PEG沉淀法-病毒提纯方法

1. Viruses such as baculovirus can be concentrated by polyethylene glycol precipitation. 2. Adjust the pH of the virus-containing supernatant to 7.2-7.5. Polyethylene glycol (PEG, MW 6,000) is added to a final concentration of 8% (w/v). 3. Stir at 4℃for 2 hours. 4. Centrifuge at 10,000 x g for 2 hours. 5. Resuspend the pellet in a small volume of appropriate buffer ( e.g., RNase-free ddH2 for virus RNA prep).
沉淀法-病毒提纯方法 主要是从稀的悬浮液中浓缩病毒，有中性盐沉淀法、聚乙二醇(PEG)沉淀法、有机溶剂沉淀法、等电点沉淀法、皂 土法和鱼精蛋白沉淀法等。 1.中性盐沉淀法：病毒一般在 45%以上饱和度的硫酸铵溶液中沉淀，且保持其感染性。在含有病毒的组织培养液 中加入等体积的饱和硫酸铵，可以很容易地沉淀某些病毒如狂犬病毒、鸡新城疫病毒等。 2.聚乙二醇沉淀法：聚乙二醇(PEG)为水溶性非离子型聚合物，具有各种不同的分子量，用于病毒沉淀的主要是分 子量为 2 000～6000 的 PEG。将 PEG 配成 50%左右的溶液，或直接将固体 PEG 加于病毒悬液中，使其达到所需浓 度，通常在 4℃搅拌过夜，然后离心使病毒沉淀。Tanncock(1985 年) 成功地用 PEG 浓缩了禽脑脊髓炎病毒。 3.有机溶剂沉淀法：甲醇、氯仿、正丁醇、氟碳化合物等都可用于提纯病毒，但乙醚、氯仿等脂溶剂对于具有脂质 囊膜的病毒具有破坏和灭活作用，故不适于这类病毒的浓缩提纯。 4.等电点沉淀法：病毒粒子在等电点时，所携带的正电荷与负电荷相互中和，因而失去相互排斥的作用而发生沉 淀。多数病毒的等电点在 pH4.5～5.5 之间，因此在 pH3～6 范围内均可沉淀，由于一部分细胞成份在等电点时亦发 生沉淀，此法效果不太理想，但从感染的组织培养液中浓缩病毒，可以获得较好结果。应用酸性范围的等电点沉淀 或分级沉淀病毒时，必须注意 pH 对病毒活性的影响及病毒粒子电荷与组织蛋白电荷的差异。 5.皂土法：Girin(1989 年)应用皂土在酸性条件下(pH4～4.5)吸附轮状病毒 SA-11，再在碱性条件下（pH8.5） ，又使 其洗脱下来，从而达到纯化目的。 6.鱼精蛋白沉淀法：鱼精蛋白为碱性蛋白，具有携带其它蛋白质共沉淀的作用，能和直径大于 50nm 的病毒共同沉 淀而不影响病毒的感染力。 当向这种沉淀物加入 1mol/LNaCl 时， 病毒又重新释放到悬液中， 而鱼精蛋白仍然沉淀。 直径小于 50nm 的小型病毒则不与鱼精蛋白共同沉淀。因此，可利用鱼精蛋白去除病毒材料中直径大于 50nm 的异 种蛋白质。
聚乙二醇 HOCH2(CH2OCH2)nCH2OH(n＞4)( Polyethylene Glycol 简写为 PEG)， 它的亲水性强， 溶于水和许多有机 溶剂，对热稳定，有广泛围的分子量，在生物大分子制备中，用的较多的是分子量为 6000～20000 的 PEG。 PEG 的沉淀效果主要与其本身的浓度和分子量有关，同时还受离子强度、溶液 pH 和温度等因素的影响。在一定 的 pH 值下， 盐浓度越高， 所需 PEG 的浓度越低， 溶液的 pH 越接近目的物的等电点， 沉淀所需 PEG 的浓度越低。 在一定范围内，高分子量和高浓度的 PEG 沉淀的效率高。以上这些现象的理论解释还都仅仅是假设，未得到充分 的证实，其解释主要有：①认为沉淀作用是聚合物与生物大分子发生共沉淀作用。②由于聚合物有较强的亲水性， 使生物大分子脱水而发生沉淀。③聚合物与生物大分子之间以氢键相互作用形成复合物，在重力作用下形成沉淀析 出。④通过空间位置排斥，使液体中生物大分子被迫挤聚在一起而发生沉淀。 有机聚合物沉淀的优点是：①操作条件温和，不易引起生物大分子变性；②沉淀效能高，使用很少量的 PEG 即可 以沉淀相当多的生物大分子；③沉淀后有机聚合物容易去除。
水溶性非离子型聚合物沉淀法常用的聚合物为聚乙二醇（PEG）及硫酸葡聚糖。水溶性聚合物沉淀蛋白质的机制尚 不清楚，大致有如下解释：①聚合物与蛋白质形成共沉物；①聚合物与蛋白质之间发生水的重分配；①聚合物与蛋 白质形成复合物。此法受许多因素影响，主要是 pH、离子强度、蛋白质浓度和 PEG 的分子量等。分子量为 2000～ 6000 的 PEG 皆适宜于做蛋白沉淀用。如若使用得当，效果甚为满意。一般认为，PEG 浓度在 3％～4％时沉淀免疫 复合物，6％～7％可沉淀 IgM，8％～12％可沉淀 IgG，12％～15％可沉淀其他球蛋白，25％可沉淀白蛋白。最突出 的应用是用 3％～4％的 PEG 沉淀免疫复合物，未结合的抗原和抗体留在溶液中。按此原理设计了快速测定法和循 环免疫复合物测定法
从网上搜索到得关于 PEG 沉淀提纯病毒的方法，先汇总至此贴，希望大家支持本版 1、用超声波或冻融的方法使细胞破碎释放出病毒； 2、慢慢搅动并加入 NaCl 终浓度是 0.5mol/L,有助于病毒的沉淀，再等量加入 10％PEG(一般使用的是 PEG6000

就可以了。如果对样品的纯度不是严格要求的话，可以建议使用 Millpore 公司的离心浓缩柱，Amicon 系列的可以 一次浓缩 15ml 样品。)； 3、4℃过夜或放置一段时间； 4、8000/min 离心 30 分钟，收集病毒沉淀； 5、将病毒沉淀加入适量的 pbs 中，4℃过夜； 6、10000r/min 离心 1 小时,沉淀即为浓缩的病毒。 还可以用梯度离心或其他方法进一步纯化。
PEG 沉淀法提纯病毒 1、用超声波或冻融的方法使细胞破碎释放出病毒； 2、慢慢搅动并加入 NaCl 终浓度是 0.5mol/L,有助于病毒的沉淀，再等量加入 10％PEG(一般使用的是 PEG6000 就可 以了。如果对样品的纯度不是严格要求的话，可以建议使用 Millpore 公司的离心浓缩柱，Amicon 系列的可以一次 浓缩 15ml 样品。)； 3、4℃过夜或放置一段时间； 4、8000/min 离心 30 分钟，收集病毒沉淀； 5、将病毒沉淀加入适量的 pbs 中，4℃过夜； 6、10000r/min 离心 1 小时,沉淀即为浓缩的病毒。 还可以用梯度离心或其他方法进一步纯化。
Concentrating virus (PEG6000) -------------------------------------------------------------------------------1. Viruses such as baculovirus can be concentrated by polyethylene glycol precipitation. 2. Adjust the pH of the virus-containing supernatant to 7.2-7.5. Polyethylene glycol (PEG, MW 6,000) is added to a final concentration of 8% (w/v). 3. Stir at 4 0Cfor 2 hours. 4. Centrifuge at 10,000 x g for 2 hours. 5. Resuspend the pellet in a small volume of appropriate buffer ( e.g., RNase-free ddH2 for virus RNA prep).
PEG-it?慢病毒浓缩试剂 ? 价 格： ￥3802.5 ? 说 明： 欢迎询价详谈 ? 货 号：LV810A-1 PEG-it?慢病毒浓缩试剂 原理 PEG 是高分子聚合物，具有高亲水性，在溶液中会吸收大量水分，减少病毒之间的距离，使病毒与病毒能够很容易 的聚合在一起，病毒的相对浓度提高，达到沉淀浓缩的目的。 PEG-it?中还含有特定的（SBI 专属的）缓冲液，它能够保持病毒的活性。少量残留的 PEG-it?还会提高感染效率， 使病毒更稳定。 图 1 使用简便快捷 只需将 5 倍的 PEG-it?溶液与包含病毒颗粒的细胞培养基混合离心 30 分钟，即可得到 10-100 倍的病毒浓缩液 特点 ?快捷：全程只需 30min 高效：?能使病毒颗粒浓缩 10-100 倍 安全：?对所有靶细胞，包括胚胎干细胞是无毒的 ?使用方便：无需使用特别的仪器，避免了昂贵的超高速离心机的使用，?只需普通离心机，低速离心即可

无残留：?没有细胞残片的残留，避免对细胞的毒性和免疫原性 ?提高转导效率：为动物转导提供高滴度的病毒 特别?适合大体积的病毒浓缩，解除了超滤管小量的限制 产品信息 货号 产品名称 包装体积 价格（￥） 说明 LV810A-1 PEG-it? Virus Precipitation 100 mL 3802.5 适用于 400ml 慢病毒细胞上清液浓 Solution (100 mL aliquot) 缩 LV825A-1 PEG-it? Virus Precipitation 250 mL 8287.5 适用于 1L 慢病毒细胞上清液浓缩 Solution (250 mL aliquot)
纯化病毒用终浓度 10%PEG 处理后 8000g 离心，溶解于 PBS。这样的方法对吗？ PEG 沉淀的原理是什么啊？ 是这样的，纯化病毒和噬菌体都可以，原理就是 PEG8000 是一种高度的网状聚合物，很粘稠，可以把病毒沉淀下 来。
Catalog # K904-200 K904-50
Product Name+ PEG Virus Precipitation Kit PEG Virus Precipitation Kit
Size 200 preparations 50 preparations
Price $725.00 $245.00
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PEG Virus Precipitation Kit 中文名称 供应商 产品报价 PEG 病毒沉淀试剂盒(200 次) Biovision ￥11600/200 次分析 包装出来的重组病毒常常含量很少，因此通常需要浓缩之后才能进行储存或其它应用。另外，在病 毒包装过程中，可能会产生有毒的蛋白或生物分子杂质。因此需要一种快速、简单而便宜的方法来 浓缩病毒，同时去除杂质。 BioVision 的 PEG 病毒沉淀试剂盒提供了一种简单方便省时的方法来浓缩病毒，无需超速离心。本 试剂盒可用于小实验样品处理或者大规模高产出、高生物量病毒制备。本试剂盒可利用细胞培养液 或者环境样品浓缩逆转录病毒、杆状病毒、慢病毒、噬菌体等。浓缩倍数可达 100 倍以上。试剂盒 中还有一种优化的重悬溶液可最大化地进行病毒复苏，根据病毒类型和来源，复苏比例在 40-100% 不等。整个过程都使用无毒试剂，浓缩的病毒可用于感染实验、DNA 或 RNA 纯化等。 1、一种快速简单便宜的方法浓缩病毒去除杂质；2、简单方便省时的方法浓缩病毒，无需超速离心； 3、病毒可浓缩 100 以上；4、整个过程都使用无毒试剂。 请在接收到该 Biovision 品牌的 PEG 病毒沉淀试剂盒(200 次)产品后，置于-20℃保存。 产品货号 K904-200
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PEG Virus Precipitation Kit 中文名称 PEG 病毒沉淀试剂盒(50 次)

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Biovision ￥3920/50 次分析
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K904-50
超速离心法-病毒提纯方法 录入时间:2009-6-26 9:30:33 来源：青岛海博  病毒粒子经过初步浓缩之后， 要进一步纯化， 通常采用超速离心法， 它是分离提纯不同大小的病毒的有效方法之一。 在应用超速离心法沉淀病毒时，必须了解所用离心机的离心力。离心机由于转头的回转产生了强大的离心力，这种 离心力是随转头的大小和离心管至转轴中心的距离而变化的。高速和超速离心机的离心条件，有的以每分钟速度 (r/min)表示，有的则以离心力——重力加速度 g(980cm/S 2) 为单位来表示。离心沉淀时，沉降]速度与离心力有关。 当运转角速度为 ω，运转半径为 R 时，则： [JZ] 离心力 g=ω 2Rav ，ω=(2πr/min)/60，  [JZ]g=[SX(]4πr/min 2[]3]600×980[SX)]×Rav     [HT5”SS][JZ] 图 13-2〓角转头的横剖面图 [JZ] 表明从旋 转中心到离心管顶部、中部及底部的距离。  [HT5SS] 上式中，Rav 为离心管中心至转轴中心的平均距离(如 图 13-2)。从上式可以作]出 r/min、R 与 g 三者关系的贯线图(如图 13-3)。三者中如知其二，就可推算另一数值。如 转速超过 7 万，或 R 为英寸时，可参阅图 13-4。     [HT5”SS][JZ] 13-3〓推算转头离心力的贯线图 图      [JZ] 13-4〓推算转头离心力的贯线图  图 由此图可以获得与半径相关的相对离心力的值。将尺放在图 左侧表示离心头中的离心管距转轴中心的距离(即旋转半径的标尺)上， ]然后使之与预选转速(即图右侧的离心速度标 尺)成一直线，在图中央的标尺上即可读出相对]离心力之值。图中点线表示测量一个相对离心力的例子。 [HT5SS] 离心机转速在 4000r/min 左右的称为低速(普通)离心机；转速至 25]000r/min 左右的]称为高速]离心机；转速 25]000r/min 以上的称为超速离心机。 高速和超速离心机装有冷冻装置和抽]真空]装置， 以保持离心腔中恒定的低温， 并减少转头运转时空气的摩擦力。超速离心机有制备和]分析用两类，最近又生产出制备、分析及区带连续离心三用 装置在一起的离心机，有的还带]扫描装置。 使用超速离心机的分离提纯方法有三种：(1)差速离心法；(2)速 度区带离心法；(3)平衡密度梯度离心法(或等密度梯度离心法)。 1.差速离心法 这是应用较早的简单方法，建立在不同大小和比重的粒子在沉降速度上存在差别的基础上。具体做法是将被分离的 样品交替进行低速离心与高速(或超速)离心。沉降速度差别在一个或几个数量级的粒子，可用本法分离提取。粒子 大小、转速与离心沉淀时间的关系，如图 13-5。     [HT5”SS][JZ] 13-5〓病毒粒子大小、转速及离心沉淀 图 时间的关系图  [HT5SS] 差速离心适用于从组织培养液、鸡胚尿囊液或经过红细胞吸附释放的病毒]悬液中提纯 病毒。 在由感染细胞或组织匀浆中提取病毒时， 由于与病毒大小相近的细胞亚单位及碎片的存在， 提纯效果不理想。 差速离心法的优点是能迅速处理大量样品，故常作为病毒精制的第一个阶段，或者用于病毒样品的浓缩和粗提。 以差速离心法分离提纯病毒时，经常以低速(2]000～3]000r/min，20～30 分钟)及中]速(10]000r/min，20～30 分钟)去 除较大的宿主细胞碎片、污染的细菌及其他较大的杂质。]然后，选择在 60 分钟内能够沉淀 80%以上的病毒粒子的 较高速度， 离心 1～2 小时， 使病毒沉淀]。 对中、 大型病毒如流行性感冒病毒， 在经红细胞吸附释放后， 25]000r/min 于 离心 60 分]钟，即可达到目的。小型病毒如脊髓灰质炎病毒、披膜病毒，则需以 35]000～45]000r/min 离心 1～2 小 时。高速或超速离心沉淀物，可用研磨和超声波振荡等方法打碎后悬浮于缓冲]液中。对于非病毒杂质较多的样品进 行差速离心，由于病毒对沉淀物的非特异性吸附而有较多损失。 ] 2.速度区带离心法

是根据被分离物质在强大离心力中沉降速度不同而进行的分离方法。该法使用的介质密度应该小于被分离物质的 密度。介质可以为均一密度，也可以为梯度密度。当被分离的物质沉降到与介质密度相等的区域时就不再沉降。不 同分子形成不同的区带， 而称为速度区带。 该法要求样品浓度为顶端浓度梯度的 1/10， 样品体积为离心管体积的 5%。 常用的介质有蔗糖、甘油、聚蔗糖等。在病毒纯化时，将病毒样品溶液层加于密度梯度层的顶部，借助病毒粒子或 其亚单位成分本身的浮密度差别，在离心力作用下降到密度相等的介质层内，最后排列成带状停留不动。密度较小 的粒子或成分停留在上面的几层内，密度较大的粒子或成分沉降于下面几层内。应用密度梯度法，可以获得相当纯 净的病毒样品。 病毒粒子或成分的沉降速度取决于其大小、 形状及比重， 也取决于离心力及悬液介质的密度和粘度。 蔗糖是生物大分子粒子密度梯度分离时最常应用的材料，因其易溶于水，且对核酸及蛋白质呈化学惰性。常用的梯 度范围从 5%～20%：10%～60%。蔗糖浓度梯度离心后，蔗糖溶液的密度以折射法测定折射率，按如下公式计算：  [JZ]ρ=2 7329η  20 6425 -2 蔗糖溶液的折射率如表 13-2。 除蔗糖浓度连续梯度离心外，近来有人在 两层浓度梯度上层加病毒浓缩样品， ]经超速离心后将病毒收集于两层界面处； 也有人在单层蔗糖浓度溶液上层加病 毒浓缩样品，]经超速离心，使病毒沉淀于蔗糖溶液底部。这两种方法比较简单，但浓缩提纯的效果远远不]如多层 连续梯度法。 3.平衡密度梯度离心法 平衡密度梯度离心法是根据粒子的浮密度不同而加以分离。所谓浮密度就是物质的质量减去在一定介质中所受的浮 力，亦称有效密度。 [JZ] 浮密度(有效密度)=m-m(ρ 0/ρ) m 为物质质量，ρ 为物质密度，ρ 0为介质密度。常用 的介质有氯化铯(CsCl)、氯化铷(Rb]Cl)、硫酸铯(Cs 2SO 4) 、溴化钾(KBr)、酒石酸钾(K 2C 4H 4O 等无 6) 机或有机盐。]病毒离心时，病毒粒子 ρ 比介质密度 ρ 0大，即 ρ>ρ 0病毒沉淀，ρ<ρ 0时则上浮。]制备梯度的 方法有两种：一种是在饱和的 CsCI 溶液上面层加病毒样品(容量比 1∶4)；]另]一种是将病毒样品与 CsCl 浓溶液均 匀地混合。一般用水平转头，经较长时间的超速离心，在]离心管中形成 CsCl 的浓度梯度，并由于离心力的作用， 样品中的病毒粒子分布于相应密度的]区域内。这种方法在分析离心中是最常用的。应用本法时，离心转头的回转数 越高，离心时]间越长，越能接近平衡状态。 平衡密度梯度离心法广泛应用于病毒和核酸的提纯上。用平衡密 度梯度离心法提纯的动物病毒有多型瘤病毒、牛痘病毒、乙型脑炎病毒、狂犬病病毒和马传贫病毒等。有的病毒在 这些无机盐类溶液中被破坏，可加入 0 2% ～0 5% 牛血清白蛋白，或用 0 5% ～3 0% 甲]醛先将病毒粒子固定， 然后进行平衡密度梯度离心，常能较好地回收病毒。大多数病毒的浮密度在 1 10 ～1 40范围内，见表 13-3。所 以制备密度范围为 1 0 ～1 7的悬浮介质， 便可满]足大多数病毒密度梯度离心的需要。 CsCl 溶液进行平衡密度 用 梯度离心时，以测定 25℃时 CsCl 溶液的折射率(ｎ  25]  D 方法)，按照下列公式求得各梯度分层液的密度： 的 密度范围为 ρ＝1 00 ～1 38g/cm 3 时，ρ  25 =10 2402  25  -12 6423 ｎ D 〓](式 1)密度范围为 ρ=1 37 ～1 9g/cm 3时，  25 =10 8601  25  -13 4974 ρ ｎ D 〓(]式 2)ｎ  25  D 各梯度分层 指 液在 25℃时的折射率，ρ  25 指各梯度分层液在 25℃时的]密度。例①〓以马传贫病毒在 CsCl 平衡密度梯度 离心后提纯于第 12 分段部位中， 此部分 CsCl 溶]液折射率为 1 3510 求其密度： ，  将所得折射率代入式 1 中， 则 [JZ] ρ  25 =10 2402×1 3510 6423=1 1923 -12 即马传贫病毒浮密度约为 1 19 。 例②〓 急性传贫马血清中游离铁蛋白在 CsCl 平衡密度梯度离心后提纯于第 18 分段部位]，此部分 CsCl 溶液折射率为 1 38 11，求其密度： 将所得折射率代入式 2 中，则 [JZ] ρ  25 =10 6801×1 3811 4974=1 5014 -13 即铁蛋白浮密度约为 1 50  。 各种无机盐溶液的密度 与折射率的关系，一般以下列公式表示： [JZ] ρ=a?n-b 如果知道各种盐类溶液的系数 a 和 b，即可按测 定折射率的方法简单地求得其密度。 由折射率计算密度时， 常用溶质的质数 a 和 b 值及其密度的适用范围如表 13-5。  4.两种超离方法的比较 速度区带离心法和平衡密度梯度离心法各有特点，现将这两种超离方法加以比较，具体见表]13-6  [JZ][HT5”H] 表 13-6〓速度梯度离心法与平衡密度梯度离心法的特点 [HT6SS][]BG(!][BHDFG2 ，WK11，WK20ZQ， WK20ZQW][]速度区带离心法[]平衡密度梯度离心法][BHDG4]原理[]沉降与颗粒质量成正比，以物质沉降速度的不 同进行分离[]沉降与颗粒的密度成]正比，以物质的浮密度不同进行分离[BHDG6]介质[]密度小，如蔗糖、甘油、聚 蔗糖， 蔗糖浓度 10% 67% 密度 1～1 3286预制梯度， ， ]不连]续[]密度大， CsCl,Cs 2SO 4 CsCl 浓度 0～1 355 如 ， ， 密度为 1～1 9025 ，自成连续梯]度[BHG4]离心力场[]强，离心速度高，使被分离物质易沉降[]稍强，速度相对低， 使 CsCl 形成梯]度，建立沉降扩散平衡[BHG4]离心过程[]样品向离心管底沉降[]不论样品起始时在什么位置，离心 中样品停留于介质]的等密度部位[BHG2]离心时间[]较短，一般为几小时到几十小时[]较长，十几小时到数天 [BG)F] 5.密度梯度离心法的操作程序 (1)密度梯度的制备： 制备密度梯度的方法有不连续的(即人工操作)和连续的(即机械操作)密度梯度两种。  不 连续的或分层的密度梯度的制备 不连续的密度梯度是以人工操作法制备的，在一定温度下(一般在 20℃或在 25℃)配制一系列浓度差为 5%的梯度溶液，例如蔗糖可配制成 5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、]40%(W/V) 等溶液(用蒸馏水或适宜的缓冲液配制)，用皮下注射器或微量吸管，小心地先吸取浓度最大的溶液注入离心管底， 然后依次加入较低的各个浓度(40%→5%)，一层覆盖着一层地层加于离心管中，注意避免产生气泡。假如各层界面 被冲动破坏，则应重新制备。也可]以将长针头插入管底，依次从浓度低到高加入各溶液。 连续的密度梯度的 制备 为了产生一个连续的密度梯度，常用梯度混合装置来制备梯度。     [HT5”SS][JZ]图 13-6〓

简易的密度梯度溶液制备装置 [JZ]A 、B 为盛蔗糖溶液的玻璃管。 [JZ]1 活塞双通；2搅拌棒；3活塞；4 连接处；5聚乙烯小管  [HT5SS] 梯度混合装置如图 13-6，由 A 和 B 管组成。两管之间用双通活塞联结。在活 塞]关闭的状态下，向 A 管中加入低浓度蔗糖溶液，向 B 管中加入高浓度的蔗糖溶液，两管中容量要相等。在 B 管 出口处用一根聚乙烯小管连接到离心管。在给 B 管充液时，可将聚乙烯小管的流出口向上转动，使之超过液体的水 平面，从而阻止液体流出。充液后可将小管接到离心管中使之贴着管壁，然后开动小搅拌器，使搅拌棒转动，同时 打开两管间活塞。这三个操作要同时进行，以保证梯度的连续性。当梯度液体自 B 管流出时不允许移动离心管，待 离心管中所盛的梯度溶液的体积达到需要量之后，将离心管小心地静止于 4℃1～2 小时，以平衡之。 现在不少 “制备用超速离心机”携带有“密度梯度制备自动装置”。按照这个方法制备的蔗糖浓度梯度，理论上按下式计算：  [JZ]C=C A -(C A -C B )(1-V)  -b/a  A管和 B 管的横断面积各为 a、b，其中所含蔗糖浓度分别为 C A 、 C B ，两液开始混合以]后流出 Vml 时流出液的浓度为 C。A 和 B 管的横断面积一般情况下相等，故 a=b，这时获 得的梯度为直线梯度。如果 a≠b 时，离心管中浓度梯度产生凸形和凹形梯度曲线。这些浓度梯度是根据样品和实验 目的而专门选用的。一般使用的浓度梯度范围为 20%→5%，40%→10%，或 60%→10%等。 (2)加入样品：用如上所述注射器或微量吸管吸取悬浮于适宜缓冲液中的病毒或核酸样品(约梯度介质体积的 1/10 容 量)，从液面上方 1mm 处，紧贴着离心管壁轻轻层加于梯度介质面上。 (3)高速或超速离心：将加入样品的离心管装入套管内，也可将离心管置于转头的套管内，以免在装进套管时震动液 体。拧紧套管螺帽，将套管吊在水平转头上，置于离心机内。梯度离心一般用高速或超速离心机。离心速度和时间， 根据所分离的样品选定。离心开始，样品中各种粒子逐渐分离，分布于相应的密度梯度层中成为带状(如为透明的聚 碳酸酯离心管，则可以清楚地见到带状分离，并拍照)。离心时间到时，使离心机自然停止，不许制动，以免破坏梯 度。 (4)梯度的分段收集(取样)：在离心完了以后，为了把已分离物质的各条带分开，必须取出梯度溶液。梯度溶液的分 段收集方法有如下几种。 ①取代法：从离心管底部穿刺或将带长针头的注射器插入离心管底，使一种稠密]的介质，如 60%～70%(W/V)蔗 糖溶液，缓慢地注入于离心管底部。然后用一个注射器或移液管，从上面逐一移出各部分。或者在离心管的颈部加 上一个塞子，这个塞子附着一根收集导管，通向一个部分收集器，收取各部分。 ②穿刺法：将离心管固定于特制的固定架上，在其底部装上一个垂直向上的空心针穿刺，使梯度溶液自由滴出，可 用部分收集器或用小试管分段收集。超速离心机一般都带有此装置。此装置的缺点是离心管在用一次后即废弃。 ③虹吸法：此法的优点是不必穿刺离心管，离心管可反复使用。经多次试证实，此法简]便易行，对梯度密度无破 坏。用一根大穿刺针截两段做虹吸管，以接上 50～100ml 玻璃注射器进行送气的方法，分段收集梯度溶液。      [HT5”SS][JZ] 13-7〓从分部密度梯度中的分部收集 [HT5”SS][GK4] 图 从分部密度梯度中的分部收集 A、 B 部分由有机玻璃制成，并利用螺帽 C]紧密地装在一起，利用 O 形垫圈封起来。通过注入浓蔗糖溶液使管内成分 缓缓向上挤入锥形]收集中而流出  [HK] [HT5SS] ④注射器吸取法：用弯曲的针头(J 状)接在注射器上，从梯 度最上层开始向]下逐层小心吸取液体。 6.梯度各层液体的密度测定 (1)称重量法：用 10ul 微量注射器吸取样品，加入于已知重量的毛细管中，在 1/10 万分析天秤上称重，计算重量 (g/ml)，即为梯度溶液的密度。 (2)测定折射率法：用阿贝氏折光仪测定各梯度层溶液的折射率(25℃)，然后按照前述的公式 ρ  25 =a? ｎ   25  -b 换算成密度(g/ml)。 D (3)浮漂法：向已制备好的各种密度溶液中滴入一滴样品，找出相应的样品浮密度溶液，即为该梯度层的密度。 7.各梯度分层液中病毒分布的鉴定 (1)以紫外分光光度计测定蛋白质和核酸吸收峰。吸取各层梯度溶液，用蒸馏水或缓冲液适当稀释后，测定波长 280 和 260nm 的 OD 值。然后以各梯度层管号为横坐标，其 OD 值为纵坐标画曲线，即为各梯度层中蛋白质病毒 含量图，有些病毒 260nm]OD 值较高。 (2)以各种血清学方法测定各梯度层中病毒的抗原效价；或用组织培养法测定病毒滴度，证实病毒分布区域。 (3)用电子显微镜负染法观察病毒粒子及其纯度。将各梯度层样品装入透析袋中，置于适宜的溶液中透析去盐，然 后取一滴样品用蒸馏水稀释，滴附于铜网膜上，用磷钨酸负染后电镜下观察病毒粒子。
1) （4 M KCl and 50 mM Tris-HCl, pH7.2）：（病毒悬液）=1：3； 2) 或者，直接加KCl到病毒悬液中，终浓度为1M； 3) 轻晃混匀，冰上放置15-30分钟 4) 离心12,000 g 10分钟4° C，收集上清 5) 分装-80 保存

沉淀蛋白质的常用方法

沉淀蛋白质的常用方法（TCA、乙醇、丙酮沉淀蛋白操作步骤） TCA-DOC For precipitation of very low protein concentration 1) To one volume of protein solution, add 1/100 vol. of 2% DOC (Na deoxycholate, detergent). 2) Vortex and let sit for 30min at 4oC. 3) Add 1/10 of Trichloroacetic acid (TCA) 100% vortex and let sit ON at 4oC (preparation of 100% TCA: 454ml H2O/kg TCA. Maintain in dark bottleat careful, use gloves!!!). 4) Spin 15min 4oC in microfuge at maximum speed (15000g). Carefully discharge supernatant and retain the pellet: dry tube by inversion on tissue paper (pellet may be difficult to see). [OPTION: Wash pellet twice with one volume of cold acetone (acetone keep at –20oC). Vortex and repellet samples 5min at full speed between washes]. 5) Dry samples under vaccum (speed vac) or dry air. For PAGE-SDS, resuspend samples in a minimal volume of sample buffer. (The presence of some TCA can give a yellow colour as a consequence of the acidification of the sample buffer ; titrate with 1N NaOH or 1M TrisHCl to obtain the normal blue sample buffer colour.) Normal TCA To eliminate TCA soluble interferences and protein concentration 1) To a sample of protein solution add Trichloroacetic acid (TCA) 100% to get 13% final concentration. Mix and keep 5min –20oC and then 15min 4oC; or longer time at 4oC without the –20oC step for lower protein concentration. Suggestion: leave ON if the protein concentration is very low. (preparation of 100% TCA: 454ml H2O/kg TCA. Maintain in dark bottleat careful, use gloves!!!). 2) Spin 15min 4oC in microfuge at maximum speed (15000g). Carefully discharge supernatant and retain the pellet: dry tube by inversion on tissue paper (pellet may be difficult to see). 3) For PAGE-SDS, resuspend samples in a minimal volume of sample buffer. (The presence of some TCA can give a yellow colour as a consequence of

沉淀分离法.

一、本章的教学目的与要求 了解沉淀分离法的原理及应用 二、授课主要内容 §3—1 无机沉淀剂分离法 一、氢氧化物沉淀分离法 二、硫化物沉淀分离法 §3—2 有机沉淀剂分离法 一、分析功能团analytical radical 二、有机沉淀反应与沉淀剂 三、重点、难点及对学生的要求 掌握沉淀分离法的原理及使用条件 四、主要外语词汇 deposition 五、辅助教学情况（多媒体课件） 六、复习思考题 1阐述沉淀剂分类 2什么是分析功能团？ 七、参考教材references 参考书：《工业分析》机械工业出版社、重庆大学出版社，1997年，第一版《分析化学》武汉大学、华师大五校合编，2001年，第五版 《分离及复杂物质分析》邵令娴编，化学工业出版社，1984年，第一版

利用沉淀反应进行分离： 举例：①Fe3+，Al3+、Ca2+、Mg2+络合滴定； ②Fe3+，Al3+低含量时掩蔽EDTA测Ca2+，Mg2+，如水硬度； ③Fe3+，Al3+高含量时先分离自掩蔽后测。 §3—1 无机沉淀剂分离法 一、氢氧化物沉淀分离法 可生成氢氧化物的离子较多，根据沉淀物的溶度积，可大致算出各种金属离子开始析出沉淀时pH值。 例如：测定Fe3+ 已知Ksp Fe(OH)3=3.5×10-38 当溶液中[Fe3+]=0.01 M 开始沉淀的pH值[OHˉ]3[Fe3+]≥Ksp = 3.5×10-38 [OHˉ]≥1.5×10-12；pOH≤11.8；pH ≥2.2； 沉淀完全进行时，溶液中[Fe3+]残留10-6 M，已知99.99%的铁Fe3+被测定， 此时[OHˉ] = 10-10.5，pOH = 10.5，pH = 3.5 即测定Fe3+的pH为2.2～3.5 根据Ksp可算出金属离子的沉淀pH范围，各种离子沉淀时的pH值不同，有的在较低的pH值时能测定，有的在较高pH值时开始沉淀，因而可控制pH进行分离。

沉淀蛋白质的常用方法

沉淀蛋白质的常用方法（TCA、乙醇、丙 酮沉淀蛋白操作步骤） TCA-DOC For precipitation of very low protein concentration 1) To one volume of protein solution, add 1/100 vol. of 2% DOC (Na deoxycholate, detergent). 2) Vortex and let sit for 30min at 4oC. 3) Add 1/10 of Trichloroacetic acid (TCA) 100% vortex and let sit ON at 4oC (preparation of 100% TCA: 454ml H2O/kg TCA. Maintain in dark bottleat careful, use gloves!!!). 4) Spin 15min 4oC in microfuge at maximum speed (15000g). Carefully discharge supernatant and retain the pellet:

dry tube by inversion on tissue paper (pellet may be difficult to see). [OPTION: Wash pellet twice with one volume of cold acetone (acetone keep at –20oC). Vortex and repellet samples 5min at full speed between washes]. 5) Dry samples under vaccum (speed vac) or dry air. For PAGE-SDS, resuspend samples in a minimal volume of sample buffer. (The presence of some TCA can give a yellow colour as a consequence of the acidification of the sample buffer ; titrate with 1N NaOH or 1M TrisHCl to obtain the normal blue sample buffer colour.) Normal TCA To eliminate TCA soluble interferences and protein concentration

浓缩蛋白方法

1，透析袋浓缩法 利用透析袋浓缩蛋白质溶液是应用最广的一种。将要浓缩的蛋白溶液放入透析袋（无透析袋可用玻璃纸代替），结扎，把高分子（6 000－12 000）聚合物如聚乙二醇（碳蜡）、聚乙烯吡咯、烷酮等或蔗糖撒在透析袋外 即可。也可将吸水剂配成30％－40％浓度的溶液，将装有蛋白液的透析袋放入即可。吸水剂用过后，可放入 温箱中烘干或自然干燥后，仍可再用。 主要用于更换蛋白质的缓冲液，有透析袋即可，不需要特殊的仪器。 2，冷冻干燥浓缩法 这是浓缩蛋白质的一种较好的办法，它既使蛋白质不易变性，又保持蛋白质中固有的成分。它是在冰冻状态下直接升华去除水分。具体做法是将蛋白液在低温下冰冻，然后移置干燥器内（干燥器内装有干燥剂，如NaOH、CaCl2和硅胶等）。密闭，迅速抽空，并维持在抽空状态。数小时后即可获得含有蛋白的干燥粉末。干燥后的蛋白质保存方便，应用时可配成任意浓度使用。也可采用冻干机进行冷冻干燥。 在冷冻状态下让扬品种的液体升华 3，吹干浓缩法 将蛋白溶液装入透析袋内，放在电风扇下吹。此法简单，但速度慢，且温度不能过高，最好不要超过15℃。4，超滤膜浓缩法 此法是利用微孔纤维素膜通过高压将水分滤出，而蛋白质存留于膜上达到浓缩目的。有两种方法进行浓缩：一种是用醋酸纤维素膜装入高压过滤器内，在不断搅拌之下过滤；另一种是将蛋白液装入透析袋内置于真空干燥器的通风口上，负压抽气，而使袋内液体渗出。 主要针对小体积蛋白质溶液（几ml）此法更不易引起变性，不过得有浓缩器，不是哪个实验室都有的。 5，凝胶浓缩法 选用孔径较小的凝胶，如SephadexG25或G50，将凝胶直接加入蛋白溶液中。根据干胶的吸水量和蛋白液 需浓缩的倍数而称取所需的干胶量。放入冰箱内，凝胶粒子吸水后，通过离心除去。 6，浓缩胶浓缩法 浓缩胶是一种高分子网状结构的有机聚合物，具有很强的吸水性能。每克干胶可吸水120ml～150ml。它能 吸收低分子量的物质，如水、葡萄糖、蔗糖、无机盐等，适宜浓缩10 000分子量以上的生物大分子物质。 浓缩后，蛋白质的回收率可达80％～90％。比凝胶应用方便，直接加入被浓缩的溶液中即可。必须注意，浓 缩溶液的pH值应大于被浓缩物质的等电点，否则在浓缩胶表面产生阳离子交换，影响浓缩物质的回收率。 7，丙酮沉淀法： 试验要求的仪器简单，但是常常导致蛋白质变性。 8，免疫沉淀法： 通过免疫沉淀法，用蛋白质特异性能够定量能够分离目的蛋白。有三个步骤组成：首先将特异性抗体加入细胞提取物，第二步加入经化学固定的金黄色葡萄球菌，以确保形成大量沉淀。这些细菌通过蛋白质A和抗体形 成复合物，蛋白质A与免疫球蛋白的Fc部分有高度的亲和性。或者说，纯化的蛋白A结合Sephrarose树脂，为从细胞提取物中分离出抗原抗体复合物，提供一个固体基质。最后通过洗脱，除去尚未沉淀的杂质。 为了除去已破碎的或固定差的细胞，在用于免疫沉淀（作用）之前可以与纤细地金黄色葡萄球菌细胞，如果要用蛋白质ASephrarose树脂,参考厂家说明书。 9，硫酸铵沉淀法： 利用高浓度盐将蛋白质析出（盐析），选择硫酸按是因为：盐析有效性，pH范围广，溶解度高，溶液散热少，经济. 10， (低温)有机溶剂沉淀法： 强调低温（0-4度以下）是因为10度时蛋白会在有机溶剂中变性，可用乙醇，丙酮等。注意：Mg2+离子，pH值。 11，聚乙二醇（PEG）沉淀法： PEG是一个水溶性非离子多聚体，使用PEG时旨在个别情况下才会是蛋白质稍有变性！他溶解是散热低，形成沉淀的平衡时间短，通常达到30%时蛋白质就会达到最大量的沉淀。

含氯消毒剂对脊髓灰质炎病毒灭活试验方法的研究

文章编号:1001-7658(2004)10-0293-04 =论著> 含氯消毒剂对脊髓灰质炎病毒灭活试验方法的研究 王炜红 陈微娜 葛 洪 侯延文 林 玲 宋长江 (黑龙江省疾病预防控制中心,哈尔滨 150036) 提要 为研究含氯消毒剂对脊髓灰质炎病毒灭活试验方法,依照2002年版5消毒技术规范6规定的试验程序进行了实验室观察。结果,含有效氯800mg/L 的次氯酸钠、10mg/L 的优氯净和50mg/L 二氧化氯对Vero 细胞生存率无影响;用0.01mol/L PBS 配制的5g/L 硫代硫酸钠中和剂对Vero 细胞生存率无影响。用含5g/L 硫代硫酸钠中和剂对含有效氯400mg/L 的次氯酸钠设计的6组中和剂鉴定试验,结果符合设计要求。用该方法检测证明,以含有效氯400mg/L 次氯酸钠消毒剂,作用30min,对脊髓灰质炎病毒平均灭活对数值\4.0。试验发现,0.03mol/L 的PBS 、卵磷脂以及吐温80对Vero 细胞生存率均有影响。关键词 脊髓灰质炎病毒;中和剂;有效氯;灭活试验中图分类号:R187.2 文献标识码:A STUDY ON TEST METHOD FOR INAC TIVATION OF POLIOVIRUS BY C HLOR INE -C ONTAIN -ING DISINFECTANTS WANG Wei -hong,C HE N Wei -na,GE Hong ,HOU Yan -wen,LIN Ling ,SO NG Chang -jiang (Heilongjian g Provincial Center for Disease Prevention and Con trol,Harbin 150036,China) Abstract In order to study the test method for inactivation of poliovirus by chlorine-containing disinfectants,laboratory obser -vation was carried out according to the test procedures specified in 5Disinfection T echnical Guidelines 6,2002ed.The results showed that sodiu m hypochlochlorite containing available chlorine 800mg/L,10mg/L You-L -Ji ng ,50mg/L chlorine diox ide and 5g/L sodi um thiosulfate neutralizer reconsti tuted with 0.01mol/L PBS had no influence on survival rate of Vero cells.The results of neu tralizer identification test,in which 6groups were designed using 5g/L sodium thiosulfate as the neutralizer for 400mg/L sodiu m hypochlori te disinfectant,fulfilled the requirement of https://www.sodocs.net/doc/d013867997.html,ing this method,it was proved that sodium hypochlori te containi ng available chlorine 400mg/L with a 30min con tact time could inactivate polivirus wi th an average inacti va -tion logarithm \4.0.It was found by test that 0.03mg/L PBS,lecithin and tween 80had influence on survival rate of Vero cells.Key words p oliovirus ;neutralizer ;available chlorine;inactivation test 1作者简介2 王炜红(1958-),女,黑龙江哈尔滨市人,大学,副主任 医师,从事病毒防治、消毒学及医院感染控制工作。 2002年版5消毒技术规范6采用脊髓灰质炎病毒1型疫苗株作为病毒灭活试验代表,并规定了相应的试验方法。脊髓灰质炎病毒属无包膜小RNA 病毒,对外界理化因子抗力比较强,培养制备方法比较简单,在很多细胞内均可生长,用其作为评价消毒理化因子灭活指标国内外都有应用11,22。但在体外灭活试验中,很多试剂对细胞生长有不同程度的毒性,如消毒试验中的消毒剂、中和剂及稀释液等,给试验带来一定的困难。为了科学评价消毒剂对该病毒的灭活效果,依据5消毒技术规范6规定的试验程序,以含氯消毒剂为对象,在实验室研究了脊髓灰质 炎病毒的灭活试验方法。现将结果报告如下。1 方法 1.1病毒滴定方法 用Vero 细胞培养制备的脊髓灰质炎病毒1型疫苗株(军事医学科学院微生物流行病研究所提供)悬液,再用细胞维持液进行10倍系列稀释,每个稀释度接种(96孔培养板)4孔,置于37e 二氧化碳培养箱内培养。逐日观察结果,连续观察5d,记录细胞病变情况,计算半数细胞感染剂量(TCID 50)。1.2中和剂鉴定试验132 1.2.1预备试验 分别测定消毒剂、中和剂、中和产物对细胞生长的影响。1取次氯酸钠、优氯净和二氧化氯系列稀释液,分别接种于已经形成单层细胞 # 293#中国消毒学杂志2004年第21卷第4期

蛋白质提取方法

蛋白质提取方法-------列举10种方法 一、植物组织蛋白质提取方法（summer） 1、根据样品重量（1g样品加入3.5ml提取液，可根据材料不同适当加入），准备提取液放在冰上。 2、把样品放在研钵中用液氮研磨，研磨后加入提取液中在冰上静置（3-4 小时）。 3、用离心机离心8000rpm40min4℃或11100rpm20min4℃ 4、提取上清夜，样品制备完成。 蛋白质提取液：300ml 1、1Mtris-HCl（PH8）45ml 2、甘油（Glycerol）75ml 3、聚乙烯吡咯烷酮（Polyvinylpolypyrrordone）6g 这种方法针对SDS-PAGE，垂直板电泳！ 二、植物组织蛋白质提取方法(summer) 三氯醋酸—丙酮沉淀法 1、在液氮中研磨叶片 2、加入样品体积3倍的提取液在-20℃的条件下过夜，然后离心（4℃8000rpm以上1小时）弃上清。 3、加入等体积的冰浴丙酮（含0.07%的β-巯基乙醇），摇匀后离心（4℃8000rpm以上1 小时），然后真空干燥沉淀，备用。 4、上样前加入裂解液，室温放置30 分钟，使蛋白充分溶于裂解液中，然后离心（15℃8000rpm 以上1小时或更长时间以没有沉淀为标准），可临时保存在4℃待用。 5、用Brandford法定量蛋白，然后可分装放入-80℃备用。 药品： 提取液：含10%TCA 和0.07%的β-巯基乙醇的丙酮 裂解液：2.7g 尿素0.2gCHAPS 溶于3ml 灭菌的去离子水中（终体积为5ml），使用前再加入1M 的DTT65ul/ml。 这种方法针对双向电泳，杂质少，离子浓度小的特点！当然单向电泳也同样适用，只是电泳的条带会减少！ 三、组织：肠黏膜（newinbio） 目的：WESTERN BLOT检测凋亡相关蛋白的表达 应用TRIPURE 提取蛋白质步骤： 含蛋白质上清液中加入异丙醇：（1.5ml每1mlTRIPURE用量）倒转混匀，置室温10min 离心：12000 g，10min，4度，弃上清，加入0.3M盐酸胍/95％乙醇：（2ml每1mlTRIPURE 用量）振荡，置室温20min 离心：7500g，5 min，4 度，弃上清 重复0.3M盐酸胍/95％乙醇步2 次 沉淀中加入100％乙醇2ml 充分振荡混匀，置室温20 min 离心：7500g，5min，4度，弃上清吹干沉淀，1％SDS溶解沉淀 离心：10000g，10min，4度 取上清-20 度保存（或可直接用于WESTERN BLOT） 存在的问题：加入1％SDS 后沉淀不溶解，还是很大的一块，4 度离心后又多了白色沉定，SDS 结晶？测浓度，含量才1mg/ml左右。 解决：提蛋白试剂盒，另外组织大小适中，要碎，立即加2X BUFFER，然后煮5－10分钟，

蛋白纯化的一般原则及方法选择

随着分子生物学的发展，越来越多的科研人员熟练掌握了分子生物学的各种试验技术，并研制成套试剂盒，使基因克隆表达变得越来越容易lIl。但分子生物学的上游工作往往并非是最终目的，分子克隆与表达的关键是要拿到纯的表达产物，以研究其生物学作用，或者大量生产出可用于疾病治疗的生物制品。相对与上游工作来说，分子克隆的下游工作显得更难，蛋白纯化工作非常复杂，除了要保证纯度外，蛋白产品还必须保持其生物学活性。纯化工艺必须能够每次都能产生相同数量和质量的蛋白，重复性良好。这就要求应用适应性非常强的方法而不是用能得到纯蛋白的最好方法去纯化蛋白。在实验室条件下的好方法却可能在大规模生产应用中失败，因为后者要求规模化，且在每日的应用中要有很好的重复性。本文综述了蛋白质纯化的基本原则和各种蛋白纯化技术的原理、优点及局限性，以期对蛋白纯化的方法选择及整体方案的制定提供一定的指导。 1 蛋白纯化的一般原则 蛋白纯化要利用不同蛋白间内在的相似性与差异，利用各种蛋白间的相似性来除去非蛋白物质的污染，而利用各蛋白质的差异将目的蛋白从其他蛋白中纯化出来。每种蛋白间的大小、形状、电荷、疏水性、溶解度和生物学活性都会有差异，利用这些差异可将蛋白从混合物如大肠杆菌裂解物中提取出来得到重组蛋白。蛋白的纯化大致分为粗分离阶段和精细纯化阶段二个阶段。粗分离阶段主要将目的蛋白和其他细胞成分如DNA、RNA等分开，由于此时样本体积大、成分杂，要求所用的树脂高容量、高流速，颗粒大、粒径分布宽．并可 以迅速将蛋白与污染物分开，防止目的蛋白被降解。精细纯化阶段则需要更高的分辨率，此阶段是要把目的蛋白与那些大小及理化性质接近的蛋白区分开来，要用更小的树脂颗粒以提高分辨常用的离子交换柱和疏水柱，应用时要综合考虑树脂的选择性和柱效两个因素。选择性指树脂与目的蛋白结合的特异性，柱效则是指蛋白的各成分逐个从树脂上集中洗脱的能力，洗脱峰越窄，柱效越好。仅有好的选择性，洗脱峰太宽，蛋白照样不能有效分离。 2.各种蛋白纯化方法及优缺点 2.1蛋白沉淀蛋白能溶于水是因为其表面有亲水性氨基酸。在蛋白质的等电点处若溶液的离子强度特别高或特别低，蛋白则倾向于从溶液中析出。硫酸铵是沉淀蛋白质最常用的盐，因为它在冷的缓冲液中溶解性好，冷的缓冲液有利于保护蛋白的活性。硫酸铵分馏常用做纯化的第一步，它可以初步粗提蛋白质，去除非蛋白成分。蛋白质在硫酸铵沉淀中较稳定，可以短期在这种状态下保存中间产物，当前蛋白质纯化多采用这种办法进行粗分离翻。在规模化生产上硫酸铵沉淀方法仍存在一些问题，硫酸铵对不锈钢器具的腐蚀性很强。其他的盐如硫酸钠不存在这种问题，但其纯化效果不如硫酸铵。除了盐析外蛋白还可以用多聚物如PEG 和防冻剂沉淀出来，PEG是一种惰性物质，同硫酸铵一样对蛋白有稳定效果， 在缓慢搅拌下逐渐提高冷的蛋白溶液中的PEG浓度，蛋白沉淀可通过离心或过滤获得，蛋白可在这种状态下长期保存而不损坏。蛋白沉淀对蛋白纯化来说并不是多么好的方法，因为它只能达到几倍的纯化效果，而我们在达到目的前需要上千倍的纯化。其好处是可以把蛋白从混杂有蛋白酶和其他有害杂质的培养基及细胞裂解物中解脱出来。

蛋白质纯化的方法选择

蛋白质纯化的方法选择 随着分子生物学的发展，越来越多的科研人员熟练掌握了分子生物学的各种试验技术，并研制成套试剂盒，使基因克隆表达变得越来越容易。但分子生物学的上游工作往往并非是最终目的，分子克隆与表达的关键是要拿到纯的表达产物，以研究其生物学作用，或者大量生产出可用于疾病治疗的生物制品。相对与上游工作来说，分子克隆的下游工作显得更难，蛋白纯化工作非常复杂，除了要保证纯度外，蛋白产品还必须保持其生物学活性。纯化工艺必须能够每次都能产生相同数量和质量的蛋白，重复性良好。这就要求应用适应性非常强的方法而不是用能得到纯蛋白的最好方法去纯化蛋白。在实验室条件下的好方法却可能在大规模生产应用中失败，因为后者要求规模化，且在每日的应用中要有很好的重复性。本文综述了蛋白质纯化的基本原则和各种蛋白纯化技术的原理、优点及局限性，以期对蛋白纯化的方法选择及整体方案的制定提供一定的指导。 1、蛋白纯化的一般原则 蛋白纯化要利用不同蛋白间内在的相似性与差异，利用各种蛋白间的相似性来除去非蛋白物质的污染，而利用各蛋白质的差异将目的蛋白从其他蛋白中纯化出来。每种蛋白间的大小、形状、电荷、疏水性、溶解度和生物学活性都会有差异，利用这些差异可将蛋白从混合物如大肠杆菌裂解物中提取出来得到重组蛋白。蛋白的纯化大致分为粗分离阶段和精细纯化阶段二个阶段。粗分离阶段主要将目的蛋白和其他细胞成分如DNA、RNA等分开，由于此时样本体积大、成分杂，要求所用的树脂高容量、高流速，颗粒大、粒径分布宽．并可以迅速将蛋白与污染物分开，防止目的蛋白被降解。精细纯化阶段则需要更高的分辨率，此阶段是要把目的蛋白与那些大小及理化性质接近的蛋白区分开来，要用更小的树脂颗粒以提高分辨率，常用离子交换柱和疏水柱，应用时要综合考虑树脂的选择性和柱效两个因素。选择性树脂与目的蛋白结合的特异性，柱效则是指各蛋白成分逐个从树脂上集中洗脱的能力，洗脱峰越窄，柱效越好。仅有好的选择性，洗脱峰太宽，蛋白照样不能有效分离。 2、各种蛋白纯化方法及其优、缺点 2．1 蛋白沉淀蛋白能溶于水是因为其表面有亲水性氨基酸，在蛋白质的等电点处若溶液的离子强度特别高或者特别低，蛋白则倾向于从溶液中析出。硫酸铵是沉淀蛋白最常用的盐，因为它在冷的缓冲液中溶解性好，冷的缓冲液有利于保持目的蛋白的活性。硫酸铵分馏常用作试验室蛋白纯化的第一步，它可以初步粗提蛋白质，去除非蛋白成分。蛋白质在硫酸铵沉淀中较稳定，可以短期在这种状态下保存中间产物，当前蛋白质纯化多采用这种办法进行粗分离翻。在规模化生产上硫酸铵沉淀方法仍存在一些问题，硫酸铵对不锈钢器具的腐蚀性很强。其他的盐如硫酸钠不存在这种问题，但其纯化效果不如硫酸铵。除了盐析外蛋白还可以用多聚物如PEG和防冻剂沉淀出来，PEG是一种惰性物质，同硫酸铵一样对蛋白有稳定效果，在缓慢搅拌下逐渐提高冷的蛋白溶液中的PEG浓度，蛋白沉淀可通过离心或过滤获得，蛋白可在这种状态下长期保存而不损坏。蛋白沉淀对蛋白纯化来说并不是多么好的方法，因为它只能达到几倍的纯化效果，而我们在达到目的前需要上千倍的纯化。其好处是可以把蛋白从混杂有蛋白酶和其他有害杂质的培养基及细胞裂解物中解脱出来。 2．2 缓冲液的更换虽然更换缓冲液不能提高蛋白纯度，但它却在蛋白纯化方案中起着极其重要的作用。不同的蛋白纯化方法需要不同pH及不同离子强度的缓冲液。假如你用硫酸铵将蛋白沉淀出来，毫无疑问蛋白是处在高盐环境中，需要想办法脱盐，可用的方法有利用半透膜透析，通过勤换透析液体去除盐分，此法尚可，但需几个小时，通常要过夜，也难以用于大规模纯化中。新型的设备将透析膜夹在两个板中间，板的一侧加缓冲液，另一侧加需脱盐的蛋白溶液，并在蛋白溶液一侧通过泵加压，可以使两侧溶液在数小时内达到平衡，若增加对蛋白溶液的压力，还可迫使水分和盐更多通过透析膜进入透析液达到对蛋白浓缩的目的。也有出售的脱盐柱，柱内的填料是小孔径的颗粒，蛋白分子不能进入孔内，先于高浓度盐离子从柱中流出，从而使二者分离。蛋白纯化的每一步都会造成目的蛋白的丢失，缓冲液平衡的步骤尤甚。蛋白会结合在任何它能接触的表面上，剪切力、起泡沫和离子强度的快速变化很容易让蛋白失活。 2．3 离子交换色谱这是在所有的蛋白纯化与浓缩方法中最有效方法。基于蛋白与离子交换树脂间的相互电荷作用，通过选择不同的缓冲液，同一种蛋白既可以和阴离子交换树脂（能结合带负电荷的分子）结合，也可以和阳离子交换树脂结合。树脂所用的带电基团有四种：二乙基氨基乙基用于弱的阴离子交换树脂；羧甲基用于弱的阳离子交换树脂；季铵用于强阴离子交换树脂；甲基磺酸酯用于强阳离子交换树脂。蛋白质由氨基酸组成，氨基酸在不同的pH环境中所带总电荷不同。大多数蛋白在生理pH（pH6～8）下带负电荷，需用阴离子交换柱纯化，极端的pH下蛋白会变性失活．应尽量避免。由于在某个特定的pH下不同的蛋白所带电荷数不同，与树脂的结合力也不同，随着缓冲液中盐浓度的增加或pH的变化，蛋白按结合力的强弱被依次洗脱。在工业化生产中更多地是改变盐浓度而不是去改变pH值，因为前者更容易控制。在实验室中几乎总是用盐浓度梯度去洗脱离子交换柱，利用泵的辅助可以使流入柱的缓冲液中盐浓度平稳地上升，当离子强度能够中和蛋白的电荷时，蛋白就被从柱上洗脱下来。但在工业生产中盐浓度很难精确控制，所以常用分步洗脱而不足连续升高的盐梯度。与排阻层析相比，离子交换特异性更好，有更多的参数可以调整以获得最优的纯化效果，树脂也比较便宜。值得一提的是，即便是用最精确控制的条件，仅用离子交换单一的方法也得不到纯的蛋白，还需要其他的纯化步骤。

脊髓灰质炎病毒

如对您有帮助，可购买打赏，谢谢 脊髓灰质炎病毒 导语：病毒是种很可怕的东西，它能直接的损害人的身体健康。人们常说得什么都好就是不要得病，不但要花钱看病还折磨人的身体，一些小感冒还好，在 病毒是种很可怕的东西，它能直接的损害人的身体健康。人们常说得什么都好就是不要得病，不但要花钱看病还折磨人的身体，一些小感冒还好，在一些重大的疾病面前不管你有多少钱，你身份有多么珍贵，你都显得那么渺小。有些病甚至还可能会留下后遗症，让受害者一生都活在它的阴影下。 脊髓灰质炎病毒，光说这几个字可能大多数都不知道这是什么，其实这是小儿麻痹症的专业的叫法。也许有些人小的时候也曾经患过这种病，有的可能完全治好了，有的可能就没那么幸运，从而留下这种病的后遗症。 脊髓灰质炎病毒是引起脊髓灰质炎的病毒。该疾病传播广泛，是一种急性传染病。病毒常侵犯中枢神经系统，损害脊髓前角运动神经细胞，导致肢体松弛性麻痹，多见于儿童，故又名小儿麻痹症。 脊髓灰质炎病毒属于微小核糖核酸(RNA)病毒科(picornaviridae)的肠道病毒属(enterovirus)。脊髓灰质炎病毒侵犯人体主要通过消化道传播。此类病毒具有某些相同的理化生物特征，在电镜下呈球形颗粒相对较小，直径20～30nm，呈立体对称12面体。病毒颗粒中心为单股正链核糖核酸，外围32个衣壳微粒，形成外层衣壳，此种病毒核衣壳体裸露无囊膜。核衣壳含4种结构蛋白VP1、VP3和由VP0分裂而成的VP2和VP4。VP1为主要的外露蛋白至少含2个表位(epitope)，可诱导中和抗体的产生，VP1对人体细胞膜上受体(可能位于染色体19上)有特殊亲和力，与病毒的致病性和毒性有关。VP0最终分裂为VP2与VP4，为 常识分享，对您有帮助可购买打赏

脊髓灰质炎野病毒输入性疫情和疫苗衍生病毒等相关事件应急处置方案

附件2： 脊髓灰质炎野病毒输入性疫情和疫苗衍生病毒 相关事件应急处置技术方案 为及早发现输入性脊灰野病毒病例和疫苗衍生病毒循环（cVDPVs）病例，迅速采取应急措施阻断病毒的传播和循环，根据《中华人民共和国卫生行业标准-脊髓灰质炎诊断标准》（WS294-2008）、《脊髓灰质炎野病毒输入性疫情和疫苗衍生病毒相关事件应急预案（试行）》、《高危AFP病例和聚集的临床符合病例调查指南》、《全国急性弛缓性麻痹（AFP）病例监测方案》（以下简称《监测方案》）、《甘肃省脊髓灰质炎野病毒输入性疫情和疫苗衍生病毒相关事件应急预案》（以下简称《甘肃省应急预案》），特制定本方案。 一、目的 （一）及时发现脊灰疫苗衍生病毒（VDPVs）、脊灰疫苗衍生病毒循环（cVDPVs）和脊灰野病毒，并迅速采取有效措施，阻断病毒的传播和循环。 （二）规范高危急性弛缓性麻痹（AFP）病例、脊灰临床符合病例以及脊灰疫苗高变异株病例的调查处置。 二、适用范围 本技术方案适用于高危AFP病例、脊灰临床符合病例、VDPVs、cVDPVs和脊灰野病毒的报告、调查和处置工作。 三、脊髓灰质炎疾病概述 （一）病原学

脊灰病毒属于小核糖核酸病毒科、肠道病毒属，按其抗原性不同，可分为Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ 3个血清型，型间无交叉免疫。流行病学资料表明，Ⅰ型野病毒引起的传播约占80%～90%，其次为Ⅲ型野病毒，目前世界上已无Ⅱ型野病毒引起的病例。 脊灰病毒在遇热、甲醛、氯和紫外线时迅速失去活力。对乙醚不敏感，对热和干燥甚敏感。使用甲醛、2%碘酊、升汞和各种氧化剂如过氧化氢、漂白粉、高锰酸钾等，均能使其灭活。 （二）流行病学 1.传染源 脊灰的传染源为病人、隐性感染者和病毒携带者。由于病毒携带者、无症状的隐性感染和无麻痹型患者不易被发现，因此在传播该病上起重要作用。本病的潜伏期为2～35天，一般为7～14天。患者自潜伏期末至发病后3～4周都有传染性，发病1～2周排毒率最高，可从70%以上的患者大便中分离出病毒，退热后传染性减小。病毒主要存在于患者的脊髓和脑部，在鼻咽部、肠道粘膜与淋巴结内亦可查到。 2.传播途径 感染者一般通过大便排出病毒，数量多且持续时间长，可达数周至数月；粪—口途径是本病的主要传播途径，在发病的早期咽部排毒可经飞沫传播。

脊髓灰质炎相关知识

脊髓灰质炎相关知识 新疆维吾尔自治区卫生厅通报和田地区发生一起脊髓灰质炎野病毒疑似输入性疫 情 新疆维吾尔自治区卫生厅8月26日通报，新疆和田地区发生一起脊髓灰质炎（以下简称“脊灰”）野病毒疑似输入性疫情。 通报称，此次疫情累计报告4例病例，年龄在4月龄至2岁之间，分布于和田地区的3个县市（和田市2例，洛浦县和于田县各1例），发病集中在2011年7月3日至7月19日期间。目前，4例病例中已有2人出院，2人仍在住院治疗，没有生命危险。病例出现后，自治区疾病预防控制中心立即采集了病例标本并送中国疾病预防控制中心国家脊髓灰质炎实验室开展相关病例标本基因测序。8月25日中国疾控中心基因测序和复核检测结果显示，相关病例感染了疑似由境外输入的I型脊灰野病毒。疫情相关溯源工作正在进行中。 脊髓灰质炎概述 脊髓灰质炎(简称脊灰，俗称为小儿麻痹)是由脊灰病毒引起，主要通过粪----口途径传播的急性传染病。主要影响年幼的儿童。病毒通过受污染的食物和水传播,经口腔进入体内并在肠道内繁殖。90%以上受感染的人没有症状，为亚临床型经过，但他们排泄的粪便带有病毒，因此传染给他人。约1％－1‰的感染者出现急性单侧性（或双侧的）弛缓性麻痹。少数感染者出现发热、疲乏、头痛、呕吐、颈部僵硬以及四肢疼痛等症状。仅有极少数感染者，由于病毒侵袭神经系统导致不可逆转的瘫痪。在瘫痪病例中，5%—10%的患者因呼吸肌麻痹而死亡。 脊灰野病毒是区别于疫苗病毒、外环境自然存在的能引起人类发病的脊灰病毒。目前疫苗可以预防脊灰野病毒的传播。 脊灰野病毒：又称为脊髓灰质炎野病毒，这里的野是没有驯化的意思，意思是可以通过感染人类，对人类造成伤害，伤害的主要部位是脊髓前角的灰质部分，造成支配肢体运动神经受损导致肢体肌肉萎缩。 我们的减毒脊髓灰质炎疫苗（OPV），是经过驯化后的野病毒，不具有或很少（百万分之一）具有对人类造成伤害的能力，但能够起到保护人类不受野病毒感染而受伤害的能力，可以称为“家病毒”。 脊灰主要影响5岁以下儿童。但如果人群抗体水平低，也可引起大年龄组儿童以及成人发病。 只要有一个国家有脊灰病毒的传播，所有国家的儿童就都有感染该病的危险。受感染的人口流动，可造成脊灰病毒跨地区或跨境传播，并可在未接受免疫接种的人群中迅速传播蔓延。

2沉淀分离技术

第二讲沉淀分离技术 2 学时 ※、通过本章学习应掌握的内容 1、什么是沉析？ 2、沉析法纯化蛋白质的优点有哪些？ 3、沉析的一般操作步骤是什么？ 4、何谓盐析？其原理是什么？ 5、盐析操作时常用的盐是什么？ 6、影响盐析的主要因素有哪些？ 7、有机溶剂沉析法的原理是什么？ 8、影响有机溶剂沉析的主要因素有哪些？ 9、等电点沉析的工作原理是什么？ 10、其它常用的沉析方法有哪些？ 、沉淀分离的目的及其方法 沉淀分离技术是经典的化学分离技术。沉淀的概念是指溶液中的介质在适当条件下由液相变成固相而析出的过程。 沉淀技术的目的包括两个：⑴通过沉淀使目标成分达到浓缩和去杂质的目

的。当目标成分是以固相形式回收时，固液分离可除去留在溶液中的非必要 成分；如果目标成分是以液相形式回收时，固液分离可使不必要的成分以沉淀形式去除。⑵通过沉淀可使已纯化的产品由液态变成固态，有利于保存和进一步的加工处理。沉淀分离技术通常包括下列各种沉淀方法： ⑴无机沉淀剂沉淀分离法：通常是以盐类作为沉淀剂的一类沉淀方法，如盐析法， 多用于各种蛋白质和酶类的分离纯化，以及某些金属离子的去除。常用的沉淀剂 有：硫酸铵、硫酸钠、柠檬酸钠、氯化纳等。 ⑵有机沉淀剂沉淀分离法：以有机溶剂作为沉淀剂的一种沉淀分离方法，多用于生物小分子、多糖及核酸类产品的分离；有时也用于蛋白质的沉淀和金属离子的去除；用于酶的沉淀分离时，易导致酶的失活。常用到的沉淀剂有：丙酮、乙醇、甲 醇等。 ⑶非离子多聚体沉淀剂沉淀分离法：采用非离子型的多聚体作为目标成分的沉淀剂，适用于生物大分子的沉淀分离，如酶、核酸、蛋白质、病毒、细菌等。典型的 非离子型多聚体是聚乙二醇（PEG），根据其相对分子量的大小, 有PEG600、 PEG4OO0 PEG20000等型号。 ⑷等电点沉淀法：主要是利用两性电解质在等电点状态下的溶解度最低而沉淀析出的原理。适用于氨基酸、蛋白质及其它属于两性电解质组分的沉淀分离，如大豆蛋 白“碱提酸沉”的提取方法。 ⑸共沉淀分离法：又可称为生物盐复合物沉淀法，用于多种化合物特别是一 些小分子物质的沉淀。它是利用沉淀的同时对其它待分离成份吸附共沉淀而 达到除杂的目的

蛋白质沉淀浓缩方法原理及详细解析之令狐文艳创作

蛋白质沉淀浓缩方法原理及详细解析 令狐文艳 在生化制备中，沉淀主要用于浓缩目的，或用于除去留在液相或沉淀在固相中的非必要成分。在生化制备中常用的有以下几种沉淀方法和沉淀剂： 1．盐析法多用于各种蛋白质和酶的分离纯化。 2．有机溶剂沉淀法多用于生物小分子、多糖及核酸产品的分离纯化，有时也用于蛋白质沉淀。 3．等电点沉淀法用于氨基酸、蛋白质及其它两性物质的沉淀。但此法单独应用较少，多与其它方法结合使用。 4．非离子多聚体沉淀法用于分离生物大分子。 5．生成盐复合物沉淀用于多种化合物，特别是小分子物质的沉淀。 6．热变性及酸碱变性沉淀法用于选择性的除去某些不耐热及在一定PH值下易变性的杂蛋白。 第一节盐析法 一般来说，所有固体溶质都可以在溶液中加入中性盐而沉淀析出，这一过程叫盐析。在生化制备中,许多物质都可以用盐析法进行沉淀分离，如蛋白质、多肽、多糖、核酸等，其中以蛋白质沉淀最为常见，特别是在粗提阶段。 盐析法分为两类，第一类叫Ks分段盐析法，在一定PH和温度下通过改变离子强度实现，用于早期的粗提液；第二种叫Kb分段盐析法，在一定离子强度下通过改变PH和温度来实现，用于后期进一步分离纯化和结晶。 一．影响盐析的若干因素 1．蛋白质浓度 高浓度蛋白溶液可以节约盐的用量，但许多蛋白质的b 和Ks常数十分接近，若蛋白浓度过高，会发生严重的共沉淀作用；在低浓度蛋白质溶液中盐析，所用的盐量较多，而共沉淀作用比较少，因此需要在两者之间进行适当选择。用于分步分离提纯时，宁可选择稀一些的蛋白质溶液，多加一点中性盐，使共沉淀作用减至最低限度。一般认为2.5%-3.0%的蛋白质浓度比较适中。 2．离子强度和类型 一般说来，离子强度越大，蛋白质的溶解度越低。在进行分离的时候，一般从低离子强度到高离子强度顺次进行。每一组分被盐析出来后，经过过滤或冷冻离心收集，再在溶液中逐渐提高中性盐的饱和度，使另一种蛋白质组分盐析出来。

蛋白质沉淀浓缩方法原理及详细解析

蛋白质沉淀浓缩方法原理及详细解析 在生化制备中，沉淀主要用于浓缩目的，或用于除去留在液相或沉淀在固相中的非必要成分。在生化制备中常用的有以下几种沉淀方法和沉淀剂： 1．盐析法多用于各种蛋白质和酶的分离纯化。 2．有机溶剂沉淀法多用于生物小分子、多糖及核酸产品的分离纯化，有时也用于蛋白质沉淀。 3．等电点沉淀法用于氨基酸、蛋白质及其它两性物质的沉淀。但此法单独应用较少，多与其它方法结合使用。 4．非离子多聚体沉淀法用于分离生物大分子。 5．生成盐复合物沉淀用于多种化合物，特别是小分子物质的沉淀。 6．热变性及酸碱变性沉淀法用于选择性的除去某些不耐热及在一定PH值下易变性的杂蛋白。 第一节盐析法 一般来说，所有固体溶质都可以在溶液中加入中性盐而沉淀析出，这一过程叫盐析。在生化制备中,许多物质都可以用盐析法进行沉淀分离，如蛋白质、多肽、多糖、核酸等，其中以蛋白质沉淀最为常见，特别是在粗提阶段。 盐析法分为两类，第一类叫Ks分段盐析法，在一定PH和温度下通过改变离子强度实现，用于早期的粗提液；第二种叫Kb分段盐析法，在一定离子强度下通过改变PH和温度来实现，用于后期进一步分离纯化和结晶。 一．影响盐析的若干因素 1．蛋白质浓度 高浓度蛋白溶液可以节约盐的用量，但许多蛋白质的b 和Ks常数十分接近，若蛋白浓度过高，会发生严重的共沉淀作用；在低浓度蛋白质溶液中盐析，所用的盐量较多，而共沉淀作用比较少，因此需要在两者之间进行适当选择。用于分步分离提纯时，宁可选择稀一些的蛋白质溶液，多加一点中性盐，使共沉淀作用减至最低限度。一般认为%%的蛋白质浓度比较适中。 2．离子强度和类型

一般说来，离子强度越大，蛋白质的溶解度越低。在进行分离的时候，一般从低离子强度到高离子强度顺次进行。每一组分被盐析出来后，经过过滤或冷冻离心收集，再在溶液中逐渐提高中性盐的饱和度，使另一种蛋白质组分盐析出来。 离子种类对蛋白质溶解度也有一定影响，离子半径小而很高电荷的离子在盐析方面影响较强，离子半径大而低电荷的离子的影响较弱，下面为几种盐的盐析能力的排列次序：磷酸钾>硫酸钠>磷酸铵>柠檬酸钠>硫酸镁。 3．PH值 一般来说，蛋白质所带净电荷越多溶解度越大，净电荷越少溶解度越小，在等电点时蛋白质溶解度最小。为提高盐析效率，多将溶液PH值调到目的蛋白的等电点处。但必须注意在水中或稀盐液中的蛋白质等电点与高盐浓度下所测的结果是不同的，需根据实际情况调整溶液PH值，以达到最好的盐析效果。 4．温度 在低离子强度或纯水中，蛋白质溶解度在一定范围内随温度增加而增加。但在高浓度下，蛋白质、酶和多肽类物质的溶解度随温度上升而下降。在一般情况下，蛋白质对盐析温度无特殊要求，可在室温下进行，只有某些对温度比较敏感的酶要求在0-4℃进行。 二．硫酸铵的使用 硫酸铵中常含有少量的重金属离子，对蛋白质巯基有敏感作用，使用前必须用H2S处理：将硫酸铵配成浓溶液，通入H2S饱和，放置过夜，用滤纸除去重金属离子，浓缩结晶，100℃烘干后使用。另外，高浓度的硫酸铵溶液一般呈酸性（PH=左右），使用前也需要用氨水或硫酸调节至所需PH。 硫酸铵的加入有以下几种方法：1）加入固体盐法用于要求饱和度较高而不增大溶液体积的情况；2）加入饱和溶液法用于要求饱和度不高而原来溶液体积不大的情况；3）透析平衡法先将盐析的样品装于透析袋中，然后浸入饱和硫酸铵中进行透析，透析袋内硫酸铵饱和度逐渐提高，达到设定浓度后，目的蛋白析出，停止透析。该法优点在于硫酸铵浓度变化有连续性，盐析效果好，但手续烦琐，需不断测量饱和度，故多用于结晶，其它情况少见。 使用固体硫酸铵时：1）必须注意饱和度表中规定的温度，一般有0℃或室温两种，加入固体盐后体积的变化已考虑在表中；2）分段盐析中，应考虑每次分段后蛋白质浓度的变化。一种蛋白质如经二次透析，一般来说，第一次盐析分离范围（饱和度范围）比较宽，第二次分离范围较窄。3）盐析后一般放置半小时至一小时，待沉淀完全后才过滤或离心。过滤多用于高浓度硫酸铵溶液，因为此种情况下，硫酸铵密度较大，若用离心法需要较高离心速度和长时间的离心操作，耗时耗能。离心多用于低浓度硫酸铵溶液。 第二节有机溶剂沉淀法 有机溶剂的沉淀机理是降低水的介电常数，导致具有表面水层的生物大分子脱水，相