高效苯酚降解菌的筛选及其降酚性能

第8卷　第10期　2008年5月167121819(2008)1022628204　

科　学　技　术　与　工　程

Science Technol ogy and Engineering

　Vol .8　No .10　M ay 2008

Ζ　2008　Sci .Tech .Engng .

高效苯酚降解菌的筛选及其降酚性能

苏槟楠　徐宏英3

　王慕华　宋　崴

(山西省生物研究所,太原030006)

摘　要　由某钢铁集团公司焦化废水池的活性污泥中筛选驯化出降酚菌株,并经紫外诱变得到一株高效降酚菌Y 5。结果表明,该菌48h 可使浓度为2000mg/L 的苯酚溶液降解到47.70mg/L,降解率达97.61%,同时COD 去除率为93.77%。该菌株最适降酚条件为温度25～35℃,pH 6.5～7.5,并且降酚率随接菌量及通气量的增加而明显提高。关键词　苯酚 高效降酚菌株 降酚条件中图法分类号　X50511; 文献标志码　

A

2008年2月3日收到

第一作者简介:苏槟楠(1969—),女,山西襄汾人,硕士,副研究员,研究方向:废水的微生物处理。E 2mail:subn123@s ohu .com 。3通信作者简介:徐宏英,E 2mail:xhy6418@s ohu .com 。

酚及酚的化合物均为有毒的有机化合物,普遍存在于石油炼制、炼焦、钢铁、纺织等工业废水中造成水源污染,直接或间接地危害人体。目前,清除工业废水中苯酚的方法包括:微生物降解、萃取、活性炭吸附和化学氧化等,其中微生物降解法不仅经济、安全,而且处理的污染物阈值低、残留少、无二次污染因而得到越来越广泛的应用

[1—2]

。但酚及其

衍生物能引起蛋白质变性,并破坏微生物质膜[3]

。

,使其在高浓度含酚废水中不仅生长良好,而且能快速降解酚及其衍生物,对于降低工业废水生物处理成本具有极其重大的意义。

本实验从焦化废水处理池的活性污泥中分离筛选出可适用于高浓度含酚废水的高效降酚菌,并对其降解苯酚的条件进行了研究,以期为高浓度含酚废水的高效处理提供菌种资源。

1　实验材料及方法

1.1　实验材料

菌源:某钢铁集团公司焦化厂废水处理池的活

性污泥。

唯一碳源培养基:KH 2P O 40.5g/L,K 2HP O 40.5g/L,MgS O 4?7H 2O 0.2g/L,CaCl 20.1g/L,NaCl 0.2g/L,MnS O 4?H 2O 微量,FeCl 2微量,NH 4NO 31.0g/L,苯酚按试验需要量添加。

琼脂平板培养基:牛肉膏5.0g /L,蛋白胨10.0g/L,氯化钠5.0g/L,琼脂15.0～20.0g/L,苯酚1.0g/L 。　

斜面培养基:酵母膏5.0g/L,蛋白胨5.0g/L,氯化钠5.0g/L,琼脂15.0～20.0g/L,pH 7.0～7.2。

仪器设备:721可见分光光度计,X y 2X 3恒温摇瓶机,电热恒温培养箱。1.2　实验方法

1.2.1　苯酚含量的测定采用42氨基安替比林分光

光度法(G B7490287)测定。1.2.2　降酚菌的筛选及驯化

取活性污泥1.0g 接种于酚浓度为500mg/L 的唯一碳源培养基50mL 中,在30℃、180r/m in 的条件下振荡培养24h 。取该培养液5.0mL 接种于酚浓度为1000mg/L 的唯一碳源培养基50mL 中,在相同条件下培养。依次类推,分别接种到酚浓度为1500mg/L 、2000mg/L 的培养基中振荡培养,共驯化4个周期。

分别测定培养后的上述4种菌液的苯酚含量,

选取苯酚已降解完的浓度为1000mg/L 的培养液

在琼脂平板上划线分离,30℃恒温培养48h 后挑取单一菌落接种于斜面培养基,培养48h 后在4℃冰箱保存备用。

1.2.3　紫外诱变选育高效降酚菌

[4]

取上述筛选出的菌株,用生理盐水配制成菌悬液4.0mL 移入无菌空培养皿中,放一无菌磁力搅拌子后置磁力搅拌器上,30W 紫外灯下30c m 处照射,时间分别为1,2,3,4m in,所有操作均在红灯下进行。

在红灯下分别取未照射的菌悬液(作为对照)和照射过的菌悬液各0.5mL 进行不同程度的稀释,取最后3个稀释度的稀释液涂于琼脂平板上,每个稀释度涂3个平板,每个平板加稀释液0.1mL,用无菌玻璃涂棒涂匀,用黑布包好,30℃恒温培养48h 。挑取单菌落再分别接种到苯酚琼脂平板上30℃

培养48h 后转接至斜面培养基,培养好后置于4℃冰箱保存。

1.2.4　高效降酚菌株的筛选

将上述保存的菌株无菌操作分别接种于苯酚浓度为500,1000,1500,2000mg/L 的唯一碳源培养基各50mL 内,30℃、180r/m in 的条件下振荡培养,测定6,12,18,24,48h 各培养瓶内酚含量。最后选取48h 内能将2000mg/L 苯酚浓度基本降解完的菌株,命名为Y 5菌株。1.2.5　高效降酚菌降解条件试验

分别测定接菌量、通气量、不同温度及pH 值等培养条件对菌株降酚性能的影响。1.2.6　高效降酚菌COD 测定

按《化学需氧量的测定重铬酸钾法》(G B11914—1989)测定。

2　结果与讨论

2.1　高效降酚菌Y 5在不同时间对不同浓度苯酚

的降解

图1表示Y 5菌株在不同时间对不同浓度苯酚的降解。按2.0%的接入量将培养好的Y 5菌液接

入不同苯酚浓度的液体培养基中,30℃,180r/m i m 的条件下振荡培养,分别测定6,12,18,24,48h 各培养瓶内酚含量。如图1所示,Y 5菌株在12h 时已能将500,1000mg/L 苯酚溶液中的苯酚完全降解,而此时1500及2000mg/L 浓度的苯酚溶液降解率分别为22.79%和18.11%;随着苯酚浓度的升高及降解时间的延长,48h 时1500mg/L 苯酚溶液降解率为100%,2000mg/L 苯酚溶液残余仅为47.70mg/L,降解率达97.61%。可见苯酚浓度的增大对

该菌株生长有一定的抑制作用,从而使其降酚能力有所下降。该菌株比同类报道的菌株(600mg/L 苯酚浓度90%降解耗时16h [5]

)的降酚能力要高

很多

。

图1　Y 5菌株在不同时间对不同浓度苯酚的降解

2.2　温度对Y 5菌株降酚性能的影响

温度主要影响微生物体内酶的活性,只有在特定酶促作用下,微生物才能完成生长过程所发生的化学反应

[6]

。而每种酶都有最适合的酶反应

温度,因此温度的变化影响酶促反应速度,最终影响细胞物质合成

[7]

。温度对Y 5菌株降酚性能的

影响如图2所示,在25～35℃范围内Y 5菌株降酚效果较好,其中30～35℃达高峰;小于25℃以及大于35℃时菌株降解率在逐渐下降,如20℃和40℃时Y 5菌株降酚率最低,说明该菌株酶促反应

温度应为25～35℃,低于或高于此温度范围其酶活将受到抑制。因而Y 5菌株降酚最适温度范围为25～35℃。

9

26210期苏槟楠,等:高效苯酚降解菌的筛选及其降酚性能　

图2　温度对Y 5菌株降酚性能的影响

2.3　pH 对Y 5菌株降酚性能的影响

环境的酸碱度影响着微生物的生理活动,每种酶都有其最适合的pH 范围。将Y 5菌株接入pH 值分别为4.0,5.0,6.0,7.0,8.0,9.0,10.0的唯一碳源培养基中,30℃,180r/m in 的条件下振荡培养后测定苯酚含量,结果如图3所示。图3表明Y 5菌株在pH 7.0时降酚率最高达100%;pH 小于7.0及大于7.0Y 5菌株的降酚率都在下降,而在pH 4.0和pH10.0时降酚率分别为8.66%和6.01%,两者都小于10%。因此Y 5菌株

降解苯酚的最适pH 值范围应为6.5～7.5。

图3　pH 对Y 5菌株降酚性能的影响

2.4　不同接菌量对Y 5菌株降酚率的影响

选取唯一碳源培养基各50mL,分别加入湿菌体0.1,0.2,0.3,0.4,0.5g (实验所采取的湿菌体由培养后的菌悬液经5000r/m in,10m in 离心后得到),观察2～6h 之内不同湿菌体接菌量对降酚性能的影响。图4既为不同接菌量对Y 5菌株降酚率的影响。从图4可以看出在2h 时0.1g 接菌量的降酚率较低为15.72%,0.5g 接菌量的降酚率较高47.53%,已明显看出接菌量越大降酚率越高。随着

时间的延长及接菌量的增加降酚率明显提高,6h 时0.

4,0.5g 接菌量降酚率都达到了100%。说明随着菌量的增加去除苯酚的有效菌也增多,使苯酚的去除效果大大增强。

图4　不同接菌量对Y 5菌株降酚性能的影响

2.5　不同通气量对Y 5菌株降酚率的影响

由于Y 5菌株为好氧菌,因此通气量的大小对其生长和降解能力都有一定影响。本试验采用在相同容积的三角瓶中装入不同量的培养液来达到不同通气量的目的。在250mL 三角锥瓶中分别装入唯一碳源培养基50,75,100,125mL,30℃,180r/m in 的条件下振荡培养后分别测定2～6h 培养液

中苯酚含量。图5为Y 5菌株在不同通气量下不同时间降酚率的变化。由图5可看出,随着装液量的增加也即通气量的下降苯酚降解率在下降,在6h 时装液量为50mL 的苯酚溶液降解率达100%

,而装液量为125mL 的苯酚溶液降解率仅为58.13%,说明通气量的减少对菌株生长有不利影响。

图5　通气量对Y 5菌株降酚性能的影响

2.6　高效降酚菌Y 5对COD 去除率的比较

C O

D 是化学需氧量,是表示废水中有机物完全

0362科　学　技　术　与　工　程8卷

氧化所需的氧量

[8]

,它反映了水中受还原性物质污染

的程度。图6表示Y 5菌株对不同浓度苯酚溶液的COD 去除率的变化。从图中可以看出,同对照相比500mg/L 、1000mg/L 苯酚溶液C OD 去除率都达到100%,1500,2000mg/L 苯酚溶液C OD 去除率分别达95.52%和93.77%。另外也可看出随着苯酚降解率的

提高C OD 去除率也在提高,说明由于苯酚含量的减少溶液中有机物含量也在减少,最终使C OD 含量下降。

图6　C OD 去除率的比较

3　结论

(1)经紫外诱变获得一株高效降酚菌株Y 5,该

菌为好氧菌,随着通气量的增大降酚率有明显的提高,且接菌量越大降酚率越高。

(2)该菌在48h 内可将2000mg/L 浓度的苯酚

溶液降解到浓度为47.70mg/L,降解率达97.61%。

(3)对其降解苯酚的条件进行研究表明,该菌

最适降酚温度25～35℃,最适降酚pH 6.5～7.5。

(4)该菌株可将不同浓度的苯酚溶液中的大部

分COD 去除,并且对浓度为2000mg/L 的苯酚溶液COD 去除率达93.77%。

参　考　文　献

1　李　勇,付金祥,蔡苏兰.微生物降解法处理含酚废水的研究进

展.辽宁城乡环境科技,2005;25(5):26—28

2　徐玉泉,张　维,陈　明,等.一株苯酚降解菌的分离和鉴定.环

境科学学报,2000;20(4):450—455

3　D luhy M ,Rybarikousa D,Bales V ,et al .Phenol degradati on by bacte 2

ria part one:is olati on and characterizati on of bacterial strain .Pol J Envir on Stud,1996;5(2):21—26

4　沈齐英,刘　录,申林波.紫外诱变选育高效降酚微生物.环境科

学与技术,2004;27(1):82—84

5　杨　光,向　阳,夏　雷.一株苯酚高效降解菌的分离及其分解

能力的初步研究.氨基酸和生物资源,2003;25(4):3—6

6　Onysko K A,Robins on C W ,Budman H M.Effect of te mperature on

the inhibiti on kinetics of phenol bi odegradati on by Pseudomonas puti 2da Q5.B i otec B i oeng,2000;70(3):291—299

7　吕荣湖,付　强.高浓度酚降解菌的选育及其降酚性能.环境科

学,2005;26(5):147—151

8　贺延龄.废水的厌氧生物处理.北京:中国轻工业出版社,

1998;522

Breed and B i odegrada ti on Perfor mance for Effecti ve

Phenol 2degrad i n g Bacter i u m

S U B in 2nan,XU Hong 2ying 3

,WANG Mu 2hua,S ONG W ei

(B i ol ogy Research I nstitute of Shanxi,Taiyuan 030006,P 1R 1China )

[Abstract]　Some phenol 2degrading ger m s have been bred fr om activated sludge of the waster water treat m ent fa 2cility of a Ir on 2Steel Gr oup Company .A effective phenol 2degrading bacteriu m (na med Y 5)has been bred by used the method of uvi olized induced mutati on .The results show that the Y 5can degrade phenol t o 47.70mg/L at con 2centrati on of 2000mg/L in 48h and the degradati on rate of phenol is 97.61%.Re moval rate of COD is 93.77%.This test shows that the condign phenol 2degrading conditi ons are 25～35℃and pH 6.5～7.5.And the degradati on rate of phenol is evidently i m p r oved with the a mount of bacteriu m and aerati on .

[Key words]　phenol effective phenol 2degrading bacteriu m phenol 2degrading conditi on

1

36210期苏槟楠,等:高效苯酚降解菌的筛选及其降酚性能

实验一 苯酚降解菌的分离及降解性测定

实验一苯酚降解菌的分离及降解性测定 实验原理：在污染环境中，大部分微生物由于受到毒害而死亡，少数微生物具有较强的降解能力或通过诱变改变其基因型或诱导产生某些酶而能在污染的环境中存活，成为有机污染物的高效降解菌或耐性菌株。 从污染环境中取样，通过在选择性培养基上培养，可筛选出目的性微生物。本实验取青年湖水样作为菌种的来源，在以苯酚为唯一碳源的无机盐培养基进行培养，分离苯酚降解菌。实验步骤： 1. 从污染地区取样品（污水，污泥或受污染的土壤）。 2. 配制无碳源的无机盐培养基，加入苯酚储备液，使培养基中苯酚浓度达100 mg/L。 121℃灭菌20 min。 3. 吸取1 ml活性污泥，加入灭菌培养基，同时做空白对照，28℃恒温摇床培养24 h（160 rmp/min）. 4. 测定苯酚降解率。 苯酚降解率的测定方法： a.标准曲线的绘制分别吸取0、1、2、3、4、5mL 酚标准溶液（100 mg/L） 于50mL容量瓶中，加蒸馏水稀释成20 mL。加入2 mL pH9.8缓冲溶液，4 mL 4％4－氨基安替比林溶液，摇匀后加入4 mL 8％铁氰化钾溶液，显色10min 后，加蒸馏水稀释至刻度。用722型分光光度计460nm波长处比色测定。 b.以不加酚的试剂作空白对照，以浓度为横坐标，以光密度为纵坐标绘制标准 曲线。 c.培养液中苯酚降解率的测定吸取培养液2mL于50mL容量瓶中，加蒸馏水 稀释成20 mL。加入2 mL pH9.8缓冲溶液，4 mL 4％4－氨基安替比林溶液， 摇匀后加入4 mL 8％铁氰化钾溶液，显色10min后，加蒸馏水稀释至刻度。 用722型分光光度计460 nm波长处比色测定。 d.根据标准曲线求出苯酚含量以分解苯酚的百分数表示酚分解作用强弱。

苯酚降解菌的筛选、鉴定及其降解特性的研究

上海师范大学 硕士学位论文 苯酚降解菌的筛选、鉴定及其降解特性的研究 姓名：何小丽 申请学位级别：硕士 专业：微生物学 指导教师：肖明 20090501

上海师范大学硕士学位论文摘要论文题目：苯酚降解菌的筛选、鉴定及其降解特性的研究 学校专业：微生物学 学位申请人：何小丽 指导教师：肖明 摘要 酚类化合物为细胞原浆毒物，属高毒性物质。这类物质来源广泛，通常污染水源，毒死鱼虾，危害农作物，并严重威胁人类的健康。含酚有机物的毒性还在于其只能被少数的微生物分解。从自然界中筛选分离出能够降解特定污染物的高效菌种，有针对性的投加到已有的污水处理系统中的生物强化技术，能够快速提供大量具有特殊作用的微生物，在有毒有害污染物治理中显示出巨大的潜力。 1、本研究从胜利油田河口采油厂的飞雁滩油田土壤样品中分离得到10株能够利用并降解苯酚的菌株P1-P4、P7、P9-P13。该10株苯酚降解菌能够在以苯酚为唯一碳源和能源的培养基上生长，经16S rDNA分子鉴定和生理生化检测，该10株降酚菌分别被鉴定到属或种。其中降酚菌株P1、P3和P4这3株菌株分别属于劳尔氏菌属(Ralstonia)、贪噬菌属（Variovorax）和节杆菌属（Arthrobacter）里的种。其它7株降酚菌株P 2、P7、P9-P13都属于假单胞菌属（Pseudomonas）里的种。这4个属里的细菌在国内外都已被报道有降解苯酚的特性，其中有关假单胞菌降解环境有机物的报道较多。 2、培养液中的苯酚含量通过4-氨基安替比啉分光光度法测定，通过苯酚降解效率的比较，菌株P2降解苯酚的能力较其它9株菌株要强。于是将菌株P2作为本研究中进一步研究的对象，研究了不同的环境条件下该菌株降解苯酚和菌体生长的情况。 3、通过苯酚羟化酶特异性引物的设计，从菌株P2扩增出苯酚羟化酶大亚基基因，该基因片段编码对苯酚有催化活性的多肽，催化苯酚代谢的第一步反应；表明菌株P2能降解苯酚是由于细胞具有降解苯酚的遗传基础。 I

苯酚降解菌的分离和鉴定

目录 目录 (1) 摘要 (2) Abstract (3) 第一章绪论 (4) 1.1 苯酚降解菌的定义及分类 (4) 1.2苯酚降解菌的性质及其用途 (4) 1.3苯酚降解的研究现状 (5) 1.4苯酚降解菌生产菌的筛选 (6) 1.5本课题的研究思路及意义 (6) 第二章材料与方法 (7) 2.1试验材料 (7) 2.2试验方法 (8) 2.2.2苯酚降解菌的驯化 (8) 2.2.3菌种在不同条件下的降解能力 (9) 2.2.4最优菌种的鉴定 (9) 3.1苯酚降解菌筛选结果及性状初步研究 (11) 3.11筛选结果 (11) 3.1.1.1初步筛选的结果 (11) 3.1.1.2 菌种驯化中的结果 (11) 3.1.2 H-1菌株的性状初步结果 (13) 3.2 H-1菌株分类鉴定结果 (13) 第四章结论 (14) 4.1菌种的筛选结果 (14) 4.2菌种的鉴定 (14) 参考文献 (15) 致谢.......................................................................................... 错误!未定义书签。

一株苯酚降解菌的分离和鉴定 摘要 为了寻找能高效降解苯酚的微生物, 从土壤中筛选得到了一株苯酚降解菌,通过逐渐增加苯酚的浓度,然后驯化出一株高效降解苯酚的细菌H-1. 当在30 ℃培养48h 时其降解率高达92.11%. 经理化特征测定及外观鉴定,将其初步鉴定为假单胞菌属.再经过对比实验测各种因素(碳源、温度、pH、通气) 对该菌生长及降解苯酚能力的影响,得知该菌能以苯酚作为唯一碳源,最适生长温度为32 ℃,最适pH 为7.0. 该菌为好氧菌,在空气充足的条件下可提高降解能力. 该菌菌落较小，菌落呈微黄色。菌体呈直或微弯的杆装，没有菌柄也没有鞘。不产芽孢。对该菌做生化鉴定，可知该菌革兰氏染色为阴性，可水解苯酚，生长温度为32℃，生长pH为pH 6.5～7.5。参照东秀珠,蔡妙英的《常见细菌系统鉴定手册》等文献方法，以形态和培养特征为主，生理生化特性及生态特性为辅，经初步鉴定为假单胞菌属，命名为H-1，具体确定到种则需要进一步的研究。 【关键词】：筛选苯酚降解鉴定

实验三高效苯酚降解菌的筛选及其性能测定课件.doc

实验三高效苯酚降解菌的筛选及其性能测定 一、实验目的 1、掌握微生物分离纯化的基本操作； 2、掌握用选择性培养基从环境中分离苯酚降解菌的原理和方法； 3、掌握微生物对酚降解能力的测定方法； 4、掌握4-氨基安替比林法测定苯酚含量的方法。 二、实验原理 在工业废水的生物处理中，对污染成分单一的有毒废水，可以选育特定的高效菌株进行处理。这些高效菌株以有机污染物作为其生长所需的能源、碳源或氮源，从而使有机污染物得以降解，具有处理效率高、耐受毒性强等优点。 苯酚是一种在自然条件下难降解的有机物，其长期残留于空气、水体、土壤中，会造成严重的环境污染，对人体、动物有较高毒性。本实验通过筛选苯酚降 解菌来处理含酚废水，将苯酚降解为为二氧化碳和水，消除对环境的污染。 + COOHCH2CH2COOH CH3COOH C O2+H2O 从环境中采样后，在以苯酚为唯一碳源的培养基中，经富集培养、分离纯化、降解实验和性能测定，可筛选出高效酚降解菌。 三、实验器材与试剂 1、样品 实验土样采自校园污水处理厂。 2、器材 恒温培养箱、恒温摇床、分光光度计、比色皿、试管、250mL三角瓶、100mL 容量瓶、培养皿、涂布玻棒、量筒、天平、灭菌锅、酒精灯、接种环、棉花、棉 线、牛皮纸、pH 试纸。 3、试剂 葡萄糖、牛肉膏、蛋白胨、苯酚、四硼酸钠（Na2B4O7）、4-氨基安替比林、过硫酸铵（（NH4）2S2O8）、K2HPO4、KH2PO4、MgSO4、琼脂。

苯酚标准溶液：称取分析纯苯酚 1.0g，溶于蒸馏水中，稀释至1000mL，摇 匀。此溶液溶度为1000mg/L。测定标准曲线时将苯酚浓度稀释至100mg/L。 Na2B4O7 饱和溶液：称取N a2B4O7 40g，溶于1L 蒸馏水中，冷却后使用，此 溶液的pH值为10.1。 3% 4-氨基安替比林溶液：称取分析纯4-氨基安替比林3g，溶于蒸馏水中， 并稀释至100mL，置于棕色瓶中，冰箱保存，可用两周。 2% （NH4）2S2O8 溶液：称取分析出（NH4）2S2O8 2g，溶于蒸馏水中，并稀 释至100mL，置于棕色瓶中，冰箱保存，可用两周。 4、培养基 富集培养基：蛋白胨0.5g，K2HPO4 0.1g，MgSO4 0.05g，水1000mL，调节pH 7.2-7.4，高压蒸汽灭菌，冷却后视需要添加适量的苯酚。 基础培养基：K2HPO4 0.6g，KH2PO4 0.4g，NH4NO3 0.5g，MgSO4 0.2g，CaC2l 0.025g，水1000mL，调节pH 7.0-7.5，高压蒸汽灭菌，冷却后视需要添加适量的苯酚。 四、实验步骤 （一）富集培养和驯化 采集活性污泥或土样，接种于装有100mL 富集培养基和玻璃珠并加有适量 苯酚（50mg/L）的三角瓶中，30℃振荡培养。待菌生长后，用无菌移液管吸取 1mL 转至另一个装有100mL 富集培养基和玻璃珠并加有适量苯酚的三角瓶中， 如此连续转接2-3 次，每次所加的苯酚量适当增加，最后可得酚降解菌占绝对优 势的混合培养物。 （二）平板分离和纯化 1、用无菌移液管吸取经富集培养的混合液10mL，注入90mL无菌水中，充 分混匀，并继续稀释到适当浓度。 2、取适当浓度的稀释菌液，加一滴于固体平板（由富集培养基加入2%的琼 脂组成，倒平板时添加适量的苯酚，浓度达到200 mg/L。）中央，用无菌玻璃涂 棒把滴加在平板上的菌液涂平，盖好皿盖，每个稀释度做2-3 个重复。 3、室温放置一段时间，待接种菌液被培养基吸收后，倒置于30℃恒温箱中 培养2-3d。 4、挑选不同菌落形态，在含适量苯酚的固体平板上划线纯化。平板倒置于

高效苯酚降解菌的分离及降解性能的研究

高效苯酚降解菌的分离及降解性能的研究 引言 石油、化工、煤气、焦化及酚类等生产厂排放的废水当中含有大量的苯酚[1]。未经净化的含酚废水可导致水源被污染，致使鱼类死亡，危害农作物，最终威胁人类的健康。许多国家将苯酚列为重要的污染物之一。目前，国内外处理含酚废水的方法主要有物理法、化学法、微生物法及各种结合法[2]。其中微生物法主要利用微生物的代谢活动去除废水中的有毒物，处理方法无2次污染且安全、经济。目前，已鉴定具有降解苯酚能力的微生物主要有假单胞菌（Pseudonomonas.sp）[3]、芽孢杆菌（Bacillus.sp）[4]、酵母菌（Yeast trichosporon）[5]、根瘤菌（Rhizobia）[6]、醋酸钙不动杆菌（A. calcoaceticus）[7]等，降酚菌株多存在于酚类污染物企业排放的废水、污泥和被废水污染的土壤中[8]。本课题拟从被苯酚废水污染的污泥中进行菌株筛选，得到耐酚菌后在以苯酚为唯一碳源的无机盐培养上筛选降酚菌株，进一步测定苯酚降解的影响因素。对特定菌株降解含酚废水的应用价值进行研究。 1 实验材料和方法 1.1 菌株来源 采集原黑龙江省佳木斯东郊黑龙农药化工集团废弃排污口

处污泥进行菌株筛选。 1.2 培养基 基础培养基：NaCl 5.0g/L，蛋白胨10g/L，琼脂15～20g/L，酵母浸膏5.0g/L，调节pH为7.0。 以苯酚为唯一碳源的无机盐培养基：CaCl2 0.1 g/L ，FeSO4.7H2O 0.01 g/L，K2HPO4 0.5g/L，MnSO4.7H2O 0.05 g/L，NaCl 0.2 g/L，KH2PO4 0.5g/L，MgSO4.H2O 0.01 g/L，NH4NO3 1.0 g/L苯酚按实验需要量添加，调节pH为7.0 [8]。 富集培养基：葡萄糖10.0g/L，营养琼脂33.0g/L，酵母浸粉10.0g/L，调节pH为7.5。 1.3 研究内容与方法 1.3.1 菌株和的驯化和分离 在超净工作台中，将10mL含0.1g/L苯酚的基础培养基倒入培养皿，取10 g污泥加90mL蒸馏水搅拌15min，静置5min后取上层清液为菌原液[8]。取1mL菌原液加入无菌水中分别制成100、10- 1、10- 2、10- 3、10-4等梯度的菌液，然后分别从各菌液试管中取1mL用涂布法接种于基础培养基平板上。在pH 值为7、25℃情况下培养24～48h。挑取单一菌落于富集培养基平板上划线、扩繁。编号，将平板置于25℃的恒温培养箱中培养24～48h后放于4℃冰箱保存。依据革兰氏染色进行微生物鉴定。 1.3.2 降酚菌的筛选

降解苯酚微生物的选育

降解苯酚微生物的选育 一、实验目的 1. 学习从含酚工业污水、活性污泥中筛选苯酚降解菌。 2. 学习通过活性污泥驯化分离耐酚菌。 二、实验原理 酚类化合物是化工、造纸、钢铁等工业废水的主要有害成分，含酚污水的排放，污染水源、毒死鱼虾、危害庄稼、严重危害人类健康，是各国研究关注的污染物之一。 含酚废水中分离出的生物降解酚能力强的菌为：假单胞菌、白乳杆菌、假丝酵母和野丝膜菌等。含酚废水生物处理目前主要采用活性污泥法。 三、实验材料 1.菌源含酚工业废水或含酚废水曝气池中的活性污泥。 2.培养基耐酚真菌培养基(固体、液体和斜面)，耐酚细菌培养基(固体、液体和斜面) ，碳源对照培养液a，苯酚培养液b。 3.试剂2% 4-氨基安替比林溶液，8%铁氰化钾溶液，氯仿，氨性氯化铵缓冲液，溴酸钾-溴化钾溶液，硫代硫酸钠溶液, 1%淀粉溶液。 4.其他稀释分离所用的无菌水，无菌培养皿，无菌移液管，测定酚所用的移液管，容量瓶，试剂瓶，酸式滴定管等。 四、实验方法 1.采样 自焦化厂、钢铁公司化工厂、造纸厂处理含酚工业污水的曝气池中取活性污泥和含酚污水，装于无菌瓶中，带回实验室，记录采样日期、地点，曝气池的水质分析包括：挥发酚、可溴化物、BOD5五日生化需氧量、COD化学需氧量、焦油、硫化物、氰化物、总氮、氨态氮、磷、pH、水温等。采集的样品应迅速稀释分离。 2.分离纯化 一般微生物在含酚培养基上不能生长。苯酚耐受菌株的筛选，可采用药物抗性菌株一样的梯度平板法。即在培养基中加入一定量的药物，使大量细胞中的少数抗性细胞在平板上的一定剂量药品的部位长成菌落，从而判定该菌耐受酚的能力。

1、梯度平板制备：在无菌培养皿中，先倾倒7～l0mL不含苯酚的无菌细菌或真菌固体培养基，将培养皿一侧置于木条上，使皿中培养基倾斜成斜面，且刚好完全盖住培养皿底部，待培养基凝固后，将培养皿放平，再倒入无菌7～l0mL(刚好完全盖住下层斜面)含70mL/l00mL苯酚的无菌耐酚细菌或耐酚真菌固体培养基，刚好完全盖住下层斜面，放置过夜。由于苯酚的扩散作用，造成上层培养基由厚到薄的药物浓度递减的梯度。 2、涂布法分离：将采集的样品作10倍梯度稀释，按涂布法分离，30℃培养2 天后，平板上生长的菌落也形成密度梯度，苯酚低浓度区形成菌苔，苯酚高浓度区出现稀少菌落，将此菌落在含耐酚细菌或真菌培养基平板上连续划线分离，最后挑取单菌落接种到耐酚斜面培养基上，30℃培养2天。 3、耐酚菌驯化 先将从含酚废水采集的活性污泥放入苯酚无机培养液中（苯酚终浓度25mg/L，MgSO4.7H2O终浓度0.3%, KH2PO4终浓度0.3%），30℃振荡培养6～7天，使苯酚降解菌大量增殖，淘汰对酚不适应的微生物；再添加苯酚无机培养液（苯酚终浓度增加至100mg/L）30℃振荡培养4～6天；再流加苯酚无机培养液（苯酚终浓度增加至200mg/L）30℃振荡培养4～6天，再提高到流加250mg/L苯酚无机培养液，30℃培养4天，从中选出对酚耐受力强的菌株。 4、性能测定。 初筛：制备不同含酚浓度的耐酚平板培养基，苯酚浓度为0.025%、0.045%、0.060%、0.075%，将选出的耐酚力强的菌株在以上平板培养基上划线分离，自高酚浓度平板上长出的菌落，即为酚降解力高的菌株。 复筛：将初筛纯化的菌种分别接入碳源对照培养液a和苯酚培养液b中，30℃振荡培养48h，0、12、24、36、48h取样测A600光密度值，绘制生长曲线，以不含酚的碳源(葡萄糖)培养液为对照。若与对照相比，在250mg/L苯酚浓度培养液中生长速度下降不明显，同时，用4-氨基安替比林法检测发酵初时发酵液和发酵终止时发酵液苯酚浓度，计算降解率，若苯酚降解率达>80%，表明确系分离到有效苯酚降解菌。 五、实验报告 1．记录分离得到的苯酚降解菌情况于表4-1。 2．根据复筛耐酚试验，绘制对照组与试验组生长曲线。 3．记录在平板上和显微镜下观察的苯酚降解菌的菌落特征和镜检特征。

苯酚降解菌

苯酚降解菌2,3-邻苯二酚双加氧酶基因克隆和序列分析 一．摘要： 环境中的酚污染主要指酚类化合物对水体的污染，通常含酚废水中又以苯酚和甲酚的含量最高。目前环境监测常以苯酚和甲酚等挥发性酚作为污染指标。苯酚广泛存在于石油、化工、煤气、焦化、钢铁及酚类生产厂排放的废水中。含酚废水的排放导致水源污染,毒死鱼虾,危害农作物,并严重威胁人类的健康,在我国水污染控制中已被列为重点解决的有害废水之一。含酚有机物的毒性还在于其只能被少数微生物所分解。在油田地层水中分离出苯酚降解菌BF80，并且从BF80中克隆出编码2，3-邻苯二酚双加氧酶(参与苯酚降解所必须的一种酶)的基因序列；采用基因克隆的策略是通过PCR进行片段克隆，并用UNIQ-10柱形DNA 回收试剂盒回收产物，采用NCBI BLAST序列分析表明该基因片段长1207bp,序列比较分析表明该基因片段与2-苯酚羟化酶A相似度达88%，氨基酸序列分析表明其与2,3-邻苯二酚双加氧酶相似度达96%。本实验研究编码降解苯酚的2,3-邻苯二酚双加氧酶的基因克隆及序列分析，为构建高效降解苯酚的基因工程菌奠定了基础。 Phenol degrading bacteria 2 - phenol hydroxylase gene sequence analysis Abstract: Phenol pollution in the environment mainly refers to phenolic compounds on water pollution, waste water containing phenol is usually turned around the highest levels of phenol and cresol. Often present environmental monitoring such as phenol and cresol Phenol as pollution indicators. Phenol widespread in the petroleum, chemical, gas, coke, steel and phenolic wastewater plant emissions. Phenolic wastewater emissions of water pollution, poisoned fish, damage crops, and a serious threat to human health, water pollution control in China has been a key to solve one of the harmful waste. The toxicity of phenol organics still only a small number of micro-organisms, their decomposition. In oilfield water of phenol degrading bacteria isolated from BF80, and BF80 was cloned from the 2,3 - catechol dioxygenase (involved in phenol degradation of an enzyme necessary) of the gene sequence; using gene cloning strategy were cloned by PCR, with UNIQ-10 column DNA extraction kit recycling products, using NCBI BLAST sequence analysis showed that the gene fragment was 1207bp, Sequence analysis showed that the gene fragment and 2 - A similarity to phenol hydroxylase 88% amino acid sequence analysis showed that with 2,3 - catechol dioxygenase similarity of 96%. This study coded degradation of phenol 2,3 Catechol Dioxygenase Gene Cloning and sequence analysis, in order to build efficient genetic engineering of bacteria degrading phenol basis 关键词：苯酚苯酚降解菌基因克隆基因序列分析

苯酚的生物降解特性研究_丁霞

“有机污染物——苯酚的生物降解特性研究”设计方案 丁霞 一、实验目的 酚类化合物为原生质毒物，毒性较大。焦化、煤气、石油、木材防腐、造纸、合成氨等工业废水中都含有高浓度的苯酚。含酚废水在我国水污染控制中被列为重点解决的有害废水之一。利用降解菌来控制苯酚的污染，越来越受到人们的重视。本项目拟采用微生物培养、苯酚生物降解的途径及其降解关键酶的分析、微生物DNA的提取、分光光度计测定、PCR、TA克隆等实验技术，阐明苯酚降解菌株的生长特性和苯酚的生物降解特性，苯酚降解菌的系统发育。对学生从事有机污染工业废水的生物处理以及有机污染的土壤或水体的生物原位修复方面的科学研究具有深远的意义。 二、实验原理 利用以苯酚为唯一碳源和能源的无机盐溶液作为驯化液，对某废水处理厂活性污泥进行驯化培养，从中分离筛选出苯酚降解菌。利用比浊法测定微生物生长量，4-氨基安替比林直接光度法测定苯酚浓度，分析苯酚生物降解的途径及其降解关键酶，PCR扩增细菌的16s RNA进行苯酚降解菌的系统发育分析。 1）微生物生长量的测定方法——比浊法 比浊法是实验室中常用的用来测定微生物生长量的方法，以反映微生物数量或浓度的一种指标。该方法是根据当某一波长的光线通过混浊的液体后，光的强度将被减弱。入射光与透过光的强度比与样品液的浊度和液体的厚度相关。根据所测得的吸光值，就可以得到微生物的生长量。本实验采用的波长为600nm，使用空白培养基作为对照。 2) 苯酚浓度的测定方法 见后面附录。 3）苯酚降解菌的系统发育分析 16S rRNA基因是细菌染色体上编码rRNA相对应的DNA序列，存在于所有细菌的染色体基因组中。16S rRNA具有高度的保守性和特异性。随着PCR技术

一株降解苯酚微生物的分离与鉴定

一株降解苯酚微生物的分离与鉴定 摘要：从武汉市某化工厂的活性污泥中分离1株能以苯酚为惟一碳源和能源生长的菌株，命名为CY1。通过逐级驯化，CY1可在含1 000 mg·L-1苯酚的培养基中降解苯酚并生长。经对该菌株进行形态特征以及16S rDNA序列比对分析，确认该菌株属于假单胞菌属(Pseudomonas)。 关键词：苯酚；降解；假单孢菌属 Isolation and Identification of A Phenol-degrading Bacterium Abstract：A strain CY1 was isolated from the sludge around a chemical plant in Wuhan，Hubei Province. It had ability of utilizing phenol as sole carbon and energy sources. By using step-by-step domesticating method，it could grow in the culture medium byusing 1 000 mg·L-1 phenol as sole carbon source. CY1 was considered to be belonged to Pseudomonas by morphological characteristics and the phylogenetical analysis of the 16S rDNA sequence. Key words：phenol；degradation；Pseudomonas 苯酚及其衍生物广泛应用于制药、农药、冶金、塑料等行业，它在环境中能与水中的氯作用生成毒性更大的氯代酚，对人类健康和动植物生长造成的危害不容忽视[1]。近年来，苯酚降解微生物的研究倍受关注，已鉴定和发现了多种具有苯酚降解能力的菌株，比如根瘤菌(Rhizobia)、乙酸钙不动杆菌(Acinetobacter calcoaceticus)、假单胞菌(Pseudo-monas sp.)、真养产碱菌(Alcaligenes eutrophus)、酵母菌(Yeasttri-chosporon cutaneum)、反硝化菌等[2]。本研究从湖北武汉某化工厂的活性污泥中驯化、筛选到一株苯酚降解细菌，并根据其16S rDNA基因序列构建了系统发育树，对其进行了鉴定。同时对苯酚的存在对菌株生长的影响进行了研究。 1材料与方法 1.1材料 污泥样品：采自湖北武汉某化工厂污水排放口。培养基：富集培养基为牛肉膏蛋白胨培养基：牛肉膏3.0 g，蛋白胨10.0 g，NaCl 5.0 g，水1 000 mL，pH值