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成人骨髓间充质干细胞向成骨细胞定向诱导分化的实验研究

成人骨髓间充质干细胞向成骨细胞定向诱导分化的实验研究
成人骨髓间充质干细胞向成骨细胞定向诱导分化的实验研究

骨髓间充质干细胞研究进展(一)

骨髓间充质干细胞研究进展(一) 【摘要】骨髓间充质干细胞是干细胞领域的研究热点之一。虽然近几年来有关间充质干细胞的研究已取得了很大进展,但仍有很多问题有待进一步解决。本文主要对间充质干细胞的生物学特性、以及免疫耐受性、分化和促修复、间充质干细胞的标记等问题进行综述。 【关键词】骨髓间充质干细胞分化标记 骨髓间充质干细胞,BMSCs)是骨髓内除造血干细胞(hematopoieticstemcells,HSC)之外的另一类干细胞,是骨髓造血微环境的重要组成部分,在体内外均具有支持和调控造血的作用。因其比较容易贴壁和形成成纤维样的克隆,因此也称成纤维细胞集落形成单位(Colonyformingunitfibroblast,。又由于它们来自骨髓的支持结构,并作为滋养层支持造血干细胞的生长,因此也有人称其为骨髓基质细胞(Bonemarrowstromalcells,BMSCs)。 1骨髓MSCs的生物学特性 不同物种的BMSCs体外培养的形态学特征大致相同,主要表现为梭形、纺锤形,少数为多角形。目前,BMSCs的分离方法主要有以下几种:(1)全骨髓培养,是将无菌抽取的骨髓加入培养液制成细胞悬液并培养,原代培养培养物以造血细胞成分居多,为利于BMSCs的贴壁生长,可采用DMEM和胎牛血清培养。BMSCs对营养要求高,胎牛血清终浓度为10%~20%,有人认为红细胞会随着换液而逐渐被自然去除,对BMSCs影响不大。细胞融合后以1:2比例传代,3~4天换液一次〔1〕;(2)离心培养法,是根据骨髓中细胞成分比重的不同,采用离心分离法提取单核细胞进行培养。在新鲜无菌的骨髓抽取物中加入抗凝培养液稀释1500~2000r/min离心20~30min,采集交界处的单核细胞层,PBS洗涤2~3次后,加入培养液接种培养;(3)细胞表面分子标记分选法,主要是根据BMSCs的细胞表面分子特征来分离。一般采用流式细胞仪、免疫磁珠或免疫沉积法来进行分选。但由于目前仍未找到BMSCs 特异性的细胞表面标记物〔2〕该法较少采用。影响BMSCs扩增的主要因素:(1)血清:血清对大量扩增BMSCs起着重要的作用,不同浓度的血清对培养BMScs纯度的影响亦较大,常用10%~20%的胎牛血清培养BMSCs;(2)接种密度:BMSCs的体外扩增速度与其接种密度也有关,一般认为较低密度种植有益于增殖。高密度接种后细胞生长较慢其原因可能是由于细胞间的接触抑制,或细胞释放到培养基中的因子影响了BMSCs的生长;(3)细胞因子:一些细胞因子对于维持BMSCs增殖和未分化状态亦十分重要;(4)动物种属:一般认为BMSCs的生长特性相似,但也有资料显示BMSCs生长特点有种属差异〔3〕。 2间充质干细胞移植后的免疫耐受性 在移植治疗中,一般情况下,移植物会引起宿主的免疫排斥反应。但对于间充质干细胞来说却不是这样。实验表明间充质干细胞可以抑制T细胞的增殖从而导致免疫耐受〔4~7〕。T 细胞与其它细胞的相互作用可以通过混和淋巴细胞反应来观察。被标记的T细胞与其它细胞混合后,如果可以引起T细胞的免疫反应,则可以观察到T细胞的增殖现象。但当把间充质干细胞与T细胞混合后却观察不到T细胞的增殖反应,而且这种现象并不是由于T细胞凋亡或其它的有害作用引起的。因为在去除间充质干细胞后,这些T细胞仍然可以对其它物质进行反应。此外,使用趋化膜将两种细胞分隔开培养后,间充质干细胞对T细胞的抑制作用依然存在,表明这种抑制作用可能通过某种可溶性的小分子起作用。另外,除了未分化的间充质干细胞可以抑制T细胞的增殖外,实验也表明,随着干细胞的分化,其抗原性并没有随之增加〔8〕。总之,间充质干细胞可以通过某种机制抑制T细胞的成熟来逃避免疫系统的清除。也暗示间充质干细胞可能在机体免疫系统的调节及骨髓中各种干细胞未分化状态的维持方面起作用。 3促组织修复和细胞分化 骨髓间充质干细胞(BMSCs)是存在于骨髓组织中的一类成体干细胞(adultstemcells,AS),在一

人脐带间充质干细胞分离培养及向脂肪与成骨细胞的分化

中国组织工程研究与临床康复 第14卷 第14期 2010–04–02出版 Journal of Clinical Rehabilitative Tissue Engineering Research April 2, 2010 Vol.14, No.14 P .O. Box 1200, Shenyang 110004 https://www.sodocs.net/doc/e54544236.html, 2492 1 Biomedicine Research and Development Centre of Jinan University, Guangzhou 510632, Guangdong Province, China; 2 Guangzhou (Jinan)-Hong Kong Joint Laboratory of Cell Engineering, Guangzhou 510632, Guangdong Province, China; 3 Asia-Pacific Stem Cell Research Centre Co., Ltd., Hong Kong 999077, China; 4 Department of Obstetrics and Gynecology, First Affiliated Hospital of Jinan University, Guangzhou 510632, Guangdong Province, China; 5 Department of Bioengineering, Clemson University, Clemson, SC 29634-0905, USA He Shao-qing ★, Studying for master’s degree, Biomedicine Research and Development Centre of Jinan University, Guangzhou 510632, Guangdong Province, China; Guangzhou (Jinan)-Hong Kong Joint Laboratory of Cell Engineering, Guangzhou 510632, Guangdong Province, China heshq106@https://www.sodocs.net/doc/e54544236.html, 人脐带间充质干细胞分离培养及向脂肪与成骨细胞的分化**★△○ 何绍清1, 2,罗振宇1, 2,刘秋英1, 2,周向荣△2, 3,邓铭权△2, 3,罗 新4,姚润斯4,高 志5,王一飞○1, 2 Isolation of human umbilical cord mesenchymal stem cells and differentiation into adipocytes and osteblasts He Shao-qing 1, 2, Luo Zhen-yu 1, 2, Liu Qiu-ying 1, 2, Zhou Xiang-rong 2, 3, Deng Ming-quan 2, 3, Luo Xin 4, Yao Run-si 4, Gao Zhi 5, Wang Yi-fei 1, 2 Abstract He SQ, Luo ZY, Liu QY, Zhou XR, Deng MQ, Luo X, Yao RS, Gao Z, Wang YF. Isolation of human umbilical cord mesenchymal stem cells and differentiation into adipocytes and osteblasts. Zhongguo Zuzhi Gongcheng Yanjiu yu Linchuang Kangfu. 2010;14(14): 2492-2496. [https://www.sodocs.net/doc/e54544236.html, https://www.sodocs.net/doc/e54544236.html,] 摘要 何绍清,罗振宇,刘秋英,周向荣,邓铭权,罗新,姚润斯,高志,王一飞.人脐带间充质干细胞分离培养及向脂肪与成骨细胞的分化[J].中国组织工程研究与临床康复,2010,14(14):2492-2496. [https://www.sodocs.net/doc/e54544236.html, https://www.sodocs.net/doc/e54544236.html,] 0 引言 间充质干细胞具有自我更新能力,能分化成为成骨、软骨、肌肉和脂肪细胞等间质组织细胞[1-3],甚至能分化为心肌、神经胶质和神经细胞[4-6]。近年来因其在组织工程和细胞替代治疗的临床前研究而备受关注。间充质干细胞分布在体内骨髓和其他组织与器官中,如脂肪组织、脐血,甚至外周血也发现有间充质干细胞 [7-10] 。 目前,骨髓间充质干细胞是最常用的种子细胞,但其数量和分化潜能随着年龄的增长显著减少 和降低[11-13],并且取材时易对供体造成身体伤害。因此,非常有必要寻找新的自体和异体移植的细胞来源。这种新的细胞除了必须具备骨 髓间充质干细胞有更强的增殖力和多向分化潜能的特点外,还必须取材便利,不易造成病毒污染,且不受伦理道德限制等。 脐带由中胚层发育而来,是胎儿时期连接胎儿和母体的索状结构,外由羊膜包被,内有两条动脉和一条静脉及血管周围富含蛋白多糖和黏多糖的组织组成[14]。分娩后的脐带一直都被当废弃物丢弃,近年来因寻求更多来源的成体干细胞而受到关注。自Mitchell 等[15]提出

人骨髓间充质干细胞的贴壁分离与体外培养

万方数据

ISSN1673—8225CN21.1539/R赵凌云,等人骨髓间充质干细胞的贴壁分离与体外培养wwM.zglckf,comkf23385083@sina.com 0引言 骨髓间充质干细胞是具有形成骨、软骨、脂肪、神经和成肌细胞能力的多种分化潜能的细胞亚群,取材方便,易于体外扩增,可进行自体移植,而不存在组织配型和免疫排斥的问题,被认为是骨组织工程中最佳的种子细胞。本实验目的在于建立一种可行的骨髓间充质干细胞取材和分离扩增的培养方法。 1材料和方法 设计:开放性实验。 单位:解放军济南军区总医院脊髓修复科。 材料:实验于2006—02/12在解放军济南军区总医院脊髓修复科完成。骨髓来源于解放军济南军区总医院脊髓修复科收治的脊髓完全性损伤患者,对本实验均知情同意。基础培养液由含体积分数为0.15胎牛血清和低糖仪一MEM配置。低糖d-MEM培养基(Hyclone);淋巴细胞分离液(密度1.077g/mL,上海试剂二厂生产);胰蛋白酶,胎牛血清(Gibico);C02培养箱(上海力申科学仪器有限公司,HF90);生物安全柜(上海力申科学仪器有限公司,HFsafe一1200/c);倒置显微镜(Leica);离心机(JOUANB4i多功能台式机)。 设计、实施、评估者:设计、实施为第一作者,评估为第二、三作者,均经过系统培训,未使用盲法评估。 方法: 骨髓间充质干细胞的分离及传代培养:在无菌条件下,以含5mL肝素钠生理盐水的20mL注射器,于患者髂后上棘穿刺抽取骨髓组织6mL,移入含5mL肝素钠生理盐水的试管内,混匀,而后沿管壁缓慢加入含10mL淋巴细胞分离液的离心管中,2000r,min离心20min,小心吸取界面层细胞,用D—Hanks平衡盐溶液洗2次,2000r/min离心8min,加入基础培养液,血细胞计数板计数,调整细胞的浓度,将细胞悬液按109—1010L-1接种于培养瓶,放置37℃、体积分数为0.05的C02饱和湿度孵箱中培养。于培养后的两三天更换培养液,并用D-Hanks平衡盐溶液冲洗2次,以去除未贴壁的造血细胞,以后每3d换液一次,进一步去除未贴壁的细胞。观察细胞生长情况,待细胞融合成片、长满培养瓶底部后,用质量浓度为2.5g/L的胰蛋白酶流过所有细胞表面,盖好瓶盖,将培养瓶放在倒置显微镜下观察,发现细胞变圆,部分脱壁,控制消化时间不超过3min,立即加入2mL有血清培养液终止消化,用弯头吸管轻轻吹打细胞生长区域,吹打过程中不要用力,结束后再用少量培养液漂洗一遍,然后加入适 5650量培养液计数,分别接种在新的培养瓶内。 骨髓间充质干细胞的生长曲线的绘制:取第3代生长状态良好的细胞,用质量浓度为2.5g/L的胰蛋白酶消化制成细胞悬液,接种至24孔培养板,3孔/组,细胞1×104/孔,每孔加入培养液1mL,放置37℃、体积分数为0.05的C02孵箱中培养。以细胞数为纵坐标,时间为横坐标,绘制细胞生长曲线。 骨髓间充质干细胞贴壁率的测定:取第3代生长状态良好的细胞,用质量浓度为2.5g/L的胰蛋白酶消化制成细胞悬液,接种至24孔培养板,3孔/组,细胞1×104/孔,每孔加入培养液1mL,放置37℃、体积分数为0.05的C02孵箱中培养,每隔2h进行细胞贴壁率检测。 主要观察指标:①骨髓间充质干细胞的形态学观察。②骨髓间充质干细胞的生长曲线。③骨髓间充质干细胞的贴壁率。 统计学分析:由第一作者采用ESA4.0软件进行统计处理,数据以娃s表示。 2结果 2.1骨髓间充质干细胞的形态学观察倒置显微镜下,骨髓间充质干细胞接种1d即贴壁,2d时贴壁细胞较多。经冲洗和换液去除悬浮细胞后,贴壁细胞继续培养3d开始增殖,伸展为椭圆型、短梭型、多角型及不规则型等(图1)。至14d细胞密集在集落中心,基本铺满瓶底,第3~5代细胞呈均匀一致的长梭型,排列成旋涡状或放射状(图2)。 图1原代培养的骨髓间充质干细胞贴壁后3d开始增殖,伸展为椭圆型、短梭型、多角型及不规则型等(倒置显微镜,x20) 2.2骨髓间充质干细胞的生长曲线骨髓间充质干细胞传代后3d内处于潜伏期,3d后进入生长期,7d后进入平台期。第3代骨髓间充质干细胞生长曲线见图3。 P.O.Box1200。Shenyang110004kf23385083@sina.com www.zglckf.com  万方数据

骨髓间充质干细胞体外诱导分化与标记(一)

骨髓间充质干细胞体外诱导分化与标记(一) 作者:吴晓林,李冬民,马德茂,张晓田,黄石,宋天保 【关键词】骨髓 【Abstract】AIM:Tostudythedifferentiationcharacteristicsandtheoptimaldosageandtimingforbromodeoxyuridi ne(Brdu)labelingofratbonemarrowderivedmesenchymalstemcells(MSCs)invitro.METHODS:Therat marrowstemcellsisolatedbyusingPercoll(1.073kg/L)wereculturedandproliferated.Thethirdpassage cellswereinducedwithdexamethasome,βglycerophosphate,ascorbicacid2phosphate,IGF1andinsuli n.Onday21,thecellswereanalyzedbyimmunohistochemistryfortypeⅠcollagenandbyhistochemistry foralkalinephosphatase(AKP).ThepurifiedMSCswereincubatedwithBrduatdifferentconcentrations( 5,10and15μmol/L)fordifferenttimeperiods(12,24,48,72and96h),followedbyimmunohistochemistryforBrdutoidentifytheoptimalBrduconcentrationandi ncubationtimeperiod.RESULTS:Afterincubationfor21dforinduceddifferentiationintoosteoblasts,ty peⅠcollagenandAKPwerepositivelyexpressed.Theincubationwith10μmol/LBrdufor72hachievedov er98%ofthelabelingratewithoutproducingobviouscelldamages.CONCLUSION:MSCscanbeinducedt odifferentiateintoosteoblastsundercertainconditionsinvitro.TheoptimalBrdulabelingconcentration andtimeperiodare10μmol/Land72h,respectively. 【Keywords】MSCs;induceddifferentiation;osteoblast;Brdu 【摘要】目的:探讨骨髓间充质干细胞(MSCs)在体外的诱导分化及5溴脱氧尿嘧啶核苷(Brdu)标记MSCs的可行性.方法:利用密度为1.073kg/L的percoll分离骨髓的单个核细胞,体外培养与扩增MSCs;取生长良好的第3代细胞,用成骨细胞分化培养液培养21d,Ⅰ型胶原免疫组化染色和碱性磷酸酶(AKP)组化染色;分别以浓度为5,10和15μmol/L的Brdu溶液标记MSCs,孵育12,24,48,72和96h后免疫组化检测Brdu,确定最佳标记量和最佳标记时间.结果:诱导分化第21日,AKP染色呈强阳色,Ⅰ型胶原免疫染色呈阳性.10μmol/LBrdu 标记MSCs的效果最好,随着孵育时间的延长,Brdu标记率逐渐增高,标记72h后标记率在90%以上.结论:MSCs在体外一定条件下可定向诱导分化为成骨细胞,用Brdu标记MSCs的最佳浓度为10μmol/L,最佳时间是72h. 【关键词】骨髓间充质干细胞;诱导分化;成骨细胞;5溴脱氧尿嘧啶核苷 0引言 骨髓间充质干细胞(mesenchymalstemcells,MSCs)是一类具有多向分化潜能的组织干细胞.因MSCs取材方便、对机体的损伤小、具有较强的传代增殖能力和免疫耐受性等特点而受到越来越多的关注.本实验的目的是利用MSCs具有分化潜能的特点,在体外诱导该细胞定向分化为成骨细胞.并用Brdu标记连续传代的MSCs,观察最佳标记时间及标记剂量,从而为追踪Brdu标记的MSCs移植入体内后的存活、生长及分化奠定基础. 1材料和方法 1.1材料健康雄性SD大鼠,体质量55~70g.由西安交通大学医学院实验动物中心提供. 1.2方法 1.2.1大鼠骨髓MSCs的体外分离培养将大鼠引颈处死后置于750mL/L乙醇浸泡约5min,无菌条件下分离出大鼠的股骨和胫骨.用PBS冲洗出骨髓细胞,经5mL针管反复吹打制成单细胞悬液,用200目的不锈钢网过滤,收集滤液.在密度为1.073kg/L的percoll(Phamacia)分离液上缓慢加入收集的滤液,2500r/min离心20min,收集滤液与分离液之间的白膜层细胞,用DMEM(Gibco)洗涤两次,1000r/min离心5min.用加有100mL/L胎牛血清(杭州四季青公司)的DMEM重悬细胞,1×108个/L种于两个直径为6cm的培养皿中培养,2d后更换培养液,加入完全培养基.并将吸出的旧培养液分别移入另两个平皿中继续培养,再过2d更换

小鼠骨髓间充质干细胞的分离培养与鉴定

小鼠骨髓间充质干细胞的分离培养与鉴定 发表时间:2012-05-24T09:50:06.677Z 来源:《医药前沿》2012年第1期供稿作者:林芸1 蔡鹏威2 陈为民1 孟春3 [导读] 分离、培养符合实验要求的小鼠骨髓间充质干细胞并进行鉴定,为进一步的研究打基础。 林芸1 蔡鹏威2 陈为民1 孟春3 ( 1 福建医科大学省立医院临床学院血液科福建福州 3 5 0 0 0 1 ) ( 2 福建省立医院检验科福建福州 3 5 0 0 0 1 ) ( 3 福州大学生物工程学院福建福州 3 5 0 0 0 1 ) 【摘要】目的分离、培养符合实验要求的小鼠骨髓间充质干细胞并进行鉴定,为进一步的研究打基础。方法采用贴壁培养法培养小鼠骨髓间充质干细胞,观察细胞的形态及生长特性,并应用流式细胞仪对细胞表面抗原CD34、CD45、CD29、CD44进行表型鉴定。结果原代分离的间充质干细胞在接种后培养24小时,细胞开始贴壁,胞体呈圆形或多边形,培养第3-5天,细胞开始较紧密贴附壁上并开始有细胞呈梭形,培养第7天开始观察到细胞分裂,随着细胞数的增加,细胞的生长速度变快,逐渐成漩涡状排列,培养第12天贴壁细胞长满瓶底的80%,并融合成片。传代后细胞生长迅速,培养7天左右即可长满瓶底的80%。传至10代仍具有良好的增殖活性。流式细胞仪检测第4代及第8代MSCs细胞均不表达CD34、CD45,但表达CD29、CD44,纯度分别为73.8% 、91.65%。结论采用贴壁培养法可获得生长状态良好、增殖能力强的间充质干细胞,随传代数增加,其纯度增加,且该方法简单、实用。 【关键词】骨髓间充质干细胞细胞培养流式细胞术表型鉴定 【中图分类号】R392.2 【文献标识码】A 【文章编号】2095-1752(2012)01-0082-02 间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs)起源于中胚层,具有高度增殖和自我更新的能力,有向骨、软骨、脂肪、血管内皮细胞、神经星型胶质细胞等分化的潜能[1],可分化成骨髓基质支持造血,并可分泌多种细胞因子促进造血干细胞增殖分化,同时它能抑制同种异体反应性T淋巴细胞,在同种异基因造血干细胞移植后的造血重建及免疫调节,预防移植物抗宿主病等方面有广阔的应用前景[2],但骨髓间充质干细胞含量极低,仅占骨髓单个核细胞的0.001%-0.010%[3],因此,培养出生长状态良好,足够数量的骨髓间充质干细胞是应用的前提。 1 材料和方法 1.1 材料 1.1.1 实验动物雄性,C57B L/6小鼠,清洁级,8周龄,体重18-20g,购于吴氏动物实验中心。 1.1.2 实验仪器与试剂低糖DMEM培养基(Gibco公司),特级胎牛血清(Hy c l o ne公司),胰蛋白酶(Si gma公司),青霉素钠(Si gma公司),链霉素(Si g m a公司),5%C O2培养箱(日本三洋公司),流式细胞仪(BD FA CSCalibur),倒置显微镜(OLYMPUS),大鼠抗小鼠单克隆抗体:CD29-PE、CD44-FITC、CD34-PE、CD45-FITC(BD公司)。 1.2 方法 1.2.1 小鼠骨髓间充质干细胞的分离及原代培养取8周龄雄性C57BL/6小鼠,颈椎脱臼法处死,75%酒精浸泡5分钟,取出双侧腿骨,置于装有P BS溶液的培养皿中小心剔除粘连于骨上的肌肉组织,移入装有预冷的含10%特级胎牛血清、青霉素钠100U/ml、链霉素0.1g/L 的低糖DMEM培养液的培养皿中,剪去腿骨两端,用1m l注射器抽取培养液反复冲洗骨髓腔,直至骨发白,收集冲洗液,反复吹打使细胞打散,静置10分钟,小心将上清移至灭菌的10m l离心管中,4℃3000r p m离心3分钟,弃上清,用含10%特级胎牛血清的L-DMEM培养液重悬细胞,反复吹打混匀,4℃3000r p m离心3分钟,弃上清,再用含10%特级胎牛血清的L-D M EM培养液重悬细胞,反复吹打混匀,4℃3000r p m离心3分钟,弃上清,再用含10%特级胎牛血清的L-DMEM培养液重悬细胞,反复吹打混匀,调整细胞密度为5×105个/ml接种于25cm2培养瓶中,置于5%C02,37℃,饱和湿度95%的培养箱中培养4小时后,轻轻吸出上清,并加入新鲜培养液。培养24小时后轻轻吹打,使未贴壁的细胞悬浮,吸出上清,加入新鲜的培养液,继续培养。以后每天换液1次,并观察细胞形态。 1.2.2 小鼠骨髓间充质干细胞的传代培养原代细胞生长接近瓶底的80%时,吸去上清,加入0.125%胰蛋白酶,37℃条件下消化并观察细胞形态,待细胞呈球形、不在粘连时吸弃胰酶,加入新鲜培养液重悬细胞,4℃3000r pm离心3分钟,弃上清,再加入培养液重悬细胞,反复吹打混匀,按1:2比例接种到新的培养瓶,置于5%C02,37℃,饱和湿度95%的培养箱中继续培养,仍然每天换液,直至细胞贴壁融合成片,接近瓶底80%时,重复以上操作,再次传代。 1.2.3 小鼠骨髓间充质干细胞的表型鉴定收获第4代及第8代生长良好的细胞,胰酶消化后,4℃1000r p m离心5分钟,弃上清,PBS洗涤细胞2次,每代细胞分别设2管,调节每管细胞数为5×105,分别加入C D29和C D44、CD34和CD45单抗,室温孵育30分钟,PBS洗涤细胞3次,流式细胞仪检测分析,同时用PBS作为一抗设置阴性对照。 2 结果 2.1 小鼠骨髓间充质干细胞的原代培养及扩增培养4小时后吸出上清,加入新鲜培养液后,大多数悬浮细胞被吸出,瓶中细胞数目明显减少,并且都呈现球转,折光率较强,原代分离的间充质干细胞在接种后培养24小时,细胞开始贴壁,胞体呈圆形或多边形,培养第3-5天,细胞开始较紧密贴附壁上并开始有细胞呈梭形,并不断长大、变长,但未观察到细胞分裂,培养第7天开始观察到细胞分裂(图1),随着细胞数的增加,细胞的生长速度变快,逐渐成漩涡状排列,培养第12天贴壁细胞长满瓶底的80%,并融合成片(图2)。传代后细胞生长迅速,培养7天左右即可长满瓶底的80%。传至10代仍具有良好的增殖活性。

_骨髓间充质干细胞在骨科中的应用

第9卷第18期·总第122期 2011年09月·下半月刊 87骨髓间充质干细胞在骨科中的应用※ 陈亮1陈跃平1,2* 摘要:骨髓间充质干细胞(BMSC)是一种来自中胚层发育的早期干细胞,具有多向分化潜能的特性,可分化为骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞等。临床上还运用BMSC治疗骨科疾病大量的体外实验已获成功。 关键词:骨髓间充质干细胞;骨科学;文献综述 doi:10.3969/j.issn.1672-2779.2011.18.055 文章编号:1672-2779(2011)-18-0087-03 骨髓中含有2类干细胞,①造血干细胞,它为循环血液提供前体细胞;②非造血性干细胞,它是骨髓中造血结构性和功能性支持细胞,在调节造血干细胞的长期存活,生长分化中起重要作用。早期分离培养时,发现其形状呈成纤维细胞样而称其为“成纤维细胞集落形成单位”或“骨髓基质成纤维细胞”。随着研究的深入,人们发现其对骨髓造血干细胞起支持诱导作用,又因其来自于骨髓基质,因而称其为“骨髓基质细胞”。因其在不同的诱导条件下,有向中胚层组织细胞分化的能力,又称其为“骨髓间充质干细胞”。 1 骨髓间充质干细胞多向分化特性 多向分化潜能被认为是BMSC最重要的生物学特征。大量体外实验证明,在不同诱导条件下,BMSC可以向多种中胚层来源的组织细胞分化,如成骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞等。 1.1 BMSC向成骨细胞的定向诱导分化BMSC在体外培养中,通过地塞米松、β磷酸甘油和抗坏血酸等的诱导,能够分化为成骨细胞。Ouyang等[1]在培养基内加入抗坏血酸后BMSC排列紧密呈片状生长,将BMSC片与去除矿物质的移植骨片结合植入受损部位,3周后形态学、组织学、免疫组织化学观察显示,植入物的结构与正常骨膜相似,并向成骨、软骨分化。 1.2 BMSC向软骨细胞的定向诱导分化BMSC向软骨细胞的定向诱导分化将此分离的BMSC加入无血清培养体系中培养,培养体系中加入转化生长因子β、软骨来源形态形成蛋白及整合素可促使BMSC向软骨细胞分化。舒朝锋等[2]实验证明,在单层诱导培养条件下,人骨髓BMSC能分泌软骨细胞特征性细胞外基质如Ⅱ型胶原、糖胺多糖等,具有作为软骨组织工程种子细胞来源的可能。 1.3 BMSC向脂肪细胞的定向诱导分化 1999年,Pittenger等[3]人的BMSC培养体系中加入甲基异丁基黄嘌呤、地塞米松、胰岛素和茚甲新等,结果成功地诱导出脂肪细胞,细胞内聚集脂滴,并表达过氧化物酶体增殖物激活受体,脂蛋白脂酶和脂肪酸结合蛋白aP2。在这种培养条件下,约95%的细胞向此系分化,细胞内的脂质小泡持续增加直至充满细胞,这些物质可被油红染成红色。 ※基金项目:广西壮族自治区科技厅自然基金[No:2010GXNSFA013223] 作者单位:1 广西中医学院附属瑞康医院骨科(南宁530011) 2 南方医科大学在读博士(南宁530011) *通讯作者 2 骨髓间充质干细胞的分离方法 骨髓中BMSC含量很少,仅占骨髓内单个核细胞总数的0. 001%~0.01%,并随年龄的增加而减少,因此,必须实现其体外分离培养、扩增。目前BMSC的分离方法主要以下几种:①密度梯度离心法:主要根据骨髓中细胞成分的比重不同,清除红细胞,分离提取骨髓单个核细胞进行贴壁培养。目前较常用Percoll 液(1.073 g/ml)和Ficoll 液(1.077 g/ml)进行密度梯度离心。值得注意的是,不同密度的分离液对BMSC的纯度影响极大。这种方法分离培养的BMSC大小均匀,纯度较高,Pittenger等[4]在过密度梯度离心法分离培养的BMSC在第1代纯度可达95%,第2代达98%。因此该法被广泛采用。②贴壁筛选法:即全骨髓法,是根据BMSC贴壁生长而造血系细胞悬浮生长的特性,通过定期换液除去不贴壁细胞,收集贴壁生长BMSC,其纯度可达95%。目前多用这两种方法,细胞的粘附特性仍是分离和纯化BMSC的最基本原则,物理性富集后塑料器皿内的贴壁培养仍是分离BMSC的最基本方法,更好的分离方法还有待于进一步的探索。 3 BMSC的表面标志及鉴定 3.1 表面标志到目前为止,BMSC的表面抗原具有非专一性,它表达了间质细胞、内皮细胞和表皮细胞的表面标志。主要包括:①粘附分子,如CD166、CD54、CD102、CD44、CD106等。②生长因子和细胞因子受体,如IL-1受体、IL-3受体、IL-4受体、IL-6受体、IL-7受体、干扰素γ受体、肿瘤坏死因子α等。③整合素家族成员,包括CD49a、CD49b、CD49c、CD29、CD104等。④其它,如CD90、CD105等。不表达造血细胞的表面标志,如CD34、CD45、CD14、CD3、CD4、CD8等,也不表达与人白细胞抗原识别有关的共刺激分子B721、B722及主要组织兼容性复合物Ⅱ类分子如人白细胞DR 抗原等[5,6]。此外,BMSC自身还能产生一些造血及非造血的生长因子、白细胞介素和化学激动因子,但除细胞因子是持续性产生外,其它的仅仅在受到刺激后表达,BMSC还能产生一系列的基质分子,包括纤维连接素、胶原、蛋白聚糖,还能表达基质2细胞,细胞2细胞等相互作用的反受体,其中特别有关的是对CD44强表达,CD44是多种配体的受体,其分别在骨、骨髓中对细胞外基质构建起着重要的作用[7,8 ]。 3.2 鉴定对BMSC进行鉴定可联合细胞化学和流式细胞分析方法[9]。细胞化学方法,BMSC具有独特的代谢特点,几乎所有细胞酸性萘酚酸酯酶及糖原阳性,酸

骨髓间充质干细胞向神经元样细胞分化的研究进展

378陕西中医2010年第31卷第3期 药杂志,2004,32(3):180—182, [73金静愉,郁仁存.乳腺癌中西医结合诊治方案口].中国肿瘤,1995,4(5):7-10。 [8]刘胜,吴雪卿,陈前军.407乳腺癌术后患者辨证分型规律探析口].辽宁中医杂志,1999,26(9):387—388.[9]唐汉钧,高尚璞,郑勇.中医药治疗乳腺癌术后288例临床观察口].上海中医药大学报,2002,16(3):23.[10]刘燕珠,王泳,吴丹红,等.中西医结合治疗乳腺癌68例[J].福建中医药,2000。31(3):30—31. [nl万华,吴雪卿,陆德铭.扶正祛邪在治疗乳腺癌中的运用[J].上海中医药大学学报,2002,16(1):30—31.[12]朱华宇,司徒红林.林毅辨治乳腺癌经验撷菁[J].辽宁中医杂志,2007,34(4):395—396. [133武自力.金静愉治疗乳腺癌经验[J].四川中医,2007,25(8)5—6. [14]刘胜,赵倩,刘佳,等.乳腺癌术后方对乳腺癌术后5年复发转移率的影响[J1.中西医结合学报,2008,6(10):1000—1004. [15]刘胜,花勇强,孙平,等.乳移平抗乳腺癌术后复发转移的临床研究[J].中西医结合学报,2007,5(2):147—149. [16]卓斌.乳康汤治疗36例乳腺癌术后或放、化疗后的临床观察口].湖南中医学院学报,1995,15(2):23. [17]陈英.益气养血、清热解毒治疗乳癌术后41例[J].浙江中医学院学报,1999,23(6):301. [18]李增战,陈捷,苗文红,等.鹿仙散结汤治疗晚期乳腺癌30例[J].陕西中医,2007,28(5):526—527. [19]喻伟国,程进明.抗癌汤结合化疗治疗肿瘤术后48例总结口].湖南中医杂志,2003,19(1):11—13. [20]李景鹏,贾英杰.贾英杰治疗乳腺癌术后的经验[J].湖北中医杂志,2007,29(7):23. [21]黄智芬,刘俊波,陈强松,等.健脾消积汤联合化疗对晚期乳腺癌患者生活质量及免疫功能的影响[J].新中医,2007,39(5):88—89. [22]樊淳理.中药治疗乳腺癌术后化疗患者41例[J].中医杂志,2006,47(3):226. [23]张卫红.卞卫和教授治疗乳腺癌经验举隅[J].南京中医药大学学报,2007,23(2):126-128. [241黄梅,杨海燕.益气活血汤改善脾虚挟瘀型乳腺癌患者化疗毒副作用的临床研究口].湖北中医杂志,2005,27(7):9-10。 [25]周明,吴勇华,刘永达.中西医结合治疗晚期乳腺癌14例分析口].中国中西医结合杂志,1995,15(4):237.[26]罗雪冰.益气祛邪汤治疗乳腺癌术后76例疗效观察[J].华夏医学,2007,(2):247—248. [27]沈哗华,宋明志,黄雯霰.中西医结合治疗71例乳腺癌术后患者的疗效分析[J].中西医结合学报,2003,1(1):30-31. [281向丽萍,欧阳恒,肖毅良.菊藻丸抗乳腺癌术后复发转移的临床观察[J].中国临床药理学与治疗学,2002,7(1):63—64. [29]王义程,丁凌,鲁志诚.三苯氧胺加中成药治疗绝经后晚期乳腺癌[J].肿瘤研究与临床,1996,8(4):265.[30]CohenI,TagliaferriM,TripathyD.TraditionalChinesemedicineinthetreatmentofbreastcancer口].SeminOnc01.2002,29(6):563—564. [31]CuiY,ShuXO,GaoY,etal.UseofcomplementaryandalternativemedicinebyChinesewomenwithbreastcancer口],BreastCancerResTreat.2004,85(3):263—270. [32]刘叙仪,孟松娘.杨敬贤,等.中药R3对耐阿霉素人乳腺癌细胞MCFTadr多药耐药的逆转i-J].中国肿瘤临床,1997,24(5):325—330 [331姜晓峰,甄永苏.大黄素逆转肿瘤细胞多药抗药性的作用[J].药学学报,1999,34(3):164—167. [34]WangL.YangCH,HorwitzSB,etal.Reversalofthebumanmurinemultidrug—resistapcephenotypewithmegestrolacetate[J].Cancer.ChemotherpharmAcol,1994,34:96. [353李忠.临床中医肿瘤学[M].辽宁科学技术出版社,2002,124—125. (收稿2009—12—10;修回2010-01—24) 骨髓间充质干细胞向神经元样细胞分化的研究进展’秦安清刘黎青△于娜◇周盛年△▲山东中医药大学基础医学院(济南250355) 【中图分类号】Q25【文献标识码】A【文章编号】lOOO一7369(2010)03~0378—03 *山东省科技攻关课题(NO:2007GGl0002017);山东省中医药管理局资助课题(NO:2007—006) △通讯作者:刘黎青周盛年 ▲山东大学齐鲁医院神经内科(济南200012) ◇山东省昌乐县中医院(昌乐262400) 骨髓问充质干细胞(BoneMarrowMesenchymalstemcells,BMSCs)又称骨髓基质干细胞,是骨髓细胞中除去造血干细胞(非粘附细胞)之外的细胞部分,作为成体干细胞之一,具有多项分化潜能,能向骨、软骨、肌肉、神经、角膜上皮细胞等中胚层或外胚层组织细胞分化,是组织工程中重要的种子细胞之一,并且具有取材方便,扩增迅速,可自体移植等特点,因 万方数据

间充质干细胞分化为心肌细胞的研究进展

间充质干细胞分化为心肌细胞的研究进展 【摘要】心肌梗死等缺血性心脏病严重威胁人类生存和生活质量,组织工程技术为根治心肌梗死等心脏病提供了一种新的方法,近年来,心肌组织工程有了较大的进展,但在种子细胞等方面的难题还远没有解决。本文对关于间充质干细胞分化为心肌细胞的研究作了一下综述,为细胞替代治疗的研究提供一定的参考。 【Abstract】Ischemic heart disease such as myocardial infarction endanger human health and life,cardiac tissue engineering is one of the new radical therapy for myocardial infarction.In recent years,researchers have made great progress in cardiac tissue engineering,but the problems of seed cells and scaffold materials are far from resolved.This paper reviews research advances of mesenchymal stem cells induced into cardiomyocyets so that it may contribute to Cell therapy. 【Key words】 Mesenchymal Stem Cells;Cardiomyocyets;Cell therapy 在成人肌肉组织中,心肌细胞(Cardiomyocytes,CMs)属于终末分化期永久性细胞,不具有再生能力[1],其对有丝分裂信号作出的反应是细胞肥大[2]而不是再生,致使损伤后心肌再生和修复严重受限,由于心肌损伤后无法通过自身的增殖、分化进行修复,坏死的心肌则由纤维疤痕组织取代[3,4]。研究发现心肌中也含有干细胞[5-7],在心肌梗死(Myocardial infarction,MI)后这些细胞会发生分裂增生,但数量极少,增殖能力太小,不能完整地修复心肌组织,更不能满足心肌组织再生的需求,致使具有收缩功能的CMs减少,最终发展成充血性心力衰竭、死亡,严重影响患者的生活质量。临床上缺乏对病变冠状动脉的再造和梗死心肌的再生、重建的根本治疗方法,而细胞替代治疗通过移植功能细胞,替代、修复或加强受损的组织或器官的细胞的生物学功能已成为治疗多种组织坏死性疾病的新策略。 1 心肌细胞和间充质干细胞的特点 心肌细胞在出生后就进入了有丝分裂的后期,基本丧失了增生和再生的能力,不再进入细胞周期,而目前尚无证据支持心肌中含有干细胞[1]。成人骨髓中含有造血细胞和非造血细胞,非造血细胞与细胞外基质一起形成了支持造血的骨髓微环境(Bone marrow microenvironment,BMME)[8]。骨髓微环境中的细胞成分包括网状内皮细胞、巨噬细胞、脂肪细胞、成纤维样细胞[9],这些细胞通过分泌各种细胞因子、生长因子、以及自身细胞表面受体的表达,对造血细胞的附着、分化、自我更新起到了重要作用[10]。目前,普遍认为,在骨髓中至少存在两种干细胞群即造血干细胞(Haematopoietic stem cells,HSCs)和MSCs,前者是所有造血细胞的祖细胞[11,12],后者则是中胚层发育的早期细胞,这类细胞可以通过体外贴壁培养加以分离,不仅能分化为造血实质和基质细胞等,还分化为多种造血以外的组织,

间充质干细胞临床研究进展

---------------------------------------------------------------最新资料推荐------------------------------------------------------ 间充质干细胞临床研究进展 间充质干细胞临床研究进展自 1867 年德国病理学家Cohnheim 在研究伤口愈合过程时,首次提出成纤维细胞可能来源于骨髓,即骨髓可能含有非造血干细胞的观点。 1869年,Goujon 发现自体红骨髓异位移植后具有成骨作用,也证实了骨髓具有成骨能力。 但直到 1976 年,Friedenstein 和 Petrakova 首先报道,通过帖壁培养的方法分离得到间充质干细胞(MSCs)。 1987 年,Friedenstein 等将骨髓放置在塑料培养皿中培养,发现骨髓单个核细胞在一定条件下可分化为成骨细胞、成软骨细胞、脂肪细胞和成肌细胞,由于能分化为多种中胚层来源的间充质细胞,因此被称之为间充质干细胞。 1991 年 Caplan 把骨髓中具有黏附于塑料培养皿表面、在体外能高度扩增、并可多向分化的细胞群命名为骨髓间充质干细胞。 1999 年,Pittenger 等在《Science》(科学)杂志上发表文章,对从骨髓标本中分离得到 MSC,应用流式细胞分析术分析 MSC,结果表明分离的细胞群体表型单一,在体外不同分化条件诱导下,可以形成成骨细胞、成软骨细胞或脂肪细胞,而且克隆化得到的细胞具有类似的分化特性,这充分证明骨髓基质中的间充质干细胞是多能干细胞。 一系列的研究已经证明 MSC 可以分化为神经、心脏、肝脏、 1 / 4

间充质干细胞向成骨细胞分化中的Wnt信号通路

中国组织工程研究 第17卷 第40期 2013–10–01出版 Chinese Journal of Tissue Engineering Research October 1, 2013 Vol.17, No.40 doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2013.40.019 [https://www.sodocs.net/doc/e54544236.html,] 潘京华,黄浩,查振刚. 间充质干细胞向成骨细胞分化中的Wnt 信号通路[J].中国组织工程研究,2013,17(40):7144-7149. P .O. Box 1200, Shenyang 110004 https://www.sodocs.net/doc/e54544236.html, 7144 www.CRTER .org 间充质干细胞向成骨细胞分化中的Wnt 信号通路*★ 潘京华1,黄 浩1,查振刚2 (1暨南大学第一临床医学院,广东省广州市 510000;2暨南大学附属第一医院,广东省广州市 510632) 文章亮点: 1 此问题的已知信息:在间充质干细胞向成骨细胞分化增殖的过程中,转化生长因子β/骨形态发生蛋白、MAPK 和Wnt 等信号传导通路途径在整个成骨细胞分化中起着重要的作用。 潘京华★,男,1988年生,广东省阳江市人,汉族,暨南大学在读硕士,主要从事骨关节的研究。 394805331@https://www.sodocs.net/doc/e54544236.html, 2 文章增加的新信息:文章从Wnt 蛋白、Wnt 信号传导通路、Wnt 信号通路的调控、Wnt 参与间充质干细胞自我增殖及wnt 信号传导通路与骨生成等方面进行了详细叙述。研究已经证明了经典Wnt 信号传导通路与非经典Wnt 信号传导通路能联合调控人间充质干细胞的多向性分化,其中Wnt 信号传导通路在参与在间充质干细胞向成骨分化的过程中,Wnt11,FZD6,sFRP2,sFRP3和Ror2等因子的表达升高,而Wnt9a 和FZD7的表达下降。 通讯作者:查振刚,博士,教授,博士生导师,暨南大学附属第一医院,广东省广州市 510632 3 临床应用的意义:经典Wnt 信号、非经典Wnt 信号以及其内部多中因子都参与间充质干细胞增殖和分化的调控。 中图分类号:R318 关键词: 干细胞;干细胞综述;Wnt 蛋白质;间充质干细胞;Wnt 信号通路;成骨细胞分化;经典Wnt 信号传导通路;非经典Wnt 信号传导通路;省级基金 文献标识码:A 文章编号:2095-4344 (2013)40-07144-06 收稿日期:2013-04-11 修回日期:2013-05-30 (2 01304127/W ·W) Pan Jing-hua ★, Studying for master’s degree, First Clinical College of Jinan University, Guangzhou 510000, Guangdong Province, China 394805331@https://www.sodocs.net/doc/e54544236.html, Corresponding author: Zha Zhen-gang, M.D., Professor, Doctoral supervisor, First Affiliated Hospital of Jinan University, Guangzhou 510632, Guangdong Province, China Received: 2013-04-11 Accepted: 2013-05-30 主题词: WNT 蛋白质类;间质干细胞;成骨细胞;细胞分化 基金资助: 广东省科技计划(2011B050300013)* 摘要 背景:研究表明Wnt 信号通路在间充质干细胞向成骨分化中具有重要作用。 目的:归纳总结Wnt 信号通路的机制、调控以及其参与间充质干细胞成骨分化的作用。 方法:应用计算机检索Pubmed 和CNKI 数据库中1998年9月至2013年3月相关文献,在标题和摘要中以“Wnt ,间充质干细胞,Wnt 信号通路,成骨细胞分化,经典Wnt 信号传导通路,非经典Wnt 信号传导通路”或“Wnt ,Mesenchymal stem cells ,Wnt signaling pathways ,osteoblastic differentiation ,canonical Wnt signaling ,non-canonical Wnt signaling ”为检索关键词进行检索。最后选择31篇符合标准的文献进行综述。 结果与结论:Wnt 信号传导通路在间充质干细胞向成骨细胞中充当着关键的角色,包括经典Wnt 信号、非经典Wnt 信号以及其内部多种因子都参与间充质干细胞增殖和分化的调控。经典Wnt 信号传导通路与非经典Wnt 信号传导通路能联合调控人间充质干细胞的多向性分化,其中Wnt 信号传导通路在参与在间充质干细胞向成骨分化的过程中,Wnt11,FZD6,sFRP2,sFRP3和Ror2等因子的表达升高,而Wnt9a 和FZD7的表达下降。但Wnt 信号的各因子如何相互影响,如何利用Wnt 信号的机制促使间充质干细胞更快、更准确地分化值得更进一步探讨与研究。 Wnt signaling pathways in osteogenic differentiation of mesenchymal stem cells Pan Jing-hua 1, Huang Hao 1, Zha Zhen-gang 2 (1First Clinical College of Jinan University, Guangzhou 510000, Guangdong Province, China; 2First Affiliated Hospital of Jinan University, Guangzhou 510632, Guangdong Province, China) Abstract BACKGROUND: Studies have shown that Wnt signaling pathways play an important role in the osteogenic differentiation of mesenchymal stem cells. OBJECTIVE: To review the mechanism and regulation of the Wnt signaling pathways, as well as Wnt signaling pathway effects on osteogenic differentiation of mesenchymal stem cells. METHODS: A computer-based search of PuMed database and CNKI database from September 1998 to March 2013 was performed to search related articles. The key words of “Wnt, mesenchymal stem cells, Wnt signaling pathways, osteoblastic differentiation, canonical wnt signaling pathway, non-canonical signaling pathway” in English or Chinese were used to search the articles in the title and the abstract. A total of 31 articles were included to review. RESULTS AND CONCLUSION: Wnt signaling pathways play a critical role in the osteogenic differentiation of mesenchymal stem cells. Canonical Wnt signaling pathway, non-canonical Wnt signaling pathway, and their

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