新型毕赤酵母分泌表达载体的构建与功能验证_宋庆凤
新型毕赤酵母分泌表达载体的构建与功能验证
收稿日期：2009-03-11
基金项目：黑龙江省生物菌种资源共享平台建设（KT05A400-1）
作者简介：宋庆凤（1983-），女，黑龙江人，硕士研究生，研究方向为生物化学与分子生物学。
*通讯作者：李杰，副教授，硕士生导师，研究方向为植物分子遗传学与基因工程。E-mail:lijie_neau@https://www.sodocs.net/doc/d911645924.html,
宋庆凤，暴立娟，李
杰*
（东北农业大学生命科学学院，哈尔滨
150030）
摘要：巴斯德毕赤酵母（Pichia pastoris ）是目前应用最广泛的外源蛋白表达系统之一。用于毕赤酵母表达系
统的表达载体种类繁多，却因需要甲醇诱导表达或者基因转化过程中引入抗生素基因而限制了其在食品行业中的应用。研究设计以毕赤酵母组成型启动子-GAP 启动子替换毕赤酵母表达载体pPIC9上的甲醇诱导型启动子AOX ，成功构建了毕赤酵母组成型表达载体pGAPH α。并以里氏木霉木聚糖酶基因xyn 2为报告基因进行功能验证，结果表明，该载体可实现xyn 2基因在毕赤酵母中的高效表达。在此基础上以经密码子优化后的克鲁维酵母菊粉酶基因信号肽INU 替换载体上原有的α-Factor 信号肽，结果表明，INU 信号肽能够有效引导XYNII 的分泌。
关键词：毕赤酵母；表达载体；GAP 启动子；INU 信号肽中图分类号：
文献标识码：A
文章编号：1005－9369（2009）07－0055－05
Construction and probation of neotype secreting expression vectors for Pichia pastoris /SONG Qingfeng,BAO Lijuan,LI Jie （College of Life Sciences,Northeast Agricul-tural Unive rsity,Harbin 150030,China )
Abstract:Pichia pastor is is one of the foreign protein expression system which has been widely
used.The expression vectors for Pichia pastoris are varied,but they can not be used in food vocation,because of the need of methanol in expression and the leading-in of antibiotic gene by transformation.This research designed to replace the methanol induced AOX promoter by Pichia pastoris 's constitutional promoter,GAP promoter,and successfully constructed the secreting expression vector pGAPH αfor Pichia
pastoris .The gene encoding endo-β-1,4-xylanase from Trichoderma Reesei,and xyn 2gene were used as a reporter gene,and then the function probation indicated that the xyn 2gene could be overexpressed in
Pichia pastoris .Based on this neotype secreting expression vector pGAPH αⅡ,we replaced the α-Factor by inulase gene's signal peptide sequence which had been optimized in codon,the results showed that the showed gene's signal peptide could also utility guide the secreting expression of xyn 2gene.
Key words:Pichia pastoris ;expression vector;GAP promoter;INU signal peptide 随着蛋白异源表达的飞速发展，越来越多的表达系统被建立并得到应用。酵母作为单细胞真核生物，因具有比较完备的基因表达调控机制和对表达产物的加工修饰能力，仍表现出不可比拟的优势。以甲醇营养型酵母
（Methylotrophic yeast ）-毕赤酵母为代表的第二代酵母表达系统，是近年来被公认的最有效的外源蛋白表达系统之一，已
有多种外源蛋白在该宿主系统中获得了成功表达[1]。作为生产外源蛋白的重要宿主菌，依靠其各种不同功能的表达载体，已经得到广泛的应用。表达的蛋白质包括酶、膜蛋白、抗原、抗体和调节蛋白等[2]。
然而，虽然用于毕赤酵母表达系统的表达载体种类繁多，却难于适用食品蛋白的表达及工业生产要求。主要影响因素有两点：pHIL 、pPIC 系列表达载体由于
第40卷第7期东北农业大学学报40(7):55~592009年7月
Journal of Northeast Agricultural University
July 2009
1.2.3毕赤酵母表达载体的构建
质粒DNA提取、电泳、酶切、大肠杆菌感受态制备、转化等操作参见[6]。连接反应方法同前[7]。
1.2.4毕赤酵母的转化
参照Invitrogen公司Pichia Expression Kit提供的说明书，采用电击转化毕赤酵母。
1.2.5木聚糖酶活性的测定
DNS法测定木聚糖酶活性[8]。
2结果与分析
2.1GAP启动子的克隆
以毕赤酵母GS115基因组DNA为模板，用设计合成的pGAP基因特异引物进行PCR扩增。得到500bp的PCR产物，电泳结果如图1。连接pMD18-T载体，酶切鉴定正确后测序。测序结果表明，所得序列与Genbank上的GAP启动子序列完全相同，将该质粒命名为pTGAP。
需要甲醇诱导方能起作用，在高密度发酵培养时安全性差；pGAPZ系列表达载体在外源基因的转化过程中又引入了抗生素基因，生物安全性低，不符合食品蛋白生产要求。同时，现有的毕赤酵母表达载体多采用α-Factor信号肽引导表达蛋白向细胞外分泌，但是其引导高分子质量蛋白分泌的能力并不理想。因此，寻找和利用新的分泌信号肽也是构建高效分泌表达载体的关键之一。本研究从启动子和信号肽的替换入手，设计和构建新型毕赤酵母分泌表达载体，为在毕赤酵母中安全高效分泌表达外源蛋白奠定基础。
1材料与方法
1.1材料
1.1.1菌株及质粒
毕赤酵母菌株GS115、大肠杆菌菌株E.coli DH5α、质粒PPIC9、pPIC9-xyn2、pTxyn2均由本研究室保存。
1.1.2工具酶及其他试剂
pMD18-T载体、T4DNA连接酶、Pyrobest Taq 酶、限制性内切酶均购自大连宝（TaKaRa）生物工程公司；DNA胶回收试剂盒购自北京百泰克生物技术有限公司；其他试剂均为国产分析纯。YPD、MD、MM培养基见Invitrogen公司Pichia Expression Kit提供的说明书。
1.1.3引物
根据三磷酸甘油醛脱氢酶基因序列（Genbank Locus：PPU62648）设计一对GAP启动子扩增引物，由上海生工技术有限公司合成。上游和下游引物分别加有Eco T22Ⅰ和Bam HⅠ酶切位点，其序列如下：pGAP-Sense：5′ATGCATGATCCTTTTTTGTAG AAATG3′
pGAP-Antisense：5′GGATCCTGTGTTTTZGAT AGTTGTTC3′
1.2方法
1.2.1GAP启动子的克隆
毕赤酵母GS115菌株接种于YPD培养基，28℃摇床培养20h，离心收集菌体，提取酵母基因组DNA[3]。以基因组DNA为模板，用pGAP基因特异引物进行PCR扩增。反应体积50μL，引物各加20 pmol，94℃，1min；51℃，45s；72℃，1min扩增30个循环。回收PCR产物并连接到pMD18-T载体，转化大肠杆菌。酶切鉴定正确后的阳性克隆送交测序。
1.2.2菊粉酶基因信号肽INU的密码子优化
参照文献[4]，根据毕赤酵母密码子用法表[5]，优化菊粉酶信号肽序列INU并设计合成接头。经
密码子改造后的接头序列如下：
M1
500bp
M-Marker DL2000;1-GAP启动子的PCR扩增产物
M-Marker DL2000;1-The PCR product of pGAP promoter
图1GAP启动子的PCR扩增
Fig.1PCR pruduct of pGAP promoter
5′GATCCACCATGAAGTT CGCTTACTCC TTG TTG TTGCCATT GGCTGGTG TCTCT
3′GTGGTACTT CAAGCGAATGAGGAACAACA ACGGTAACCGACCACAGAGAGCT TCT GTT ATT AACTACAAGAGATAC3′
CGA AGACAA TAATTGATG TTCTCT ATG5′
·56·东北农业大学学报第40卷
Xho ⅠAat ⅡSac ⅠEco T22Ⅰ
Bam H Ⅰ
Sna B Ⅰ
Eco R ⅠNot Ⅰ
Bst11077Ⅰ
Amp r Co1E1
3′AOX1
HIS4ORE TT
S 5′AOXI
pPIC98023bp Bam H Ⅰ
Eco T22Ⅰ
Amp r LacZ
pGAP
ori
pPGAP
3190bp
Bam H Ⅰ+Eco T22ⅠBam H Ⅰ+Eco T22Ⅰ
Aat Ⅱ
Xho ⅠSac ⅠEco T22Ⅰ
Bam H Ⅰ
Sna B Ⅰ
Eco R ⅠNot Ⅰ
Bst11077Ⅰ
3′AOX1
HIS4ORE
TT Co1E1
Amp r
5′AOXI
pGAP α-Factor pGAPH α8256bp 图2
毕赤酵母表达载体pGAPH α的构建
Fig.2
Construction of expression vector pGAPH αfor Pichia pastoris
Xho ⅠAat ⅡSac ⅠEco T22Ⅰ
Bam H ⅠSna B ⅠEco R ⅠNot Ⅰ
Bst11077Ⅰ
Amp r
Co1E1
3′AOX1
HIS4ORE
TT
5′AOXI
pGAP α-Factor pGAPH α8256bp
Amp
LacZ
ori
pTxyn23170bp
p
o
Eco R Ⅰxyn 2
Not Ⅰ
Eco R Ⅰ+Not ⅠEco R Ⅰ+Not Ⅰ
Xho ⅠAat Ⅱ
Sac ⅠEco T22ⅠBam H ⅠSna B ⅠEco R Ⅰ
Not Ⅰ
Bst11077Ⅰ
Amp r
Co1E1
3′AOX1
HIS4ORE
TT 5′AOXI
pGAP α-Factor pGAPH α-xyn2
8826bp
Bgl Ⅱxyn 2
Bgl Ⅱ
图3
毕赤酵母表达载体pGAPH α-xyn2的构建
Fig.3
Construction of expression vector pGAPH α-xyn2for P ichia pastoris
2.2毕赤酵母表达载体pGAPH α的构建
毕赤酵母表达载体pGAPH α的构建过程如图2所示。以Bam H Ⅰ、Eco T22Ⅰ双酶切pTGAP 和
pPIC9载体，分别回收约500bp 的GAP 启动子片段和约8000bp 的pPIC9载体大片段，连接，构建成毕赤酵母表达载体pGAPH α。
宋庆凤等：新型毕赤酵母分泌表达载体的构建与功能验证第7期·57·
xyn2XhoⅠ
AatⅡSacⅠEco T22Ⅰ
Bam HⅠ
Sna BⅠ
Eco RⅠ
NotⅠ
Bst11077Ⅰ
Amp r
Co1E1
3′AOX1
HIS4ORE
TT
5′AOXI
pGAP
α-Factor
pGAPHα-xyn2
8826bp
Bam HⅠ
INU
Sna BⅠBamHⅠ+SnaBⅠ
xyn2
XhoⅠ
AatⅡ
SacⅠ
Bam HⅠ
Sna BⅠ
Eco RⅠ
NotⅠBst11077Ⅰ
Amp r
Co1E1
3′AOX1
HIS4ORE
TT
5′AOXI
pGAP
INU
pGAPHα-xyn2
8653bp
BglⅡ
BglⅡ
图4毕赤酵母表达载体pGAPHI-xyn2的构建
Fig.4Construction of expression vector pGAPHI-xyn2for P ichia pastoris
表13种不同载体表达xyn2基因的酶活性测定
Table1Activities of exoenzyme expressed by the three secreting expression vectors（IU·mL-1）
菌株/质粒Strains/Plasmids 12345
平均值
Average
GS115/pPIC9-xyn2 GS115/pGAPHα-xyn2 GS115/pGAPHI-xyn2131
115
73
131
94
72
139
93
72
130
63
66
133
94
64
132.8
91.8
69.4
2.3毕赤酵母表达载体pGAPHα-xyn2的构建
分别以Not I、Xho I双酶切pTxyn2和pGA-PHα，pTxyn2回收570bp xyn2基因片段，与酶切回收后的pGAPHα载体大片段连接，构建成毕赤酵母重组表达质粒pGAPHα-xyn2（见图3）。
2.4毕赤酵母表达载体pGAPHI-xyn2的构建
以Bam H I、Sna B I双酶切质粒pGAPHα-xyn2，与经密码子优化的菊粉酶基因信号肽INU 连接，构建食品级毕赤酵母重组表达质粒pGAPHI-xyn2（见图4）。
2.5新型毕赤酵母表达载体的功能验证
BglⅡ酶切构建好的2种新型毕赤酵母表达载体pGAPHα-xyn2和pGAPHI-xyn2，使质粒线性化，电击法转化毕赤酵母GS115，筛选转化子。将转化子在YPD培养基中震荡培养48h，离心取上清液，测定木聚糖酶活性，以毕赤酵母诱导型表达载体pPIC9-xyn2为对照，试验结果见表1。在没有甲醇诱导的情况下，GS115/pGAPHα-xyn2菌株表达的木聚糖酶活性最高达到115U·mL-1，平均为91.8U·mL-1，表明GAP启动子可以调控外源基因在毕赤酵母中的高水平组成型表达，新型表达载体pGAPHα构建成功。GS115/pGAPHI-xyn2菌株表达的木聚糖酶活性平均为69.4U·mL-1，表明在毕赤酵母中菊粉酶基因信号肽能够有效地引导蛋白质分泌。
·58·东北农业大学学报第40卷
3讨论
启动子在基因表达过程中具有很重要的作用，本文用GAP启动子替换毕赤酵母表达载体pPIC9上的AOX启动子，构建组成型表达载体pGAPHα。在生产和应用过程中无需甲醇诱导，大大增加了安全性。
同时，与pGAPZ系列组成型表达载体相比，pGAPHα在转化过程中无抗生素基因被引入，也增加了安全性。尽管在本试验中与AOX启动子相比，GAP启动子调控的xyn2基因表达水平稍低，但是在安全性方面的优势使其有望在食品等领域得到广泛应用。
重组蛋白的高效分泌表达对于提高表达量和产品的纯化都是有利的，在毕赤酵母中，信号肽对不同的异源蛋白分泌效率有很大的差异[10]。本文以经过密码子优化的克鲁维酵母菊粉酶基因信号肽INU 替换毕赤酵母表达载体pGAPHα上的α-Factor信号肽，能够有效地引导木聚糖酶的分泌。尽管在本试验中，INU信号肽引导木聚糖酶分泌的能力不如α-Factor信号肽，但是由于菊粉酶是大分子蛋白质（90 ku），所以INU信号肽能有效弥补α-Factor信号肽不能有效引导高分子质量蛋白质分泌的缺陷。
4结论
本研究成功构建了毕赤酵母组成型表达载体pGAPHα，并以里氏木霉木聚糖酶基因xyn2为报告基因进行功能验证，结果表明该载体可实现xyn2基因在毕赤酵母中的高效表达。在此基础上以经密码子优化后的克鲁维酵母菊粉酶基因信号肽INU替换表达载体上原有的α-Factor信号肽，结果表明INU信号肽能够有效引导外源蛋白XYNII 在毕赤酵母中的分泌表达。
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宋庆凤等：新型毕赤酵母分泌表达载体的构建与功能验证
第7期·59·
毕赤酵母表达系统研究进展
毕赤酵母表达系统研究进展 作者：齐连权， 陈薇， 来大志， 于长明， 王海涛 作者单位：军事医学科学院微生物学流行病学研究所,北京,100071 刊名： 中国生物工程杂志 英文刊名：JOURNAL OF CHINESE BIOTECHNOLOGY 年，卷(期)：2002,22(6) 被引用次数：11次 参考文献(21条) 1.Trinh L;Noronha S B;Fannon M Recovery of mouse endostatin producedby Pichia pastoris using expanded bed adsorption[外文期刊] 2000(04) 2.查看详情 3.Barr KA;Hopkins S A;Sreekrishna K Protocol for efficient secretion of HSA developed from Pichia pastoris 1992 4.Cereghino J L;Cregg J M Heterologous protein expression in the methylotrophic yeast Pichia pastoris[外文期刊] 2000(1) 5.Kjeldsen T;Pettersson A F;Hach M Secretory expression and characterization of insulin in Pichia pastoris[外文期刊] 1999(29) 6.Bewley M C;Tam B M;Grewal J X ray crystallography and massspectroscopy reveal that the N lobe of human transferrin expressed in Pichia pastorisis folded correctly but is glycosylated on serine 32 [外文期刊] 1999(08) 7.Kalidas C;Joshi L;Batt C Characterization of glycosylated variantsof beta lactoglobulin expressed in Pichia pastoris[外文期刊] 2001(03) 8.Briand L;Perez V;Huet J C Optimization of the production ofa honeybee odorant binding protein by Pichia pastoris[外文期刊] 1999(03) 9.Rydberg E H;Sidhu G;Vo H C Cloning mutagenesis and structural analysis of human pancreatic alpha amylase expressed in Pichia pastoris[外文期刊] 1999(03) 10.Guo R T;Chou L J;Chen Y C Expression in Pichia pastoris andcharacterization by circular dichroism and NMR of rhodostomin[外文期刊] 2001(04) 11.Zani M;Brillard Bourdet M;Lazure C Purification and characterization of active recombinant rat kallikrein rK9[外文期刊] 2001(02) 12.ChirulovaV;Cregg J M;Meagher M M Recombinant protein production in an alcohol oxidase defective strain of Pichia pastoris in fed batch fermentations[外文期刊] 1997 13.Hasslacher M;Schall M;Hayn M High level intracellular expression of hydroxynitrile lyase from the tropical rubber tree Hevea brasiliensis in microbial hosts[外文期刊] 1997(1) 14.Takahashi K;Takai T;Yasuhara T Effects of site directed mutagenesis in the cysteine residues and the N glycosylation motif in recombinant Der f 1on secretion and protease activity[外文期刊] 2001(04) 15.Boado R J;Ji A;Pardridge W M Cloning and expression in Pichia pastoris of a genetically engineered single chain antibody against the rat transferrin receptor[外文期刊] 2000(06)
毕赤酵母实验操作技巧介绍材料
毕赤酵母表达实验手册 大肠杆菌表达系统最突出的优点是工艺简单、产量高、生产成本低。然而，许多蛋白质在翻译后，需经过翻译后的修饰加工，如磷酸化、糖基化、酰胺化及蛋白酶水解等过程才能转化成活性形式。大肠杆菌缺少上述加工机制，不适合用于表达结构复杂的蛋白质。另外，蛋白质的活性还依赖于形成正确的二硫键并折叠成高级结构，在大肠杆菌中表达的蛋白质往往不能进行正确的折叠，是以包含体状态存在。包含体的形成虽然简化了产物的纯化，但不利于产物的活性，为了得到有活性的蛋白，就需要进行变性溶解及复性等操作，这一过程比较繁琐，同时增加了成本。 与大肠杆菌相比，酵母是低等真核生物，具有细胞生长快，易于培养，遗传操作简单等原核生物的特点，又具有真核生物时表达的蛋白质进行正确加工，修饰，合理的空间折叠等功能，非常有利于真核基因的表达，能有效克服大肠杆菌系统缺乏蛋白翻泽后加工、修饰的不足。因此酵母表达系统受到越来越多的重视和利用。 大肠杆菌是用得最多、研究最成熟的基因工程表达系统，当前已商业化的基因工程产品大多是通过大肠杆菌表达的，其主要优点是成本低、产量高、易于操作。但大肠杆菌是原核生物，不具有真核生物的基因表达调控机制和蛋白质的加工修饰能力，其产物往住形成没有活性的包涵体，需要经过变性、复性等处理，才能应用。近年来，以酵母作为工程菌表达外源蛋白日益引起重视，主更是因为酵母是单细胞真核生物，不但具有大肠杆菌易操作、繁殖快、易于工业化生产的特点，还具有真核生物表达系统基因表达调控和蛋白修饰功能，避免了产物活性低，包涵体变性、复性等等间题［1］。 与大肠杆菌相比，酵母是单细胞真核生物，具有比较完备的基因表达调控机制
酵母表达系统使用心得
Pichia酵母表达系统使用心得 甲醇酵母表达系统有不少优点，其中以Invitrogen公司的Pichia酵母表达系统最为人熟知，并广泛应用于外源蛋白的表达。虽然说酵母表达操作简单表达量高，但是在实际操作中，并不是每个外源基因都能顺利得到高表达的。不少人在操作中会遇到这样那样的问题，收集了部分用户在使用EasySelect Pichia Expression System这个被誉为最简单的毕赤酵母表达的经典试剂盒过程中的心得体会。其中Xiang Yang是来自美国乔治城大学（Georgetown University）Lombardi癌症中心（Lombardi Cancer Center），部分用户来自国内。 甲醇酵母部分优点： 1.属于真核表达系统，具有一定的蛋白质翻译后加工，有利于真核蛋白的表达； 2.AOX强效启动子，外源基因产物表达量高，表达产物可以达到每升数克的水平； 3.酵母培养、转化、高密度发酵等操作接近原核生物，远较真核系 统简单，非常适合大规模工业化生产； 4.可以诱导表达，也可以分泌表达，便于产物纯化； 5.可以甲醇代替IPTG作为诱导物，部分甲醇酵母更可以用工业甲醇替代葡萄糖作为碳源，生产成本低。 产品性能：优点——使用简单，表达量高，His-tag便于纯化；缺点——酵母表达蛋白有时会出现蛋白切割问题。 巴斯德毕赤酵母（Pichia pastoris）是一种能高效表达重组蛋白的酵母品种，一方面由于其是属于真核生物，因此表达出来的蛋白可以进行糖基化修饰，另一方面毕赤酵母生长速度快，可以将表达的蛋白分泌到培养基中，方便蛋白纯化。 毕赤酵母表达载体pPICZ在多克隆位点（MCR）3'端带有his-tag和c-myc epitopes，这些tag有利于常规检测和纯化，而且在MCR5'端引入了alpha factor（α-factor）用以分泌表达，并且在表达后α-factor可以自动被切除。在进行克隆的时候，如果你选择的是EcoRI，那么只需在目标蛋白中增加两个氨基酸序列即可完成。另外pPICZ系列选用的是Zeocin抗生素作为筛选标记，而诱导表达的载体需要甲醇——甲醇比一般用于大肠杆菌表达诱导使用的IPTG便宜。 第一步——构建载体 Xiang Yang：pPICZ系列有许多克隆位点可供选择，同时也有三种读码框以便不用的用户需要。 红叶山庄：有关是选择pPIC9K还是pPICZ系列？pPIC9K属于穿梭质粒，也可以在原核表达，而pPICZ系列比较容易操作，大肠和毕赤酵母均用抗Zeocin筛选（PIC9K操作麻烦一点，大肠用amp抗性，而毕赤酵母先用His缺陷筛选阳性克隆，在利用G418筛选多拷贝），而且对于大小合适（30—50KD）的蛋白在产量上是pPIC9K无法比拟的。 leslie：要做毕赤酵母表达实验，首先当然就要了解这个可爱的酵母了（椭圆形，肥嘟嘟的，十分可爱），她和大肠杆菌长得有较大区别（大肠杆菌是杆状的），因此在培养的过程中要区别这两种菌体，除了气味，浓度，颜色以外，也可以取样到显微镜中观测。大家做毕赤表达的时候应该都遇过这种情况吧，表达过程中染菌（我们实验室曾经污染过各种颜色形状的细菌，那真是一段可怕的经历），如果在不知情的情况下继续做下去，那可以就是浪费大把的
毕赤酵母手册
毕赤酵母表达实验手册 作者：Jnuxz 来源：丁香园时间：2007-9-5 大肠杆菌表达系统最突出的优点是工艺简单、产量高、周期短、生产成本低。然而，许多蛋白质在翻译后，需经过翻译后的修饰加工，如磷酸化、糖基化、酰胺化及蛋白酶水解等过程才能转化成活性形式。大肠杆菌缺少上述加工机制，不适合用于表达结构复杂的蛋白质。另外，蛋白质的活性还依赖于形成正确的二硫键并折叠成高级结构，在大肠杆菌中表达的蛋白质往往不能进行正确的折叠，是以包含体状态存在。包含体的形成虽然简化了产物的纯化，但不利于产物的活性，为了得到有活性的蛋白，就需要进行变性溶解及复性等操作，这一过程比较繁琐，同时增加了成本。 大肠杆菌是用得最多、研究最成熟的基因工程表达系统，当前已商业化的基因工程产品大多是通过大肠杆菌表达的，其主要优点是成本低、产量高、易于操作。但大肠杆菌是原核生物，不具有真核生物的基因表达调控机制和蛋白质的加工修饰能力，其产物往住形成没有活性的包涵体，需要经过变性、复性等处理，才能应用。近年来，以酵母作为工程菌表达外源蛋白日益引起重视，原因是与大肠杆菌相比，酵母是低等真核生物，除了具有细胞生长快，易于培养，遗传操作简单等原核生物的特点外，又具有真核生物时表达的蛋白质进行正确加工，修饰，合理的空间折叠等功能，非常有利于真核基因的表达，能有效克服大肠杆菌系统缺乏蛋白翻译后加工、修饰的不足。因此酵母表达系统受到越来越多的重视和利用。［1］。 同时与大肠杆菌相比，作为单细胞真核生物的酵母菌具有比较完备的基因表达调控机制和对表达产物的加工修饰能力。酿酒酵母（Saccharomyces.Cerevisiae）在分子遗传学方面被人们的认识最早，也是最先作为外源基因表达的酵母宿主。1981年酿酒酵母表达了第一个外源基因----干扰素基因［2］，随后又有一系列外源基因在该系统得到表达［3、4、5、6］。干扰素和胰岛素虽然已经利用酿酒酵母大量生产并被广泛应用，当利用酿酒酵母制备时，实验室的结果很令人鼓舞，但由实验室扩展到工业规模时，其产量迅速下降。原因是培养基中维特质粒高拷贝数的选择压力消失［7、8］，质粒变得不稳定，拷贝数下降。拷贝数是高效表达的必备因素，因此拷贝数下降，也直接导致外源基因表达量的下降。同时，实验室用培养基成分复杂且昂贵，当采用工业规模能够接受的培养基时，导致了产量的下降［9］。为克服酿酒酵母的局限，1983年美国Wegner等人最先发展了以甲基营养型酵母（methylotrophic yeast）为代表的第二代酵母表达系统［10］。 甲基营养型酵母包括：Pichia、Candida等．以Pichia.pastoris（毕赤巴斯德酵母）为宿主
毕赤酵母发酵手册
毕赤酵母发酵手册 总览 简介： 毕赤酵母和酿酒酵母很相似，都非常适合发酵生长。毕赤酵母在有可能提高总体的蛋白质产量的发酵中能够达到非常高的细胞浓度， 我们建议只有那些有过发酵经验或者能得到有经验的人的指导的人参与发酵。因为发酵的类型很多，所以我们很难为您的个人案例提高详细的过程。下面所给出的指导是基于Mut+和Mut s两种基因型的毕赤酵母菌株在15L的台式玻璃发酵罐中发酵而成。请在您的发酵开始前先阅读操作员手册。下面所给出的表就 发酵参数： 在整个发酵过程中监测和调控下列参数非常重要。下面的表格描述了这些参
设备推荐： 下面是所推荐设备的清单： ·发酵罐的夹套需要在发酵过程中给酵母菌降温，尤其是在甲醇流加过程中。你需要一个固定的来源来提供冷却水（5-10℃）。这可能意味着你需要一个冷冻装置来保持水的冷却。 ·一个泡沫探针就像消泡剂一样不可或缺。 ·一个氧气的来源——空气（不锈钢的发酵罐需要1-2vvm）或者纯氧（玻璃发酵罐需要0.1-0.3vvm）。 ·添加甘油和甲醇的补料泵。 ·pH的自动控制。 培养基的准备： 你需要准确配置下列溶液： ·发酵所需的基本盐类（第11页） ·PTM1补充盐类（第11页） ·75ml的50％的甘油每升初始发酵液，12ml的PTM1补充盐每升甘油。 ·740ml的100％的甲醇每升初始发酵液，12ml的PTM1补充盐每升甲醇。毕赤酵母生长的测定： 在不同的时间点通过测OD600的吸光值和湿细胞的重量来检测毕赤酵母的生长。培养的代谢速率通过通过观察溶氧浓度对应于有效碳源来测定。
溶氧的测定： 简介： 溶解氧的浓度时指氧气在培养基中的相关比例，溶氧100％是指培养基中氧达到饱和。毕赤酵母的生长需要消耗氧气，减少溶解氧的满度。毕赤酵母在生长时会消耗氧气，减少溶氧的程度。然而，因为代谢甲醇的最初阶段需要氧气，所以将溶氧浓度维持在一个适当的水平（＞20％）来确保毕赤酵母在甲醇上的生长就至关重要。准确测定和监测培养中的溶氧浓度将会为您提供关于培养状态和健康程度之类的重要信息。因此，精确校正您的发酵设备非常重要，请查阅您的操作手册。 溶氧浓度的维持： 1、很难依靠发酵罐的氧气转换速率（OTR）将溶氧浓度维持在20％，特别是在 小型的玻璃罐中。在玻璃发酵罐中，通气一般约为0.1-0.3vvm（1L发酵液每分钟1L氧气）来提供氧气使DO保持在20％。氧气消耗的变化依赖于所添加的甲醇的总量和蛋白质的表达。 2、在通气为0.1-0.3vvm时，氧气可达到足够的水平，这在许多玻璃发酵罐中可 以通过通入无菌空气来实现。在不锈钢发酵罐中，压力可增加OTR（与K L a 有关）。 3、如果一个发酵罐不能提供足够水平的氧气，甲醇的添加需要因此适当降低。 请注意降低甲醇的总量可能导致蛋白质表达水平的降低。 4、为了使蛋白质表达水平达到最大，发酵时间应被分割来以较低的流加速度添 加相似水平的甲醇。对许多重组蛋白质来说，可以观察到甲醇消耗的总量和蛋白质产生的总量有直接的关系。 DO测量的用处： 在毕赤酵母生长阶段，消耗氧气而使DO浓度维持在较低水平。请注意不管是在甘油或甲醇中生长，都要消耗氧气。DO浓度可用来衡量代谢速率和碳源是否受抑制，代谢速率则是培养健康程度的一个指标。如果你希望能够完全的诱导AOX1启动子，确定碳源是否受抑制就非常重要。例如：DO浓度的改变可让你确定是否在添加甲醇前所有的甘油都已耗尽，其次还可以确定甲醇流加的速率是否超过消耗的速率。过多的甲醇（＞1-2％vvm）可能会产生毒害。 DO的调控： 如果碳源受到抑制，关闭碳源的添加将会导致培养理工甲醇的速率降低，DO值会上升。终止碳源的添加，观察在碳源的流加关闭后需要多长时间来使DO值上升10％。如果延迟时间很短（＜1min），说明碳源受抑制。
毕赤酵母表达实验手册
xx酵母表达实验手册 （作参考） 部分试剂中英文名称： 小牛肠碱性磷酸酶（CIP）、AOX1（alcohol oxidase，醇氧化酶） 10*YNB（含有硫酸铵、无氨基酸的 13.4%酵母基础氮源培养基） 500*B（ 0.02%生物素Biotin）、100*H（ 0.4%Histidine组氨酸） 10*D（20%Dextrose葡萄糖）、10*M（5%Methanol甲醇） 10*GY（10%Glycerol甘油）、100*AA（ 0.5% of each Amino Acid，各种氨基酸）、1M磷酸钾溶液（potassium phosphate buffer，pH 6.0） Sorbitol (山梨醇)、磷酸钾溶液（potassium phosphate buffer） YEPDM（Yeast Extract Peptone Dextrose Medium，酵母浸出粉/胰蛋白胨/右旋葡萄糖培养基） Minimal Glycerol Medium（最小甘油培养基） YPD培养基的配制： 每（L）液体预混合物（50g/L）终浓度酵母提取物10g250g1%蛋白栋 20g500g2%葡萄糖20g500g2%※注：
配制YPD培养基时，20%（10×）葡萄糖溶液最好采用单独过滤除菌或高压灭菌（在灭菌后再加入到其他各种成分），以免在高压灭菌时培养基变黑并妨碍酵母菌的最佳生长。 ※极限培养基{合成葡萄糖（SD）培养基} 每（L）液体预混合物（50g/L）终浓度YNB-AA/AS 1.7g68g 0.17%（NH 4） 2SO 45g200g 0.5%葡萄糖20g800g2%注： 这种极限培养基可以培养没有特殊营养要求的酵母菌，但更多时候这种培养基是作为一种待添加其他成分的极限培养基（见下文提到的CM省却成分培养基）。 完全极限（CM）省却成分培养基（每L中含）： 省却成分粉剂 1.3g(见表 13.1.1) YNB-AA/AS 1.7g （NH 4）
毕赤酵母表达手册
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毕赤酵母多拷贝表达载体试剂盒 用于在含多拷贝基因的毕赤酵母菌中表达并分离重组蛋白 综述： 基本特征： 作为真核生物，毕赤酵母具有高等真核表达系统的许多优点：如蛋白加工、折叠、翻译后修饰等。不仅如此，操作时与E.coli及酿酒酵母同样简单。它比杆状病毒或哺乳动物组织培养等其它真核表达系统更快捷、简单、廉价，且表达水平更高。同为酵母，毕赤酵母具有与酿酒酵母相似的分子及遗传操作优点，且它的外源蛋白表达水平是后者的十倍以至百倍。这些使得毕赤酵母成为非常有用的蛋白表达系统。 与酿酒酵母相似技术： 许多技术可以通用： 互补转化基因置换基因破坏另外，在酿酒酵母中应用的术语也可用于毕赤酵母。例如：HIS4基因都编码组氨酸脱氢酶；两者中基因产物有交叉互补；酿酒酵母中的一些野生型基因与毕赤酵母中的突变基因相互补，如HIS4、LEU2、ARG4、TR11、URA3等基因在毕赤酵母中都有各自相互补的突变基因。 毕赤酵母是甲醇营养型酵母： 毕赤酵母是甲醇营养型酵母，可利用甲醇作为其唯一碳源。甲醇代谢的第一步是：醇氧化酶利用氧分子将甲醇氧化为甲醛，还有过氧化氢。为避免过氧化氢的毒性，甲醛代谢主要在一个特殊的细胞器－过氧化物酶体－里进行，使得有毒的副产物远离细胞其余组分。由于醇氧化酶与O2的结合率较低，因而毕赤酵母代偿性地产生大量的酶。而调控产生醇过氧化物酶的启动子也正是驱动外源基因在毕赤酵母中表达的启动子。 两种醇氧化酶蛋白： 毕赤酵母中有两个基因编码醇氧化酶－AOX1及AOX2。细胞中大多数的醇氧化酶是AOX1基因产物。甲醇可紧密调节、诱导AOX1基因的高水平表达，较典型的是占可溶性蛋白的30%以上。AOX1基因已被分离，含AOX1启动子的质粒可用来促进编码外源蛋白的目的基因的表达。AOX2基因与AOX1基因有97%的同源性，但在甲醇中带AOX2基因的菌株比带AOX1基因菌株慢得多，通过这种甲醇利用缓慢表型可分离Muts菌株。 表达： AOX1基因的表达在转录水平受调控。在甲醇中生长的细胞大约有5%的polyA+ RNA 来自AOX1基因。AOX1基因调控分两步：抑制/去抑制机制加诱导机制。简单来说，在含葡萄糖的培养基中，即使加入诱导物甲醇转录仍受抑制。为此，用甲醇进行优化诱导时，推荐在甘油培养基中培养。注意即使在甘油中生长（去抑制）时，仍不足以使AOX1基因达到最低水平的表达，诱导物甲醇是AOX1基因可辨表达水平所必需的。 AOX1突变表型： 缺失AOX1基因，会丧失大部分的醇氧化酶活性，产生一种表型为Muts的突变株（methanol utilization slow），过去称为Mut，而Muts可更精确地描述突变子的表型。结果细胞代谢甲醇的能力下降，因而在甲醇培养基中生长缓慢。Mut+（methanol utilization plus）指利用甲醇为唯一碳源的野生型菌株。这两种表型用来检测外源基因在毕赤酵母转化子中的整合方式。 蛋白胞内及分泌表达： 外源蛋白可在毕赤酵母胞内表达或分泌至胞外。分泌表达需要蛋白上的信号肽序列，将外源蛋白靶向分泌通路。几种不同的分泌信号序列已被成功应用，包括几种外源蛋白本身分 制作者：陈苗商汉桥
酵母表达系统使用心得
精心整理 Pichia酵母表达系统使用心得 甲醇酵母表达系统有不少优点，其中以Invitrogen公司的Pichia酵母表达系统最为人熟知，并广泛应用于外源蛋白的表达。虽然说酵母表达操作简单表达量高，但是在实际操作中，并不是每个外源基因都能顺利得到高表达的。不少人在操作中会 这个 是来中心（ 1. 3. 4. 5. 产品性能：优点——使用简单，表达量高，His-tag便于纯化；缺点——酵母表达蛋白有时会出现蛋白切割问题。 巴斯德毕赤酵母（Pichiapastoris）是一种能高效表达重组蛋白的酵母品种，一方面由
于其是属于真核生物，因此表达出来的蛋白可以进行糖基化修饰，另一方面毕赤酵母生长速度快，可以将表达的蛋白分泌到培养基中，方便蛋白纯化。 毕赤酵母表达载体pPICZ在多克隆位点（MCR）3'端带有his-tag和c-mycepitopes，这些tag有利于常规检测和纯化，而且在MCR5'端引入了alphafactor（α-factor）用以 的是系 PIC9K G418无 leslie：要做毕赤酵母表达实验，首先当然就要了解这个可爱的酵母了（椭圆形，肥嘟嘟的，十分可爱），她和大肠杆菌长得有较大区别（大肠杆菌是杆状的），因此在培养的过程中要区别这两种菌体，除了气味，浓度，颜色以外，也可以取样到显微
镜中观测。大家做毕赤表达的时候应该都遇过这种情况吧，表达过程中染菌（我们实验室曾经污染过各种颜色形状的细菌，那真是一段可怕的经历），如果在不知情的情况下继续做下去，那可以就是浪费大把的时间了。 基本熟悉了毕赤酵母，了解了她生长的喜好（多糖偏酸环境），生长的周期等等 有 的 余的 （起始密码子），有人认为酵母启动子与外源基因的ATG之间的距离越短对于表达的该基因越有利； ⑤如果不希望有c-myc和His-tag，可以在基因片段末尾加入终止密码子；
毕赤酵母表达操作手册(精译版)
毕赤酵母多拷贝表达载体试剂盒 用于在含多拷贝基因的毕赤酵母菌中表达并分离重组蛋白 综述： 基本特征： 作为真核生物，毕赤酵母具有高等真核表达系统的许多优点：如蛋白加工、折叠、翻译后修饰等。不仅如此，操作时与E.coli及酿酒酵母同样简单。它比杆状病毒或哺乳动物组织培养等其它真核表达系统更快捷、简单、廉价，且表达水平更高。同为酵母，毕赤酵母具有与酿酒酵母相似的分子及遗传操作优点，且它的外源蛋白表达水平是后者的十倍以至百倍。这些使得毕赤酵母成为非常有用的蛋白表达系统。 与酿酒酵母相似技术： 许多技术可以通用： 互补转化基因置换基因破坏另外，在酿酒酵母中应用的术语也可用于毕赤酵母。例如：HIS4基因都编码组氨酸脱氢酶；两者中基因产物有交叉互补；酿酒酵母中的一些野生型基因与毕赤酵母中的突变基因相互补，如HIS4、LEU2、ARG4、TR11、URA3等基因在毕赤酵母中都有各自相互补的突变基因。 毕赤酵母是甲醇营养型酵母： 毕赤酵母是甲醇营养型酵母，可利用甲醇作为其唯一碳源。甲醇代谢的第一步是：醇氧化酶利用氧分子将甲醇氧化为甲醛，还有过氧化氢。为避免过氧化氢的毒性，甲醛代谢主要在一个特殊的细胞器－过氧化物酶体－里进行，使得有毒的副产物远离细胞其余组分。由于醇氧化酶与O2的结合率较低，因而毕赤酵母代偿性地产生大量的酶。而调控产生醇过氧化物酶的启动子也正是驱动外源基因在毕赤酵母中表达的启动子。 两种醇氧化酶蛋白： 毕赤酵母中有两个基因编码醇氧化酶－AOX1及AOX2。细胞中大多数的醇氧化酶是AOX1基因产物。甲醇可紧密调节、诱导AOX1基因的高水平表达，较典型的是占可溶性蛋白的30%以上。AOX1基因已被分离，含AOX1启动子的质粒可用来促进编码 的目的基因的表达。AOX2基因与AOX1基因有97%的同源性，但在甲醇中带 的菌株比带AOX1基因菌株慢得多，通过这种甲醇利用缓慢表型可分离Muts菌株表达： AOX1基因的表达在转录水平受调控。在甲醇中生长的细胞大约有5%的polyA+ RNA 来自AOX1基因。AOX1基因调控分两步：抑制/去抑制机制加诱导机制。简单来说，在含葡萄糖的培养基中，即使加入诱导物甲醇转录仍受抑制。为此，用甲醇进行优化诱导时，推荐在甘油培养基中培养。注意即使在甘油中生长（去抑制）时，仍不足以使AOX1基因达到最低水平的表达，诱导物甲醇是AOX1基因可辨表达水平所必需的。 AOX1突变表型： 缺失AOX1基因，会丧失大部分的醇氧化酶活性，产生一种表型为Muts的突变株（methanol utilization slow），过去称为Mut，而Muts可更精确地描述突变子的表型。结果细胞代谢甲醇的能力下降，因而在甲醇培养基中生长缓慢。Mut+（methanol utilization plus）指利用甲醇为唯一碳源的野生型菌株。这两种表型用来检测外源基因在毕赤酵母转化子中的整合方式。 蛋白胞内及分泌表达： 外源蛋白可在毕赤酵母胞内表达或分泌至胞外。分泌表达需要蛋白上的信号肽序列，将外源蛋白靶向分泌通路。几种不同的分泌信号序列已被成功应用，包括几种外源蛋白本身分
2020年毕赤酵母表达系统资料整理
作者：非成败 作品编号：92032155GZ5702241547853215475102 时间：2020.12.13 毕赤酵母表达系统 Mut+和Muts 毕赤酵母中有两个基因编码醇氧化酶——AOX1及AOX2，细胞中大多数的醇氧化酶是AOX1基因产物，甲醇可紧密调节、诱导AOX1基因的高水平表达，较典型的是占可溶性蛋白的30%以上。AOX1基因调控分两步：抑制/去抑制机制加诱导机制。简单来说，在含葡萄糖的培养基中，即使加入诱导物甲醇转录仍受抑制。为此，用甲醇进行优化诱导时，推荐在甘油培养基中培养。注意即使在甘油中生长(去抑制)时，仍不足以使AOX1基因达到最低水平的表达，诱导物甲醇是AOX1基因可辨表达水平所必需的。AOX1基因已被分离，含AOX1启动子的质粒可用来促进编码外源蛋白的目的基因的表达。AOX2基因与AOX1基因有97%的同源性，但在甲醇中带AOX2基因的菌株比带AOX1基因菌株慢得多，通过这种甲醇利用缓慢表型可分离Muts菌株。在YPD(酵母膏、蛋白胨、葡萄糖)培养基中，不论是Mut+还是Muts其在对数期增殖一倍的时间大约为2h。Mut+和Muts菌株在没有甲醇存在的情况下生长速率是一样的，存在甲醇的情况下，Mut+在对数期增殖一倍的时间大约为4至6个小时，Muts在对数期增殖一倍的时间大约为18个小时。 菌株GS115、X-33、KM71和SMD1168的区别 GS115、KM71和SMD1168等是用于表达外源蛋白的毕赤酵母受体菌，与酿酒酵母相比，毕赤酵母不会使蛋白过糖基化，糖基化后有利于蛋白的溶解或形成正确的折叠结构。GS115、KM71、SMD1168在组氨酸脱氢酶位点(His4)有突变，是组氨酸缺陷型，如果表达载体上携带有组氨酸基因，可补偿宿主菌的组氨酸缺陷，因此可以在不含组氨酸的培养基上筛选转化子。这些受体菌自发突变为组氨酸野生型的概率一般低于10-8。GS115表型为Mut+，重组表达载体转化GS115后，长出的转化子可能是Mut+，也可能是Muts(载体取代AXO1基因)，可以在MM和MD培养基上鉴定表型。SMD1168和GS115类似，但SMD1168基因组中的Pep4基因发生突变，是蛋白酶缺陷型，可降低蛋白酶对外源蛋白的降解作用。 其中X-33由于是野生型，因此耐受性比较好，如果担心转化率的话可以考虑这种酵母菌，而X33与GS115一样都是属于MUT＋表现型，也就是说可以在含甲醇的培养基中快速生长，但是据说会对外源基因表达有影响， KM71的亲本菌在精氨酸琥珀酸裂解酶基因(arg4)有突变，在不含精氨酸的培养基中不能生长。用野生型ARG4基因(约2kb)插入到克隆的野生型AOX1基因的BamHI(AOX1基因15/16密码子)及SalI(AOX1基因227/228密码子)位点，取代了AOX1基因16-227密码子，此结构转化至KM71亲本菌(arg4his4)中，分离产生KM71 MutsArg+His-菌株，Arg+转化子遗传分析显示野生型AOX1被aox1::ARG4结构所取代，所以KM71所有转化子都是Muts 表型。AOX1位点没有被完全缺失，理论上可用你的目的结构通过基因取代方法替换
Pichia酵母表达系统使用心得
Pichia酵母表达系统使用心得 摘要：Pichia酵母表达系统广泛应用于外源基因表达。 生物通编者按：甲醇酵母表达系统有不少优点，其中以Invitrogen公司的Pichia酵母表达系统最为人熟知，并广泛应用于外源蛋白的表达。虽然说酵母表达操作简单表达量高，但是在实际操作中，并不是每个外源基因都能顺利得到高表达的。不少人在操作中会遇到这样那样的问题，生物通编者特地收集了部分用户在使用EasySelect Pichia Expression System这个被誉为最简单的毕赤酵母表达的经典试剂盒过程中的心得体会。其中Xiang Yang是来自美国乔治城大学（Georgetown University）Lombardi癌症中心（Lombardi Cancer Center），部分用户来自国内。 + 表示优胜于；- 表示不如；= 表示差不多 EasySelect Pichia Expression System
产品性能： 优点——使用简单，表达量高，His-tag便于纯化 缺点——酵母表达蛋白有时会出现蛋白切割问题 全面产品报告及心得体会： 巴斯德毕赤酵母（Pichia pastoris）是一种能高效表达重组蛋白的酵母品种，一方面由于其是属于真核生物，因此表达出来的蛋白可以进行糖基化修饰，另一方面毕赤酵母生长速度快，可以将表达的蛋白分泌到培养基中，方便蛋白纯化。 毕赤酵母表达载体pPICZ在多克隆位点（MCR）3'端带有his-tag和c-myc epitopes，这些tag有利于常规检测和纯化，而且在MCR5'端引入了alpha factor（α-factor）用以增加表达，并且在表达后α-factor可以自动被切除。在进行克隆的时候，如果你选择的是EcoRI，那么只需在目标蛋白中增加两个氨基酸序列即可完成。另外pPICZ系列选用的是Zeocin抗生素作为筛选标记，而诱导表达的载体需要甲醇——甲醇比一般用于大肠杆菌表达诱导使用的IPTG便宜。 第一步构建载体 Xiang Yang：pPICZ系列有许多克隆位点可供选择，同时也有三种读码框以便不用的用户需要。 红叶山庄：有关是选择pPIC9K还是pPICZ系列？pPIC9K属于穿梭质粒，也可以在原核表达，而pPICZ系列比较容易操作，大肠和毕赤酵母均用抗Zeocin筛选（PIC9K操作麻烦一点，大肠用amp抗性，而毕赤酵母先用His缺陷筛选阳性克隆，在利用G418筛选多拷贝），而且对于大小合适（30—50KD）的蛋白在产量上是pPIC9K 无法比拟的。 leslie：要做毕赤酵母表达实验，首先当然就要了解这个可爱的酵母了（椭圆形，肥嘟嘟的，十分可爱），她和大肠杆菌长得有较大区别（大肠杆菌是杆状的），因此在培养的过程中要区别这两种菌体，除了气味，浓度，颜色以外，也可以取样到显微镜中观测。大家做毕赤表达的时候应该都遇过这种情况吧，表达过程中染菌（我们实验室曾经污染过各种颜色形状的细菌，那真是一段可怕的经历），如果在不知情的情况下继续做下去，那可以就是浪费大把的时间了。 基本熟悉了毕赤酵母，了解了她生长的喜好（多糖偏酸环境），生长的周期等等情况后，当然更多的精力还是应该花在表达的目的蛋白上，我的表达蛋白有些恐怖，有100KD，本来当然应该放在大肠杆菌中表达，但是为了分泌表达（其实后来发现大肠杆菌pET系列分泌表达系列也不错）和糖基化修饰（主要是这个方面，因
毕赤酵母表达经验总结
毕赤酵母表达经验总结 甲醇酵母表达系统有不少优点，其中以Invitrogen公司的Pichia酵母表达系统最为人熟知，并广泛应用于外源蛋白的表达。虽然说酵母表达操作简单表达量高，但是在实际操作中，并不是每个外源基因都能顺利得到高表达的。不少人在操作中会遇到这样那样的问题，生物通编者特地收集了部分用户在使用EasySelect Pichia Expression System这个被誉为最简单的毕赤酵母表达的经典试剂盒过程中的心得体会。其中Xiang Yang是来自美国乔治城大学（Georgetown University）Lombardi癌症中心（Lombardi Cancer Center），部分用户来自国内。 甲基酵母部分优点与其他真核表达系统比较与原核表达系统比较 1.属于真核表达系统，具有一定的蛋白质翻译后加工，有利于真核蛋白的表达优点-+ 2.AOX强效启动子，外源基因产物表达量高，可以达到每升数克表达产物的水平++++ 3.酵母培养、转化、高密度发酵等操作接近原核生物，远较真核系统简单，非常适合大规模工业化生产。+++= 4.可以诱导表达，也可以分泌表达，便于产物纯化。=+ 5.可以甲醇代替IPTG作为诱导物，部分甲醇酵母更可以甲醇等工业产物替代葡萄糖作为碳源，生产成本低++++ + 表示优胜于；- 表示不如；= 表示差不多 EasySelect Pichia Expression System 产品性能： 优点——使用简单，表达量高，His-tag便于纯化 缺点——酵母表达蛋白有时会出现蛋白切割问题 全面产品报告及心得体会： 巴斯德毕赤酵母（Pichia pastoris）是一种能高效表达重组蛋白的酵母品种，一方面由于其是属于真核生物，因此表达出来的蛋白可以进行糖基化修饰，另一方面毕赤酵母生长速度快，可以将表达的蛋白分泌到培养基中，方便蛋白纯化。 毕赤酵母表达载体pPICZ在多克隆位点（MCR）3'端带有his-tag和c-myc epitopes，这些tag有利于常规检测和纯化，而且在MCR5'端引入了alpha factor（α-factor）用以增加表达，并且在表达后α-factor 可以自动被切除。在进行克隆的时候，如果你选择的是EcoRI，那么只需在目标蛋白中增加两个氨基酸序列即可完成。另外pPICZ系列选用的是Zeocin抗生素作为筛选标记，而诱导表达的载体需要甲醇——甲醇比一般用于大肠杆菌表达诱导使用的IPTG便宜。 第一步——构建载体 Xiang Yang：pPICZ系列有许多克隆位点可供选择，同时也有三种读码框以便不用的用户需要。 红叶山庄：有关是选择pPIC9K还是pPICZ系列？pPIC9K属于穿梭质粒，也可以在原核表达，而pPICZ系列比较容易操作，大肠和毕赤酵母均用 抗Zeocin筛选（PIC9K操作麻烦一点，大肠用amp抗性，而毕赤酵母先用His缺陷筛选阳性克隆，在利用G418筛选多拷贝），而且对于大小合适（30—50KD）的蛋白在产量上是pPIC9K无法比拟的。leslie：要做毕赤酵母表达实验，首先当然就要了解这个可爱的酵母了（椭圆形，肥嘟嘟的，十分可爱），她和大肠杆菌长得有较大区别（大肠杆菌是杆状的），因此在培养的过程中要区别这两种菌体，除了气味，浓度，颜色以外，也可以取样到显微镜中观测。大家做毕赤表达的时候应该都遇过这种情况吧，表达过程中染菌（我们实验室曾经污染过各种颜色形状的细菌，那真是一段可怕的经历），如果在不知情的情况下继续做下去，那可以就是浪费大把的时间了。 基本熟悉了毕赤酵母，了解了她生长的喜好（多糖偏酸环境），生长的周期等等情况后，当然更多的精力还是应该花在表达的目的蛋白上，我的表达蛋白有些恐怖，有100KD，本来当然应该放在大肠杆菌中表达，但是为了分泌表达（其实后来发现大肠杆菌pET系列分泌表达系列也不错）和糖基化修饰（主要是这个方面，因为我的蛋白是人源的，表达出来用于酵母双杂，因此需要有完备的糖基化修饰）。这样我的DNA片段由于较长，所以在做克隆的时候也要非常小心，需要注意的是： ①酶切位点不能出现在目的DNA片段中——如果片段长无法避免，可以采用平末端连接； ②虽然α-factor可以自动切除，但是在设计表达的时候，如果在N端不能出现任何多余的aa（比如药物蛋白表达），需要特别留意（说明书上有详细说明：P13）； ③有三种不同的读码框（对于pPICZα系列来说就是对上α-factor序列），在设计克隆的时候要反复确
巴斯德毕赤酵母表达系统
文章编号:100128751(2002)0620246205 巴斯德毕赤酵母表达系统 唐元家 余柏松 综述(中国医药集团四川抗菌素工业研究所, 成都610051) 摘要: 巴斯德毕赤酵母表达系统在DNA 重组技术中得到越来越广泛的应用。该酵母具有独特的生物学特性,作为真核表达系统,具有严格调控外源蛋白的表达,加工修饰表达产物,表达量高,营养要求低等优点;在该表达系统中,主要有3种表达宿主菌,其载体包括整合型载体和自我复制型游离载体,其转化和表达比大肠埃希氏菌系统复杂;巴斯德毕赤酵母中表达产物可分泌至胞外,从而获得较高表达量和利于表达产物的分离纯化。 关键词: 巴斯德毕赤酵母; 外源蛋白; 表达中图分类号: Q816 文献标识码: A 收稿日期:2001209227 修订日期:2002206215 作者简介:唐元家,男,生于1975年,在读硕士研究生,主要从事基因工程药物的研究。 余柏松,男,生于1957年,硕士,研究员,主要从事生物药物的研究及开发。 基因工程技术的发展为生物体生产外源蛋白展示 了广阔的前景。到目前为止,已发展了多种蛋白质表达系统,比如大肠埃希氏菌表达系统,酵母表达系统,高等真核细胞表达系统等。长期以来,人们用大肠埃希氏菌作为宿主表达了多种蛋白。这是因为大肠埃希氏菌具有若干优点,如遗传背景和生化特性清楚,容易操作,生长迅速,营养要求简单等。但这一系统本身也存在若干缺陷:(1)缺少真核生物的蛋白翻译后的修饰和加工,如剪切、糖基化、形成二硫键等;(2)表达的蛋白多形成不溶性包含体,需要经过复杂的复性才能恢复构象和活性;(3)背景蛋白很多,纯化麻烦;(4)表达量一般不是很高。从1979年开始,为了克服大肠埃希氏菌表达系统的缺点,发展了酵母表达系统。最先使用的是酿酒酵母,它具有繁殖速度快,能高密度发酵,可以进行蛋白质翻译后的修饰和加工等优点。1981 年Hitzeman 等用酿酒酵母表达人干扰素获得成功〔1〕 。 此后用该系统还表达了其它多种原核和真核蛋白,但酿酒酵母系统也具有局限性,如缺乏强有力的启动子, 分泌效率差,表达菌株不够稳定,表达质粒易于丢失等。有鉴于此,人们发展了新一代的酵母表达系统———巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris )表达系统,即甲醇酵母表达系统。 1 巴斯德毕赤酵母表达系统的优点 巴斯德毕赤酵母表达系统是近年来发展迅速、应用广泛的一种真核表达系统,有许多其它蛋白表达系 统所不具备的优点。(1)具有强有力的乙醇氧化酶(AOX1)基因启动子,可严格调控外源蛋白的表达;(2) 作为真核表达系统,可对表达的蛋白进行加工折叠和 翻译后修饰,。比如,用原核表达系统表达人组织型基质金属蛋白酶抑制剂(TI MP ),虽然获得了大量重组蛋白,但是由于重组蛋白形成包含体,难以使TI MP 分子内的6对二硫键正确折叠配对,始终未能得到有活性的全长分子。李克勤等用巴斯德毕赤酵母表达系统获得了分泌型前正 确折叠的TI MP 21,重组蛋白的表达量达40mg/L 〔2〕 ;(3)营养要求低,生长快,培养基廉价,与昆虫、哺乳动物等高等真核细胞相比,巴斯德毕赤酵母易于进行操作和培养。巴斯德毕赤酵母对需氧生长有强的偏好,这一生理学特性使得它既能高密度发酵生长,亦有利于工业放大生产;(4)表达量高。酿酒酵母中表皮生长因子(EG F )的表达量为714mg/L ,而在巴斯德毕赤酵母中的表达量为450mg/L ,表达量提高约60倍。许多蛋白在巴斯德毕赤酵母中的表达量可达到g/L 以上水平,如 破伤风毒素C 片段表达量达12g/L 〔3〕 ,Heva brasiliensis 羟腈裂合酶的表达水平高达22g/L 〔4〕 ;(5)在巴斯德毕 赤酵母中表达的蛋白既可存在于胞内,又可分泌到胞 外。由于巴斯德毕赤酵母自身分泌的蛋白(背景蛋白)非常少和培养基中不含其他的蛋白质,这样分泌的外源蛋白占了培养液中总蛋白的绝大部分,因此十分有利于外源蛋白的分离和纯化,如表达的重组水蛭素 (HIR ),仅经过二步层析纯化,纯度高达97%以上〔5〕 ,表达的人重组白细胞介素经过疏水层析、离子交换和 凝胶过滤三步纯度即可达到99%〔6〕 ;(6)外源基因能通过质粒整合到巴斯德毕赤酵母基因组上,这样得到