹——western-blot-实验流程及注意事项

蛋白印迹——Western blot 实验流程及注意事项 各种凝胶电泳方法可以直接了解蛋白的某些性质如迁移率、电荷、大小、丰度以至蛋白的亲疏水性等。此外,特异染色方法可用于识别不同种类的蛋白质。Western blot技术大大扩展了凝胶电泳后识别和鉴定蛋白的可能性。这一技术首先将电泳分离后的蛋白质条带或斑点从凝胶介质转移到固相支持膜上,然后用特异性配体进行检测。特异性抗体和凝集素等已被广泛应用检测印迹膜上的蛋白。印迹技术还常常作为电泳分离后用化学方法(如蛋白氨基端序列分析等)鉴定蛋白的一个重要步骤。 一、聚丙烯酰胺凝胶电泳(Polyacrylamide gel electrophoresis, PAGE或SDS-PAGE) 聚丙烯酰胺凝胶电泳简称为PAGE(Polyacrylamide gel electrophoresis),是以聚丙烯酰胺凝胶作为支持介质的一种常用电泳技术。聚丙烯酰胺凝胶由单体丙烯酰胺和甲叉双丙烯酰胺聚合而成,聚合过程由自由基催化完成。催化聚合的常用方法有两种:化学聚合法和光聚合法。化学聚合以过硫酸铵(AP)为催化剂,以四甲基乙二胺(TEMED)为加速剂。在聚合过程中,TEMED催化过硫酸铵产生自由基,后者引发丙烯酰胺单体聚合,同时甲叉双丙烯酰胺与丙烯酰胺链间产生甲叉键交联,从而形成三维网状结构。

PAGE根据其有无浓缩效应,分为连续系统和不连续系统两大类,连续系统电泳体系中缓冲液pH值及凝胶浓度相同,带电颗粒在电场作用下,主要靠电荷和分子筛效应。不连续系统中由于缓冲液离子成分,pH,凝胶浓度及电位梯度的不连续性,带电颗粒在电场中泳动不仅有电荷效应,分子筛效应,还具有浓缩效应,因而其分离条带清晰度及分辨率均较前者佳。不连续体系由电极缓冲液、浓缩胶及分离胶所组成。浓缩胶是由AP催化聚合而成的大孔胶,凝胶缓冲液为pH6.7的Tris-HCL。分离胶是由AP催化聚合而成的小孔胶,凝胶缓冲液为pH8.9 Tris-HCL。电极缓冲液是pH8.3 Tris-甘氨酸缓冲液。2种孔径的凝胶、2种缓冲体系、3种pH值使不连续体系形成了凝胶孔径、pH值、缓冲液离子成分的不连续性,这是样品浓缩的主要因素。 实验步骤 1.配制分离胶5ml(配方见图1); 2.将液体用1ml移液器加入玻璃板(从玻璃板的边缘加入,速度适中,尽量不 要产生气泡); 3.用去离子水压胶(利用重力作用把胶压平,否则如果有气泡,胶就不平了, 影响电泳效果。注意上面盖一保鲜膜,防止液体挥发); 4.大约1第二天一早配制堆积胶), 5.倒掉玻璃板上面的水并用滤纸吸干,加入堆积胶,并插入梳子; 6.约1小时后堆积胶凝固,把玻璃板转移到电泳装置并加紧(防止漏液); 7.将电泳装置内加入电泳缓冲液并观察是否漏液; 8.拔掉梳子,用微量注射器冲洗上样孔,加入和上样缓冲buffer混合变性的蛋 白;①蛋白上样量:20-50μg;②上样缓冲液:加入5×SDS 上样缓冲液至终浓度为1×;③上样最大体积:根据梳子孔径和玻璃板的距离而定,一般我们用的上样最大体积在30ul左右;④蛋白变性:上样前要将样品于沸水中煮5-10min 使蛋白变性。可以使用PCR仪进行变性,99℃5分钟,加快速度,这样就不用将水煮沸了,同时在水中煮蛋白样品有下面弊端:a. EP 管容易炸开,样品丢失;b. 容易进水,使样品体积增加,超过电泳最大上样量; 9.在电泳槽中加入电泳缓冲液; 10.恒压80V 30分钟,100V 2小时左右,溴酚蓝跑到底即可(电泳时间可以根 据自己目的蛋白的具体条件设置,一般4~5 h,电压为40V 较好,也可用60V。);

Westernblot基本操作步骤

W e s t e r n b l o t基本操作步骤 一、细胞蛋白的提取 弃去培养基,加入预冷的PBS洗一遍,加入的RIPA裂解液(含1mM PMSF(100×),每10ml加蛋白酶抑制剂和磷酸酶抑制剂各一片,六孔板每孔150-250μl,60mm×15mm 培养皿300-400μl,),于冰上裂解约5分钟,裂解总液12000rpm离心10 min。取上清,用BCA法测定蛋白浓度。用于western blot的蛋白样品取一定量加4×loading buffer,10×reducing,再用裂解液补齐到所需上样体积。离心,使蛋白沉底。将EP管于沸水中煮5min,变性,之后再离心后准备上样。 二、BCA法测蛋白浓度操作步骤 将蛋白标准配制溶液溶解蛋白标准(BSA),配制成5mg/ml的蛋白标准溶液,10μl 分装,-20℃冷冻保存。 完全溶解蛋白标准品,取10μl用PBS稀释至100μl,使终浓度为0.5mg/ml。 据样品数量,按50体积BCA试剂A加1体积BCA试剂B(50:1)配制适量BCA工作液,充分混匀。BCA工作液室温24小时内稳定。 将标准品按0, 1, 2, 4, 8, 12, 16, 20μl加到96孔板的标准品孔中,加稀释标准品的溶液补足到20μl。 加适当体积样品到96孔板的样品孔中(可以通过预实验摸索稀释倍数),加PBS 到20μl。 各孔加入100μl BCA工作液,37℃放置30分钟。 测定580nm条件下吸光度。根据标准曲线计算出蛋白浓度。 三、Western blot基本操作步骤 1、溶液配制: ①Runnig Buffer(1×):SDS Runnig Buffer(20×)50mL,加MiliQ水至1L; ②Transfer Buffer(1×): Transfer Buffer(10×)100mL,甲醇200mL(20%,v/v),加MiliQ水至1L; ③TBST缓冲液 1M Tris·HCl(pH7.6):60.5g Tris-base,加入约30ml浓盐酸,调PH至7.6,加MiliQ 水至500ml。 TBS缓冲液(10×):1M Tris·HCl 100ml+80g NaCl加MiliQ水1L TBST缓冲液(1×):TBS缓冲液(10×)100ml+0.5ml Tween-20(0.05%,v/v),加MiliQ水至1L。 ④封闭液:5% BSA(5g/100ml,称取1g BSA至20ml TBST,充分混匀溶解) 2、样品准备与加样 ①用4×SDS loading buffer, 10×reducing与蛋白质样品混合,并将此EP 管放在水浴锅中沸水煮5min,使蛋白质变性。 ②将预制胶固定到电泳装置中,并在装置中加满Runnig Buffer(1×),内槽加入0.5mL 抗氧化剂,小心拔下梳子; ③向上样孔中加入一定体积的蛋白样品(总蛋白量20μg以上)。向marker孔中加入2.5μl marker(按照实验要求设定marker量),向空白孔中加入一定体积的加样缓冲液(loading buffer)。注意采用相同(或相近)的上样体积,以保证蛋白的各带宽度相同。防止体积较大的上样孔中的蛋白质将向相邻的泳道扩散。 3、电泳

Western blot实验操作步骤

Western blot实验步骤 一、制备蛋白样品(单层贴壁细胞总蛋白提取) 1.倒掉细胞培养液,加3ml预冷的PBS洗涤细胞,重复两次,弃掉PBS 后将细胞培养瓶置于冰上。 2.裂解液RIPA(强)1ml +PMSF10ul(100:1),两者混匀后加入培养瓶中裂解细胞,冰上裂解30min,为使细胞充分裂解,培养瓶要经常来回摇动。 3.裂解完后,用细胞刮将细胞刮于一侧(动作要快),转移至ep管中. 4.4度,12000rpm,离心5min.离心后取上清至新的ep管中,用于后续实验(-80保存) 常用蛋白收样:倒掉细胞培养基后,预冷PBS洗涤细胞2次,弃去,再加入1ml PBS,用细胞刮轻轻刮取细胞,转移至1.5ml ep管中,12000rpm,离心5min,尽量吸净上清,沉淀于-80保存,用于后续实验。融化蛋白样品,加入RIPA+PMSF细胞裂解液(200ul/ep管),充分混匀,冰上裂解20min,4度离心,5min ,12000rpm,小心吸取上清至新的ep管中。 二、蛋白浓度测定(BCA法) BCA(碧云天)蛋白浓度测定试剂盒灵敏度高,检测浓度下限达到25ug/ml,最小检测蛋白量达到0.5ug,待测样品体积为1-20ul。在50-2000ug/ml浓度范围内有较好的线性关系。 标准蛋白BSA浓度:5mg/ml (-20保存),完全溶解蛋白标准品,取10ul 稀释至100ul,使终浓度为0.5mg/ml(ug/ul)。蛋白样品在什么溶液中,

标准品也宜用什么溶液稀释。但为了简便起见,也可以用0.9%NaCl 或PBS稀释标准品。 1.配置BCA工作液 A液: B液= 50 :1 ,混匀 A液+B液=200ul (每个样本) 样本数量: 7个标准品 + N 个待测蛋白样本 2.先将每孔加入200ul BCA工作液,再加入蛋白样本。(96孔板), 总体积为10ul.待测蛋白样本先10倍稀释。 3.37度,温箱中孵育30min。562nm波长,测OD值。待测蛋白样品浓度在50-2000ug/ml浓度范围内有较好的线性关系。 4.根据所测样品的OD值,绘制标准曲线。根据标准曲线即可计算样本相应的蛋白含量,除以样本稀释液总体积(10ul),再乘以样本稀释倍数,即为样本的实际浓度(ug/ul) 5.蛋白定量后,以最小蛋白浓度为标准,将各组蛋白样本调至相同浓度(ddH2O补齐) 绘制标准曲线:X轴为蛋白质量,Y为OD值 插入—XY散点图,选中图上一点,右键,添加趋势线—选项(显

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Western Blot详解(原理、分类、试剂、步骤及问题解答) Western免疫印迹(Western Blot)是将蛋白质转移到膜上,然后利用抗体进行检测。对已知表达蛋白,可用相应抗体作为一抗进行检测,对新基因的表达产物,可通过融合部分的抗体检测。 本文主要通过以下几个方面来详细地介绍一下Western Blot技术: 一、原理 二、分类 i.放射自显影 ii.底物化学发光ECL ECF iv.底物DAB呈色 三、主要试剂 四、主要步骤 五、实验常见的问题指南 1.参考书推荐 2.针对样品的常见问题 3.抗体 4.滤纸、胶和膜的问题 的相关疑问 6.染色的选择 7.参照的疑问

8.缓冲液配方的常见问题 9.条件的摸索 10.方法的介绍 11.结果分析 一、原理 与Southern或Northern杂交方法类似,但Western Blot采用的是聚丙烯酰胺凝胶电泳,被检测物是蛋白质,“探针”是抗体,“显色”用标记的二抗。经过PAGE分离的蛋白质样品,转移到固相载体(例如硝酸纤维素薄膜)上,固相载体以非共价键形式吸附蛋白质,且能保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变。以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原,与对应的抗体起免疫反应,再与酶或同位素标记的第二抗体起反应,经过底物显色或放射自显影以检测电泳分离的特异性目的基因表达的蛋白成分。该技术也广泛应用于检测蛋白水平的表达。 二、分类 现常用的有底物化学发光ECL和底物DAB呈色,体同水平和实验条件的是用第一种方法,目前发表文章通常是用底物化学发光ECL。只要买现成的试剂盒就行,操作也比较简单,原理如下(二抗用HRP标记):反应底物为过氧化物+鲁米诺,如遇到HRP,即发光,可使胶片曝光,就可洗出条带。

western blot实验步骤

Western bolt 一、实验目的 通过实验了解western blot技术的原理和操作。 二、实验原理 SDS-PAGE是最常用的定性分析蛋白质的电泳方式,特别是用于蛋白质纯度检测和测定蛋白质分子量。 PAGE能有效的分离蛋白质,主要依据其分子量和电荷的差异,而SDS-PAGE的分离原理则仅根据蛋白质的分子量的差异。 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳,是在聚丙烯酰胺凝胶系统中引进SDS(十二烷基硫酸钠),SDS会与变性的多肽,并使蛋白带负电荷,由于多肽结合SDS的量几乎总是与多肽的分子量成正比而与其序列无关,因此SDS多肽复合物在丙稀酰胺凝胶电泳中的迁移率只与多肽的大小有关,在达到饱和的状态下,每克多肽可与1.4g去污剂结合。当分子量在15KD到200KD之间时,蛋白质的迁移率和分子量的对数呈线性关系,符合下式:logMW=K-bX,式中:MW为分子量,X为迁移率,k、b均为常数,若将已知分子量的标准蛋白质的迁移率对分子量对数作图,可获得一条标准曲线,未知蛋白质在相同条件下进行电泳,根据它的电泳迁移率即可在标准曲线上求得分子量。 硝酸纤维素膜(nitrocellulose filter membrane,简称NC膜),在胶体金试纸中用做C/T线的承载体,同时也是免疫反应的发生处。NC膜是生物学试验中最重要的耗材之一。 第一抗体就是能和特异性抗原特异性结合的蛋白。第二抗体是能和抗体结合,即抗体的抗体,其主要作用是检测抗体的存在,放大一抗的信号。 化学发光HRP底物(辣根过氧化物酶底物,也常被称为ECL试剂)是目前Western blot检测中最为灵敏的试剂。显影液的A液主要成分为鲁米诺(Luminol)及发光增强剂,B液主要成分为过氧化物溶液。二抗上含有HRP(辣根过氧化物酶),可以催化A液和B液反应发光。 三、实验器材 1.电泳槽,胶板架子 2.转膜仪 3.NC膜 4.电泳电源 5.滤纸 6.摇床 7.X射线摄影暗匣 8.X射线胶片 9.塑料薄膜 四、实验试剂 1.runningbuffer 5xrunningbuffer(1L) Tris 15.1g

WB操作步骤-自己整理

Western Blot 相关实验方法与试剂(湿转法) 人工肝实验室学习姚瑶 (一)目的蛋白提取: (1)单层贴壁细胞总蛋白的提取: 1、倒掉细胞培养液,加入Hanks液洗涤一次后倒掉,根据所用细胞决定是否用胰酶消化,加入适量(约5ml)新鲜细胞培养液后,将贴壁细胞吹起,并转移至4支离心管内,配平后,1500转离心10min。 2、倒掉上清,用4度预冷PBS溶液洗涤沉淀,1500转离心10min。 共洗三次,每次十分钟。 3、倒掉上清,吸净,每管加入50ul 细胞裂解液RIPA,吹散,加入后由于DNA的释放可迅速变粘稠,故应尽快转移至1.5ml EP 管内,-20℃裂解30min。 4、超声波细胞裂解仪上将各管裂解15s。(可不做) 5、4℃,12000转离心10min。 6、将上清转移至0.5ml EP管中,每管100ul,冰浴待用。 (2)组织中总蛋白的提取: 1、取约100mg肝组织于研磨器内,加入500ul 细胞裂解液RIPA,研磨后吸出于1.5ml EP管内,再加入500ul RIPA,研磨后吸出于上EP管内。冰上裂解30min。

2、配平后,4℃,14000转离心10min。 3、将上清分装于0.5ml EP管内,每管100ul,冰浴待用(二)蛋白含量的测定: 1、稀释标准品:10ul标准品C液+90ul PBS溶液,混匀。 2、按0、1、2、4、8、12、16、20ul将稀释后的标准品加入于96孔板内,并用PBS将各孔补足20ul。 3、将第2、3排96孔板分别加入样品1ul、0.5ul,(可采用倍比稀释法),并用PBS将各孔补足20ul。 4、配制工作液:按A液:B液=50:1配制适量工作液,每孔加入200ul。 5、37℃水浴30min。 6、酶标仪测定各孔OD值(A570,Mode1)。 7、绘制标准曲线,计算样品蛋白浓度。 (三)SDS-PAGE电泳: (1)清洗玻璃板 (2)灌胶与上样: 1、配胶:根据目的蛋白的大小,决定分离胶的浓度。

WB实验步骤

蛋白电泳(制胶、SDS-PAGE电泳) 实验材料: SDS-PAGE凝胶制备试剂盒、电泳缓冲液、提取的蛋白或全细胞裂解液、广谱彩虹预染中分子量蛋白Marker、SDS-PAGE Loading Buffer(还原,5×)、G250蛋白快速染色试剂、若干蒸馏水 实验仪器、耗材: 蛋白电泳仪、制胶仪、水平摇床、15ml离心管、5ml移液器、微量移液器、1.5ml离心管、塑料饭盒(可在微波炉里加热使用) 配制溶液: ●配制10%APS溶液:-20度保存 0.5g APS + 5ml蒸馏水、2.5g APS + 25ml蒸馏水 ●配制200 ml电泳缓冲液:CW0045 Tris-Glycine SDS(ph8.3,10×) 20 ml Tris-Glycine SDS + 180 ml 蒸馏水 ●配制1 ml loading buffer: 200 ul 5×loading buffer +800 ul蒸馏水 实验步骤: 一.制胶: 1.参照凝胶模具说明书,装配好凝胶模具。 2.根据分离蛋白的大小配制分离胶和浓缩胶。 3.配制10%分离胶: 将不同体积的30%Acr-Bis(29:1)、分离胶缓冲液和双蒸水在小烧杯或试管中混合。 加入10%APS和TEMED,轻轻搅拌使其混匀,避免产生气泡。 配制SDS-PAGE分离胶

4.待胶灌至距离玻璃板顶端1.5cm的时候停止灌胶,加入蒸馏水水封。静置40分钟 至1小时。 5.待分离胶凝固后(水层胶层中间出现折线),倒掉蒸馏水,用滤纸将水溶液吸干。 6.配制5%浓缩胶: 7.将浓缩胶溶液加至分离胶的上面,直至凝胶溶液到达前玻璃板的顶端。 注意:灌胶速度要快,防止凝胶。 8.将梳子插入凝胶内,避免产生气泡。静置20分钟,等待浓缩胶聚合。 9.待凝胶聚合后,小心地拔出梳子,以免破坏加样孔。赶走气泡。 二.SDS-PAGE电泳: 1. 在电泳槽的内外槽灌至电泳缓冲液。 2. 制备样品: 1)蛋白样品: 根据植物蛋白或动物组织蛋白定量结果,计算蛋白提取液加入量,制备上样溶液。 蛋白提取液+ 5×上样缓冲液+ 蒸馏水,上样量为40-60ug。 制备的样品,煮沸5分钟,12,000 rpm离心5分钟,取上清,上样。

Western_Blot操作步骤

Western Blot操作步骤 一、 Western blot 实验步骤概述 1. 组织取材:组织块称重 2. 利用液氮、研钵粉碎组织块 3. 加入RIPA缓冲液(每克组织3 ml RIPA),PMSF(每克组织30μl,10 mg/ml PMSF),利用Polytron进一步匀浆(15,000转/分*1分钟)维持4℃ 4. 加入PMSF(每克组织30μl,10 mg/ml PMSF),冰上孵育30分钟 5. 移入离心管4℃约20,000 g(约15,000转)15分钟 6. 上清液为细胞裂解液可分装-20℃保存 7. 进行Bradford比色法测定蛋白质浓度 8. 取相同质量的细胞裂解液(体积*蛋白质浓度),并加等体积的2×电泳加样缓冲液 9. 沸水浴中3分钟 10. 上样 11. 电泳(浓缩胶20mA,分离胶35mA) 12. 电转膜仪转膜(100mA 40分钟) 13. 膜用丽春红染色,胶用考马斯亮蓝染色 14. Westernblot 试剂盒显色 15. 分析比较记录 二、 Western具体实验步骤 Western,也称Western blot、Western blotting、Western印迹,是用抗体检测蛋白的重要方法之一。Western可以参考如下步骤进行操作。 1.收集蛋白样品(Protein sample preparation):可以使用适当的裂解液裂解贴壁细胞、悬浮细胞或组织样品。对于某些特定的亚细胞组份蛋白,例如细胞核蛋白、细胞浆蛋白、线粒体蛋白等,可以参考相关文献提取这些亚细胞组份蛋白,也可以使用试剂盒进行抽提。收集完蛋白样品后,为确保每个蛋白样品的上样量一致,需要测定每个蛋白样品的蛋白浓度。根据所使用的裂解液的不同,需要采用适当的蛋白浓度测定方法。因为不同的蛋白浓度测定方法对于一些去垢剂和还原剂等的兼容性差别很大。如果使用北京博奥森生物技术公司生产的WIP细胞裂解液,可以使用BCA蛋白浓度测定试剂盒。 2.电泳(Electrophoresis) (1) SDS-PAGE凝胶配制:SDS-PAGE凝胶可以参考一些文献资料进行配制,也可以使用博奥森生产的SDS-PAGE凝胶配制试剂盒。该试剂盒提供了除水和配胶器具外的所有试剂以及配制各种浓度SDS-PAGE的配方。

westernblot原理及步骤

westernblot原理及步骤 免疫印迹(Western Blot)是将蛋白质转移到膜上,然后利用抗体进行检测。对已知表达蛋白,可用相应抗体作为一抗进行检测,对新基因的表达产物,可通过融合部分的抗体检测。Western Blot是检测单一细胞蛋白表达量最好的方法;若要对表达蛋白进行细胞定位,confocal应是首选的方法,若要进行蛋白相互作用的关系,应考虑免疫共沉淀技术。 一、Western Blot的原理 Western Blot与Southern或Northern杂交方法类似,但Western Blot采用的是聚丙烯酰胺凝胶电泳,被检测物是蛋白质,“探针”是抗体,“显色”用标记的二抗。经过PAGE分离的蛋白质样品,转移到固相载体(例如硝酸纤维素薄膜)上,固相载体以非共价键形式吸附蛋白质,且能保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变。以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原,与对应的抗体起免疫反应,再与酶或同位素标记的第二抗体起反应,经过底物显色或放射自显影以检测电泳分离的特异性目的基因表达的蛋白成分。该技术也广泛应用于检测蛋白水平的表达。 二、操作步骤 (一)蛋白质样品获得: 1.所需试剂: (1)蛋白酶抑制剂mix: hjjhh储存浓度5ml mix中的加入量终浓度 *PMSF(溶于乙醇)100mM 25ul 50uM *Trypsin Inhibitor 1mg/ml 250ul 50ug/ml *EGTA(pH8.0)0.5M 80ul 8mM *EDTA(pH8.0)0.5M 10ul 1mM Aprotinin 1mg/ml 25ul 5ug/ml Pepstatin(溶于乙醇)0.2mg/ml 50ul 10ug/ml Leupeptin 5mg/ml 100ul 0.1mg/ml Benzamidine 100mM 250ul 5mM NaF 5M 250ul 250mM NaVO4(FW183.8)0.2M 25ul 1mM 注意:*代表必须加的试剂 (2)细胞裂解缓冲液(培养细胞用):1% NP40, 25 mM Hepes。配制1M DTT溶液,保存在-20℃冰箱中。 配制细胞裂解液(现用现配):将裂解缓冲液和抑制剂溶液等体积混合,然后加入DTT溶液,使其浓度为1 mM。 (3)RIPA(组织样品):1×PBS,1%NP-40,0.5%脱氧胆酸钠,0.1% SDS。(蛋白抑制剂在提取蛋白时现加,按10ul/ml RIPA的量加10mg/ml PMSF,Aprotinin按30ul/ml RIPA的量加入) 也可用样品裂解液:(2%SDS;0.01%溴酚兰;10%甘油;60mmol/LTris-HCl(PH6.8);100mmol/LDTT(取自-20℃存放的1mol/L储存液,临用时加入)

[原创]-Western-blot转膜整个过程

转膜(Trarsmembran) 1 转膜的定义 将电泳后分离的蛋白质从凝胶中转移到固相载体(例如NC膜)上,通常有两种方法:毛细管印迹法和电泳印迹法。常用的电泳转移方法有湿转和半干转。两者的原理完全相同,只是用于固定胶/膜叠层和施加电场的机械装置不同。前者操作容易,转移效率高;而后者适用于大胶的蛋白转移,所用缓冲液少。 2 转移膜的选择 杂交膜的选择是决定Western blot成败的重要环节。应根据杂交方案、被转移蛋白的特性以及分子大小等因素,选择合适材质、孔径和规格的杂交膜。用于Western blot的膜主要有两种:硝酸纤维素膜(NC)和PVDF膜。NC膜是蛋白印迹实验的标准固相支持物,在低离子转移缓冲液的环境下,大多数带负电荷的蛋白质会与膜发生疏水作用而高亲和力的结合在一起,但在非离子型的去污剂作用下,结合的蛋白还可以被洗脱下来。根据被转移的蛋白分子量大小,选择不同孔径的NC膜。因为随着膜孔径的不断减小,膜对低分子量蛋白的结合就越牢固。通常用0.45 μm和0.2 μm两种规格的NC膜。大于20 kD的蛋白可用0.45 μm的膜,小于20 kD的蛋白就要用0.2 μm的膜了,如用0.45 μm的膜就会发生“Blowthrough”的现象。PVDF膜灵敏度、分辨率和蛋白亲和力比常规的膜要高,非常适合于低分子量蛋白的检测。但PVDF膜在使用之前必需用纯甲醇浸泡饱和1-5秒钟。 最常用于Western Blot的转移膜主要是硝酸纤维素(Nitrocellulose, NC)膜和聚偏二氟乙烯(Polyvinylidene Fluoride, PVDF)膜,此外也有用尼龙膜、DEAE纤维素膜做蛋白印迹。尼龙膜和NC膜的特点相似,主要用于核酸杂交。 硝酸纤维素(nitrocellulose, NC)膜:NC与蛋白质靠疏水作用结合,无需预先活化,对蛋白质的活性影响小;非特异性本底显色浅;价格低廉,使用方便。但结合在NC上的小分子蛋白质在洗涤时易丢失;NC韧性较差,易损坏。 聚偏二氟乙烯(Polyvinylidene fluoride, PVDF)膜:与蛋白质亲和力高,用前需在甲醇中浸泡,以活化膜上的正电基团,使其更容易与带负电荷蛋白结合。 膜的选择主要根据: p 膜与目的蛋白分子的结合能力(也就是单位面积的膜能结合蛋白的载量),以及膜的孔径(也就是拦截蛋白的大小); p 不影响后续的显色检测(也就是适和用于所选的显色方法,信噪比好); p 如果后继实验有其他要求,比如要做蛋白测序或者质谱分析,还要根据不同目的来挑选不同的转移膜。 几种膜的性质对比 PVDF膜NC膜尼龙膜 背景低低较高蛋白结合能力100-200 μg/cm280-100 μg/cm2>400 ug/cm2 机械强度强干的膜很脆软而结实 溶剂抗性强差差

western blot 实验原理及操作

Western Blot详解(原理、分类、试剂、步骤及问题解答) Western免疫印迹(Western Blot)是将蛋白质转移到膜上,然后利用抗体进行检测。对已知表达蛋白,可用相应抗体作为一抗进行检测,对新基因的表达产物,可通过融合部分的抗体检测。 本文主要通过以下几个方面来详细地介绍一下Western Blot技术: 一、原理 二、分类 i.放射自显影 ii.底物化学发光ECL iii.底物荧光ECF iv.底物DAB呈色 三、主要试剂 四、主要步骤 五、实验常见的问题指南 1.参考书推荐 2.针对样品的常见问题 3.抗体 4.滤纸、胶和膜的问题 5.Marker的相关疑问 6.染色的选择 7.参照的疑问 8.缓冲液配方的常见问题

9.条件的摸索 10.方法的介绍 11.结果分析 一、原理 1975年,Southern建立了将DNA转移到硝酸纤维素膜(NC膜)上,并利用DNA-RNA杂交检测特定的DNA片段的方法,称为Southern印迹法。而后人们用类似的方法,对RNA和蛋白质进行印迹分析,对RNA的印迹分析称为Northern印迹法,对单向电泳后的蛋白质分子的印迹分析称为Western 印迹法,对双向电泳后蛋白质分子的印迹分析称为Eastern印迹法。 与Southern或Northern杂交方法类似,但Western Blot采用的是聚丙烯酰胺凝胶电泳,被检测物是蛋白质,“探针”是抗体,“显色”用标记的二抗。经过PAGE分离的蛋白质样品,转移到固相载体(例如硝酸纤维素薄膜)上,固相载体以非共价键形式吸附蛋白质,且能保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变。以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原,与对应的抗体起免疫反应,再与酶或同位素标记的第二抗体起反应,经过底物显色或放射自显影以检测电泳分离的特异性目的基因表达的蛋白成分。该技术也广泛应用于检测蛋白水平的表达。

新手Western blot步骤及注意事项

WesternBlot操作步骤及注意事项 【原理】 Western Blot采用的是聚丙烯酰胺凝胶电泳,被检测物是蛋白质,“探针”是抗体,“显色”用标记的二抗。经过PAGE分离的蛋白质样品,转移到固相载体(例如硝酸纤维素薄膜)上,固相载体以非共价键形式吸附蛋白质,且能保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变。以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原,与对应的抗体起免疫反应,再与酶或同位素标记的第二抗体起反应,经过底物显色或放射自显影以检测电泳分离的特异性目的基因表达的蛋白成分。该技术也广泛应用于检测蛋白水平的表达。 【试剂及配制】 1、SDS-PAGE试剂:见试剂盒说明书。 2、电泳缓冲液 Tris(分子量121.14) 3.03g 甘氨酸(分子量75.07) 18.77g SDS 1g 蒸馏水定容至1000ml 溶解后室温保存,可配制成10X电泳缓冲液进行保存(Tris、甘氨酸、SDS用量X10倍,蒸馏水定容至1000ml)。电泳缓冲液使用2~3次后推荐更换。 3、转膜缓冲液 湿转法 48mmol/L Tris 2.375g 39mmol/L甘氨酸11.25g 0.0375%SDS 0.375g 加少部分蒸馏水溶解 20%甲醇200ml 蒸馏水定容至1000ml 溶解后室温保存,可配制成10X转膜缓冲液(不含甲醇)进行保存(Tris、甘氨酸、SDS用量X5倍,蒸馏水定容至500ml,或按10倍用量定容至1000ml等;用时取100ml,加入200ml 甲醇再加蒸馏水稀释至1000ml)。使用转膜缓冲液时注意室内通风。转膜缓冲液用于转膜一次后,建议更换新转移缓冲液,旧转移缓冲液可用于转膜前浸泡物品。 4、TBS缓冲液 1mol/LTris·HCl(pH7.5)10ml NaCl 8.8g 蒸馏水定容至1000ml 配制后室温保存,可配制成10XTBS缓冲液,使用时稀释10倍。 5、TBST缓冲液(洗膜液) 20%Tween20 1.65ml TBS 700ml 混匀后即可使用,现配现用,因含Tris缓冲液,其PH易受空气中二氧化碳影响,此外注意使用时不要直接接触到皮肤,其有致癌作用。

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