脐带干细胞综述
脐带间充质干细胞的研究进展
间充质干细胞（mesenchymal stem cells,MSC
S
）是来源于发育早期中胚层
的一类多能干细胞[1-5]，MSC
S
由于它的自我更新和多项分化潜能，而具有巨大的
治疗价值 ,日益受到关注。MSC
S
有以下特点：(1)多向分化潜能，在适当的诱导条件下可分化为肌细胞[2]、成骨细胞[3、4]、脂肪细胞、神经细胞[9]、肝细胞[6]、心肌细胞[10]和表皮细胞[11, 12]；(2)通过分泌可溶性因子和转分化促进创面愈合；(3)
免疫调控功能，骨髓源（bone marrow ）MSC
S
表达MHC-I类分子，不表达MHC-II 类分子，不表达CD80、CD86、CD40等协同刺激分子，体外抑制混合淋巴细胞反应，体内诱导免疫耐受[11, 15]，在预防和治疗移植物抗宿主病、诱导器官移植免疫耐受等领域有较好的应用前景；(4)连续传代培养和冷冻保存后仍具有多向分化潜能，可作为理想的种子细胞用于组织工程和细胞替代治疗。1974年Friedenstein [16]
首先证明了骨髓中存在MSC
S ，以后的研究证明MSC
S
不仅存在于骨髓中，也存在
于其他一些组织与器官的间质中：如外周血[17]，脐血[5]，松质骨[1, 18]，脂肪组织[1]，滑膜[18]和脐带。在所有这些来源中，脐血(umbilical cord blood)和脐带(umbilical cord)是MSC
S
最理想的来源，因为它们可以通过非侵入性手段容易获
得，并且病毒污染的风险低，还可冷冻保存后行自体移植。然而，脐血MSC的培养成功率不高[19, 23-24]，Shetty 的研究认为只有6%，而脐带MSC的培养成功率可
达100%[25]。另外从脐血中分离MSC
S
，就浪费了其中的造血干/祖细胞(hematopoietic stem cells/hematopoietic progenitor cells,HSCs/HPCs) [26,
27]，因此，脐带MSC
S (umbilical cord mesenchymal stem cells, UC-MSC
S
)就成
为重要来源。
一．概述
人脐带约40 g, 它的长度约60–65 cm, 足月脐带的平均直径约1.5 cm[28, 29]。脐带被覆着鳞状上皮，叫脐带上皮，是单层或复层结构，这层上皮由羊膜延续过来[30, 31]。脐带的内部是两根动脉和一根静脉，血管之间是粘液样的结缔组织，叫做沃顿胶质，充当血管外膜的功能。脐带中无毛细血管和淋巴系统。沃顿胶质的网状系统是糖蛋白微纤维和胶原纤维。沃顿胶质中最多的葡萄糖胺聚糖是透明质酸，它是包绕在成纤维样细胞和胶原纤维周围的并维持脐带形状的水合凝胶，使脐带免受挤压。沃顿胶质的基质细胞是成纤维样细胞[32]，这种中间丝蛋白表达于间充质来源的细胞如成纤维细胞的，而不表达于平滑肌细胞。共表达波形蛋白和索蛋白提示这些细胞本质上肌纤维母细胞。
脐带基质细胞也是一种具有多能干细胞特点的细胞，具有多项分化潜能，其
形态和生物学特点与骨髓源性MSC
S 相似[5, 20, 21, 38, 46]，但脐带MSC
S
更原始，是介
于成体干细胞和胚胎干细胞之间的一种干细胞，表达Oct-4, Sox-2和Nanog等多
种胚胎干细胞的特有分子标志[20]，有更高的克隆形成率[45]，倍增时间更短[47, 56]，具有更强的扩增能力， 7代后可扩增300倍[20]；Lund等的研究认为一条人脐带共可扩增到1015个细胞 [29][47]；UC-MSC
S
在体外培养和体内移植都是安全的，不会自发转化成畸胎瘤[20] [43]，体外的细胞分裂周期可达50－60次[20]。目前各家报道的
UC-MSC
S 的细胞动力学有差异，可能是由于UC-MSC
S
的来源不同，包括血管间、血
管周及羊膜下细胞群，由此导致了UC-MSC
S
的异质性[20, 38]。
3.1. UC-MSC的分子标志[57]：目前文献报道的分子标志见表一。
脐带基质细胞的分子标志(通过蛋白，mRNA或基因表达分析检测所得)
分子标志可得性参考文献
Vimentin＋[20, 38]
Desmin＋[20, 38]
ASMA＋[19, 20]
CD10 ＋[43, 47]
CD13 ＋[43, 45, 47, 50, 58]
CD14 －[20, 43, 45, 47]
CD29(integrinβ1) ＋[41, 43, 45, 46, 49, 58]
CD31（PECAM）－[43, 45, 47, 49, 56, 58]
CD33 －[43]
CD34 －[20, 38, 42, 43, 45-47, 49, 50, 56,
58, 59]
CD38 －
CD44 (HCAM) ＋
CD45 －[38, 42, 43, 45-47, 49, 50, 56, 58,
59]
CD49b (integrinα2) ＋[43, 50]
CD49c (integrinα4) ＋[43]
CD49d (integrinα3) ＋[43]
CD49e ＋[43, 56]
CD51 (integrinα5) ＋
CD54 (ICAM-1) －/＋a
CD56 －[43]
CD73 (SH3) ＋
CD90 (Thy-1)＋
CD105 (endoglin, SH2)＋
CD106 (VCAM-1)－/＋a[38, 45, 50, 58]
CD117 (c-kit)－/＋a[32, 38, 47, 50, 56, 58]
CD123 (IL-3 receptor)－[38]
CD133－[43]
CD146＋[56]
CD166 (ALCAM)＋[45, 49]
CD235a (glycophorin A)－[38]
HLA-1＋
HLA-DR (MHC class II)－[38, 43, 45, 47, 50, 58, 60]
HLA-DP (MHC class II)－[38, 47]
HLA-DQ (MHC class II)－[47]
HLA-A, B, C (MHC class I)＋[38, 45, 47, 50, 58]
HLA-G (MHC class I)－[38]
STRO-1－[38, 56]
Oct-4－/＋[38, 43, 48]
Nanog＋[43, 48]
SSEA-4－[38]
Sox-2＋[43, 48]
reference [48]细胞来源是猪，其它细胞来源均为人。
a不同参考文献的报道有矛盾
缩写: ALCAM, activated leukocyte cell adhesion molecule; HCAM, homing-associated cell adhesion molecule; HLA, human leukocyte antigen; ICAM, intercellular adhesion molecule; IL, interleukin; MHC, major histocompatibility complex; PECAM, platelet endothelial cell adhesion molecule; SSEA, stage-specific embryonic antigen; VCAM, vascular cell adhesion molecule. 3.2 人UC-MSC的类型
人UC-MSC作为一个异质的细胞群，从表型上至少有两种不同类型的细胞[20]：I型和II型，波形蛋白在两型细胞均表达，而I型细胞还表达角蛋白中间丝（Pancytokeratin），I型细胞主要来源于血管周细胞。两型细胞在向软骨、骨和脂肪谱系的分化上没有区别，但在神经谱系的分化上有区别，I型细胞体外不能向神经元细胞分化。
3.3 UC-MSC的分化潜能
UC－MSCs起源于胚外中胚层，脂肪、软骨、骨、心肌和骨骼肌的诱导是目前研究最多的谱系[57]。目前没有发现公认的MSC S特异性表面抗原，无直接方法可鉴定MSC S，都是通过在培养过程中出现分化表型，然后逆推得知是否为MSC S[61, 62]。研究证明人UC-MSC体外可以分化为脂肪细胞、软骨细胞[20, 40, 46, 56]、骨细胞、心肌细胞[46, 49]、骨骼肌细胞、神经元/神经胶质前体细胞[20, 45, 46]、多巴胺能神经元、内皮细胞[58]。与BM- MSCs相比，UC－MSCs分化为软骨和骨的能力更强[20]，成骨分化速度更快[56]，而分化为脂肪的能力更弱[20]。在向软骨谱系诱导时，UC-MSC s不仅表达I I型胶原，也表达I型胶原[20]。
四．临床应用前景
近来，随着对MSC
S 研究的深入，逐渐发现MSC
S
在损伤等刺激下能参与多种组
织的修复，其机制尽管尚未完全阐明，但初步结果显示可能与创伤的刺激及局部
创面的微环境中含有各种不同的因子有关，它们具有促进MSC
S 趋化以及诱导MSC
S
向所需要的组织或细胞分化来参与组织的修复。有研究认为MSC
S
通过分泌可溶性因子来改变微环境，在促进创面愈合过程中比细胞转分化起的作用更大。细胞分化依赖于细胞所处的三维空间结构和相应的多维分化信号[62]。细胞与细胞、细胞
与细胞外基质间相互作用直接影响干细胞的分化方向和进程。周边环境对其增殖、分化有重要作用。生物体提供了复杂微妙的微环境，可以借助生物体本身来进一步完成多种干细胞的诱导分化。
Weiss等[64, 65]移植猪的UC－MSCs到纹状体接受过神经毒素6-羟基多巴胺注射的大鼠脑里，结果提示UC－MSCs移植是安全的，没有明显的宿主免疫应答，UC－MSCs能够增殖，不形成畸胎瘤；移植的UC－MSCs可以分化为酪氨酸羟化酶阳性细胞。他们以后的研究发现[43]，移植未分化的人UC－MSCs到单侧震颤麻痹症的大鼠脑中，UC－MSCs可以改善阿朴吗啡引起的眩晕。Jomura等[41]预先在大鼠的左侧丘脑核、海马、胼胝体和皮层显微注射了大鼠的Oct-4(+)UC －MSCs，然后通过心跳停止再复苏造成脑缺血，实验证明预先注射了UC－MSCs 的大鼠脑部椎体细胞的损伤最轻，提示了UC－MSCs在脑缺血的治疗中是有前景的。Lund等[47]移植人UC－MSCs到有早期视网膜退变的大鼠视网膜下，通过视网膜电流图，空间分辨能力，亮度阈的测定，发现能够促进光感受器的恢复。人UC－MSCs可能有助于治疗视网膜退行性疾病如色素性视网膜炎。Tsai发现人UC－MSCs可以治疗四氯化碳诱导的大鼠的肝纤维化[66]。
UC-MSC
S 作为一种具有多能干细胞特点的细胞，不但能够成为骨髓MSC
S
等理
想替代物，而且具有更大的应用潜能。因为①脐带有更充足的来源，收集容易，
对供者无任何损伤不受任何伦理及法理限制；②脐带受胎盘屏障的保护，其成分被病毒、细菌污染的几率低；③脐带MSC
S
的免疫源性更低，能耐受更大程度上的
HLA配型不符；④脐带包含丰富的干细胞；⑤脐带MSC
S
体外倍增时间短，克隆形
成率高，扩增能力强；⑥收集的脐带MSC
S
不仅可做异基因移植的供体，而且还可
将之低温保存数十年，用于自体移植治疗相关疾病；⑦脐带MSC
S
移植可以治疗急
性移植物抗宿主病[67]。因此，脐带MSC
S
作为一种新的替代细胞来源，在各系统疾病的细胞移植及基因治疗中有着广阔的应用前景。
【CN110050780A】冻存液及其在脐带间充质干细胞冻存中的应用【专利】
(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201910216830.0 (22)申请日 2019.03.21 (71)申请人 广州赛莱拉干细胞科技股份有限公 司 地址 510000 广东省广州市开发区广州国 际生物岛螺旋四路一号生产区第五层 502单元 (72)发明人 陈海佳 葛啸虎 王小燕 杨祖婷 (74)专利代理机构 北京集佳知识产权代理有限 公司 11227 代理人 温可睿 赵青朵 (51)Int.Cl. A01N 1/02(2006.01) A61K 35/28(2015.01) A61P 19/02(2006.01) A61P 19/08(2006.01) (54)发明名称 冻存液及其在脐带间充质干细胞冻存中的 应用 (57)摘要 本发明涉及干细胞技术领域，尤其涉及冻存 液及其在脐带间充质干细胞冻存中的应用。 本发明提供的组合物，能够显著性的提高脐带间充质 干细胞在冻存条件下的活性，而以其制得的干细 胞制剂，具有良好的成骨分化、成软骨分化的潜 能，从而能够具有良好的修复软骨损伤的作用， 从而起到治疗骨关节炎的效果。权利要求书1页 说明书6页 附图3页CN 110050780 A 2019.07.26 C N 110050780 A
1.一种冻存液， 其由如下体积份的液体组成： 2.根据权利要求1所述的冻存液，其特征在于， 由如下体积份的液体组成； 3.根据权利要求1或2所述的冻存液，其特征在于， 所述人血白蛋白注射液中人血白蛋白的质量分数为20％； 所述葡萄糖注射液中葡萄糖的质量分数为5％； 所述羟乙基淀粉注射液中羟乙基淀粉的质量分数为6％。 4.权利要求1～3任一项所述的冻存液在脐带间充质干细胞冻存中的应用。 5.一种脐带间充质干细胞冻存方法，其特征在于，以权利要求1～3任一项所述的冻存液重悬脐带间充质干细胞。 6.根据权利要求5所述的冻存方法，其特征在于，所述重悬至细胞密度为5×107cells/mL。 7.权利要求1～3任一项所述的冻存液在制备干细胞制剂中的应用。 8.一种干细胞制剂，其包括：脐带间充质干细胞和权利要求1～3任一项所述的冻存液。 9.根据权利要求8所述的干细胞制剂，其特征在于，所述脐带间充质干细胞的密度为5×107cells/mL。 10.权利要求7～9任一项所述的干细胞制剂在制备治疗骨关节炎的药物中的应用。 权 利 要 求 书1/1页2CN 110050780 A
脐带间充质干细胞研究进展
的表达及NAC的干预作用［J］.黑龙江医药科学，2005，28（6）：30-31. ［23］路浩，达剑森，梅莉，等.母鼠妊娠期铅镐联合暴露对仔鼠脑组织的氧化损伤及乙酰半胱氨酸的保护效应［J］.中国兽医 科学，2008，38（1）：42-45.［24］FLORA G J，SETH P K.Beneficial effects of S-adenosyl-Lme?thionine on aminolevulinic acid hydratase，glutathione and lipid peroxidation during acute lead-ethanol administration in mice ［J］.Alcohol，1999，18（2/3）：103-108. （收稿日期：2010-02-08 编辑：张素文） 脐带间充质干细胞研究进展 蒋洁1，张雪梅1，张建湘2 1怀化医学高等专科学校组织学与胚胎学教研室（湖南怀化418000）；2中南大学湘雅基础医学院组织学与胚胎学系（长沙410013） 间充质干细胞（mesenchymal stem cells，MSCs）是来源于发育早期中胚层的具有高度自我更新能力和多向分化潜能的多能干细胞，广泛存在于全身多种组织中，可在体外培养扩增，并能在特定条件控制下分化为神经细胞、成骨细胞、肌肉细胞、脂肪细胞等［1］，在细胞替代治疗及组织工程方面有极大的应用价值。目前，MSCs主要来源于骨髓，但由于骨髓源性MSCs存在高度病毒污染的可能，且随着年龄增长其细胞数量和扩增、分化能力出现明显下降趋势，故寻找一种能替代骨髓并可弥补其缺陷的间充质干细胞来源，已越来越受到各国学者的关注。脐带间充质干细胞作为一种多潜能干细胞，成功避开了胚胎干细胞来源缺乏、异体排斥、道德伦理等诸多限制，成为干细胞领域的研究热点。本文就近年来国内外在脐带间充质干细胞方面的相关研究进行总结和分析，对脐带间充质干细胞的分离培养、生物学特性以及分化能力等问题作简要综述。 1 脐带MSCs的来源与分离 1.1 脐带MSCs的来源 脐带中富含造血、间充质、神经及内皮等多种干/祖细胞［2］，其中间充质干细胞来源分4种：（1）来源于Wharton’s jelly（WJ）［3-4］；（2）来源于脐血管周围；（3）来源于脐血；（4）来源于脐静脉血管内皮下［5-6］。 KAVIANI等［7］研究发现脐带血可能含有与骨髓类似的MSCs。ERICES等［2］首次报道了从脐带血中分离培养出间充质样细胞，虽然其免疫表型和功能特点与骨髓来源的MSCs极为类似，但在处理的29份标本中只有7份表现为间充质样细胞（mesenchymal-like cell，MLC）。WEXLER等［8］研究发现脐血标本仅产生少量、非融合、异质的贴壁细胞层，这提示脐血中MSCs较稀少，脐血标本并不是MSC的丰富来源。GOODWIN等［9］认为可以从脐带血中分离出间充质样干细胞，但是培养时间较长，需要保持酸性培养环境。随着对脐带血间充质干细胞研究的深入，大家的结论也越来越趋于一致，脐血中的确存在着MSCs，但其所占比例较骨髓低的多，脐带血和外周血并非间充质干细胞的最佳来源。 另一方面，SARUGASER等［5］发现培养后的人脐带血管外周（HUCPV）细胞呈现较高水平的成纤维样集落形成（CFU-F），进行骨诱导后，细胞快速增殖并分化形成骨结节。COVAS等［10］从人脐带血管内皮和内皮下分离出形态学和免疫表型类似于BMSC的细胞，并表现出向脂肪和骨原分化的潜能。覆盖于WJ组织表面的脐带上皮（UCE）细胞被认为是来源于羊膜上皮组织。MIZOGUCHI等［11］对UCE 细胞进行分离培养时发现干细胞特征的细胞，该细胞不仅表达单层和黏液上皮角蛋白，而且还表达复层上皮角蛋白，能够转化和表达表皮细胞的表型。 1.2 脐带MSCs的分离 脐带间充质干细胞的培养并非易事，特别是如何快速、高效地从脐带中获得MSCs以满足基础和未来临床研究的需要是一个亟待解决的问题。 目前，间充质干细胞的体外分离方法主要有：（1）贴壁培养筛选法；（2）密度梯度离心法；（3）流式细胞仪或免疫磁珠分选法。贴壁培养筛选法主要是利用MSCs对培养瓶具有较强的黏附能力，而造血系细胞、内皮细胞等不贴壁，在以后的换液中逐渐被弃去，达到分离纯化干细胞的目的。密度梯度离心法是根据MSCs与其他细胞的密度不同来进行分离，如广泛采用的Percoll密度梯度离心法。随着对MSCs表面抗原认识的深入，也有人利用免疫方法如流式细胞仪分选法、免疫磁珠法等分离MSCs，此方法是根据细胞大小不同或细胞表面的一些特殊标志进行分离。在贴壁培养筛选法方面，酶消化法的使用较为广泛。如WANG等［4］将去除脐血管的脐带组织，用刀片刮除WJ组织，胶原酶消化16h，培养3d后可观察到成纤维样细胞生长。SARUGASE等［5］将包裹WJ基质的脐血管两端用缝线结扎呈环状，于胶原酶消化获得的细胞进行培养，倒置相差显微镜下可以观察到星形的成纤维样细胞。ROMANOV等［12］通过对脐带血管系统行酶消化，获得血管内皮和内皮下混合细胞群体，培养7d后可观察到成纤维样细胞。 2 脐带MSCs的生物学特性 2.1 细胞形态与增殖特性 取脐带间质组织剪碎后经酶消化，细胞贴壁后观察细胞形态呈长的扁平的梭形，类似成纤维细胞，传代后的细胞形态无明显变化［4］。MA等［13］将人脐带WJ行组织块培养，原代培养时间为10~14d，传代后增殖速度较快，但细胞传至9代后增殖速度减慢。而MITCHELL等［14］对猪脐带WJ中的MSCs进行了研究，细胞传至80代时仍未呈现衰老趋势，也未表现出生长加速。相关研究表明，脐带血管内皮经过消化获得的细胞呈贴壁生长，细胞培养24h后，可观察到2种形态的贴壁细胞：数量较多的鹅卵石样形态细胞，与血管内皮细胞相似；数量较少的纺锤状成纤维瘤样细胞，证实为MSCs的前体细胞。脐带MSCs在体外培养体系中能快速增殖，传代后3~5d能增殖
脐带间充质干细胞的
脐带间充质干细胞 脐带间充质干细胞（Mesnchymal Stem Cells，MSCs）是指存在于新生儿脐带组织中的一种多功能干细胞，它能分化成许多种组织细胞，具有广阔的临床应用前景。 目录 1概念 2优势 3分离培养 4用途 5干细胞研究 ?期刊简介 ?研究对象 ?研究内容 1概念 脐带间充质干细胞是以人脐带血血清为主体的培养体系的脐带间充质干细胞培养扩增的方法：流式细胞仪检测结果显示，贴壁细胞均表达CD44、CD29，低表达CD106，不表达造血细胞表型CD14、CD34、CD45和内皮细胞表型CD31，
也不表达HLA-DR：细胞倍增时间为30h，细胞周期分析表明，G0～G1期和+G2+M期所占比例分别为78.84%和11.16%。结论：应用灭活脐带血清培养体系可成功扩增人脐带间充质干细胞，培养的细胞具有间充质干细胞的基本特性，为建立间充质干细胞库和临床应用提供了理论依据。 2优势 脐带间充质干细胞（MSCs）具有较高的分化潜能，可向多个方向进行分化。它在骨、软骨、肌肉、肌腱、韧带、神经、肝、内皮和心肌等组织工程方面具有广阔的临床应用前景。有报道从人脐带中分离出MSCs，且细胞含量、增殖能力优于骨髓MSCs，免疫原性比骨髓MSCs低[1]，并且具有取材方便，无伦理学争议等优点，因此越来越受到研究工作者们的关注。干细胞的培养体系主要应用含动物血清（如胎牛血清）的培养基，在此种环境下生长的干细胞，其内部结构会发生何种变化尚未可知，为避免含动物血清培养中病毒等病原体污染和异种血清所致的过敏反应，课题组进行了以人脐带血血清为主体的培养体系体外培养扩增脐带间充质干细胞的实验研究。以探讨人脐带血血清替代动物血清用于培养临床组织工程用干细胞的可行性。同时研究脐带间充质干细胞形态学、生长特性、细胞周期、免疫表型等特性，旨在建立脐带间充质干细胞的富集方法，为建立脐带间充质干细胞库和临床应用提供有力的理论依据。[2] 3分离培养
脐带间充质干细胞培养方法
(一)1.Sections of 8–10 cm of umbilical cords, which are routinely discarded, were internally washed with phosphate-buffered saline (PBS), supplemented with 3% penicillin/streptomycin (Invitrogen-Gibco, Grand Island, NY, https://www.sodocs.net/doc/e046058.html, ) and immediately immers ed in Dulbecco ’s modi fied Eagle ’s medium- low glucose (DMEM-LG; Invitrogen-Gibco) supplemented with 10% fetal bovine serum (FBS; Invitrogen-Gibco) and 3% penicillin/streptomycin (Invitrogen-Gibco). All samples were processed within 12 –15 h after collection. 2. UCs were fil led with 0.1% collagenase (Sigma-A ldrich, St. L oui s, https://www.sodocs.net/doc/e046058.html,/sigma-aldrich/home.h tml) in PBS and incuba ted at 37°C for 20 min. Each UC was washed wi th proli feration medium, and the detach ed cell s were harvested after gentl e mass age of the UC. Cells were centr ifuged at 300 g for 10 min, resus -pended in prolifera tion medium, and seeded in 25-cm^ 2 flasks at a densi ty of 5 × 10^7 cells per ml.After 24 h of incubation, non-adherent cells were removed, and culture medi um was replace d every 3 days. （二）HuMSCs were prepared as previously described.8 Wharton's jelly was processed within 24 hours of collection and cut into pieces of about 1 mm3 for culture. These pieces were placed in 24-well plates and cultured in DMEM supplemented with 10% fetal bovine serum (FBS), 5 ng/ml EGF, 5 ng/ml basic fibroblast growth factor, 100 U/ml penicillin and 100 mg/ml streptomycin, and 1 μg/ml amphoterin B. The culture plate was placed in an incubator with saturated humidity at about 37°C containing 5% (v/v) CO2. The medium was changed every three days and the cells were passaged when they reaching 70% confluence. Adherent cells were recovered by treatment with 0.25% trypsin for 3 to 5 minutes then centrifuged. (三) 脐带间充质干细胞的分离：脐带自手术台取下后，浸入含抗生素的生理盐水中，4 ℃保存，在操净台内取出脐带，用D-PBS冲洗净脐动脉和脐静脉内的残余血液，用止血钳和剪刀剔除上述血管，将脐带剪成1 mm^3大小的组织块后放入200 mL 蓝盖试剂瓶，加入质量/ 体积比为0.1%的Ⅱ型胶原酶30 mL，置于恒温振荡仪内持续消化6 h ，100 目筛网过滤收集细胞。加入D-Hank’s液冲洗细胞3 次，用含体积分数为10%胎牛血清的DMEM/F12重悬细胞，调整细胞密度为(4.8×10^3~1×10^4)/cm^2，接种于6 孔板内，于37 ℃、体积分数为5%的CO2孵箱内培养，24 h 后换液。 脐带间充质干细胞在不同培养体系中的体外扩增：待原代培养的脐带间充质干细胞贴壁后，在两个6 孔板中进行3 种培养体系的生长对比实验。第1 个6孔板中细胞密度为1×10^7 L^-1，采用连续适应法使细胞由原代培养时使用的DMEM/F12分别逐步过渡到低糖DMEM、MesenPRO RS?Medium 和STEMPRO?MSC SFM 3 种培养体系，即用含体积分数为10%胎牛血清的DMEM/F12培养基和相应的3种培养基按体积比1 ∶1 混合培养细胞，通过下列混合培养基的方式，连续几代减少当前培养基的量，即1 ∶2 ，1 ∶4 ，1 ∶16和100% 替代培养基，每次适应改变培养体系时，传代细胞一两次，其中孔 1 为原代培养时的DMEM/F12培养液，孔2为低糖DMEM，孔3 为MesenPRO RS?Medium ，孔4 为STEMPRO? MSC SFM。第2 个6孔板中细胞密度为2×10^7 L^-1，每孔培养液设置同上，目的是避免在不同时间消化传代间充质干细胞时出现实验操作上的误差。 (四)脐带间充质干细胞的体外分离培养 (1)脐带白手术台取下后，浸入含抗生素的0．9％生理盐水中，4"C保存； (2)在超净台内取出脐带，用生理盐水冲洗净脐动脉和脐静脉内的残余血液，用止血 钳和剪刀剔除上述血管，将脐带剪成1mm^3大小的组织块； (3)加入质量／体积比为0．1％的II型胶原酶至完全覆盖组织块，置于培养箱内持续消化
脐带间充质干细胞储存意义
以往，新生儿出生后的脐带一直被人们视作废弃物。近些年，随着科技的进步和医学知识的普及，已有不少人知道从脐带血中提取脐带血造血干细胞可用于血液系统疾病的治疗，而提取血液后的脐带同样被当作医疗废弃物处理掉。 其实，脐带组织中蕴含丰富的干细胞资源，其中间充质干细胞最为丰富，间充质干细胞是一种具有奇特功能的干细胞，被认为最具临床应用价值，除了支持造血功能之外，还可用于心血管疾病、肝硬化、骨和肌肉衰退性疾病、脑及脊髓神经损伤、老年痴呆及红斑狼疮和硬皮病及自身免疫性疾病等的治疗，并在美容、保健、抗衰老等方面显示了巨大的应用潜力。从脐带组织中提取的间充质细胞均一性好、活性强、免疫原性低，扩增数量巨大，可供多次使用，是理想的间充质干细胞来源。 孩子出生时是唯一一次获取高质量、高纯度的间充质干细胞的机会，储存脐带间充质干细胞，给孩子和家人一份健康保障！ 储存干细胞能够帮助您什么？ 治疗疾病，拯救生命 宝宝出生时的脐带（过去通常被废弃）中存在造血干细胞和间充质干细胞，可以拯救生命。干细胞能够治疗的重大疾病很多，如白血病、糖尿病、肝硬化、心脑血管疾病、进行性肌营养不良、系统性硬化症等等，到目前为止，干细胞已经可以治疗近100种疾病。 储存健康，有备无患 相当于成人脊髓或脂肪中的干细胞，脐带干细胞更纯洁、更健康、更容易采集。将脐带干细胞储存，是对生命健康的一大保障。脐带干细胞是在宝宝出生时采集，机会只有一次。 宝宝储存，全家可用 脐带间充质干细胞（存在于脐带中的一种干细胞），是一类免疫原性比较低的细胞，家庭成员也可以使用。间充质干细胞数量多，可扩展（使数量增多），满足全家的需要 自体储存，安全放心 自体储存的脐带间充质干细胞具有完美的组织相容性，不需配型，移植后细胞更容易存活，用自己的干细胞治疗更安全，更可靠。 健康投资，性价比高 干细胞是非常昂贵的，国外一份干细胞的价格要1.5—2万美元，国内的也价格不菲，如果使用自己的干细胞治病或保健，会节约大量的费用。 随着科技的发展脐带间充质干细胞作用会越来越广泛。现阶段在美容和抗衰老方面也都取得重要进展。
脐带间充质干细胞(MSCS)抗衰老的临床实验
脐带间充质干细胞（MSCS）抗衰老的临床实验 作者：Simon Sun Isa Li 【摘要】目的：观察脐带间充质干细胞对人体衰老的影响和安全性，对比观察脐带间充质干细胞对衰老的逆转现象。方法：抽取20名健康人作为志愿者，进行脐带间充质干细胞静脉回输（其中男性6人，女性14人，年龄为50-80岁），实验组10名志愿者进行静脉滴注3个疗程脐带间充质干细胞，对照组滴注生理盐水。实验组和对照组志愿者均为双盲实验，疗程结束后3个月、6个月、12个月的对比观察。结论：治疗组有效率为90%，从外表、内分泌、精神状态、体能、睡眠均表现出有效性。 Abstract: Objective: To observe the effect and safety of umbilical cord mesenchymal stem cells (MSCs) on human aging. Methods: a total of 20 healthy volunteers, of umbilical cord mesenchymal stem cells reinfusion (6 males, 14 females, aged 50-80 years old), the experimental group of 10 volunteers were intravenous infusion of 3 cycles of umbilical cord mesenchymal stem cells, the control group of normal saline drip. The experimental group and the control group were double blind experiment, 3 months after the end of treatment, and the observation of 6 months and 12 months. Conclusion: the effective rate of the treatment group was 90%, which was effective from the appearance, endocrine, mental state, physical fitness and sleep. 对抗衰老延长寿命是人类的梦想，但以往的方法以失败见终，究其原因均是不能针对衰老的根本原因所致。而人类衰老的原因一是衰老的细胞不能被代替，正常的新陈代谢因为干细胞的补充不足所致。随着干细胞和研究的发展，以及进行临床治疗中所带来的抗衰老表现，提示脐带间充质干细胞会对衰老的过程产生正影响，具有良好的市场应用价值。本实验就是采取双盲实验的方法来进行对证，验证MSCS对衰老的逆转影响。 脐带间充质干细胞（Mesnchymal Stem Cells，MSCs）是指存在于新生儿脐带组织中的一种多功能干细胞，它能分化成许多种组织细胞，具有广阔的临床应
脐带间充质干细胞的前世今生
脐带间充质干细胞的前世今生 概念：脐带间充质干细胞是以人脐带血血清为主体的培养体系的脐带间充质干细胞培养扩增的方法：流式细胞仪检测结果显示，贴壁细胞均表达CD44、CD29，低表达CD106，不表达造血细胞表型CD14、CD34、CD45和内皮细胞表型CD31，也不表达HLA-DR：细胞倍增时间为30h，细胞周期分析表明，G0～G1期和+G2+M期所占比例分别为78.84%和11.16%。结论：应用灭活脐带血清培养体系可成功扩增人脐带间充质干细胞，培养的细胞具有间充质干细胞的基本特性，为建立间充质干细胞库和临床应用提供了理论依据。 分离培养方法：取新鲜健康脐带，用PBS冲洗干净后，用剪刀镊子剔去血管，剥出里面的华氏胶组织，将所得组织充分剪碎至 1 mm3大小，加入α-MEM培养液置于37℃，5%的CO2培养箱培养，培养液中含10% FBS，100U/ml青霉素，100U/ml链霉素。脐带组织培养5-7天后，可见有部分细胞从组织块周围爬出，形态呈细小的梭形，一周后，细胞开始迅速增殖，形成大小不等的细胞集落，待细胞长满后，用0.25%胰蛋白酶消化传代。 优势：脐带间充质干细胞（MSCs）具有较高的分化潜能，可向多个方向进行分化。它在骨、软骨、肌肉、肌腱、韧带、神经、肝、内皮和心肌等组织工程方面具有广阔的临床应用前景。有报道从人脐带中分离出MSCs，且细胞含量、增殖能力优于骨髓MSCs，免疫原性比骨髓MSCs低[2] ，并且具有取材方便，无伦理学争议等优点，因此越来越受到研究工作者们的关注。干细胞的培养体系主要应用含动物血清（如胎牛血清）的培养基，在此种环境下生长的干细胞，其内部结构会发生何种变化尚未可知，为避免含动物血清培养中病毒等病原体污染和异种血清所致的过敏反应，课题组进行了以人脐带血血清为主体的培养体系体外培养扩增脐带间充质干细胞的实验研究。以探讨人脐带血血清替代动物血清用于培养临床组织工程用干细胞的可行性。同时研究脐带间充质干细胞形态学、生长特性、细胞周期、免疫表型等特性，旨在建立脐带间充质干细胞的富集方法，为建立脐带间充质干细胞库和临床应用提供有力的理论依据。