搜档网
当前位置:搜档网 › 引物的合成和纯化

引物的合成和纯化

引物的合成和纯化
引物的合成和纯化

FAQ:引物的合成和纯化

1. 引物是如何合成的?

目前引物合成基本采用固相亚磷酰胺y三酯法。该方法具有高效、快速的偶联以及起始反应物比较稳定的特点。主要是将DNA固定在固相载体上完成DNA链的合成的,合成的方向是由待合成引物的3'端向5'端合成的,相邻的核苷酸通过3'→5'磷酸二酯键连接。

固相亚磷酰胺三酯法合成引物的具体步骤如下:

1) 将预先连接在固相载体CPG上的活性基团被保护的核苷酸与三氯乙酸反应,脱去其5'-羟基的保护基团DMT,获得游离的5'-羟基。

2) 合成DNA的原料,亚磷酰胺保护核苷酸单体,与活化剂四氮唑混合,得到核苷亚磷酸活化中间体,它的3'端被活化,5'-羟基仍然被DMT保护,与溶液中游离的5'-羟基发生缩合反应。

3) 带帽(capping)反应,缩合反应中可能有极少数5'-羟基没有参加反应(少于2%),用乙酸酐和1-甲基咪唑终止其后继续发生反应,这种短片段可以在纯化时分离掉。

4) 在氧化剂碘的作用下,亚磷酰形式转变为更稳定的磷酸三酯。

经过以上四个步骤,一个脱氧核苷酸被连接到固相载体的核苷酸上。再以三氯乙酸脱去它的5'-羟基上的保护基团DMT,重复以上步骤,直到所有要求合成的碱基被接上去。合成过程中可以观察TCA处理阶段的颜色判定合成效率。

通过氨水高温处理,连接在CPG上的引物被切下来,通过RPC、PAGE等手段纯化引物,成品引物用C18浓缩,脱盐,沉淀。沉淀后的引物用水悬浮,测定OD260定量,根据定单要求分装。

2. DNA合成粗产物中含有什么杂质?

主要是合成反应过程中产生的失败片段以及脱保护基团时产生的铵盐。

3. 引物纯化方式有哪些?

引物常用的纯化方式C18脱盐、RPC纯化、PAGE纯化、HPLC纯化。

纯化方式详细说明

C18柱脱盐又称为简易反相柱,对DNA有特异性吸附,可被有机溶液洗脱,但不会被水洗脱,因此能有效地去除盐分,但不能有效去除比目的片段短的小片段。该方法一般不会对普通PCR反应产生影响。对于需要用于测序、克隆的引物不能使用这个级别。

RPC纯化RPC纯化是通过反相净化滤芯(Reverse Phase Cartridge) 对引物进行纯化,纯化原理与反相HPLC纯化一样。与反相HPLC比较,RPC是一种有效并且更加经济的纯化方式。反相净化滤芯通常包含一种疏水基质如C18的硅胶,能够很好的吸附DNA,并且可以用水轻松地将切割下来的保护基团和短的引物片段从反相柱上洗掉。RPC纯化的引物可以应用于DNA测序、PCR及基因合成等。

PAGE纯化PAGE纯化法是使用变性聚丙烯酰胺凝胶电泳,对引物DNA进行分离,然后从凝胶中回收目的DNA。PAGE纯化法也是一种非常有效的DNA纯化方法,纯化后的DNA纯度大于90%,对长链Oligo DNA (大于50 mer)的纯化特别有效。

HPLC纯化HPLC纯化是使用高效液相色谱的原理,对引物DNA进行纯化。该方法用于分离纯化或分析时能达到很高的纯度和灵敏度。在引物DNA的分析和纯化中,常用的有

离子交换(ion-exchange)HPLC和反相(reverse-phase)HPLC。reverse phase

HPLC:纯度大于90%;ion exchange HPLC:纯度大于95%,可以有效的去除N-1

短片段。HPLC纯化主要用于短链和修饰引物的纯化。该法的缺点是成本较高,批

量生产效率不高。

4. 引物纯化方式如何选择?

引物纯化主要方法的适用范围及建议

您可以根据您的实验需求,选择合适的金斯瑞引物纯化方式,更加经济方便。如果您需要进一步的指导,请联系金斯瑞技术支持。

应用引物长度要求纯度级别要求

< 45 base DSL

一般PCR扩增

> 45 base PAGE

诊断PCR扩增< 40 base RPC, PAGE

DNA测序20 base左右PAGE

亚克隆,点突变等根据实验需要RPC, PAGE, HPLC

基因构建(全基因合成)根据实验需要PAGE

反义核酸根据实验需要PAGE

修饰引物根据实验需要PAGE, HPLC

5. 合成的引物5’端是否有磷酸化?

合成的引物5’端为羟基,没有磷酸基团。如果需要,您可以用多核苷酸激酶进行5'端磷酸化,或者要求我们合成时直接在5'或3'端进行磷酸化,需要另外收费。

6. 最长可以合成多长的引物?

引物越长,出现问题的概率就越大。除非有特殊需要,我们建议合成片段长度不要超过80 mer,按照目前的引物合成效率,80 mer的粗产品,全长引物的百分比不会超过40%,后续处理还会丢失很多,因此最后的产量很低。金斯瑞最长可合成110 base的引物。

7. 为何长链引物的收费要比短链引物要高?

在合成长链引物时,所需要的试剂比短链引物要多,尤其是长度大于90 base的引物。由于成本的增加,从而导致价格较高。

8. 交付引物质量好坏的判断标准是什么?

合成的引物和您的定单序列一致,而不是能否扩增出您所需要的产物。

9. PCR产物经过克隆以后测序发现引物区与合成序列不相符合,怎么办?

多数情况是PCR过程和克隆过程中引入的错误。遇到这种情况,请您

1) 重新挑取克隆测序,会有找到正确克隆的可能

2) 可以要求我们重新免费合成引物。

10. 测序发现引物有突变是怎么回事?

引物合成是一种多步骤的化学反应,每一步的合成效率最高也就是99%,副产品不可以避免。链越长,突变的频率累加起来就越高。在您PCR扩增后克隆测序的时候,为了节约时间和提高成功率,我们有如下建议:

1)请您在检测到阳性克隆后准备2~3个阳性克隆子的菌液,尽量送测2个或以上克隆,这样成功率将大大提高,也节约很多时间;

2)也可以先送测1个克隆,其余两个克隆子的菌液在冰箱4度保存,一旦出现个别点突变或缺失,立即将余下的两个克隆送测;

3)这样得到正确的序列可能性将非常高,并且可以免去重新PCR、连接、克隆以及筛选的一系列实验操作,更省去了很多时间;

如您发现2~3个以上克隆都在引物区存在突变,经确认是由引物的原因引起的话,我们将会立即安排加急免费重合,并以最快的速度送到您的手里。

引物纯化方式选择指南设计

引物纯化方式选择指南2012-2-16 10:24:14 容导读 一、DNA合成的方法和原理 二、引物纯化的方法原理及其效果 三、纯化方法与应用指南 四、常见问题的原因分析及相应的对策 一、DNA合成的方法和原理 目前引物合成主要采用固相亚磷酰胺三酯法进行。基于该方法的DNA合成仪有多种,由ABI/PE 公司生产的高通量DNA自动合成仪得到了广泛的应用。各合成仪进行引物合成的原理基本相同,主要区别在于合成产率的高低、试剂消耗量和单个循环用时等。生工公司采用的合成仪主要机型为全新的ABI3900高通量合成仪。 固相亚磷酰胺三酯法合成DNA片段,具有高效、快速偶联以及起始反应物比较稳定的特点。该方法是在固相载体上完成DNA链的合成的,DNA化学合成不同于酶促的DNA合成过程从5’→3’方向延伸,而是由3’端开始,相邻的核苷酸通过3’→5’磷酸二酯键连接。具体的反应步骤如图一。 1、脱保护基(Deblocking) 用三氯乙酸(Trichloroacetic Acid,TCA) 脱去连结在CPG (Controlled Pore Glass) 上的核苷酸的保护基团DMT (二甲氧基三苯甲基),获得游离的5'-羟基端,以供下一步缩合反应。2、活化(Activation) 将亚磷酰胺保护的核苷酸单体与四氮唑活化剂混合并进入合成柱,形成亚磷酰胺四唑活性中间体(其3'-端已被活化,但5'-端仍受DMT保护),此中间体将与GPG上的已脱保护基的核苷酸发生缩合反应。

3、连接(Coupling) 亚磷酰胺四唑活性中间体遇到CPG上已脱保护基的核苷酸时,将与其5'-羟基发生亲合反应,缩合并脱去四唑,此时合成的寡核苷酸链向前延长一个碱基。 4、封闭(Capping) 缩合反应后,为了防止连在CPG上的未参与反应的5'-羟基在随后的循环反应中被延伸,常通过乙酰化来封闭此端羟基,一般乙酰化试剂是用乙酸酐和N-甲基咪唑等混合形成的。 图1: DNA合成原理示意图(固相亚磷酰胺三酯法) 5、氧化(Oxidation) 缩合反应时核苷酸单体是通过亚磷酯键与连在CPG上的寡核苷酸连接,而亚磷酯键不稳定,易被酸、碱水解,此时常用碘的四氢呋喃溶液将亚磷酰转化为磷酸三酯,得到稳定的寡核苷酸。 经过以上五个步骤后,一个脱氧核苷酸就被连到CPG的核苷酸上,同样再用三氯乙酸脱去新连上的脱氧核苷酸5'-羟基上的保护基团DMT后,重复以上的活化、连接、封闭、氧化过程即可得到DNA片段粗品。最后对其进行切割、脱保护基,合成的Oligo在脱去保护基后,目的Oligo纯度是比较低的,其中含有大量的杂质。主要杂质有:所脱下的保护基与氨形成的苯甲酸氨和异丁酸氨,腈磷基上脱下的腈乙基,以及合成时产生的短链等。以至于粗产品中全长Oligo DNA含量仅为25%左右。尽管合成时每一步的效率都在98%~99%,但累积的效率并不高。这些杂质成分,尤其是存在于粗产品中的大量盐和短链,不但造成定量不准,还会影响下一步的反应。因此必须对Oligo DNA进行纯化、定量等合成后处理即可得到符合实验要求的寡核苷酸片段。 二、引物纯化的方法原理及其效果 基于以上合成的原理和步骤,目前,常见的几种纯化方法如C18柱、OPC或HAP、PAGE、

引物纯化方式HAP、PAGE、DHLPC的区别

引物纯化方式HAP、PAGE、DHLPC等的区别 纯化方式: 一OPC纯化 OPC纯化是使用一种叫Cartridge的反向层析柱(美国Waters 公司生产 ),根据DNA保护基(DMTr基)和层析柱中树脂间的亲和力作用的原理进行纯化目的DNA片段。OPC法纯化的DNA纯度大于90%,适用于PCR用引物,DNA测序用引物,各种探针等。此级别对短链较为有效。具体操作方法如下。 1. DNA 合成是用全自动DNA 合成仪从3‘ →5‘ 进行人工合成的。在刚合成完的DNA 的5‘ 端的碱基上带有一个大型的疏水性保护基团DMTr 基,而中间产物的短链杂质DNA 中不具有DMTr 基。利用这一性质进行目的DNA 的纯化。 2. 把粗样DNA 加入Sep-Pak Cartridge 柱上(简易反相柱) 。此时,所有的合成产物全吸附于反相柱上。 3. 用甲醇清洗反相柱。此时,吸附能力强的带有DMTr 保护基的目的DNA 仍吸附于反相柱上,而短链杂质DNA 片段全部被冲走。 4. 向反相柱上加入强酸TFA (Trifluoroacetic acid) , 切断DMTr 保护基和目的DNA 之间的连接。 5. 再用乙腈洗脱目的DNA 。此时回收出来的目的DNA 的纯度能达到95% 以上。可用于DNA 测序等。 二 PAGE纯化 PAGE纯化法是使用变性聚丙烯酰胺凝胶电泳,对DNA片段进行分离,然后从凝胶中回收目的DNA的方法。PAGE纯化法也是一种非常有效的DNA纯化方法,纯化后的纯度大于95%,对长链Oligo DNA的纯化特别有效。适用于PCR用引物,DNA测需用引物,各种探针等。 三 HPLC纯化 采用高效液相色谱纯化,产物纯度极高,可达99%。适用于各种基因工程试验,特别是:荧光标记DNA、长链DNA、PCR克隆,定点突变,人工合成基因等。 HPLC 纯化 HPLC 纯化是使用高效液相色谱仪,对目的DNA 片段进行纯化的方法。HPLC 纯化的设备投资大,生产成本高,但使用本法纯化的 DNA 片段纯度极高,大于99% 。HPLC 纯化的操作方法如下。 1. 合成高纯度级DNA 制品时,在全自动DNA 合成仪上,需自动脱去DMTr 保护基。 2. 将粗样DNA 注入分离性能极强的离子交换高效液相色谱系统,进行粗检测,确认主峰位置、目的DNA 含量等。 3. 增加注样量,回收主峰平头部分。此时可达到去除杂质短链DNA ,纯化目的DNA 的目的。为了确保DNA 的纯度,一般一次的纯化量为 1 OD 左右。 4. 将回收后的DNA 进行纯度检测,确认纯度的可靠性。

引物合成的详解1引物是如何合成的目前引物合成基本采用固相亚

引物合成的详解 1.引物是如何合成的? 目前引物合成基本采用固相亚磷酰胺三酯法。DNA合成仪有很多种, 主要都是由ABI/PE 公司生产,无论采用什么机器合成,合成的原理都相同,主要差别在于合成产率的高低,试剂消耗量的不同和单个循环用时的多少。 亚磷酰胺三酯法合成DNA片段,具有高效、快速的偶联以及起始反应物比较稳定的特点。亚磷酰胺三酯法是将DNA固定在固相载体上完成DNA链的合成的,合成的方向是由待合成引物的3′端向5′端合成的,相邻的核苷酸通过3′→5′磷酸二酯键连接。 第一步是将预先连接在固相载体CPG上的活性基团被保护的核苷酸与三氯乙酸反应,脱去其5′-羟基的保护基团DMT,获得游离的5′-羟基。 第二步,合成DNA的原料,亚磷酰胺保护核苷酸单体,与活化剂四氮唑混合,得到核苷亚磷酸活化中间体,它的3′端被活化,5′-羟基仍然被DMT保护,与溶液中游离的5′-羟基发生缩合反应。 第三步,带帽(capping)反应,缩合反应中可能有极少数5′-羟基没有参加反应(少于2%),用乙酸酐和1-甲基咪唑终止其后继续发生反应,这种短片段可以在纯化时分离掉。 第四步,在氧化剂碘的作用下,亚磷酰形式转变为更稳定的磷酸三酯。 经过以上四个步骤,一个脱氧核苷酸被连接到固相载体的核苷酸上。再以三氯乙酸脱去它的5′-羟基上的保护基团DMT,重复以上步骤,直到所有要求合成的碱基被接上去。合成过程中可以观察TCA处理阶段的颜色判定合成效率。 通过氨水高温处理,连接在CPG上的引物被切下来,通过OPC, PAGE等手段纯化引物,成品引物用C18浓缩,脱盐,沉淀。沉淀后的引物用水悬浮,测定OD260定量,根据定单要求分装。 2.引物纯化方式有哪些,如何选择? ◆C18柱脱盐:有人称其为简易反相柱,它对DNA有特异性的吸附,可以被有机溶解洗脱,但不会被水洗脱,所以能有效地去除盐分。它不能有效去除比目的片段短的小片段。实际上,它是一种脱盐的作用。这种方法一般不会对普通PCR反应产生影响。对于需要用于测序、克隆的引物不能使用这个级别。 ◆OPC纯化:OPC纯化是根据DNA保护基(DMTr基)和Cartridge柱中树脂间的亲合力作用的原理进行纯化目的DNA片段。OPC法纯化的DNA纯度大于95%。适用于40mer以下引物的纯化。 ◆PAGE纯:PAGE纯化法是使用变性聚丙烯酰胺凝胶电泳,对DNA片段进行分离,然后从凝胶中回收目的DNA的方法。PAGE纯化法也是一种非常有效的DNA纯化方法,纯化后的DNA纯度大于95%,对长链Oligo DNA (大于50mer)的纯化特别有效。 ◆HPLC纯化:HPLC纯化是使用高效液相色谱的原理,对DNA片段进行纯化。纯度可以大于99%。主要用于短链和修饰引物的纯化。该法的弱点是成本较高,批量生产效率不高。 3.引物的OD数如何定量? 答:引物合成引物OD数是这样测定的:用紫外分光光度计,波长260nm,石英比色杯,光程为1厘米,测定溶液的光密度。测定时溶液的光密度最好稀释到0.2-1.0之间。DNA干粉用一定体积的水充分振荡溶解以后,用1ml水稀释测OD值。需要根据稀释倍数换算出母液的OD值。 4.需要什么级别的引物? 答:引物常用的纯化方式C18脱盐,OPC纯化,PAGE纯化,HPLC纯化。根据实验需要,确定订购引物的纯度级别。 应用引物长度要求纯度级别要求 一般PCR扩增<45 base OPC 一般PCR扩增>45 base PAGE

引物纯化方法介绍

武汉安基生物科技有限公司 引物纯化方法介绍 1) RPC 纯化,它对DNA 有特异性的吸附,可以被有机溶液洗脱,但不会被水洗脱,所以能有效地去除盐分,但是它不能有效去除比目的片段短的小片段。这种方法处理的产物中虽然含有比目的片段少5'端一个或两个或多个碱基的产物,却一般不会对普通PCR 反应产生影响。但是对于需要用于测序、用于克隆的引物不能使用这个级别。 2) OPC 柱纯化,OPC 柱中装有对DMT 具有亲和力的树脂,合成DNA 片段时保留5'端最后一个碱基上的DMT,所有合成产物吸附在O PC 柱上以后,用稀的有机溶剂洗柱,带有DMT 的片段吸附能力强,不易被洗脱,不带有DMT 的片段吸附能力弱,被洗脱。然后用三氟乙酸TFA 或三氯乙酸TCA 脱去DMT 基团,再用浓一点的有机溶剂洗脱DNA。这种方法的优点是快速,简易。但是其专一性吸附DMT 能力有限,不免仍然有短片段带入的可能,而且负载量小。特别是对长于25碱基以上的片段纯化效果不好。 3) HPLC 纯化,这是国外厂家常常使用的办法。它是依据不同大小的片段带有的净荷多少来分离产物的。合成粗产物中不同长度的DNA 片段决定了它带有不同的净电荷,较长的片段带有高电荷比带电荷低的短片段在离子交换柱中流动得慢。先将粗产物检测主峰位置,再增加加样量,回收主峰位置的部分。它的优点是自动化程度高、省人力;缺点是纯化量小、不能纯化长片段(对于长于40碱基的片段,无法纯化)。 4) PAGE 纯化,几乎所有专业书籍上介绍的最佳纯化方法。 它是依据DNA 片段在变性聚丙烯酰胺凝胶中电泳时的迁移率不同来分离大小片段的。由于各分子所带电荷和大小不同,综合影响其在凝胶中的迁移速度,大片段迁移得慢,经过一定时间的电泳,大小片段会分开,然后停止电泳,剥离凝胶,置于荧光TLC 板上在紫外灯下切割目的条带,浸泡碎胶,并从泡胶的盐溶液中回收目的DNA。优点是纯化效果很好、尤其是纯化长链效果更好、而且是可以直观看见DNA 片段合成情况的质控环节。通常认为的缺点是实验室水平的PAGE 纯化实验步骤多费人工、电泳及后处理过程样品损失量大、电泳装置局限或电泳时间如果不够会影响纯化效果。但这些缺点完全可以克服。我们通过扩大规模流水作业使实验过程便于掌握和节

引物设计注意事项

引物设计 首先引物与模板的序列要紧密互补, 其次引物与引物之间避免形成稳定的二聚体或发夹结构, 再次引物不能在模板的非目的位点引发DNA聚合反应(即错配)。 引物设计应注意如下要点: 1. 引物的长度一般为15-30 bp,常用的是18-27 (22)bp,但不应大于 38,因为过长会导致其延伸温度大于74℃,不适于Taq DNA聚合酶进行反应。 2. 碱基要随机分布。 引物序列在模板内应当没有相似性较高,尤其是3’端相似性较高的序列,否则容易导致错误引发(False priming)。降低引物与模板相似性的一种方法是,引物中四种碱基的分布最好是随机的,不要有聚嘌呤或聚嘧啶的存在。尤其3′端不应超过3个连续的G或C,如GGG或CCC,因这样会使引物在GC富集序列区错误引发。 3. 引物3’端的末位碱基对Taq酶的DNA合成效率有较大的影响。不同 的末位碱基在错配位置导致不同的扩增效率,末位碱基为A的错配效率明显高于其他3个碱基,因此应当避免在引物的3’端使用碱基A。而当末位链为T时,错配的引发效率大大降低,G、C错配的引发效率介于A、T之间,所以3′端最好选择T。 非配对结构最好出现在引物中间。 另外,引物二聚体或发夹结构也可能导致PCR反应失败,3’端尽量不含互补碱基。 5’端序列对PCR影响不太大,因此常用来引进修饰位点或标记物。 4. 引物序列的GC含量一般为40-60%,过高或过低都不利于引发反应。 上下游引物的GC含量不能相差太大。 5. 引物所对应模板位置序列的Tm值在72℃左右可使复性条件最佳。 Tm值的计算有多种方法,如按公式Tm=4(G+C)+2(A+T),在Oligo 软件中使用的是最邻近法。 6. ΔG值是指DNA双链形成所需的自由能,该值反映了双链结构内部碱 基对的相对稳定性。应当选用3’端ΔG值较低(绝对值不超过9),而5’端和中间ΔG值相对较高的引物。引物的3’端的ΔG值过高,容易在错配位点形成双链结构并引发DNA聚合反应。 7. 引物二聚体及发夹结构的能值过高(超过 4.5kcal/mol)易导致产 生引物二聚体带,并且降低引物有效浓度而使PCR反应不能正常进行。

引物

一、引物的合成和纯化 1. 引物是如何合成的? 目前引物合成基本采用固相亚磷酰胺y三酯法。该方法具有高效、快速的偶联以及起始反应物比较稳定的特点。主要是将DNA固定在固相载体上完成DNA链的合成的,合成的方向是由待合成引物的3'端向5'端合成的,相邻的核苷酸通过3'→5'磷酸二酯键连接。 固相亚磷酰胺三酯法合成引物的具体步骤如下: 1) 将预先连接在固相载体CPG上的活性基团被保护的核苷酸与三氯乙酸反应,脱去其5'-羟基的保护基团DMT,获得游离的5'-羟基。 2) 合成DNA的原料,亚磷酰胺保护核苷酸单体,与活化剂四氮唑混合,得到核苷亚磷酸活化中间体,它的3'端被活化,5'-羟基仍然被DMT保护,与溶液中游离的5'-羟基发生缩合反应。 3) 带帽(capping)反应,缩合反应中可能有极少数5'-羟基没有参加反应(少于2%),用乙酸酐和1-甲基咪唑终止其后继续发生反应,这种短片段可以在纯化时分离掉。 4) 在氧化剂碘的作用下,亚磷酰形式转变为更稳定的磷酸三酯。 经过以上四个步骤,一个脱氧核苷酸被连接到固相载体的核苷酸上。再以三氯乙酸脱去它的5'-羟基上的保护基团DMT,重复以上步骤,直到所有要求合成的碱基被接上去。合成过程中可以观察TCA处理阶段的颜色判定合成效率。 通过氨水高温处理,连接在CPG上的引物被切下来,通过OPC、PAGE等手段纯化引物,成品引物用C18浓缩,脱盐,沉淀。沉淀后的引物用水悬浮,测定OD260定量,根据定单要求分装。 2. DNA合成粗产物中含有什么杂质? 主要是合成反应过程中产生的失败片段以及脱保护基团时产生的铵盐。 3. 引物纯化方式有哪些? 引物常用的纯化方式C18脱盐、OPC纯化、PAGE纯化、HPLC纯化。 纯化方式详细说明 C18柱脱盐又称为简易反相柱,对DNA有特异性吸附,可被有机溶液洗脱,但不会被水洗脱,因此能有效地去除盐分,但不能有效去除比目的片段短的小片段。该方法一般不会对普通PCR反应产生影响。对于需要用于测序、克隆的引物不能使用这个级别。 OPC纯化OPC柱纯化,OPC柱中装有对Dmt具有亲和力的树脂,合成DNA片段时保留5'端最后一个碱基上的Dmt,所有合成产物吸附在OPC柱上以后,用稀的有机溶剂洗柱,带有Dmt的片段吸附能力强,不易被洗脱,不带有Dmt的片段吸附能力弱,被洗脱。然后用三氟乙酸TFA或三氯乙酸TCA脱去Dmt基团,再用浓一点的有机溶剂洗脱DNA。这

引物篇

引物篇 1.引物是如何合成的? 目前引物合成基本采用固相亚磷酰胺三酯法。DNA合成仪有很多种, 主要都是由ABI/PE 公司生产,无论采用什么机器合成,合成的原理都相同,主要差别在于合成产率的高低,试剂消耗量的不同和单个循环用时的多少。 亚磷酰胺三酯法合成DNA片段,具有高效、快速的偶联以及起始反应物比较稳定的特点。亚磷酰胺三酯法是将DNA固定在固相载体上完成DNA链的合成的,合成的方向是由待合成引物的3'端向5'端合成的,相邻的核苷酸通过3'→5'磷酸二酯键连接。 第一步是将预先连接在固相载体CPG上的活性基团被保护的核苷酸与三氯乙酸反应,脱去其5'-羟基的保护基团DMT,获得游离的5'-羟基; 第二步,合成DNA的原料,亚磷酰胺保护核苷酸单体,与活化剂四氮唑混合,得到核苷亚磷酸活化中间体,它的3'端被活化,5'-羟基仍然被DMT保护,与溶液中游离的5'-羟基发生缩合反应。 第三步,带帽(capping)反应,缩合反应中可能有极少数5'-羟基没有参加反应(少于2%),用乙酸酐和1-甲基咪唑终止其后继续发生反应,这种短片段可以在纯化时分离掉。 第四步,在氧化剂碘的作用下,亚磷酰形式转变为更稳定的磷酸三酯。 经过以上四个步骤,一个脱氧核苷酸被连接到固相载体的核苷酸上。再以三氯乙酸脱去它的5'-羟基上的保护基团DMT,重复以上步骤,直到所有要求合成的碱基被接上去。合成过程中可以观察TCA处理阶段的颜色判定合成效率。 通过氨水高温处理,连接在CPG上的引物被切下来,通过OPC, PAGE等手段纯化引物,成品引物用C18浓缩,脱盐,沉淀。沉淀后的引物用水悬浮,测定OD260定量,根据定单要求分装。 2.引物纯化方式有哪些,如何选择? ◆C18柱脱盐:有人称其为简易反相柱,它对DNA有特异性的吸附,可以被有机溶解洗脱,但不会被水洗脱,所以能有效地去除盐分。它不能有效去除比目的片段短的小片段。实际上,它是一种脱盐的作用。这种方法一般不会对普通PCR 反应产生影响。对于需要用于测序、克隆的引物不能使用这个级别。 ◆OPC纯化: OPC纯化是根据DNA保护基(DMTr基)和Cartridge柱中树脂间的亲合力作用的原理进行纯化目的DNA片段。OPC法纯化的DNA纯度大于95%。适用于40mer以下引物的纯化。 ◆PAGE纯:PAGE纯化法是使用变性聚丙烯酰胺凝胶电泳,对DNA片段进行分离,然后从凝胶中回收目的DNA的方法。PAGE纯化法也是一种非常有效的DNA纯化方法,纯化后的DNA纯度大于95%,对长链Oligo DNA (大于50mer)的纯化特别有效。 ◆HPLC纯化:HPLC纯化是使用高效液相色谱的原理,对DNA片段进行纯化。纯度可以大于99%。主要用于短链和修饰引物的纯化。该法的弱点是成本较高,批量生产效率不高。 3.引物的OD数如何定量? 答:引物合成引物OD数是这样测定的:用紫外分光光度计,波长260nm,石英比色杯,光程为1厘米,测定溶液的光密度。测定时溶液的光密度最好稀释到0.2-1.0之间。DNA干粉用一定体积的水充分振荡溶解以后,用1ml水稀释测OD值。需要根据稀释倍数换算出母液的OD值。 4.需要什么级别的引物? 答:引物常用的纯化方式C18脱盐,OPC纯化,PAGE纯化,HPLC纯化。根据实验需要,确定订购引物的纯度级别。应用引物长度要求纯度级别要求 一般PCR扩增 < 45base OPC >45 base PAGE 诊断PCR扩增 < 40base OPC, PAGE

引物纯化方式HAPAGEDHLPC的区别修订稿

引物纯化方式 H A P A G E D H L P C的区 别 Document number【SA80SAB-SAA9SYT-SAATC-SA6UT-SA18】

引物纯化方式HAP、PAGE、DHLPC等的区别 纯化方式: 一 OPC纯化 OPC纯化是使用一种叫Cartridge的反向层析柱(美国 Waters 公司生产 ),根据DNA保护基(DMTr基)和层析柱中树脂间的亲和力作用的原理进行纯化目的DNA片段。OPC法纯化的DNA纯度大于90%,适用于PCR用引物,DNA测序用引物,各种探针等。此级别对短链较为有效。具体操作方法如下。 1. DNA 合成是用全自动 DNA 合成仪从3‘ → 5‘ 进行人工合成的。在刚合成完的 DNA 的5‘ 端的碱基上带有一个大型的疏水性保护基团 DMTr 基,而中间产物的短链杂质 DN A 中不具有 DMTr 基。利用这一性质进行目的 DNA 的纯化。 2. 把粗样 DNA 加入 Sep-Pak Cartridge 柱上(简易反相柱 ) 。此时,所有的合成产物全吸附于反相柱上。 3. 用甲醇清洗反相柱。此时,吸附能力强的带有 DMTr 保护基的目的 DNA 仍吸附于反相柱上,而短链杂质 DNA 片段全部被冲走。 4. 向反相柱上加入强酸 TFA (Trifluoroacetic acid) , 切断 DMTr 保护基和目的 DNA 之间的连接。 5. 再用乙腈洗脱目的 DNA 。此时回收出来的目的 DNA 的纯度能达到 95% 以上。可用于 DNA 测序等。 二PAGE纯化 PAGE纯化法是使用变性聚丙烯酰胺凝胶电泳,对DNA片段进行分离,然后从凝胶中回收目的DNA的方法。PAGE纯化法也是一种非常有效的DNA纯化方法,纯化后的纯度大于9 5%,对长链Oligo DNA的纯化特别有效。适用于PCR用引物,DNA测需用引物,各种探针等。 三HPLC纯化 采用高效液相色谱纯化,产物纯度极高,可达99%。适用于各种基因工程试验,特别是:荧光标记DNA、长链DNA、PCR克隆,定点突变,人工合成基因等。 HPLC 纯化 HPLC 纯化是使用高效液相色谱仪,对目的 DNA 片段进行纯化的方法。 HPLC 纯化的设备投资大,生产成本高,但使用本法纯化的DNA 片段纯度极高,大于 99% 。 HPLC 纯化的操作方法如下。 1. 合成高纯度级 DNA 制品时,在全自动 DNA 合成仪上,需自动脱去 DMTr 保护基。 2. 将粗样 DNA 注入分离性能极强的离子交换系统,进行粗检测,确认主峰位置、目的 DN A 含量等。 3. 增加注样量,回收主峰平头部分。此时可达到去除杂质短链 DNA ,纯化目的 DNA 的目的。为了确保 DNA 的纯度,一般一次的纯化量为 1 OD 左右。 4. 将回收后的 DNA 进行纯度检测,确认纯度的可靠性。 四 HAP

引物合成设计常见问题与技巧

1. 引物是如何合成的? 目前引物合成基本采用固相亚磷酰胺三酯法。DNA合成仪有很多种,主要都是由ABI/PE 公司生产,无论采用什么机器合成,合成的原理都相同,主要差别在于合成产率的高低,试剂消耗量的不同和单个循环用时的多少。申能博彩公司采用的合成仪主要机型为ABI3900高通量合成仪,合成长链主要采用Beckman 1000M和PE8909 DNA合成仪,引物修饰和高OD数合成采用ABI394等。 亚磷酰胺三酯法合成DNA片段,具有高效、快速的偶联以及起始反应物比较稳定的特点。亚磷酰胺三酯法是将DNA固定在固相载体上完成DNA链的合成的,合成的方向是由待合成引物的3‘端向5’端合成的,相邻的核苷酸通过3‘→5’磷酸二酯键连接。 第一步是将预先连接在固相载体CPG上的活性基团被保护的核苷酸与三氯乙酸反应,脱去其5'-羟基的保护基团DMT,获得游离的5'-羟基; 第二步,合成DNA的原料,亚磷酰胺保护核苷酸单体,与活化剂四氮唑混合,得到核苷亚磷酸活化中间体,它的3‘端被活化,5'-羟基仍然被DMT保护,与溶液中游离的5'-羟基发生缩合反应。 第三步,带帽(capping)反应,缩合反应中可能有极少数5'-羟基没有参加反应(少于2%),用乙酸酐和1-甲基咪唑终止其后继续发生反应,这种短片段可以在纯化时分离掉。 第四步,在氧化剂碘的作用下,亚磷酰形式转变为更稳定的磷酸三酯。 经过以上四个步骤,一个脱氧核苷酸被连接到固相载体的核苷酸上。再以三氯乙酸脱去它的5'-羟基上的保护基团DMT,重复以上步骤,直到所有要求合成的碱基被接上去。合成过程中可以观察TCA处理阶段的颜色判定合成效率。 通过氨水高温处理,连接在CPG上的引物被切下来,通过OPC, PAGE等手段纯化引物,成品引物用C18浓缩,脱盐,沉淀。沉淀后的引物用水悬浮,测定OD260定量,根据定单要求分装。 2. 引物纯化方式有哪些,如何选择? ◆C18柱脱盐:有人称其为简易反相柱,它对DNA有特异性的吸附,可以被有机溶解洗脱,但不会被水洗脱,所以能有效地去除盐分。它不能有效去除比目的片段短的小片段。实际上,它是一种脱盐的作用。这种方法一般不会对普通PCR反应产生影响。对于需要用于测序、克隆的引物不能使用这个级别。 ◆OPC纯化:OPC纯化是根据DNA保护基(DMTr基)和Cartridge柱中树脂间的亲合力作用的原理进行纯化目的DNA片段。OPC法纯化的DNA纯度大于95%.适用于40mer 以下引物的纯化。 ◆PAGE纯:PAGE纯化法是使用变性聚丙烯酰胺凝胶电泳,对DNA片段进行分离,然后从凝胶中回收目的DNA的方法。PAGE纯化法也是一种非常有效的DNA纯化方法,纯化后的DNA纯度大于95%,对长链Oligo DNA (大于50mer)的纯化特别有效。

引物-生产及使用详解

引物-生产及使用详解 (一)引物的合成和纯化 1. 引物是如何合成的? 目前引物合成基本采用固相亚磷酰胺三酯法。DNA合成仪有很多种,无论采用什么机器合成,合成的原理都相同,主要差别在于合成产率的高低,试剂消耗量的不同和单个循环用时的多少。安基生物公司采用的合成仪为最新引进的 Dr.Oligo192高通量合成仪,效率高,合成量大,质量稳定。 亚磷酰胺三酯法合成DNA片段,具有高效、快速的偶联以及起始反应物比较稳定的特点。该方法具有高效、快速的偶联以及起始反应物比较稳定的特点。主要是将DNA固定在固相载体上完成DNA链的合成的,合成的方向是由待合成引物的3'端向5'端合成的,相邻的核苷酸通过3'→5'磷酸二酯键连接。 固相亚磷酰胺三酯法合成引物的具体步骤如下: 第一步:将预先连接在固相载体CPG上的活性基团被保护的核苷酸与三氯乙酸反应,脱去其5'-羟基的保护基团DMT,获得游离的5'-羟基。 第二步:合成DNA的原料,亚磷酰胺保护核苷酸单体,与活化剂四氮唑混合,得到核苷亚磷酸活化中间体,它的3'端被活化,5'-羟基仍然被DMT保护,与溶液中游离的5'-羟基发生缩合反应。 第三步:带帽(capping)反应,缩合反应中可能有极少数5'-羟基没有参加反应(少于2%),用乙酸酐和1-甲基咪唑终止其后继续发生反应,这种短片段可以在纯化时分离掉。 第四步:在氧化剂碘的作用下,亚磷酰形式转变为更稳定的磷酸三酯。 经过以上四个步骤,一个脱氧核苷酸被连接到固相载体的核苷酸上。再以三氯乙酸脱去它的5'-羟基上的保护基团DMT,重复以上步骤,直到所有要求合成的碱基被接上去。合成过程中可以观察TCA处理阶段的颜色判定合成效率。 通过氨水高温处理,连接在CPG上的引物被切下来,通过OPC、PAGE等手段纯化引物,成品引物用C18浓缩,脱盐,沉淀。沉淀后的引物用水悬浮,测定OD260定量,根据定单要求分装。 2. DNA合成粗产物中含有什么杂质? 主要是合成反应过程中产生的短片段以及脱保护基团时产生的铵盐。 3. 引物纯化方式有哪些? 引物常用的纯化方式C18脱盐、OPC纯化、PAGE纯化、HPLC纯化。 纯化方式详细说明

引物纯化的方法有哪些

【蛋白研究系列专题】-17丨分分钟get引物各纯化方式 如今,引物纯化方式多种多样。各位科研君,每天忙碌奔波于核酸提取、载体构建、蛋白表达等环节,没有深入了解过各种引物纯化方式吧!今天,小编带各位对各种引物纯化方式作下对比。各位科研君在以后的研究中,记得对号入座哦! 一般纯化方式 目前,采用的主打的引物纯化方式是脱盐纯化。其只能纯化掉引物中的盐分,并不能去除含的小片段,价格较为便宜,能满足一般常规的应用。 1. C18柱: 又称为简易反相柱,对DNA有特异性吸附,可被有机溶液洗脱,但不会被水洗脱。因此能有效地去除盐分,但不能有效去除比目的片段短的小片段。该方法一般不会对普通PCR反应产生影响。对于需要用于测序、克隆的引物不能使用这个级别。 2. OPC纯化: 采用寡核苷酸纯化柱 (Oligonucleotide Purification Cartridge,OPC)纯化,制品纯度保证80 ~ 90%。此级别制品可用作PCR引物、DNA测序引物、各种探针等。该级别只提供长度在35 mer以下的合成DNA制品。序列更长时,制品的纯度得不到保证。 3. HAP纯化方法 HAP(High Affinity Purification)其原理是利用合成引物5'-端DMT基团对HAP树脂专一性吸附,而不含DMT的短链DNA不被吸附,从而达到分离纯化的目的。制品纯度可达到80~90%,可以满足杂交探针、测序、常规PCR(不再做进一步克隆实验)等用途了。但是因为其专一性吸附 DMT 能力有限,不免仍然有短片段带入的可能,而且负载量小。特别是对长于39 碱基以上的片段纯化效果不好。此级别只提供长度在10-39mer以下的合成oligo DNA制品。序列更长时,制品的纯度得不到保证。 4. RPC纯化 RPC纯化是通过反相净化滤芯 (Reverse Phase Cartridge) 对引物进行纯化,纯化原理与反相HPLC纯化一样。与反相HPLC比较,RPC是一种有效且更加经济的纯化方式。反相净化滤芯通常包含一种疏水基质如 C18的硅胶,能够很好的吸附DNA,并且可以用水轻松地将切割下来的保护基团和短的引物片段从反相柱上洗掉。RPC纯化的引物可以应用于DNA测序、 PCR及基因合成等。 5. TON纯化 基于特异和反相层析法,从合成好的产物中去除失败序列,提供最终的目标序列。适于35个碱基以下的引物。毛细管电泳(Capillary Electrophoresis)纯度大于75%。PAGE纯化方式 PAGE纯化价格适中,纯度较高,能满足大多数应用,尤其是长度大于50个碱基的长链引物。 1. 经典PAGE纯化:

引物合成详解

引物合成详解2010-5-17 来源: 1. 引物是如何合成的? 目前引物合成基本采用固相亚磷酰胺三酯法。DNA合成仪有很多种, 主要都是由ABI/PE 公司生产,而Bioneer自行研制的专利384并行高通量DNA合成仪,可实现99%的高合成率。无论采用什么机器合成,合成的原理都相同,主要差别在于合成产率的高低,试剂消耗量的不同和单个循环用时的多少。 亚磷酰胺三酯法合成DNA片段,具有高效、快速的偶联以及起始反应物比较稳定的特点。亚磷酰胺三酯法是将DNA固定在固相载体上完成DNA链的合成的,合成的方向是由待合成引物的3′端向5′端合成的,相邻的核苷酸通过3′→5′磷酸二酯键连接。 第一步是将预先连接在固相载体CPG上的活性基团被保护的核苷酸与三氯乙酸反应,脱去其5′-羟基的保护基团DMT,获得游离的5′-羟基。 第二步,合成DNA的原料,亚磷酰胺保护核苷酸单体,与活化剂四氮唑混合,得到核苷亚磷酸活化中间体,它的3′端被活化,5′-羟基仍然被DMT保护,与溶液中游离的5′-羟基发生缩合反应。 第三步,带帽(capping)反应,缩合反应中可能有极少数5′-羟基没有参加反应(少于2%),用乙酸酐和1-甲基咪唑终止其后继续发生反应,这种短片段可以在纯化时分离掉。 第四步,在氧化剂碘的作用下,亚磷酰形式转变为更稳定的磷酸三酯。 经过以上四个步骤,一个脱氧核苷酸被连接到固相载体的核苷酸上。再以三氯乙酸脱去它的5′-羟基上的保护基团DMT,重复以上步骤,直到所有要求合成的碱基被接上去。合成过程中可以观察TCA处理阶段的颜色判定合成效率。 通过氨水高温处理,连接在CPG上的引物被切下来,通过OPC, PAGE等手段纯化引物,成品引物用C18浓缩、脱盐,沉淀。沉淀后的引物用水悬浮,测定OD260定量,根据定单要求分装。 2.引物纯化方式有哪些,如何选择? ◆脱盐 寡核苷酸合成后,为了纯化寡核苷酸成为天然的DNA结构,首先必须去除保护基团。通过浓氨水处理,合成的寡核苷酸从固相载体上分离,2-氰乙氧基――磷酸二脂键的保护基团,以及碱基的保护基团基(苯甲酰基和异丁基)被去除,从而形成了天然的DNA结构。然而,必要的去保护步骤完成后,寡核苷酸混合物还包含几种必须被去除的小分子有机化合物。所有非必须有机化合物被移除的过程通常叫做脱盐。脱盐纯化可以借助反向硅胶柱进行。尽管脱盐纯化可以移除所有的非必须有机杂质,但它不能有效移除合成中产生微量的提前终止的寡核苷酸杂链。然而,脱盐的寡核苷酸还是能够满足PCR检测等基础生物研究。 ◆BioRP / OPC纯化 如果寡核苷酸以“三苯甲基”的形式合成,则N-甲基寡核苷酸包含5’-DMT基团,提前终止的寡核苷酸不包含该基团。因为DMT基有强的亲脂的特性,有5’-DMT基团的寡核苷酸与反相树脂有亲和性,因此反相亲和树脂通常被用于寡核苷酸的纯化。利用反向树脂和5’-DMT寡核苷酸存在强亲和力,但是提前终止的寡核苷酸不包含DMT基团,所以,我们能够成功的把想要的N-甲基寡核苷酸从提前终止的寡核苷酸杂质中分离出来。 ◆HPLC 如果合成的寡核苷酸应用于克隆,定向诱变或定量的基因探测,那么对其纯度要求较高。脱盐或OPC纯化的寡核苷酸可能达不到要求,则HPLC纯化被广泛地用于这个目的。作为一种纯化树脂,阴离子交换树脂或反向树脂被用于寡核苷酸纯化。阴离子交换树脂的HPLC 通常显示95-98%纯化效率,对于达到35-mer寡核苷酸的纯化是充分的。反向树脂化的HPLC 与阴离子交换树脂的HPLC呈现相似的纯化效率。因为HPLC的纯化效率很大程度依靠寡

引物的合成和纯化

FAQ:引物的合成和纯化 1. 引物是如何合成的? 目前引物合成基本采用固相亚磷酰胺y三酯法。该方法具有高效、快速的偶联以及起始反应物比较稳定的特点。主要是将DNA固定在固相载体上完成DNA链的合成的,合成的方向是由待合成引物的3'端向5'端合成的,相邻的核苷酸通过3'→5'磷酸二酯键连接。 固相亚磷酰胺三酯法合成引物的具体步骤如下: 1) 将预先连接在固相载体CPG上的活性基团被保护的核苷酸与三氯乙酸反应,脱去其5'-羟基的保护基团DMT,获得游离的5'-羟基。 2) 合成DNA的原料,亚磷酰胺保护核苷酸单体,与活化剂四氮唑混合,得到核苷亚磷酸活化中间体,它的3'端被活化,5'-羟基仍然被DMT保护,与溶液中游离的5'-羟基发生缩合反应。 3) 带帽(capping)反应,缩合反应中可能有极少数5'-羟基没有参加反应(少于2%),用乙酸酐和1-甲基咪唑终止其后继续发生反应,这种短片段可以在纯化时分离掉。 4) 在氧化剂碘的作用下,亚磷酰形式转变为更稳定的磷酸三酯。 经过以上四个步骤,一个脱氧核苷酸被连接到固相载体的核苷酸上。再以三氯乙酸脱去它的5'-羟基上的保护基团DMT,重复以上步骤,直到所有要求合成的碱基被接上去。合成过程中可以观察TCA处理阶段的颜色判定合成效率。 通过氨水高温处理,连接在CPG上的引物被切下来,通过RPC、PAGE等手段纯化引物,成品引物用C18浓缩,脱盐,沉淀。沉淀后的引物用水悬浮,测定OD260定量,根据定单要求分装。 2. DNA合成粗产物中含有什么杂质? 主要是合成反应过程中产生的失败片段以及脱保护基团时产生的铵盐。 3. 引物纯化方式有哪些? 引物常用的纯化方式C18脱盐、RPC纯化、PAGE纯化、HPLC纯化。 纯化方式详细说明 C18柱脱盐又称为简易反相柱,对DNA有特异性吸附,可被有机溶液洗脱,但不会被水洗脱,因此能有效地去除盐分,但不能有效去除比目的片段短的小片段。该方法一般不会对普通PCR反应产生影响。对于需要用于测序、克隆的引物不能使用这个级别。 RPC纯化RPC纯化是通过反相净化滤芯(Reverse Phase Cartridge) 对引物进行纯化,纯化原理与反相HPLC纯化一样。与反相HPLC比较,RPC是一种有效并且更加经济的纯化方式。反相净化滤芯通常包含一种疏水基质如C18的硅胶,能够很好的吸附DNA,并且可以用水轻松地将切割下来的保护基团和短的引物片段从反相柱上洗掉。RPC纯化的引物可以应用于DNA测序、PCR及基因合成等。 PAGE纯化PAGE纯化法是使用变性聚丙烯酰胺凝胶电泳,对引物DNA进行分离,然后从凝胶中回收目的DNA。PAGE纯化法也是一种非常有效的DNA纯化方法,纯化后的DNA纯度大于90%,对长链Oligo DNA (大于50 mer)的纯化特别有效。 HPLC纯化HPLC纯化是使用高效液相色谱的原理,对引物DNA进行纯化。该方法用于分离纯化或分析时能达到很高的纯度和灵敏度。在引物DNA的分析和纯化中,常用的有

引物合成的详解

引物合成的详解.txt这是一个禁忌相继崩溃的时代,没人拦得着你,只有你自己拦着自己,你的禁忌越多成就就越少。自卑有多种档次,最高档次的自卑表现为吹嘘自己干什么都是天才。11月13日 引物合成的详解 1.引物是如何合成的? 目前引物合成基本采用固相亚磷酰胺三酯法。DNA合成仪有很多种, 主要都是由ABI/PE 公司生产,无论采用什么机器合成,合成的原理都相同,主要差别在于合成产率的高低,试剂消耗量的不同和单个循环用时的多少。 亚磷酰胺三酯法合成DNA片段,具有高效、快速的偶联以及起始反应物比较稳定的特点。亚磷酰胺三酯法是将DNA固定在固相载体上完成DNA链的合成的,合成的方向是由待合成引物的3′端向5′端合成的,相邻的核苷酸通过3′→5′磷酸二酯键连接。 第一步是将预先连接在固相载体CPG上的活性基团被保护的核苷酸与三氯乙酸反应,脱去其5′-羟基的保护基团DMT,获得游离的5′-羟基。 第二步,合成DNA的原料,亚磷酰胺保护核苷酸单体,与活化剂四氮唑混合,得到核苷亚磷酸活化中间体,它的3′端被活化,5′-羟基仍然被DMT保护,与溶液中游离的5′-羟基发生缩合反应。 第三步,带帽(capping)反应,缩合反应中可能有极少数5′-羟基没有参加反应(少于2%),用乙酸酐和1-甲基咪唑终止其后继续发生反应,这种短片段可以在纯化时分离掉。 第四步,在氧化剂碘的作用下,亚磷酰形式转变为更稳定的磷酸三酯。 经过以上四个步骤,一个脱氧核苷酸被连接到固相载体的核苷酸上。再以三氯乙酸脱去它的5′-羟基上的保护基团DMT,重复以上步骤,直到所有要求合成的碱基被接上去。合成过程中可以观察TCA处理阶段的颜色判定合成效率。 通过氨水高温处理,连接在CPG上的引物被切下来,通过OPC, PAGE等手段纯化引物,成品引物用C18浓缩,脱盐,沉淀。沉淀后的引物用水悬浮,测定OD260定量,根据定单要求分装。 2.引物纯化方式有哪些,如何选择? ◆C18柱脱盐:有人称其为简易反相柱,它对DNA有特异性的吸附,可以被有机溶解洗脱,但不会被水洗脱,所以能有效地去除盐分。它不能有效去除比目的片段短的小片段。实际上,它是一种脱盐的作用。这种方法一般不会对普通PCR反应产生影响。对于需要用于测序、克隆的引物不能使用这个级别。 ◆OPC纯化: OPC纯化是根据DNA保护基(DMTr基)和Cartridge柱中树脂间的亲合力作用的原理进行纯化目的DNA片段。OPC法纯化的DNA纯度大于95%。适用于40mer以下引物的纯化。 ◆PAGE纯:PAGE纯化法是使用变性聚丙烯酰胺凝胶电泳,对DNA片段进行分离,然后从凝胶中回收目的DNA的方法。PAGE纯化法也是一种非常有效的DNA纯化方法,纯化后的DNA纯度大于95%,对长链Oligo DNA (大于50mer)的纯化特别有效。 ◆HPLC纯化:HPLC纯化是使用高效液相色谱的原理,对DNA片段进行纯化。纯度可以大于99%。主要用于短链和修饰引物的纯化。该法的弱点是成本较高,批量生产效率不高。 3.引物的OD数如何定量? 答:引物合成引物OD数是这样测定的:用紫外分光光度计,波长260nm,石英比色杯,光程为1厘米,测定溶液的光密度。测定时溶液的光密度最好稀释到0.2-1.0之间。DNA干粉用一定体积的水充分振荡溶解以后,用1ml水稀释测OD值。需要根据稀释倍数换算出母液的OD值。 4.需要什么级别的引物?

相关主题