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DNA分子标记及其优缺点

DNA分子标记种类及相应的优缺点

摘要：对RFLP、RAPD、AFLP、SSR、ISSR 等常用的DNA 分子标记技术以及其他几种新兴的标记技术( SNP、EST 等) 的原理、特点进行了综述,并对各自的优缺点进行了探讨。

关键词：DNA分子标记优缺点

分子标记是继形态标记、细胞标记和生化标记之后发展起来的一种较为理想的遗传标记形式,它以蛋白质、核酸分子的突变为基础,检测生物遗传结构与其变异。分子标记技术从本质上讲,都是以检测生物个体在基因或基因型上所产生的变异来反映生物个体之间的差异。每一种分子标记都有其自身的特点和特定的应用范围,但就一般意义而言,DNA 分子标记与形态标记和生化标记等相比,具有许多独特的优点: ①不受组织类别、发育阶段等影响。植株的任何组织在任何发育时期均可用于分析。②不受环境影响。因为环境只影响基因表达(转录与翻译) ,而不改变基因结构即DNA 的核苷酸序列。③标记数量多,遍及整个基因组。④多态性高,自然存在许多等位变异。⑤有许多标记表现为共显性,能够鉴别纯合基因型和杂合基因型, 提供完整的遗传信息。⑥DNA 分子标记技术简单、快速、易于自动化。⑦提取的DNA 样品,在适宜条件下可长期保存,这对于进行追溯性或仲裁性鉴定非常有利。因此,DNA 分子标记可以弥补和克服在形态学鉴定及同工酶、蛋白电泳鉴定中的许多缺陷和难题,因而在品种鉴定方面展示了广阔的应用前景。

1. 1 第1 代分子标记

1.1. 1 RFLP 标记技术。1980 年Botesin提出的限制性片段长度多态性

(Restriction fragment length polymorphisms ,RFLP) 可以作为遗传标记,开创了直接应用DNA 多态性的新阶段,是最早应用的分子标记技术。RFLP 是检测DNA 在限制性内切酶酶切后形成的特定DNA 片段的大小,反映DNA 分子上不同酶切位点的分布情况,因此DNA 序列上的微小变化,甚至1 个核苷酸的变化,也能引起限制性内切酶切点的丢失或产生, 导致酶切片段长度的变化。

优点：RFLP 标记的等位基因具有共显性的特点,结果稳定可靠,重复性好,特别

适应于构建遗传连锁图。

缺点：在进行RFLP 分析时,需要该位点的DNA片段做探针,用放射性同位素及核

酸杂交技术,既不安全又不易自动化。另外,RFLP 对DNA 多态性检出的灵敏度不高,RFLP 连锁图上还有很多大的空间区。

1.1. 2 RAPD 标记技术。为了克服RFLP 技术上的缺点,Williams等于1990

年建立了随机扩增多态DNA (Randomamplified polymorphic DNA ,RAPD) 技术,由于其独特的检测DNA 多态性的方式使得RAPD 技术很快渗透于基因研究的各个领域。RAPD 是建立于PCR 基础之上的分子标记技术,基本原理是利用一个随机引物(8～10 个碱基) 通过PCR 反应非定点地扩增DNA 片段,然后用凝胶电泳分

离扩增片段来进行DNA 多态性研究。对任一特定引物而言,它在基因组DNA 序列上有其特定的结合位点,一旦基因组在这些区域发生DNA 片段插入、缺失或碱基突变,就可能导致这些特定结合位点的分布发生变化,从而导致扩增产物的数量和大小发生改变,表现出多态性。

优点：与RFLP 相比,RAPD 技术简单,检测速度快,DNA 用量少,实验设备简单,

不需DNA 探针,设计引物也不需要预先克隆标记或进行序列分析,不依赖于种属特异性和基因组的结构,合成一套引物可以用于不同生物基因组分析,用一个引物就可扩增出许多片段,而且不需要同位素,安全性好。

缺点：当然,RAPD 技术受许多因素影响,实验的稳定性和重复性差,首先是显性

遗传,不能识别杂合子位点,这使得遗传分析相对复杂 ,在基因定位、作连锁遗传图时,会因显性遮盖作用而使计算位点间遗传距离的准确性属特异性和基因组的结构,合成一套引物可以用于不同生物基因组分析,用一个引物就可扩增出许多片段,而且不需要同位素,安全性好。当然,RAPD 技术受许多因素影响,实验的稳定性和重复性差,首先是显性遗传,不能识别杂合子位点,这使得遗传分析相对复杂 ,在基因定位、作连锁遗传图时,会因显性遮盖作用而使计算位点间遗传距离的准确性下降;其次,RAPD 对反应条件相当敏感,包括模板浓度、Mg2 +浓度,所以实验的重复性差。

1. 1. 3 AFLP 标记技术。扩增片段长度多态技术(AFLP) ,又名限制片段

选择扩增技术(Selective restriction fragment amplifi2cation ,SRFA) ,于1993 年由荷兰KEYGENE 公司的Zabean 和Vos 等发明,并已申请专利。AFLP 是近年来迅速发展起来的一种分子标记技术,它将基因组DNA 用成对的限制性内切酶双酶切后产生的片段用接头(与酶切位点互补) 连接起来,并通过5′端与接头互补的半特异性引物扩增得到大量DNA 片段,从而形成指纹图谱的分子标记技术。AFLP 指纹呈孟德尔式共显性和显隐性遗传。

优点：它兼具RAPD 与RFLP 的优点,有较高的稳定性,用少量的选择性引物能在

较短时间内检测到大量位点,并且每对引物所检测到的多个位点都或多或少地随机分布在多条染色体上,各染色体上AFLP 标记的数目与染色体长度呈正相关( r = 0. 501) ,而一对引物获得的标记涉及的染色体数与标记数呈正相关( r = 0. 826) 。因此,通过少量效率高的引物组合,可获得覆盖整个基因组的AFLP 标记。目前,AFLP 作为一种高效的指纹技术,已在遗传育种研究中发挥它的优势。

缺点：不过也有研究认为,AFLP 对基因组纯度和反应条件要求较高,另外用于遗

传作图时,少数的标记与图谱紧密度有出入。此外, 在RAPD 和RFLP 技术基础上建立了SCAR(Sequence characterize damplified regions ,序列特异性扩增区域) 、CAPS(Cleaved ampli2fied polymorphic sequence ,酶切扩增多态序列) 和DAF(DNA am2plified fingerprints ,DNA 扩增指纹) 等标记技术。这些技术的出现,进一步丰富、完善了第1 代分子标记技术,增加了人们对DNA 多态性的研究手段。

1. 2 第2 代分子标记

1. 2. 1 SSR 标记技术。在真核生物基因组中存在许多非编码的重复序列,

如重复单位长度在15～65 个核苷酸的小卫星DNA(Minisatellite DNA) ,重复单位长度在2～6 个核苷酸的微卫星DNA (Microsatellite DNA) 。小卫星和微卫星DNA 分布于整个基因组的不同位点。由于重复单位的大小和序列不同以拷贝数不同,从而构成丰富的长度多态性。Moore 等于1991 年结合PCR 技术创立了SSR (Simple sequence repeat ,简单重复序列) 标记技术。SSR 也称微卫星DNA ,是一类由几个(多为1～5 个) 碱基组成的基序串联重复而成的DNA 序列,其中最常见的是双核苷酸重复,即(CA) n和(TG) n ,每个微卫星DNA 的核心序列结构相同,重复单位数目10～60 个,其高度多态性主要来源于串联数目的不同。不同遗传材料重复次数不同,导致了SSR 长度的高度变异性,这一变异性正是SSR 标记产生的基础。SSR 标记的基本原理:根据微卫星重复序列两端的特定短序列设计引物,通过PCR 反应扩增微卫星片段。由于核心序列重复数目不同,因而扩增出不同长度的PCR 产物,这是检测DNA 多态性的一种有效方法。微卫星序列在群体中通常具有很高的多态性,而且一般为共显性,因此是一类很好的分子标记。目前已利用微卫星标记构建了人类、小鼠、大鼠、水稻、小麦、玉米等物种的染色体遗传图谱。

优点：这些微卫星标记已被广泛应用于基因定位及克隆、疾病诊断、亲缘分析

或品种鉴定、农作物育种、进化研究等领域。此外,SSR 标记不仅能够鉴定纯合体和杂合体,而且结果更加可靠,方法简单,省时省力。

1. 2. 2 ISSR 标记技术。ISSR 即内部简单重复序列,是一种新兴的分子

标记技术。1994 年Zietkiewicz 等对SSR 技术进行了发展,建立了加锚微卫星寡核苷酸(Anchored microsatellite oligo nucleotides) 技术。他们用加锚定的微卫星寡核苷酸作引物,即在SSR 的5′端或3′端加上2～ 4 个随机选择的核苷酸,这可引起特定位点退火,从而导致与锚定引物互补的间隔不太大的重复序列间的基因组节段进行PCR 扩增。这类标记又被称为ISSR ( Inter2simple sequence repeat ) 、ASSR(Anchored simple sequence repeats) 或AMP2PCR 。在所用的两翼引物中,可以一个是ASSR 引物,另一个是随机引物。如果一个是5′端加锚的ASSR 引物,另一个是随机引物,则被称为RAMP 技术[19] 。用于

ISSR2PCR 扩增的引物通常为16～18 个碱基序列,由1～4 个碱基组成的串联重复和几个非重复的锚定碱基组成,从而保证了引物与基因组DNA 中SSR 的5′或3′末端结合,通过PCR 反应扩增SSR 之间的DNA 片段。

优点：SSR 在真核生物中的分布是非常普遍的,并且进化变异速度非常快,因而

锚定引物的ISSR2PCR 可以检测基因组许多位点的差异。与SSR2PCR 相比,用于ISSR2PCR 的引物不需要预先的DNA 测序,也正因如此,有些ISSR 引物可能在特定基因组DNA 中没有配对区域而无扩增产物,通常为显性标记,呈孟德尔式遗传,且具有很好的稳定性和多态性。

1. 3 第3 代分子标记

1. 3. 1 SNP 标记技术。单核苷酸多态性(Single nucleotide

polymorphism ,SNP) 被称为第3 代DNA 分子标记,是指同一位点的不同等位基因之间个别核苷酸的差异,这种差异包括单个碱基的缺失或插入,更常见的是单个核苷酸的替换,且常发生在嘌呤碱基(A 与G) 和嘧啶碱基(C 与T) 之间。SNP 标记可帮助区分两个个体遗传物质的差异,被认为是应用前景最好的遗传标记。目前,已有2 000 多个标记定位于人类染色体上,在拟南芥上也已发展出236 个SNP 标记。在这些SNP 标记中大约有30 %包含限制性位点的多态性。

优点：检测SNP 的最佳方法是DNA 芯片技术,最新报道的微芯片电泳(Microchip

electrophoresis) ,可以高速度地检测临床样品的SNP ,它比毛细管电泳和板电泳的速度可分别提高10 和50倍。SNP 与第1 代的RFLP 及第2 代的SSR 标记的不同有2 个方面:其一,SNP 不再以DNA 片段的长度变化作为检测手段,而直接以序列变异作为标记;其二,SNP 标记分析完全摒弃了经典的凝胶电泳,代之以最新的DNA 芯片技术。

1. 3. 2 EST 标记技术。表达序列标签( Expressed sequence Tag , EST)

是美国国立卫生研究院(National Institutes of Health ,NIH) 的生物学家Venter 于1991 年提出的。随着人类基因组计划的开展,EST 技术首先被广泛应用于寻找人类新基因,绘制人类基因组图谱,识别基因组序列编码区等研究领域,之后又被广泛应用于植物基因组研究。EST 是指在来源于不同组织的cDNA 文库中随机挑选克隆、测序,得到部分cDNA 序列,一个EST对应于某一种mRNA 的cDNA 克隆的一段序列,长度一般为150～500 bp ,只含有基因编码区域。

优点：EST可代表生物体某种组织某一时间的一个表达基因,所以被称之为“表

达序列标鉴”;而EST的数目则显示出其代表的基因表达的拷贝数,一个基因的表达次数越多,其相应的cDNA 克隆越多,所以通过对cDNA 克隆的测序分析可以了解基因的表达丰度。目前构建cDNA 文库一般都使用试剂盒,方法成熟,而且飞速发展的DNA 测序技术,也使得进一步降低大规模DNA 序列测定成本成为可能。

4 展望

DNA分子标记技术的开发虽然只有短短20 年左右的历史,但已取得了巨大的进展。分子标记技术的广泛应用最重要的影响因素是成本与效益。随着分子标记技术的发展, 它已接近程序化而变得易于实施。但在实践中还有许多问题急需解决，例如如何采用更易为育种家们接受的简便、实用的分子标记( SSR、RAPD 等) 来构建新的连锁图,更多重要农艺性状基因的精细定位、检测过程自动化的实现、分子标记技术与常规育种经验的结合等。我们相信,随着这些问题的圆满解

决,DNA分子标记技术必然会有突破性的进展。

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分子标记

分子标记 3分（内容丰富）编辑词条分子标记技术在搜搜百科中为本词条的同义词，已为您做自动跳转。摘要 Molecular Markers 【分子标记的概念】分子标记是以个体间遗传物质内核苷酸序列变异为基础的遗传标记，是DNA 水平遗传多态性的直接的反映。与其他几种遗传标记——形态学标记、生物化学标记、细胞学标记相比，DNA分子标记具有的优越性有：大多数分子标记为共显性，对隐性的性状的选择十分便利；基因组变异极其丰富，分子标记的数量几乎是无限的；在生物发育的不同阶段，不同组织的DNA都可用于标记分析；分子标记揭示来自DNA的变异；表现为中性，不影响目标性状的表达，与不良性状无连锁；检测手段简单、迅速。随着分子生物学技术的发展，现在DNA分子标记技术已有数十种，广泛应用于遗传育种、基因组作图、基因定位、物种亲缘关系鉴别、基因库构建、基因克隆等方面。分子标记的概念有广义和狭义之分。广义的分子标记是指可遗传的并可检测的DNA序列或蛋白质。狭义分子标记是指能反映生物个体或种群间基因组中某种差异的特异性DNA片段。理想的分子标记必须达以下几个要求：(1) 具有高的多态性；(2) 共显性遗传，即利用分子标记可鉴别二倍体中杂合和纯合基因型；(3) 能明确辨别等位基因；(4) 遍布整个基因组；(5) 除特殊位点的标记外，要求分子标记均匀分布于整个基因组；(6) 选择中性(即无基因多效性)；(7) 检测手段简单、快速(如实验程序易自动化)；(8) 开发成本和使用成本尽量低廉；(9) 在实验室内和实验室间重复性好(便于数据交换)。但是，目前发现的任何一种分子标记均不能满足以所有要求。【分子标记的种类】一、基于分子杂交技术的分子标记技术此类标记技术是利用限制性内切酶解及凝胶电泳分离不同的生物 DNA 分子，然后用经标记的特异 DNA 探针与之进行杂交，通过放射自显影或非同位素显色技术来揭示 DNA 的多态性。 ①限制性片段长度多态性(Restriction Fragment Length Polymorphism，RFLP) 1974年Grodzicker等创立了限制性片段长度多态性(RFLP)技术，它是一种以DNA—DNA杂交为基础的第一代遗传标记。RFLP基本原理：利用特定的限制性内切酶识别并切割不同生物个体的基因组DNA，得到大小不等的DNA片段，所产生的DNA数目和各个片段的长度反映了DNA分子上不同酶切位点的分布情况。通过凝胶电泳分析这些片段，就形成不同带，然后与克隆DNA探针进行Southern

分子遗传学名词解释

2014分子遗传学复习一、名词解释 1、结构基因（Structural gene）：可被转录形成mRNA，并进而翻译成多肽链，构成各种结构蛋白质，催化各种生化反应的酶和激素等。 2、调节基因（Regulatory gene）：指某些可调节控制结构基因表达的基因，合成阻遏蛋白和转录激活因子。其突变可影响一个或多个结构基因的功能，或导致一个或多个蛋白质（或酶）量的改变。 3、基因组(genome)：基因组（应该）是整套染色体所包含的DNA分子以及DNA 分子所携带的全部遗传指令。或单倍体细胞核、细胞器或病毒粒子所含的全部DNA或RNA。 4、C值悖理(C-v a l u e p a r a d o x)：生物基因组的大小同生物在进化上所处的地位及复杂性之间无严格的对应关系，这种现象称为C值悖理(C——value paradox)。 N值悖理（N-v a l u e p a r a d o x）：物种的基因数目与生物进化程度或生物复杂性的不对应性，这被称之为N（number of genes）值悖理(N value paradox)或G（number of genes）值悖理。 5、基因家族(gene family)：由同一个祖先基因经过重复(duplication)与变异进化而形成结构与功能相似的一组基因，组成了一个基因家族。 6、孤独基因（orphon）：成簇的多基因家族的偶尔分散的成员称为孤独基因（orphon) 。 7、假基因(pseudogene): 多基因家族经常包含结构保守的基因，它们是通过积累突变产生，来满足不同的功能需要。在一些例子中，突变使基因功能完全丧失，这样的无功能的基因拷贝称为假基因，经常用希腊字母表示 8、①卫星DNA（Satellite DNA）：是高等真核生物基因组重复程度最高的成分，由非常短的串联多次重复DNA序列组成。 ②小卫星DNA(Minisatellite DNA) ：一般位于端粒处，由几百个核苷酸对的单元重复组成。 ③微卫星DNA (Microsatellite DNA)：由2－20个左右的核苷酸对的单元重复成百上千次组成。 ④隐蔽卫星DNA(cryptic satellite DNA)：用密度梯度离心分不出一条卫星带，但仍然存在于DNA主带中的高度重复序列 9、DNA指纹(DNA fingerprints)：小卫星DNA是高度多态性的，不同个体，各自不同。但其中有一段序列则在所有个体中都一样，称为“核心序列”，如果把核心序列串联起来作为探针，与不同个体的DNA进行分子杂交，就会呈现出各自特有的杂交图谱，它们和人的手纹一样，具有专一性和特征性，因个体而异，因而称为“DNA指纹”。 10、超基因(super gene) ：是指真核生物基因组中紧密连锁的若干个基因座，它们作用于同一性状或一系列相关性状。超基因家族（supergene family）：是DNA序列相似，但功能不一定相关的若干个单拷贝基因或若干组基因家族的总称。 11、单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism，SNP)：主要是指基因组水平上由单个核苷酸的变异所引起的DNA顺序多态性。它是人类可遗传变异中最常见的一种，占所有已知多态性的90％以上。 12、遗传标记（Genetic marker）：可示踪染色体、染色体片段、基因等传递轨

DNA分子标记技术及其应用

DNA分子标记技术及其应用摘要：分子遗传标记是近年来现代遗传学发展较快的领域之一。本文系统阐述了DNA分子标记的概念，以及RFLP、RAPD、ALFP、STS、SSR和SNP为代表的分子标记技术的原理和主要方法，并简单介绍了DNA分子标记技术的应用。最后探讨了其进展以及存在的一些问题。关键词：分子标记；应用分子遗传标记技术作为一种新的分子标记技术，在分子生物学特别是在分子遗传学的研究中得到了广泛的应用和发展，其所构建的遗传图谱具有高度的特异性。与其它遗传标记相比较，DNA分子标记具有诸多优点，如：遗传稳定，多态性高，多为共显性，数量丰富，遍及整个基因组，操作简便。这些优点使其广泛地应用于生物基因组研究、进化分类、遗传育种、医学等方面，成为分子遗传学和分子生物学研究与应用的主流之一。 1DNA分子标记的概念遗传标记是基因型特殊的易于识别的表现形式，在遗传学的建立和发展过程中起着重要作用。从遗传学的建立到现在，遗传标记的发展主要经历了4个阶段，表现出了4种类型：1形态标记（Morphological Markers），指生物的外部特征特性,包括质量性状作遗传标记和数量性状作遗传标记；2细胞标记（Cytological Markers），主要指染色体组型和带型；3生化标记（Biochemical Markers），指生物的生化特征特性，主要包括同工酶和贮藏蛋白两种标记；4DNA分子标记（Molecular Markers）是以生物大分子（主要是遗传物质DNA）的多态性为基础的一种遗传标记。前3种标记是对基因的间接反映,而DNA分子标记是DNA水平遗传变异的直接反映。与其它遗传标记相比较，DNA分子标记具有诸多优点，如：遗传稳定，多态性高，多为共显性，数量丰富，遍及整个基因组，操作简便。这些优点使其广泛地应用于生物基因组研究、进化分类、遗传育种、医学等方面。目前，被广泛应用的DNA分子标记主要有RFLP（限制性片段长度多态性）、RAPD（随机扩增多态性DNA）、ALFP（扩增片段长度多态性）、STS（序列标记位点）、SSR（简单重复序列）和SNP（单核苷酸多态性）等。 2分子遗传标记技术的种类 2.1RFL P标记 RFLP(Restriction Fragment Length Polymorphism，限制性片段长度多态性)标记,是人类遗传学家Botstein等于1980年提出的,是以Southern杂交为核心的第一代分子标记技术。它是用限制性内切酶切割不同个体基因组DNA后,用印迹转移杂交的方法检测同源序列酶切片段在长度上的差异。这种差异是由于变异的产生或是由于单个碱基的突变所导致的限制性位点增加或消失,或是由于DNA序列发生插入、缺失、倒位、易位等变化所引起的结构重排所致。其差异的检测是利用标记的同源序列DNA片段作探针进行分子杂交,再通过放射自显影(或非同位素技术)实现的。与传统的遗传标记相比,RFL P标记具有下列优点: (1)RF LP标记无表型效应,其检测不受外界条件、性别及发育阶段的影响；

分子标记遗传图谱的构建方法---完整

分子标记遗传图谱的构建检测出的每个分子标记反映的都是相应染色体座位上的遗传多态性状态。为了有效地分析利用分子标记所提供的遗传信息，人们希望知道不同分子标记在染色体上的相对位置或排列情况，也就是要构建分子标记的遗传连锁图谱。利用DNA标记构建遗传连锁图谱在原理上与传统遗传图谱的构建是一样的。其基本步骤包括：选择适合作图的DNA标记；根据遗传材料之间的DNA多态性，选择用于建立作图群体的亲本组合；建立具有大量DNA标记处于分离状态的分离群体或衍生系；测定作图群体中不同个体或株系的标记基因型；对标记基因型数据进行连锁分析，构建标记连锁图。至今为止，已构建了许多植物的高密度分子标记连锁图。本章侧重介绍利用DNA标记构建分子遗传连锁图谱的原理与方法。第一节作图群体的建立要构建DNA标记连锁图谱，必须建立作图群体。建立作图群体需要考虑的重要因素包括亲本的选配、分离群体类型的选择及群体大小的确定等。一、亲本的选配 / 亲本的选择直接影响到构建连锁图谱的难易程度及所建图谱的适用范围。一般应从四个方面对亲本进行选择，首先要考虑亲本间的DNA多态性。亲本之间的DNA多态性与其亲缘关系有着密切关系，这种亲缘关系可用地理的、形态的或同工酶多态性作为选择标准。一般而言，异交作物的多态性高，自交作物的多态性低。例如，玉米的多态性极好，一般自交系间配制的群体就可成为理想的RFLP作图群体；番茄的多态性较差，因而只能选用不同种间的后代构建作图群体；水稻的多态性居中，美国康乃尔大学实验室1988年发表的RFLP连锁图谱是以籼稻和爪哇稻之间的杂交组合为基础构建的（McCouch et al. 1988）。在作物育种实践中，育种家常将野生种的优良性状转育到栽培种中，这种亲源关系较远的杂交转育，DNA 多态性非常丰富。第二，选择亲本时应尽量选用纯度高的材料，并进一步通过自交进行纯化。第三，要考虑杂交后代的可育性。亲本间的差异过大，杂种染色体之间的配对和重组会受到抑制，导致连锁座位间的重组率偏低，并导致严重的偏分离现象，降低所建图谱的可信度和适用范围；严重的还会降低杂种后代的结实率，甚至导致不育，影响分离群体的构建。由于各种原因，仅用一对亲本的分离群体建立的遗传图谱往往不能完全满足基因组研究和各种育

分子标记与植物遗传改良

第6讲分子标记与植物遗传改良一、分子标记在植物遗传研究中的应用p1 二、分子标记在植物育种中的应用p4 三、DNA分子标记的原理p11 四、质量性状的分子标记p25 (p1-14, p15-32) 一、分子标记在植物遗传研究中的应用分子标记是指一类在分子水平（多为DNA）上的具有多态性的遗传标记。1980年RFLP 作为新型遗传标记首次被提出，开创了直接应用DNA变异的新阶段。分子标记技术多种多样，各具特点，在实际中应根据需要和条件来选用。从植物遗传改良的角度来看，技术难度较小、使用成本较低且准确度又较高的分子标记将更易于为人们所接受。总之，随着多种类型分子标记的发展，分子标记技术将在植物遗传研究中得到越来越广泛的应用。（一）分子标记连锁图的构建近年来，农作物基因组和分子生物学研究取得了巨大进展，构建了许多高密度的分子标记连锁图。早在1988年，美国Cornell大学即用一个50株的籼粳亚种间F2群体（IR34583/Bulu Dalum）构建了第1张水稻RFLP连锁图。 1994年底，Cornell大学和日本水稻基因组研究组（RGP）同时发表了各自构建的高密度水稻分子标记连锁图。前者的作图群体为113株的野-栽回交群体（Oryza sativa/ O. longistaminata// O. sativa）。图谱全长1491cM，共含726个分子标记，其中多为基因组DNA 克隆，标记间平均距离2cM。后者是利用186株籼粳亚种间F2群体构建而成，全长1575cM，共含1383个分子标记，其中cDNA克隆883个，基因组DNA克隆265个，RAPD标记147个。（基因的遗传距离以图距为单位，1个图距单位相当于1%的重组率。cM：一种度量重组概率的单位。在生殖细胞形成的减数分裂过程中，常常会发生同源染色体之间的交叉现象，如果两个标记之间发生交叉重组的概率为1％，那么它们之间的距离就定义为1cM。对人类基因组，1cM大致相当于1Mbp。水稻基因组的大小估计为430Mb，是禾谷类作物基因组中最小的，大约为人基因组大小的1/7，）为了使两张图能相互参照，信息通用，华中农业大学从两张图中选出了400多个RFLP

分子遗传(名词解释及简答)

名词、简答（依据ppt）一、基因表达调控 1.基因(Gene) 遗传的基本单位，含有编码一种RNA，大多数情况是编码一种多肽的信息单位；负载特定遗传信息的DNA片段，其结构包括由DNA编码序列、非编码调节序列和内含子组成的DNA区域。 2.基因表达(gene expression) 从DNA到蛋白质的过程。对这个过程的调节即为基因表达调控(regulation of gene expression)。 3.基因表达的特点时间特异性——发育阶段特异性空间特异性——组织细胞特异性 4.基因表达调控的概念机体各种细胞中含有的相同遗传信息(相同的结构基因)，根据机体的不同发育阶段、不同的组织细胞及不同的功能状态，选择性、程序性地表达特定数量的特定基因的过程。 5.基因表达的方式 1）组成性表达(constitutive expression):基因较少受环境因素影响，而是在个体各个生长阶段的大多数或几乎全部组织中持续表达，或变化很小。如管家基因 ★管家基因(housekeeping gene)：某些基因在一个个体的几乎所有细胞中持续表达。 2）诱导和阻遏表达诱导表达(induction expression)——在特定环境信号刺激下，基因表现为开放或增强，表达产物增加。阻遏表达(repression expression)——在特定环境信号刺激下，基因被抑制，从而使表达产物减少。 6.基因表达调控的意义 1）以适应环境、维持生长和增殖 2）以维持细胞分化与个体发育 7.原核生物基因表达的调控 8、真核生物基因表达的调控——多层次和复杂性 ★转录前水平：染色体丢失、基因扩增、基因重排、DNA的甲基化、组蛋白修饰、染色质结构

分子标记种类及概述

分子标记概述遗传标记主要有四种类型: 形态标记（morphological marker）、细胞标记（cytological markers）、生化标记（Biochemical marker）和分子标记（molecular marker）。分子标记是其中非常重要的一种，他是以个体间遗传物质核苷酸序列变异为基础的遗传标记，是DNA 水平遗传多态性的直接的反映。早在1923年，Sax等就提出利用微效基因与主基因的紧密连锁，对微效基因进行选择的设想。但由于形态标记数目有限，而且许多标记对育种家来说是不利性状，因而难以广泛应用。细胞标记主要依靠染色体核型和带型，数目有限。同工酶标记在过去的二、三十年中得到了广泛的发展与应用。作为基因表达的产物，其结构上的多样性在一定的程度上能反映生物DNA组成上的差异和生物遗传多样性。但由于其为基因表达加工后的产物，仅是DNA 全部多态性的一部分，而且其特异性易受环境条件和发育时期的影响；此外同工酶标记的数量有限，不能满足育种需要。近年来，分子生物学的发展为植物遗传标记提供了一种基于DNA变异的新技术手段，即分子标记技术。与其它标记方法相比，分子标记具有无比的优越性。它直接以DNA形式出现，在植物体的各个组织、各发育时期均可检测到，不受季节、环境的限制，不存在表达与否的问题；数量极多，基因组变异极其丰富，分子标记的数量几乎是无限的；多态性高，利用大量引物、探针可完成覆盖基因组的分析；表现为中性，即不影响目标性状的表达，与不良性状无必然的连锁；许多标记为共显性，对隐性的性状的选择十分便利，能够鉴别出纯合的基因型与杂合的基因型，提供完整的遗传信息。随着分子生物学技术的发展，现在DNA分子标记技术已有数十种，广泛应用于遗传育种、基因组作图、基因定位、物种亲缘关系鉴别、基因库构建、基因克隆等方面。分子标记的概念有广义和狭义之分。广义的分子标记是指可遗传的并可检测的DNA序列或蛋白质。蛋白质标记包括种子贮藏蛋白和同工酶（指由一个以上基因位点编码的酶的不同分子形式）及等位酶（指由同一基因位点的不同等位基因编码的酶的不同分子形式）。狭义分子标记是指能反映生物个体或种群间基因组中某种差异的特异性DNA片段。理想的分子标记必须达以下几个要求：(1) 具有高的多态性；(2) 共显性遗传，即利用分子标记可鉴别二倍体中杂合和纯合基因型；(3) 能明确辨别等位基因；(4) 遍布整个基因组；(5) 除特殊位点的标记外，要求分子标记均匀分布于整个基因组；(6) 选择中性(即无基因多效性)；(7) 检测手段简单、快速(如实验程序易自动化)；(8) 开发成本和使用成本尽量低廉；(9) 在实验室和实验室间重复性好(便于数据交换)。但是，目前发现的任何一种分子标记均不能满足以所有要求。分子标记种类利用分子标记技术分析生物个体之间DNA序列差别并用于作图的研究始于1980年。经过十几年的发展，现在的DNA标记技术已有几十种，主要有一下几大类。

分子标记在植物遗传育种中的应用

分子标记在植物遗传育种中的应用 E M摘要N: 分子标记是继形态标记O细胞标记和生化标记之后发展起来的一种新的较为理想的遗传标记F已被广泛地应用于生命科学研究的各个领域P在植物遗传育种中F分子标记主要用于基因组图谱构建O基因定位O辅助标记选择O种质资源评价O基因克隆O杂种优势预测O杂交育种及跟踪育种过程等方面P文章主要介绍了分子标记在植物遗传育种中的应用原理及分析方法F并对其应用前景进行了展望PM关键词N 分子标记K植物遗传育种K遗传标记优良品种是当今农业经济发展的基础资源F对目标性状#如丰产O优质O抗逆等$的选择是新品种选育过程的中心环节P 传统的育种方法主要是根据植物在田间的表现进行评价和选择P 但由于表型性状不仅取决于遗传组成F也受控于环境条件F有时环境条件的影响可遮盖植株在基因型上的差异F因此仅根据表型进行选择F效果不够理想P特别是对受多基因控制的数量性状的选择F更难做到准确P虽然育种学已建立了一套完整的选择程序F并在农业生产上培育出了许多高产O优质O抗逆的新品种F然而传统的育种方法仍存在周期长O预见性差O工作量大O工作效率低等问题P随着遗传学的发展F人们注意到利用易于鉴别的遗传标记 #R6=6398SA0T607$来进行辅助选择F可提高选择效果P遗传标记已逐渐成为植物遗传育种的重要工具P尤其是分子遗传学的发展及分子标记技术的建立F使作物遗传育种进入了一个新阶段P新

技术与传统方法相结合F有可能解决目前育种中一些重要环节上的主要难题F从而大大加速育种工作进程P分子标记已在遗传图谱的构建O辅助标记选择O基因克隆等方面显示出了非常诱人的前景P - 应用分子标记构建基因组图谱基因组图谱是遗传研究的重要内容F又是种质资源O育种及基因克隆等许多应用研究的理论依据和基础P因此F基因组图谱已成为当今生命科学的重要研究领域P基因组图谱包括以染色体重组交换为基础的遗传图谱#R6=6398SA+$和以U2? 的核苷酸序列为基础的物理图谱#V4W798A’SA+$P数十年来F许多遗传学家利用形态标记O生化标记和传统的细胞遗传学方法F为构建各种主要作物的遗传图谱进行了大量工作F并取得了一定的进展P但是由于形态标记和生化标记数目少F特殊遗传材料培育困难及细胞学工作量大F因而除极少数作物#如玉米O番茄$外F在分子标记出现之前F大多数作物还没有一个较为完整的遗传连锁图F极大地限制了遗传学理论研究和应用研究的进展P 进入.,年代以来F分子标记的迅速发展F大大促进了遗传连锁图的构建P目前主要农作物O果树O蔬菜等的XCYV7OX?VU7遗传图谱已相继建立M-ZINP利用分子标记构建遗传图谱的理论基础是染色体的交换与重组P 两点测验和三点测验是其基本程序P由于作图群体的不断增大和标记数量的日益扩增F如今的遗传图谱构建已不得不计算机化了P 遗传图谱构建过程主要包括[-$选择和建立适合的作图群体

DNA分子标记及其优缺点

DNA分子标记种类及相应的优缺点摘要：　对RFLP、RAPD、AFLP、SSR、ISSR 等常用的DNA 分子标记技术以及其他几种新兴的标记技术( SNP、EST 等) 的原理、特点进行了综述,并对各自的优缺点进行了探讨。关键词：DNA分子标记优缺点分子标记是继形态标记、细胞标记和生化标记之后发展起来的一种较为理想的遗传标记形式,它以蛋白质、核酸分子的突变为基础,检测生物遗传结构与其变异。分子标记技术从本质上讲,都是以检测生物个体在基因或基因型上所产生的变异来反映生物个体之间的差异。每一种分子标记都有其自身的特点和特定的应用范围,但就一般意义而言,DNA 分子标记与形态标记和生化标记等相比,具有许多独特的优点: ①不受组织类别、发育阶段等影响。植株的任何组织在任何发育时期均可用于分析。 ②不受环境影响。因为环境只影响基因表达(转录与翻译) ,而不改变基因结构即DNA 的核苷酸序列。③标记数量多,遍及整个基因组。④多态性高,自然存在许多等位变异。⑤有许多标记表现为共显性,能够鉴别纯合基因型和杂合基因型, 提供完整的遗传信息。⑥DNA 分子标记技术简单、快速、易于自动化。⑦提取的DNA 样品,在适宜条件下可长期保存,这对于进行追溯性或仲裁性鉴定非常有利。因此,DNA 分子标记可以弥补和克服在形态学鉴定及同工酶、蛋白电泳鉴定中的许多缺陷和难题,因而在品种鉴定方面展示了广阔的应用前景。 1. 1 第1 代分子标记 1.1. 1 RFLP 标记技术。1980 年Botesin提出的限制性片段长度多态性(Restriction fragment length polymorphisms ,RFLP) 可以作为遗传标记,开创了直接应用DNA 多态性的新阶段,是最早应用的分子标记技术。RFLP 是检测DNA 在限制性内切酶酶切后形成的特定DNA 片段的大小,反映DNA 分子上不同酶切位点的分布情况,因此DNA 序列上的微小变化,甚至1 个核苷酸的变化,也能引起限制性内切酶切点的丢失或产生, 导致酶切片段长度的变化。优点：RFLP 标记的等位基因具有共显性的特点,结果稳定可靠,重复性好,特别适应于构建遗传连锁图。缺点：在进行RFLP 分析时,需要该位点的DNA片段做探针,用放射性同位素及核酸杂交技术,既不安全又不易自动化。另外,RFLP 对DNA 多态性检出的灵敏度不高,RFLP 连锁图上还有很多大的空间区。 1.1. 2 RAPD 标记技术。为了克服RFLP 技术上的缺点,Williams

遗传标记的发展及其类型

遗传标记的发展及其类型 1形态标记 19世纪60年代，Mendel以豌豆为材料，详细研究了豌豆的7对相对性状的遗传规律。由于这些性状都具有典型的外部形态，很容易识别，从而构成了最早的遗传标记，即形态学标记，由此奠定了近代遗传学的基础。形态标记是利用植物外部形态多态性进行的标记技术。自然界中的生物存在着许多非常明显的形态标记，如果形、花色、矮杆、卷叶等。形态标记简单直观且经济方便，但大多数植物中的形态标记数量有限，多态性较差，表型易受环境影响，且形态标记的获得周期长，不适于需要完整的基因组测试的数量性状位点分析，故形态标记在作物遗传育种中的作用有限。 2细胞学标记细胞学标记是利用植物细胞染色体的变异的标记技术。植物细胞染色体的变异包括染色体核型和带型的变异。细胞学标记虽然能进行一些重要基因的染色体定位，但标记材料的培育需要大量的人力和时间，并且有些物种对染色体数目和结构变异反应敏感，难以获得标记材料，从而限制了细胞学标记在遗传育种上的应用。 3生化标记生化标记主要指同工酶标记，是依据植物体内有效成分的化学分析进行标记的技术。同工酶是同种功能的酶的不同形式，由一个以上基因座位编码，其可通过电泳和组织化学染色法分离成肉眼可见的酶谱带型。与形态标记和细胞学标记相比，生化标记表现近中性，对植物经济性状无大的不良影响，且是基因产物差异的直接反映，受环境影响较小。但由于在植物群体研究中能表现出位点多态性的同工酶种类较少，使其应用也受到限制而不能成为较理想的遗传标记。 4分子标记分子标记是以生物大分子的多态性为基础的标记技术，目前使用的分子标记主要是指DNA分子标记。DNA分子标记能反映植物个体或种群的基因组DNA 间的差异，如由于碱基易位、倒位、缺失、插入、重排或由于存在长短与排列不一的重复序列而产生的差异。起步于20世纪70年代的分子标记在近40年间发展迅速，目前已出现了几十种分子标记方法。与前3种标记(形态、细胞学和生化标记)技术相比，分子标记具有巨大的优越性: ①直接以DNA的形式表现，在植物体的各个组织、各发育时期均可检测到，受季节、环境限制，不存在表达

分子标记辅助育种技术

分子标记辅助育种技术第一节分子标记的类型和作用原理遗传标记是指可以明确反映遗传多态性的生物特征。在经典遗传学中，遗传多态性是指等位基因的变异。在现代遗传学中，遗传多态性是指基因组中任何座位上的相对差异。在遗传学研究中，遗传标记主要应用于连锁分析、基因定位、遗传作图及基因转移等。在作物育种中，通常将与育种目标性状紧密连锁的遗传标记用来对目标性状进行追踪选择。在现代分子育种研究中，遗传标记主要用来进行基因定位和辅助选择。 1、形态标记形态标记是指那些能够明确显示遗传多态性的外观性状。如、株高、穗型、粒色等的相对差异。形态标记数量少，可鉴别标记基因有限，难以建立饱和的遗传图谱。有些形态标记受环境的影响，使之在育种的应用中受到限制。 2、细胞学标记细胞学标记是指能够明确显示遗传多态性的细胞学特征。如染色体的结构特征和数量特征。核型：染色体的长度、着丝粒位置、随体有无。可以反映染色体的缺失、重复、倒位、易位。染色体结构特征带型：染色体经特殊染色显带后，带的颜色深浅、宽窄和位置顺序,可以反映染色体上常染色质和异染色质的分布差异。染色体数量特征—是指细胞中染色体数目的多少。染色体数量上的

遗传多态性包括整倍体和非整倍体变异。细胞学标记优点：克服了形态标记易受环境影响的缺点。缺点：（1）培养这种标记材料需花费大量的人力物力；（2）有些物种对对染色体结构和数目变异的耐受性差，难以获得相应的标记材料；（3）这种标记常常伴有对生物有害的表型效应；（4）观察鉴定比较困难。 3、蛋白质标记用作遗传标记的蛋白质分为酶蛋白质和非酶蛋白质两种。非酶蛋白质：用种子储藏蛋白质经一维或二维聚丙烯酰胺凝胶电泳，根据显示的蛋白质谱带或点，确定其分子结构和组成的差异。酶蛋白质：利用非变性淀粉凝胶或聚丙烯酰胺凝胶电泳及特异性染色检测，根据电泳谱带的不同来显示酶蛋白在遗传上的多态性。蛋白质标记的不足之处：（1）每一种同工酶标记都需特殊的显色方法和技术；（2）某些酶的活性具有发育和组织特异性；（3）标记的数量有限。 4 、 DNA标记 DNA分子标记是DNA水平上遗传多态性的直接反映。 DNA水平的遗传多态性表现为核苷酸系列的任何差异，包括单个核苷酸的变异。二、分子标记的类型及作用原理

分子标记技术简介

分子标记技术简介分子标记是以个体间遗传物质内核苷酸序列变异为基础的遗传标记，是DNA水平遗传多态性的直接的反映。与其他几种遗传标记——形态学标记、生物化学标记、细胞学标记相比，DNA分子标记具有的优越性有：大多数分子标记为共显性，对隐性的性状的选择十分便利；基因组变异极其丰富，分子标记的数量几乎是无限的；在生物发育的不同阶段，不同组织的DNA都可用于标记分析；分子标记揭示来自DNA的变异；表现为中性，不影响目标性状的表达，与不良性状无连锁；检测手段简单、迅速。随着分子生物学技术的发展，现在DNA分子标记技术已有数十种，广泛应用于遗传育种、基因组作图、基因定位、物种亲缘关系鉴别、基因库构建、基因克隆等方面。分子标记的概念有广义和狭义之分。广义的分子标记是指可遗传的并可检测的DNA序列或蛋白质。狭义分子标记是指能反映生物个体或种群间基因组中某种差异的特异性DNA片段。理想的分子标记必须达以下几个要求：(1) 具有高的多态性；(2) 共显性遗传，即利用分子标记可鉴别二倍体中杂合和纯合基因型；(3) 能明确辨别等位基因；(4) 遍布整个基因组；(5) 除特殊位点的标记外，要求分子标记均匀分布于整个基因组；(6) 选择中性(即无基因多效性)；(7) 检测手段简单、快速(如实验程序易自动化)；(8) 开发成本和使用成本尽量低廉；(9) 在实验室内和实验室间重复性好(便于数据交换)。但是，目前发现的任何一种分子标记均不能满足以所有要求。

【分子标记的种类】一、基于分子杂交技术的分子标记技术此类标记技术是利用限制性内切酶解及凝胶电泳分离不同的生物DNA 分子，然后用经标记的特异 DNA 探针与之进行杂交，通过放射自显影或非同位素显色技术来揭示 DNA 的多态性。 ①限制性片段长度多态性(Restriction Fragment Length Polymorphism，RFLP) 1974年Grodzicker等创立了限制性片段长度多态性(RFLP)技术，它是一种以DNA—DNA杂交为基础的第一代遗传标记。RFLP基本原理：利用特定的限制性内切酶识别并切割不同生物个体的基因组DNA，得到大小不等的DNA片段，所产生的DNA数目和各个片段的长度反映了DNA分子上不同酶切位点的分布情况。通过凝胶电泳分析这些片段，就形成不同带，然后与克隆DNA探针进行Southern杂交和放射显影，即获得反映个体特异性的RFLP图谱。它所代表的是基因组DNA在限制性内切酶消化后产生片段在长度上差异。由于不同个体的等位基因之间碱基的替换、重排、缺失等变化导致限制内切酶识别和酶切发生改变从而造成基因型间限制性片段长度的差异。 RFLP的等位基因其有共显性特点。RFLP标记位点数量不受限制，通常可检测到的基因座位数为1—4个。RFLP技术也存在一些缺陷，主要是克隆可表现基因组DNA多态性的探针较为困难；另外，实验操作较繁锁，检测周期长，成本费用也很高。自RFLP问世以来，已经在基因定位及分型、遗传连锁图谱的构建、疾病的基因诊断等研究中仍得到了广泛的应用。

综述-分子标记

分子标记遗传标记作为识别基因型的表现形式，在生物基因研究方面起到了重要作用，目前通过遗传标记的方法定位基因位置已成为基因定位的常用方法。遗传标记主要有形态标记（morphological marker）、细胞标记（cytological markers）、生化标记（Biochemical marker）和分子标记（molecular marker）四种类型。形态标记、细胞标记因其自身局限性的原因，目前鲜有使用。虽然以同工酶标记为代表的生化标记得到了广泛的发展，但由于其检测的范围狭窄、统计难度大等缺陷，目前仅在少数方面有所应用。从20世纪70年代分子标记出现至今的40年，分子标记因其无比的优越性，使得其成为目前应用最广泛的遗传标记方法。一、分子标记的概念分子标记是指以生物大分子的多态性为基础的一种遗传标记。广义的分子标记是指可遗传并能检测的蛋白质或DNA序列。而狭义的分子标记仅仅是指基于DNA分子多态性构建的标记方法。二、分子标记的特点理想的分子标记一定要达到以下标准：1、具有高的多态性；2、共显性遗传即利用分子标记可鉴别二倍体中杂合和纯合基因型；3、能明确辨别等位基因；4、遍布整个基因组；5、除特殊位点的标记外要求分子标记均匀分布于整个基因组；6、选择中性即无基因多效性；7、检测手段简单、快速如实验程序易自动化；8、开发成本和使用成本尽量低廉；9、在实验室内和实验空间重复性好便于数据交换。目前，在现实条件下并没有这种绝对理想的分子标记，但相比形态标记、细胞标记、生化标记，分子标记依旧有着明显的优越性：1、直接以DNA形式表现，在生物体各组织、各时期均可检测，不受环境限制；2、数量多，遍布全基因组，有近乎无限的检测座位；3、多态性高；4、表现为中性，不影响目标性状的表达；5、许多标记为共显性，能区别纯合体与杂合体。三、分子标记的分类分子标记技术通常被分为基于分子杂交的分子标记技术（RFLP）（或叫做非PCR基础上的分子标记技术）、基于PCR技术的分子标记技术和同时基于分子杂交和PCR两种技术的分子标记技术三大类型。基于PCR技术的分子标记技术又可分为基于随机引物的PCR分子标记技术（或叫非特异PCR分子标记技术）和基于特异引物的PCR分子标记技术（或叫特异PCR分子标记技术）。随着分子标记技术的不断发展，许多新兴分子标记技术的出现，人们又根据分子标记的基因组来源将分子标记技术分为随机DNA分子标记（Random DNA Markers，RDM）、目的基因分子标记（Gene Targeted Markers，GTM）和功能性分子标记(Functional Markers，FM)。 1、限制性片段长度多态性标记限制性片段长度多态性（restriction fragment length polymorphism，RFLP）由Grodzicker等人于1974年基于DNA被限制性内切酶酶切后形成特定大小的片段。其优点在于：1、广泛存在；2、共显性，可区分纯合与杂合；3、结果稳定可靠，重复性好。正是有了这些优点，RFLP作为最早出现的分子标记方式，曾被广泛应用。但由于其在使用时需要用放射性同位素标记、酶切时对DNA质量要求高、标记的多态性变异程度偏低等原因，使得RFLP很快就被新的分子标记所替代。 2、随机扩增多态性DNA标记随机扩增多态性DNA标记（random amplified polymorphic DNA，RAPD）是以基因组DNA 为模板，以人工合成的随机引物，通过PCR 扩增反映扩增片段的DNA片段导入、缺失以及引物结合位点上的碱基突变。RAPD只需合成一套引物，就可可用于不同生物基因组的分析；RAPD技术简便易行，省力省时，并且检测灵敏方便；RAPD分析所需样品DNA量极

SSR分子标记遗传分析

SSR分子标记遗传分析实验原理： SSR简单序列重复标记（Simple sequence repeat, 简称SSR标记），也叫微卫星序列重复，是由一类由几个核苷酸（1－5个）为重复单位组成的长达几十个核苷酸的重复序列，长度较短，广泛分布在染色体上。由于重复单位的次数的不同或重复程度的不完全相同，造成了SSR长度的高度变异性，由此而产生SSR标记。虽然SSR在基因组上的位置不尽相同，但是其两端序列多是保守的单拷贝序列，因此可以用微卫星区域特定顺序设计成对引物，通过PCR技术，经聚丙烯酰胺凝胶电泳，即可显示SSR位点在不同个体间的多态性。优点：（1）标记数量丰富，具有较多的等位变异，广泛分布于各条染色体上；（2）是共显性标记，呈孟德尔遗传；（3）技术重复性好，易于操作，结果可靠。缺点：开发此类标记需要预先得知标记两端的序列信息，而且引物合成费用较高实验材料：欧美山杨杂种幼嫩叶片实验器具、药品：模板DNA、dNTP、PCR提取Buffer、Mg2+、上游引物、下游引物、Taq酶、去离子水、琼脂糖、Gel-RED染色剂、1×TAE、PCR仪、琼脂糖凝胶电泳系统、紫外凝胶成像系统 SSR引物及退火温度位点Loci 重复单元 Repeat unit 引物序列(5′-3′) Primer sequence (5′-3′) 退火温度 T(℃) PTR2 (TGG)8AAGAAGAACTCGAAGA TGAAGAACT(F) ACTGACAAAACCCCTAA TCTAACAA(R) 63℃ PTR7 (CT)5A T(CT)6A TTTGA TGCCTCTTCCTTCCAGT(F) TA TTTTCA TTTTCCCTTTGCTTT(R) 49.4℃ PTR14 (TGG)5TCCGTTTTTGCA TCTCAAGAA TCAC(F) A TACTCGCTTTA TAACACCA TTGTC(R) 55.4℃ 实验步骤： 1.总DNA的提取采用CTAB法提取植物总DNA （1）取700ul CTAB提取液加入20ul巯基乙醇于65℃金属浴内预热；（2）称取适量植物叶片,放入消过毒的研钵中,迅速加入液氮研磨成白色粉末；（3）将粉末移入提取液,混匀,65℃水浴（或金属浴）30min,其间不时的温和摇匀；（4）加入700ul氯仿:异戊醇(24:1)轻轻摇匀,10000rpm 离心10min,取上清(重复2次)；（5）加入700ul异丙醇室温沉淀10min,10000rpm 离心10min,弃上清；（6）用70%乙醇洗两次,37℃气干.去除DNA表面的盐或试剂小分子物质；（7）加入20ul灭菌的去离子水溶解DNA；（8）利用0.7%的琼脂糖凝胶电泳检测提取的总DNA的含量和纯度。 2.总DNA的检测

三代遗传标记

三代遗传标记分子标记是继形态标记、细胞标记和生化标记之后发展起来的一种较为理想的遗传标记形式,它以蛋白质、核酸分子的突变为基础,检测生物遗传结构与其变异。分子标记技术从本质上讲,都是以检测生物个体在基因或基因型上所产生的变异来反映生物个体之间的差异。每一种分子标记都有其自身的特点和特定的应用范围,但就一般意义而言,DNA 分子标记与形态标记和生化标记等相比,具有许多独特的优点: ①不受组织类别、发育阶段等影响。植株的任何组织在任何发育时期均可用于分析。②不受环境影响。因为环境只影响基因表达(转录与翻译) ,而不改变基因结构即DNA 的核苷酸序列。③标记数量多,遍及整个基因组。④多态性高,自然存在许多等位变异。⑤有许多标记表现为共显性,能够鉴别纯合基因型和杂合基因型, 提供完整的遗传信息。⑥DNA 分子标记技术简单、快速、易于自动化。⑦提取的DNA 样品,在适宜条件下可长期保存,这对于进行追溯性或仲裁性鉴定非常有利。因此,DNA 分子标记可以弥补和克服在形态学鉴定及同工酶、蛋白电泳鉴定中的许多缺陷和难题,因而在品种鉴定方面展示了广阔的应用前景。 1. 1 第1 代分子标记 1.1. 1 RFLP 标记技术。 1980 年Botesin提出的限制性片段长度多态性(Restriction fragment length polymorphisms ,RFLP) 可以作为遗传标记,开创了直接应用DNA 多态性的新阶段,是最早应用的分子标记技术。RFLP 是检测DNA 在限制性内切酶酶切后形成的特定DNA 片段的大小,反映DNA 分子上不同酶切位点的分布情况,因此DNA 序列上的微小变化,甚至1 个核苷酸的变化,也能引起限制性内切酶切点的丢失或产生, 导致酶切片段长度的变化。

分子标记技术

SSR标记技术和ISSR 标记技术雷世勇 2.1 SSR 标记技术。在真核生物基因组中存在许多非编码的重复序列,如重复单位长度在15～65 个核苷酸的小卫星DNA ,重复单位长度在2～6 个核苷酸的微卫星DNA。小卫星和微卫星DNA 分布于整个基因组的不同位点。由于重复单位的大小和序列不同以及拷贝数不同,从而构成丰富的长度多态性。定义：SSR （全称为简单序列长度多态性标记）也称微卫星DNA ,是一类由几个多为1～5 个碱基组成的基序串联重复而成的DNA 序列,其中最常见的是双核苷酸重复,即 CA n和 TG n ,每个微卫星DNA 的核心序列结构相同,重复单位数目10～60 个,其高度多态性主要来源于串联数目的不同。根据微卫星重复序列两端的特定短序列设计引物,通过PCR 反应扩增微卫星片段。由于核心序列重复数目不同,因而扩增出不同长度的PCR 产物,这是检测DNA 多态性的一种有效方法。微卫星序列在群体中通常具有很高的多态性,而且一般为共显性,因此是一类很好的分子标记。 SSR分子标记的应用举例 ――鹅掌楸种属及杂种的分子标记北美鹅掌楸EST序列中开发的EST-SSR引物引物筛选物种特异性扩增引物特异性验证 SSR 标记技术的特点有：（1）数量丰富，广泛分布于整个基因组；（2）具有较多的等位性变异；（3）共显性标记，可鉴别出杂合子和纯合子；（4）实验重复性好，结果可靠；（5）由于创建新的标记时需知道重复序列两端的序列信息，因此其开发有一定困难，费用也较高。SSR 标记的应用目前已利用微卫星标记构建了人类、小鼠、大鼠、

水稻、小麦、玉米等物种的染色体遗传图谱。这些微卫星标记已被广泛应用于基因定位及克隆、疾病诊断、亲缘分析或品种鉴定、农作物育种、进化研究等领域。 2.2 ISSR 标记技术 ISSR 即（内部简单重复序列）,是一种新兴的分子标记技术。它是建立在1994年发展的一种微卫星基础上的分子标记。已经广泛应用于各种动植物的品种鉴定、遗传图谱建立、遗传多样性的研究等方面。几个重要的名词： ISSR：他们用加锚定的微卫星寡核苷酸作引物,即在SSR 的5′端或3′端加上2～ 4 个随机选择的核苷酸,这可引起特定位点退火,从而导致与锚定引物互补的间隔不太大的重复序列间的基因组节段进行PCR 扩增。这类标记又被称为 ASSR或AMP-PCR。RAMP: 在所用的两翼引物中,可以一个是ASSR 引物,另一个是随机引物。如果一个是5′端加锚的ASSR 引物,另一个是随机引物,则被称为RAMP 技术。 ISSR分子标记的优点 2实验成本低； 3操作简单；4实验稳定性高； 5物种间通用； 6多态性较高； 1记录方便； 7精确度高； 8检测方便； 9开发费用低。 ISSR 标记技术原理：用于ISSR-PCR 扩增的引物通常为16～18 个碱基序列,由1～4 个碱基组成的串联重复和几个非重复的锚定碱基组成,从而保证了引物与基因组DNA 中SSR 的5′或3′末端结合,通过PCR 反应扩增SSR 之间的DNA 片段。SSR 在真核生物中的分布是非常普遍的,并且进化变异速度非常快,因而锚定引物的ISSR-PCR 可以检测基因组许多位点的差异。 ISSR的应用举例 ――攀枝花苏铁遗传多样性的ISSR分析 PCR扩增及产物检测：从

DNA分子标记及其优缺点

分子标记

分子遗传学名词解释

DNA分子标记技术及其应用

分子标记遗传图谱的构建方法---完整

分子标记与植物遗传改良

分子遗传(名词解释及简答)

分子标记种类及概述

分子标记在植物遗传育种中的应用

DNA分子标记及其优缺点

遗传标记的发展及其类型

分子标记辅助育种技术

分子标记技术简介

综述-分子标记

SSR分子标记遗传分析

三代遗传标记

分子标记技术

最新分子遗传标记及其应用

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