拟南芥的遗传转化技术
拟南芥的遗传转化技术
1种子消毒处理
用70%的乙醇浸泡2分钟，用15% （体积比）NaClO溶液旋转洗涤10分钟，无菌水漂洗5次。
2播种和移栽
用无菌水重悬浮消毒处理的种子，均匀分散到1/2MS固体培养基表面上，培养皿倒置，4°C春化两天，25°C正置暗培养一天，再置于22°C的组织培养室中正常培养。待苗长至四片叶子时，将其移栽到营养土中，置于22°C恒温环境中，16h光照/8h黑暗培养，初期可适当绕些营养液。
3拟南芥幼苗修剪
植株长出顶生花序时，去除其顶生花序，以刺激腋生花序的生长，注意避免伤及腋生花序。准备侵染前，剪除角果以及开放过的花朵。
4拟南芥的遗传转化
4.1农杆菌感受态细胞的制备及转化
(1)取-80℃超低温冰箱中保存的农杆菌菌株GV3101，在（含50mg/LRif和
100mg/L Kan)的YEB培养基平板上划线，28℃培养约36-48 h。（单菌落）(2)挑取单菌落GV3101接种于5ml LB液体培养基（含50mg/LRif和100mg/L Kan)
中，28℃200rmp/min振荡培养过夜；（活化）
(3)取2ml菌液转入100ml LB液体培养基(含50mg/LRif和100mg/LKan)中继续
培养至OD600=0.5；（增殖培养）
(4)转入50ml无菌离心管中，冰浴30min，4℃，4000r/min离心10min，弃上清；
(5)加入10ml预冷的150mmol/L NaCl重悬菌体；
(6)4℃，4000rmp/min 离心10min，弃上清；
(7)加入1/10体积预冷的50 mmol/L CaC12重悬菌体；
(8)分装于无菌l.5ml离心管中，100ul/管，4℃保存备用；取1ug提取纯化的重
组质粒DNA，加入200u1感受态细胞中，混匀；
(9)冰浴10min，转入液氮冷冻5min，迅速置于37℃水浴，热激5min；
(10)加入500ul LB液体培养基，28°C，200rmp/min振荡培养2-3h；
(11)5000r/min 离心2min，弃上清；
(12)剩余菌液(残留100ul左右)用移液器反复抽吸悬浮，然后均匀涂布于LB平
板(含50mg/L Rif，100mg/LKan)表面，28℃培养2-3d。
4.2 含有重组质粒的农杆菌的PCR鉴定
挑取LB平板上的单菌落，接种于5ml LB液体培养基（含50mg/L利福平Rif,100mg/L Kan)中，28℃培养1-2d，以未转化的农杆菌作对照，进行菌落PCR 鉴定。
4.3花序法侵染拟南芥
(1)挑取单菌落接种于5ml LB液体培养基(含50mg/L Rif和100mg/L Kan)中，
28℃200rmp/min振荡培养过夜；
(2)取2ml 菌液转入100ml LB 液体培养基(含50mg/LRif 和100mg/L Kan), 28℃
200rmp/min振荡培养至OD600值为1.0-1.5左右；
(3) 6000rmp/min，离心10min，弃上清；
(4) 1ml 5%蔗糖溶液悬浮，6000rmp/min，离心2min，弃上清；
(5) 重复步骤4；
(6) 加入5%蔗糖溶液重悬菌体，至OD600值为0.4-0.7左右；
(7) 浸泡前按0.05%体积比加入silwet 77表面活性剂；
(8) 浸泡前绕水，并将已经结的荚剪去，将花苞浸泡于上述溶液中1min；
(9) 将植株倒置，黑暗培养24h，取出，正常生长培养。
农杆菌侵染拟南芥花序的转化方法
农杆菌侵染拟南芥花序的转化方法 制备转化用的农杆菌菌液 准备： 1．灭菌试管 400毫升细长烧杯2瓶，离心瓶4-6个（250ml）。 2．试剂：YEP 1200ml（每瓶300ml 共4瓶）+Kan 1;1000，Rif1:500。 1/2MS+2%蔗糖（灭菌115度20分钟），Silwet在-20℃贮存。 3．步骤： 共转化农杆菌：于中午12点接菌于有YEP培养液的试管中10ul：10ml接种。28℃，3000rpm摇过夜，约30小时，次日下午6点将已摇活的菌按（1：400）及750ul菌液转至汉300毫升YEP+K50+Rif中培养28℃，300rpm约14小时，次日上午8点测OD值，用YEP+Rif作为空白对照，当菌液达到OD600为1.5~3.0之内时，可收集菌体于250ml离心瓶（灭菌）,4℃，4000g 离心10min 。用10%蔗糖（含0.02%silwet）稀释至OD600 约为0.8-- 1.0左右即，用10%蔗糖作对照。转化时将花在溶液中浸泡50s左右，于弱光下生长。 4．浇水：转化前一天将需要做转化的野生型拟南芥苗子浇水浇透。 （注意：选取上述配好的溶液2ml，充分打碎管底部的菌体，在将混匀的菌体溶入600ml溶液中，混匀后再加入Silwet(100%)120ul终浓度为0.02%）。 2．先将浇透水用于转化的苗子的夹全部剪掉，再用宽胶带把花盆的土封好。3．转化的准备工作：2个400细长烧杯，宽胶带，记号笔，表等。 4．转化过程略，视苗的长势弱 0.8 Pa 3`，长势好的0.8 Pa 5`。 5．标记好，将转化好的苗平放于盒子内，上盖封口膜封好，避光培养24hrs 2天后，将植株立起正常培养，浇水，3天1次。 花序浸泡(flower-dipping)法转化拟南芥
遗传学名词解释大全
autoregulation 自我调节：基因通过自身的产物来调节转录。 autosome 常染色体：性染色体以外的任何染色体。 auxotroph 营养缺陷型：微生物的一种突变体，它不能合成生长所需的物质，培养时必须在培养基中加入此物质才能生长。 back mutation 回复突变：见reversion bacteriophage (phage) 一种感染细菌的病毒。 balance model 平衡模型：关于遗传变异比例的一种模型，它认为自然选择维持了群体中大量遗传变异的存在。 balanced polymorphism 平衡多态现象：稳定的遗传多态现象是由自然选择来维持的。 Barr body 巴氏小体：在正常雌性哺乳动物的核中有一个高度凝聚的染色质团，它是一个失活的X染色体。 base analog 碱基类似物：一种化学物质，其分子结构和DNA的碱基相似，在DNA的代谢过程中有时会取代正常碱基，结果使DNA的碱基发生突变。 bead theory 串珠学说：已被否定的学说，认为基因附着在染色体上，就象项链上的串珠。它既是突变单位又是重组单位。 binary fission 二分分裂：一个细胞分裂为大小相近的两个子细胞的过程。binomial distribution 二项分布：具有两种可能结果的 biparental zygote 双亲合子：又称双亲遗传(biparental inheriance)，衣藻(chlamydomonas) 的合子含有来自双亲的DNA。这种细胞一般很少见。 biochemical mutation 生化突变，见自发突变(autotrophic mutation)。bivalent 二价体：在第一次减数分裂时彼此联合的一对同源染色体。bottleneck effect 瓶颈效应：一种类型的漂变。当群体很小时产生这种效应，结果使基因座中有的基因丢失了。 branch-point sequence 分支点顺序：在哺乳动物细胞中的保守顺序：YNCURAY(Y: 嘧啶,R:嘌呤, N:任何碱基)，位于核mRNA内含子和II 类内含子3'端附近，其中的A可通过5'-2'连接的方式和内含子5'端相连接，在剪接时形成套马索状结构。 broad-sense heritability 广义遗传力：表型方差中所含遗传方差的百分比。cotplot 浓度时间乘积图：一个样本单位单链DNA分子复性动力学曲线。以结合为双链的量为纵坐标，以DNA浓度和时间的乘积为横坐标作出的DNA复性动力学曲线 C value C值：生物单倍体基因所含的DNA总量。 CAAT element CAAT元件：真核启动子上游元件之一，常位于上游-80bp附近，其功能是控制转录起始频率，保守顺序是 5'-GGCCAATCT-3'。 cancer 癌：恶性肿瘤，细胞失控，异常分裂且在生物体内可播散。 5'-capping -5'加帽：在 mRNA加工的过程中在前体 mRNA分子的5'端加上甲基核苷酸的“帽子”。 catabolite repression (glucose effect) 分解代谢物阻遏（糖效应）：当糖存在时能诱发细菌操纵子的失活，即使操纵子的诱导物存在也是如此。 cDNA 互补DNA：以mRNA为模板，以反转录酶催化合成的DNA的拷贝。 cDNA clone cDNA分子克隆：将cDNA片段装在载体上转化细菌扩增出多克隆的过程，最终可建立cDNA文库。
甘蓝栽培技术
甘蓝栽培技术 （一）育苗移栽 1、品种选择 春甘蓝选用抗逆性强、冬性强、耐抽薹、商品性好的早熟品种；夏秋甘蓝选用抗病性强、耐热的品种。 2、栽培季节的划分 春甘蓝：春季直播或育苗移栽，夏季收获。 夏秋甘蓝：春夏育苗，夏定植，秋收获。 3、育苗 （1）育苗土配制：育苗土的好坏与蔬菜秧苗的生长发育有很大的关系。良好的床土必须肥沃，含有丰富的营养物质，具有良好的物理性状，通气性好，保水力强，这样的床土称营养土，为了达到上述要求，营养土应人工配制。营养土按此配制：土壤、腐殖质、肥料按4：4：2的比例配。土壤最好选用没有种过十字花科蔬菜的大田土，取土时要用13～17厘米内的表层土。 肥料用充分腐熟的有机肥，最好是厩肥，又叫圈粪，它的有机物含量高，不但有丰富的营养物质，而且有疏松土壤作用，包括：如牛粪、马粪、驴粪、羊粪等，以牛粪最好。也可用腐殖质或经过沤制的树叶或桔杆等，有营养且能疏松土壤的物质。需要注意的是厩肥必须充分腐熟发酵，一是有利于作物吸收，二是发酵时产生的高温可杀死虫卵、病原微生物等有害物质，减少苗期病害。配制营养土的速效肥有草木灰，人粪尿，化学肥料等草木灰中含钾并能加深土壤颜色，多吸收阳光，提高地温，尤其对早春育苗有利，其用量约占营养土的5～10%。人粪尿的营养元素全面，使用前应充分腐熟，施用量占营养土的5%～10%，如果营养土中速效肥料不足，应施入0.1～0.2%的过磷酸钙或0.1%的复合肥。一般不能使用氮素肥料以免造成氨害，营养土配好后要过筛。 （2）育苗土消毒： 药剂消毒：①50％多菌灵按每100公斤营养土需2.5～3克多菌灵，将其配成水溶液后向土上喷洒，边喷边翻，将药和土充分拌匀，用塑料薄膜覆盖，2～3天后揭去塑料膜，晾2天便可播种了。②用50%多菌灵可湿性粉剂与50%福美双
烟草遗传转化实验
烟草遗传转化实验文件管理序列号：[K8UY-K9IO69-O6M243-OL889-F88688]
实验八植物细胞悬浮培养 实验目的：学习和掌握植物细胞悬浮培养的操作技术与方法。 实验器材： 超净工作台、恒温培养室、高压灭菌器、冰箱、恒温培养箱、培养瓶、250 mL 、500 mL三角瓶、镊子、酒精灯等。 配置MS液体培养基（2，4-D 2 mg/L+1%甘露醇 +3% 蔗糖，pH 5.8）分装于250ml的三角瓶中，每瓶50ml。 实验材料：烟草叶片愈伤组织。 实验方法： 1.70%乙醇净化工作台并擦洗干净，将所用的材料、工具、培养基等放入 工作台。打开紫外灯和风机，15分钟后关闭紫外灯开始方可操作。 2. 在超净台上用无菌镊子夹取出生长旺盛的松软愈伤组织，放入150ml 三角瓶中并轻轻夹碎,每个三角瓶加入培养基20-30ml，每瓶接种1-2g愈伤组织，按愈伤组织与液体培养基1∶10的比例，以保证最初培养物中有足够量的细胞。 3.接种后的三角瓶用天平称取重量并记载，然后置于摇床上，在转速 100-120rpm，25℃下培养以及散射光条件下，进行振荡悬浮培养。4.每周更换新鲜液体培养基两次，每次更换1/3。每次更换新鲜培养基时 称取重量。 5. 每个人接种悬浮培养细胞1瓶，观察并记录细胞生长情况。 6. 培养7天后，制作细胞生长曲线：为了解县浮培养细胞的生长动态，可用以下方法绘制生长曲线图： 鲜重法：在转代培养的不同时间，取一定体积的悬浮培养物，离心收集后，称量细胞的鲜重，以鲜重为纵座标，培养时间为横座标，绘制 鲜重增长曲线。 烟草遗传转化实验 实验目的
大棚甘蓝种植技术
大棚甘蓝种植技术 1茬口安排 莴笋12月中下旬在大棚内育苗，次年1月下旬至2月上旬移栽，4月下旬收获;甘蓝3月下旬育苗，5月上旬移栽，7月收获上市;蒜 苗7月下旬播种，可在冬前收获，也可扣棚保温到年底供应春节市场。 2大棚莴笋栽培要点 2.1品种选择选用耐寒，适应性强，抽薹迟的品种，如耐寒白叶、耐寒二白皮等品种。 2.2育苗12月中下旬育苗。播种前先将种子在清水中浸泡24h 左右，然后洗净保湿催芽。种子出芽达80%左右，即可将种子掺在 少量的细土中拌匀撒播。播后育苗床浇足底水，待水下渗后，覆土0.5～1cm，盖上薄膜。苗期控制浇水，以免幼苗徒长。 2.3定植与管理定植前每公顷施腐熟有机肥7.5万kg、复合肥1500kg作基肥。定植垄宽120cm，高15cm，垄沟宽30cm，扣上大棚 棚膜。苗龄40d左右时进行定植，株行距35cm×30cm，定植后浇缓 苗水。定植初期注意通风降湿，当茎部开始膨大至收获前，棚温控 制在15～20℃，大于20℃时可摘去棚膜，并浇水追肥，保持土壤湿润。 2.4病虫害防治大棚莴笋病害主要有霜霉病、灰霉病和菌核病， 在发病初期用25%甲霜灵锰锌可湿性粉剂800～900倍液，50%速克 灵可湿性粉剂1500倍液或与50%多菌灵胶悬剂500～600倍液喷2～ 3次。隔7d防治1次。2.5收获莴笋收获的最适时期是主茎顶端与 最高叶片的叶尖相平时。为了提早上市，可适当早采，收大留小， 分批上市，以提高产量。 3甘蓝栽培技术要点
3.1品种选择选用中熟品种，如京丰1号、中甘8、夏光等。 3.2育苗3月下旬育苗。播种前将种子用55%温水处理15min， 然后常温条件下浸种3小时左右，捞出甩干置于22～24℃条件下催芽，待80%左右种子出芽即可播种。将育苗床浇透底水，待水下渗 后撒播种子。播种后均匀覆土1cm左右。为防止立枯病发生，可用50%多菌灵可湿性粉剂对土壤杀菌，每平方米7～10g拌于覆土中。 3.3苗期管理出苗前白天温度20～25℃，夜间温度13～15℃。 幼苗出土后开始适当放风，降温降湿蹲苗。白天12～15℃，夜间 5～8℃，然后再逐渐提高温度，白天15～20℃。夜间8～10℃。当 幼苗长到2叶1心时进行移苗。 3.3整地施肥及定植定植土每公顷施腐熟有机肥6.0万kg，过磷酸钙750kg。5月上旬定植，定植前5～7d对苗进行低温锻炼，使之 适应外界条件。定植后浇缓苗水，缓苗后及时通风，降温管理，防 止徒长。定植株行距40cm×40cm。 3.4肥水管理莲座期进行1次追肥，施尿素225kg/hm2。及时中 耕除草，莲座末期适当控制灌水，防止田间积水。 3.5病虫害防治软腐病可用农用链霉素200mg/kg浓度的药液灌根。黑腐病发病初，用60%抑霉灵或35%瑞毒霉，加50%福美双1:1 混合拌匀，加水配制500倍药液。蚜虫可用50%抗蚜威可湿陛粉剂1500倍液喷雾。菜青虫用20%杀灭菊酯乳油1500倍液喷雾防治。一 般6～7d喷雾1次。连喷2～3次。 3.6收获7月上中旬当叶球基本包实时就可收获。 4蒜苗栽培要点 4.1播前处理选用优良早熟多瓣蒜种，栽种前将蒜苗盘分开，按大、中、小瓣进行分级，放入冷水中浸泡12～14h，打破蒜种休眠。 4.2适期播种，合理施肥7月下旬至8月上旬播种。播种前每公 顷施腐熟农家肥22.5万kg，尿素300kg，过磷酸钙750kg，钾肥 225kg。每隔30om开1条30～40cm宽的垄沟。在垄沟内按行距 10cm、株距5cm点播蒜种，然后覆盖1～1.5om细土，播完浇透水1
试述基因及基因工程技术与人类生存与发展之间的关系
试述基因及基因工程技术与人类生存与发展之间的关系 学院：物理科学与工程技术学院姓名：学号： 摘要： 科学界预言，21世纪是一个基因工程世纪。基因工程是在分子水平对生物遗传作人为干预，要认识它，我们先从生物工程谈起：生物工程又称生物技术，是一门应用现代生命科学原理和信息及化工等技术，利用活细胞或其产生的酶来对廉价原材料进行不同程度的加工，提供大量有用产品的综合性工程技术。 生物工程的基础是现代生命科学、技术科学和信息科学。生物工程的主要产品是为社会提供大量优质发酵产品，例如生化药物、化工原料、能源、生物防治剂以及食品和饮料，还可以为人类提供治理环境、提取金属、临床诊断、基因治疗和改良农作物品种等社会服务。这对我们人类社会一切生物的生存与发展将会带来巨大的影响。 关键字：基因工程，转基因，安全性，人类健康。 1 基因工程 1.1 定义 基因工程（genetic engineering;gene engineering）又名重组脱氧核糖核酸技术(recombinant DNA technique) ，狭义的基因工程仅指用体外重组DNA技术去获得新的重组基因；广义的基因工程则指按人们意愿设计，通过改造基因或基因组而改变生物的遗传特性。如用重组DNA技术，将外源基因转入大肠杆菌中表达，使大肠杆菌能够生产人所需要的产品；将外源基因转入动物，构建具有新遗传特性的转基因动物；用基因敲除手段，获得有遗传缺陷的动物等。 1.2 发展 1866年，奥地利遗传学家孟德尔神父发现生物的遗传基因规律；1868年，瑞士生物学家弗里德里希发现细胞核内存有酸性和蛋白质两个部分。酸性部分就是后来的所谓的DNA；1882年，德国胚胎学家瓦尔特弗莱明在研究蝾螈细胞时发现细胞核内的包含有大量的分裂的线状物体，也就是后来的染色体；1944年，美国科研人员证明DNA是大多数有机体的遗传原料，而不是蛋白质；1953年，美国生化学家华森和英国物理学家克里克宣布他们发现了DNA的双螺旋结果，奠下了基因工程的基础；1980年，第一只经过基因改造的老鼠诞生；1996年，第一只克隆羊诞生；1999年，美国科学家破解了人类第22组基因排序列图；未来的计划是可以根据基因图有针对性地对有关病症下药。 2 基因工程应用 2.1 农牧业、食品工业 运用基因工程技术，不但可以培养优质、高产、抗性好的农作物及畜、禽新品种，还可以培养出具有特殊用途的动、植物。 2.1.1转基因鱼 生长快、耐不良环境、肉质好的转基因鱼（中国）。 2.1.2.转基因牛 乳汁中含有人生长激素的转基因牛（阿根廷）。 2.1.3转黄瓜抗青枯病基因的甜椒 2.1.4转鱼抗寒基因的番茄 2.1.5转黄瓜抗青枯病基因的马铃薯
植物叶绿体基因工程发展探析(一)
植物叶绿体基因工程发展探析(一) 摘要从叶绿体的概念、转化优点、转化主要过程及方法等方面概述了叶绿体基因工程的发展情况,介绍了叶绿体基因工程的应用,包括提高植物光合效率、合成有机物质、生产疫苗、增强植物抗性及在系统发育学中的应用等,并提出叶绿体基因工程存在的问题,对其未来发展进行了展望。 关键词植物叶绿体;基因工程;发展;应用;存在问题;展望叶绿体作为植物中与光合作用直接相连的重要细胞器,其基因组的功能也因此扮演着十分重要的角色。1882年Straburger观察到藻类叶绿体能分裂并进入子代细胞;1909年Baur和Correns通过在3种枝条颜色不同的紫茉莉间杂交得出,质体是母本遗传的。人们便开始对叶绿体遗传方面产生了浓厚的兴趣1]。1988年Boynton等首次用野生型叶绿体DNA转化了单细胞生物衣藻突变体(atPB基因突变体),使其完全恢复光合作用能力,标志着叶绿体基因工程的诞生2]。叶绿体基因工程作为一种很具有发展前景的植物转基因技术,在植物新陈代谢、抗虫性、抗病性、抗旱性、遗传育种等方面都将有着越来越重要的意义。 1叶绿体基因工程概述 1.1叶绿体简介 叶绿体是植物进行光合作用的重要器官,是一种半自主型的细胞器,能够进行自我复制,含有双链环状DNA。叶绿体DNA分子一般长120~160kb。叶绿体DNA有IRA和IRB2个反向重复序列(分别位于A链和B链),两者基因大小完全相同,只是方向相反,它们之间有1个大的单拷贝区(大小约80kb)和1个小的单拷贝区(大小约20kb)。 1.2叶绿体基因组转化优点 叶绿体基因具有分子量小、结构简单、便于遗传的特点,故相对于传统的细胞核遗传更能高效表达目的基因,这是因为叶绿体基因本身拥有巨大的拷贝数3]。叶绿体基因可实现外源基因的定点整合,避免位置效应和基因沉默;遗传表达具有原核性;安全性好,叶绿体属于母系遗传,后代材料稳定;目的基因产物对植物的影响小。利用叶绿体基因转化的这些优点,可以加快育种速度和效率,节约育种时间。 1.3叶绿体转化的主要过程 叶绿体转化过程通常分4步:一是转化载体携带外源目的基因通过基因枪法或其他转化体系导入叶绿体;二是将外源表达框架整合到叶绿体的基因组里;三是筛选具有转化的叶绿体细胞;四是继代繁殖得到稳定的叶绿体转化植物4]。 1.4叶绿体转化的主要方法 依据叶绿体转化的主要过程,生物学家相应地研究若干种叶绿体基因转化的方法,其中常用的叶绿体转化方法:一是微弹轰击法。将钨粉包裹构建完整的质粒载体,用基因枪轰击植物的各种组织、器官,然后对重组叶绿体进行连续筛选,不断提高同质化水平,最后获得所需的转基因植株5]。二是农杆菌T-DNA介导的遗传转化法。将外源目的基因、选择标记基因等构建到农杆菌的Ti质粒上,然后通过与植物组织或器官共培养,最后把所需外源基因转化到叶绿体并获得表达。三是PEG处理法。只需将构建好的质粒(含外源基因、标记基因、同源片断、启动子、终止子等)在一定的PEG浓度下与植物原生质体共培养。 2叶绿体基因工程的应用 2.1提高植物光合效率 植物的光合效率非常有限,太阳能的很小一部分可以转化为植物所需要的能量,从而转变为人类需要的产品。植物光合效率取决于Rubisco酶的丰富度。Rubisco酶一方面可以制造可溶性蛋白,另一方面也可以限制CO2合成。人们可以通过2种直接的方法提高光合速率:一是加速酶催化的循环过程;二是提高酶的特性,减少光呼吸浪费的能量6]。很多科学家正试图通过提高Rubisco酶来提高植物的光合效率,而其中拟南芥和水稻的定点整合试验取得了重大突
甘蓝栽培技术
甘蓝栽培技术 ■标准化文件发布号：（9456?EUATWK-MWUB?WUNN?INNUL?DDQTY-KII
甘蓝栽培技术 （-）育苗移栽 1、品种选择 春甘蓝选用抗逆性强、冬性强、耐抽荃、商品性好的早熟品种：夏秋甘蓝选用抗病性强、耐热的品种。 2、栽培季节的划分 春甘蓝：春季直播或育苗移栽，夏季收获。 夏秋甘蓝：春夏育苗，夏定植，秋收获。 3、育苗 （1）育苗土配制：育苗土的好坏与蔬菜秧苗的生长发育有很大的关系。良好的床土必须肥沃，含有丰富的营养物质，具有良好的物理性状，通气性好，保水力强，这样的床土称营养土，为了达到上述要求，营养土应人工配制。营养土按此配制：土壤、腐殖质、肥料按4： 4： 2的比例配。土壤最好选用没有种过十字花科蔬菜的大田土，取土时要用13?17厘米内的表层土。 肥料用充分腐熟的有机肥，最好是厩肥，乂叫圈粪，它的有机物含量高，不但有丰富的营养物质，而且有疏松土壤作用，包括：如牛粪、马粪、驴粪、羊粪等，以牛粪最好。也可用腐殖质或经过泯制的树叶或桔杆等，有营养且能疏松土壤的物质。需要注意的是厩肥必须充分腐熟发酵，一是有利于作物吸收，二是发酵时产生的高温可杀死虫卵、病原微生物等有害物质，减少苗期病害。配制营养土的速效肥有草木灰，人粪尿，化学肥料等草木灰中含钾并能加深土壤颜色，多吸收阳光，提高地温，尤其对早春育苗有利，其用量约占营养土的5?10%o人粪尿的营养元素全面，使用前应充分腐熟，施用量占营养土的5%?10%,如果营养土中速效肥料不足，应施入0.1?0.2%的过磷酸钙或0.1%的复合肥。一般不能使用氮素肥料以免造成氨害，营养土配好后要过筛。 （2）育苗土消毒： 药剂消毒：①50%多菌灵按每100公斤营养土需2.5?3克多菌灵，将其配成水溶液后向土上喷洒，边喷边翻，将药和土充分拌匀，用塑料薄膜覆盖，2?3天后揭去塑料膜，晾2天便可播种了。②用50%多菌灵可湿性粉剂与50%福美双可湿性粉剂
拟南芥转化 浸花法
拟南芥转化—浸花法 实验步骤： 关键记录： a浸染的最好阶段是一个花盆里有20-30个花絮以及一些成熟的果夹，这些果夹浸染之前需要剪掉。 b/颠倒植株将植株浸入农杆菌细胞悬浮液10s。 c.塑料膜包裹保持黑暗高湿度16-24h。一周后可再次侵入农杆菌细胞悬浮液浸染。
d.移去塑料膜，让植株在温室中生长一个月。 e.干燥成熟的果夹用小袋套住。 f.筛选主要转基因植株在筛选培养基上。
说明： 如果转化实验要延迟或者构建没有准备好又或者想要植株有很多的花序，可以剪掉植株第一次的抽苔，使其长出更多的分支和花序，在剪去第一个抽苔的6-8天后，开始农杆菌悬浮液浸染。 如果希望增强营养来支持转化的细胞，同时又减少野生型种子（即增加转化效率）以及减少筛选主要转基因植株期间真菌病害。去掉用于转化植株上的果夹。 具体步骤： 1.已转化的农杆菌在含抗生素筛选培养基上长出单克隆，对鉴定后确定转化成功的单克隆于5ml液体YEP培养基（含抗生素）28℃活化培养16h。 2.取适量（1:50）活化培养的菌液于50ml液体YEP培养基（含抗生素）中28℃扩大培养6h。 注意：在此要鉴定是否为正确的转化农杆菌，酶切、PCR均可。确认后，为了下次转化浸染，可以在这一步将农杆菌甘油管-70℃保存或者将菌液密封保存于4℃,高达1个月。 3.将20ml农杆菌细胞悬浮液于4000g、10min室温离心，加入1倍体积的10mM MgCl2,5%蔗糖溶液（即100ml H2O中加MgCl2·6H2O 0.202g，蔗糖 5g）。 浸染前加表面活性剂使其终浓度为0.02%（20ml加4uL）。混匀，转移至50ml离心管。 注意：表面活性剂浓度过高有毒害。为了产生含两种独立载体的转化植株，我们要用两种农杆菌细胞，各含有一种载体，分别加入30mL 10mM MgCl2,5%蔗糖溶液，浸染前加入适量表面活性剂，将它们混合在一个大烧杯里。在双转化试验中我们至少要用48株植株。间隔7天进行第二次浸染植株。 小心：戴手套及口罩防止表面活性剂的毒害。 4.浸染时将农杆菌悬浮液倒满50mL离心管的小盖子，将拟南芥横放使花序浸入小盖子中的悬浮液10s，轻微晃动小盖，20ml农杆菌悬浮液至少有效用于转化30株拟南芥， 150个花序以上，这一步骤要保证能在植株上看到菌液。 注意：确定所有花盆都已浸染，有时很有必要浸染整个植株确保浸染更短更多的花芽。将过多的农杆菌液移除也很重要。否则长时间
拟南芥原生质体制备转化方法整理
溶液配制 1、纤维素酶解液：
2、PEG4000溶液（一次配置可以保存五天，但是最好现用现配，每个样品需100μl PEG4000溶液，可根据实验样品量调整溶液配置总量）
3、W5 溶液 4、MM G溶液
5、WI溶液 拟南芥原生质体制备转化方法整理 一、土培室播种种植的拟南芥。 二、生长良好情况下在未开花前用于取材叶片制备原生质体。 三、剪取中部生长良好的叶片用刀片切成0.5 -1 mm宽的叶条。 四、将切好叶条掷入预先配置好的酶解液中（每5-10 ml酶解液大约需10-20片叶子）。并用镊子帮助使叶子完全浸入酶解液。
五、用真空泵于黑暗中抽30分钟。（此时可配制PEG4000溶液，200和1000 ul 枪头去尖使操作时吸打缓和。） 六、在室温中无须摇动继续黑暗条件下酶解至少3个小时。当酶解液变绿时轻轻摇晃培养皿促使原生质体释放出来。（此时预冷一定量W5溶液） 七、显微镜下检查溶液中的原生质体，拟南芥叶肉原生质体大小大约30-50 um。 八、在过滤除去未溶解的叶片前用等量的W5溶液稀释含有原生质体的酶液。 九、先用W5溶液润湿35-75 um的尼龙膜或60-100目筛子，然后用它过滤含有原生质体的酶解液。 十、用30毫升的圆底离心管100g，1-2分钟离心沉淀原生质体。尽量去除上清然后用10ml 冰上预冷的W5溶液轻柔重悬原生质体。 十一、在冰上静至原生质体30分钟。 以下操作在室温23℃下进行
十二、100g离心八至十分钟使原生质体沉淀在管底。在不碰触原生质体沉淀的情况下尽量去除W5溶液。然后用适量MMG溶液（1m）重悬原生质体，使之最终浓度在2X105个/ml。 十三、加入10 ul DNA（10-20微克约5-10kb的质粒DNA）至2ml离心管中。 十四、加入100 ul原生质体（2x104个），轻柔混合。 十五、加入110 ul PEG溶液，轻柔拍打离心管完全混合（每次大约可以转化6-10个样品）。 十六、诱导转化混合物5-15分钟（转化时间视实验情况而定，要表达量更高也许需要更高转化时间）。 十七、室温下用400-440 ul W5溶液稀释转化混合液，然后轻柔颠倒摇动离心管使之混合完好以终止转化反应。 十八、室温下用台式离心机100g离心2分钟然后去除上清。再加入1ml W5溶液悬浮清洗一次，100g离心两分钟去上清。
抱子甘蓝种植方法
抱子甘蓝 一、播种育苗 1、种子处理： 用50℃温水浸种(两份开水兑一份凉水）边倒边搅拌，使种子均匀受热，持续15~20分钟，水温降到30℃，继续浸种1~2小时。浸种后，取出种子，用湿布包好，放置在25-30℃条件下催芽，每天用20-30℃水淘洗一次，待大部分种子露白即可播种。 2、基质处理： 草炭、蛭石1:1或草炭、蛭石、蘑菇废料1:1:1，覆盖料一律用蛭石，每立方米基质加入 1.2公斤尿素和 1.2公斤磷酸二氢钾，肥料与基质混拌均匀后备用 3、穴盘育苗或营养钵育苗，幼苗5～6片真叶时定植。 二、苗期管理 温度： 早春育苗要注意保温，控制在20～25℃的温度下，齐苗后注意放风。夏季育苗要防高温（60%～65%）。3叶1心后，结合喷水进行1～2次叶面喷肥。如果用苗床育苗，一般需二次成苗。苗床要选择通风良好、排灌方便的地块，每亩大田用种量20～25克，播种面积约4平方米，播种后浅覆土。夏秋季育苗，播种后要用黑色遮阳网在床面直接覆盖，再浇透水，保持湿润。种子开始出苗后及时撤去遮阳网，降温防雨。高温炎热的晴天要日盖晚揭，小苗2～3片真叶时，分苗一次约需苗床10～13平方米。 三、移栽定植 1、整地：
用腐熟的有机肥，每亩2000～3000kg，磷肥20kg。整碎土块，深沟高畦，开好排水沟以防涝害。选择阴天或晴天傍晚定值。 2、定植密度： 早熟品种 1.2宽每畦种2行，株距30～50cm，每亩植2000～2500株；高生品种每畦种1行亩栽1200株。（早期行间可种植短期蔬菜-樱桃萝卜、油菜）带土定植，尽量少伤根，提高成活率。 四、田间管理 1、浇水： 幼苗定植后需经常浇水，以保证小苗生长对水分的需要。定植后4~5天结合浇水点施提苗肥，每亩用尿素约5公斤，以促苗快长。第二次追肥可在定植后1个月左右，以后在小芽球膨大期以及小叶球始收期分别再追肥一次，每次每亩用尿素10～15公斤，或用农家经腐熟的稀肥追施。植株生长的中期，水分管理以见干见湿为宜。当下部小叶球始成时，又要经常灌溉，使土壤保持充分的水分。雨天要做好排水。 2、xx松土、除草： 每次灌水施肥后要进行中耕松土、除草，并结合中耕进行培土，防止植株倒伏。 3、整枝： 当抱子甘蓝的植株茎杆中部形成小叶球时，即要将下部老叶、黄叶摘去，以利于通风透光，促进小叶球发育。随着下部芽球的逐渐膨大，还需将芽球旁边的叶片从叶柄基部摘掉。在气温较高时，植株下部的腋芽不能形成小叶球，或已变成松散的叶球，也应及早摘除。 同时要根据具体情况到一定时候摘去顶芽，以减少养分的消耗，使下部芽球生长充实。一般矮生品种不需摘顶芽。摘芽时间看需要而定。
拟南芥SSCD1基因启动子与GUS重组载体的构 建与转化
Botanical Research 植物学研究, 2018, 7(3), 287-293 Published Online May 2018 in Hans. https://www.sodocs.net/doc/ef11141311.html,/journal/br https://https://www.sodocs.net/doc/ef11141311.html,/10.12677/br.2018.73037 Construction and Transformation of Recombinant Plasmid of Gene SSCD1 Promoter and GUS Gene in Arabidopsis thaliana Peilin Liu1, Tiantian Zhi1, Chunmei Ren1,2* 1College of Bioscience and Biotechnology, Hunan Agricultural University, Changsha Hunan 2Crop Gene Engineering Key Laboratory of Hunan Province, Changsha Hunan Received: Apr. 22nd, 2018; accepted: May 16th, 2018; published: May 23rd, 2018 Abstract The tyrosine degradation pathway is an important metabolic pathway in animals, but in plants, less is known about this pathway. Our previous study found that: in Arabidopsis thaliana, the SSCD1 gene encodes the final enzyme of the tyrosine degradation pathway, fumarate lace to ace-tate hydrolase (FAH), and mutation of this gene results in cell death in Arabidopsis under short day. To investigate the tissue expression characteristics of the SSCD1gene, a fusion expression vector of Arabidopsis thaliana SSCD1 gene promoter and GUS gene was constructed and trans-formed into Arabidopsis thaliana, and the transgenic plant was obtained and identified by GUS histochemical staining. The GUS histochemical staining showed that the GUS gene driven by the SSCD1 gene promoter was strongly expressed in the hypocotyls, but weakly in the cotyledons and roots. However, the expression was almost absent in the true leaves. The results of this study in-dicate that the SSCD1 gene plays a more important role in hypocotyls, which is very important for deeply exploring tyrosine degradation pathway in plants. Keywords Arabidopsis, SSCD1 Mutant, Tyrosine Degradation Pathway, GUS 拟南芥SSCD1基因启动子与GUS重组载体的构建与转化 刘佩琳1，支添添1，任春梅1,2* *通讯作者。
基因操作和蛋白质工程技术专题立项指引-国家科技部
863计划生物和医药技术领域2006年度 专题课题申请指南 前言 “十一五”期间，依据《国家中长期科学和技术发展规划纲要》、《国家“十一五”科学技术发展规划》和《863计划“十一五”发展纲要》，863计划生物和医药技术领域将围绕医药卫生、工业发酵、环境治理、资源开发和生物安全等国民经济和社会发展中若干关键技术领域的重大技术需求，坚持“发展高技术、实现产业化”的指导方针，遵循生物技术自身的发展规律，加强自主创新、集成创新和消化吸收再创新，建立起较为完善的国家生物医药产业技术创新体系，为使我国生物医药技术在国际竞争中占据有利位置奠定坚实基础。 863计划生物和医药技术领域总体目标是：突破若干前沿技术，建立和完善具有中国特色的生物技术创新体系，全面提升我国生物技术的整体竞争力；以重大疾病为重点，加强生物技术与临床资源的系统集成，攻克若干重大疾病预防和诊治的关键技术；以医药和工业发酵为突破口，强化生物技术向产业的应用辐射，支撑和引领生物产业的快速发展。 按照以上总体考虑，863计划生物和医药技术领域将在项目和专题两个层次进行部署，设置“基因操作和蛋白质工程技术”、“新一代工业生物技术”、“生物信息与生物计算技术”和“现代医学技术”四个专题。专题将分年度公开发布课题申请指南，以下为本领域2006年度专题课题申请指南。 专题一、基因操作和蛋白质工程技术专题 一、指南说明
本专题针对基因操作和蛋白质工程技术的国际前沿发展趋势和重点，围绕我国人口健康、食物安全、生态安全、资源开发、环境保护等方面的重大需求，充分发掘和利用我国丰富的生物遗传资源，发挥我国在基因组、蛋白质组等方面的优势，突破一批基因操作和蛋白质工程的核心技术，获得一批具有自主知识产权和重大应用前景的功能基因、蛋白及技术专利，使我国基因操作和蛋白质工程技术及应用水平接近或达到世界先进水平，全面提升我国生物技术的原始创新能力和集成创新能力，推动我国生物产业的跨越发展，使我国生物技术研究与产业在激烈的国际竞争中赢得主动和优势。课题设置突出技术的前瞻性、原创性和集成创新性，强调前期工作基础及研究内容的延续性，鼓励技术发展与产品开发的紧密结合。 此次发布的是本专题2006年度课题申请指南，年度经费预算为7000万元。拟支持的课题分两类，一类是探索导向类课题，拟对基因操作关键技术、蛋白质工程关键技术、小RNA关键技术、染色体操作与基因定位整合关键技术等研究方向进行支持，课题支持强度为100万元以下，课题支持年限为3年；一类是目标导向类课题，拟对人类重要功能基因发掘与利用技术、微生物重要功能基因发掘与利用技术等研究方向进行支持，课题支持强度为500万元以下，课题支持年限为3年。 二、指南内容 （一）探索导向类课题 1．基因操作关键技术 本方向的主要研究内容包括：研究开发高效、高通量和大规模基因表达分析和检测技术，快速、低成本、高通量的改良测序技术，基因的干扰和沉默技术，SNP发现与鉴定技术，基因组水平非随机表达文库的构建及表达技术，低丰度表达基因和选择剪切表达产物检测技术，具有重要功能的非编码序列检测分析技术，基因组定向诱导突
甘蓝栽培技术
1. 茬口安排 选择3年内未种过十字花科的田地最佳，最好选择与瓜类、豆类、葱蒜类、茄果类及粮食作 物轮作，并选择无根肿病的田块。有机肥和无机肥相结合，在中等肥力条件下，结合整地每 亩施有机肥500kg，复合肥100kg及6-7斤硼砂。 2. 栽培季节与品种选择 3. 苗期 无论在塑料大棚或露地定植的结球甘蓝都在温室内育苗。 现在一般选择苗床育苗或穴盘育苗。 苗床应选土质肥沃疏松、排灌方便的田块。苗床畦面宽1米，浇透水后稍晾干即可播种。6～ 7平方米播种子25～30克左右，播后盖细土1～1.5厘米，并在畦面盖稻草、松毛或遮阳网。 雨季可用小拱棚避雨育苗。出苗后逐步揭去稻草或松毛等覆盖物，2～3片真叶时进行匀苗， 拔除弱苗及病苗，保持苗距3～4厘米，注意防治病虫害。 穴盘宜采用128孔，播种前根据播种量确定穴盘数量，用十字花科蔬菜专用育苗基地。反复 浇水直至基质含水量为最大持水量的55%-65%，即手握基质后有水印且无滴水。将种子点在 压好穴的盘中，每穴1粒，播深0.5-1.0cm，每盘多撒10粒种子用于补苗。播后用基质覆盖，再浇1次透水，使基质与穴盘格相平，盖一层塑料薄膜，傍晚加盖草帘，以增温保湿。注： 采取穴盘育苗必须在定植前进行炼苗，壮苗。 4. 大田整地及定植 一般亩施腐熟农家肥2000 ～3000公斤，翻地后亩施50公斤生物有机肥，按1.5～2米作畦。 提倡用地膜覆盖种植，使用黑色地膜或除草膜可控制杂草生长。当苗有6～76片真叶时可定植。上午浇水，下午精心起苗，多带土少伤根，缩短缓苗期。小甘蓝行珠距40×40厘米或 40×45厘米，每亩地定植4000株-5000株。定植后及时查看苗情，死苗的应及时补栽。 5. 田间管理 定植成活后注意进行蹲苗，适当控制浇水，中耕松土保墒，促进根系生长，防止茎叶徒长， 但春、冬甘蓝不进行蹲苗。蹲苗结束（约10天左右）追肥灌水，用尿素8～10公斤、普钙 10公斤、硫酸钾5公斤追施提苗肥，促进营养生长。进入莲座期是吸收肥水最多的时期，此 时应重追肥一次，每亩用尿素15～20公斤、普钙15公斤、硫酸钾10公斤，追肥后灌水。甘
拟南芥原生质体的提取和转化
拟南芥原生质体的提取和转化 (1)取4周后抽薹前的叶片，切成1mm宽的长条，置于甘露醇溶液（称1.82g D-甘露醇于 20ml双蒸水中）；共需叶片约90片； (2)将步骤1中细条捞出，置于酶解液中；避光，23℃,40-50rpm摇床上酶解3小时； (3)酶解液过100-200目的筛子，收集滤液，置于15ml离心管中，均分为两管；于4℃， 60g，离心15min； (4)原生质体用冰冷W5溶液轻柔洗涤，每管4ml；4℃，100g，离心1min； (5)弃上清，沉淀用冰冷的W5溶液轻柔悬浮，每管4ml；冰上放置30min； (6)23℃，100 g离心1min；弃上清，每管沉淀用0.5ml MaMg重悬； 以下操作均在23℃下进行： (7)取约10-20ug 质粒于1.5ml EP管中，加100ul 步骤6中的原生质体；用200ul 枪头（剪 去前端）轻柔混匀； (8)加入110ul PEG/Ca 溶液，轻柔混匀；放置20-30min； (9)加入0.44ml W5 溶液，来回颠倒混匀；23℃，100 g，1min，brake 设为4-5； (10)弃上清，加100ul W5，混匀；加900ul W5，混匀； (11)上述混合液体置于六孔板内，23℃，避光，孵育6-18小时。 (1)酶解液： cellulose R10 15% Macerozyme R10 0.3% Mannitol 1.09g KCl 0.3M MES 0.3M 调节pH值到5.7，55℃加热10min，冷却到室温再加入下列溶液 CaCl20.15M β-巯基乙醇0.75mM (2)PEG溶液（40%，v/v） PEG4000 1g 0.8M Mannitol 0.625ml 1M CaCl2 0.25m (3)W5溶液
包菜种植技术教学教材
包菜种植技术
叶类蔬菜丰产栽培技术 包菜丰产栽培技术 包菜是结球甘蓝（简称甘蓝）有俗称，在我国南北各地广有栽培。是一种生产量大，产量高，可鲜食可加工及下部脚叶可作饲料的用途广泛的大宗蔬菜。包菜可在夏、秋季及越冬栽培，下面介绍其丰产栽培技术。 包菜是结球甘蓝（简称甘蓝）有俗称，在我国南北各地广有栽培。是一种生产量大，产量高，可鲜食可加工及下部脚叶可作饲料的用途广泛的大宗蔬菜。包菜可在夏、秋季及越冬栽培，下面介绍其丰产栽培技术。 (一)品种： 1．夏光甘蓝：表现为早熟，耐热、丰产、结球紧，正祁度高。是作为夏季甘蓝栽培的主要品种。该种亩产2000—2500公斤。为小平头包，系杂交一代品种。 2．京丰1号：表现为早中熟，较耐热，耐寒、耐肥、忌渍水和干旱，叶球紧实，中平头型，成熟一致，品质好，是近年来广为推广的秋栽甘蓝杂交一代良种，亩产3000公斤左右。 3．鸡心包：表现为早熟，冬性强，不易抽苔，耐寒、耐肥，不耐热，忌渍水和干旱。植株紧凑，尖头型，是多年的越冬春包菜主栽品种，亩产1000—1500公斤。 4．春丰：系杂交一代品种，表现为早熟，丰产，耐寒，越冬不易抽苔，外叶少，叶球胖尖形，结球紧实，亩产3000一4000公斤。系近年来越冬春包菜栽培的新优品种。
5．昆甘一号：系杂交一代品种，表现为叶球紧，牛心形，冬性较弱，品质好，抗病性较强，抗寒性较差，主要作早春甘蓝栽培。亩产2000公斤左右。 (二)播种育苗： 1．播种期：夏光甘蓝，3月至7月上旬播种；京丰一号、秋甘蓝7月上、中旬播种；越冬甘蓝、鸡心包、牛心包、春丰等在10月下旬至11月上旬播种。每亩用种量50—75克。 2．育苗：选择肥沃、爽水的菜土，播种前翻耕烤晒过白，然后正细正平，每亩施1500公斤腐熟人粪尿液作基肥，干后耙匀，使土肥融合，再行播种，每平方米播种子10克。然后盖上一层过筛后的发酵煤灰土(细土杂肥亦可)，干旱时，搭平棚进行遮阳(用遮阳网较好)，长期保持土壤湿润，出苗后及时除杂除草，喷施药剂防治病虫。 (三)大田栽培： 1．苗龄：在25—30天之间。 2．移栽：选择健壮无病叶、无残破叶、长势一致、根脚好的苗子，带士进行移栽。栽植密度为：夏光甘蓝，株行距35×45厘米；秋甘蓝京丰L号，株行距40×45厘米；鸡心、牛心、春丰越冬春甘蓝，株行距35×40厘米。 3．大田正土：施基肥，移栽前15—20天左右，先将大田上翻挖转来，任其烤晒10天左右，再行正土，粗正一次，移栽前2天再行细正一次，然后施入基肥，每亩施腐熟人粪尿液2000公斤，过磷酸钙25公斤、草木灰或火土灰1 50—200公斤。为使肥效集中，可将基肥直接施于植楔内，待干后再将穴土拌匀，以待移栽。移栽后每株苗子都浇一点压兜水，每株0．5公斤，以后每天浇一次复水直至成活。
花序浸染法转化拟南芥
花序浸染法转化拟南芥 1 种植或者移栽拟南芥之前都需要提前一天泡土，泡土过程中要加足量的水。营养土和蛭石1：1比例混合。 2 可以采取两种方法种植野生型拟南芥：一种是直接在大钵子里种八、九颗，小钵子里种四、五颗，等它稍微长大以后去掉长势不好的或者不能成活的，大钵子保留四颗，小钵子保留两颗，这种方法不用移栽；另一种是现在大钵子里种上几十颗（小钵子里相应的减少），等它们长成小苗后移栽（千万不要等它们长大了再移栽，因为这时它们的根会缠绕在一起，很不好移栽，而且还容易伤根），这种方法移栽比较麻烦，但是在移栽过程中能保证你要移栽的每一颗都是长势良好的拟南芥。不管你采取哪种方法，在种下拟南芥后都需要浇水并盖膜，盖膜的目的是为了保持水分。注意：移栽拟南芥后还需要盖3到4天的膜，因为刚移栽的苗子比较小。总之盖膜时间自己灵活掌握。 3 转拟南芥一般用GV3101这个农杆菌，在你电转农杆菌，挑取阳性克隆检测后，先用2ml离心管少量摇菌，每管装1ml的LB，分装2管，摇8—10小时（时间灵活掌握，有时候需要摇更长的时间才能浑浊）待浑浊后再转移到500ml三角瓶（按1：100的比例装有200ml的LB）中大量摇菌8—10小时直到浑浊为止（有时候需要摇更长的时间才能浑浊）。浑浊的标准是OD值为0.8，但是现在基本都不测OD值。（在摇菌过程中所用的离心管和LB要灭菌，另外还要注意添加抗生素利福平，最好选用利福平和另外一种到两种抗生素以达到双抗或者三抗的效果，实际上双抗就可以了，理论上可以添加三种抗生素，一种是利福平，GV3101农杆菌本身就是抗利福平的；另一种是农杆菌自身所携带的协助Ti质粒载体上的基因所抗的抗生素；还有一种就是T-DNA区内基因所对应的抗生素），接下来就是离心富集农杆菌（用离心瓶或者是50ml的大离心管，这个时候离心瓶或者50ml大离心管可以灭菌也可以不灭菌），然后用100ml的5﹪的蔗糖悬浮，蔗糖溶液中加入20微升表明活性剂，也就是浓度0.02%（此时的蔗糖溶液就不用灭菌了，因为以后的侵染也不在超净工作台操作）。要转的每个基因的每个载体都是先2ml少量摇菌，然后按1：100的比例200ml大量摇菌。 4 在拟南芥初次开花时将花蕾剪掉，可以促进侧枝更多的花枝的增生。适合转化植株的花卉并没有成熟，也没有产生已受精的角果。在用花序侵染法转拟南芥之前，先用剪刀剪去已经长成的角果（因为这些角果将来结的种子肯定是非转基因的，如果不剪掉的话会降低阳性率，本身阳性率已经很低了，再降低就更不爽了），把100ml的5﹪的蔗糖悬浮的菌液倒入大皿内，然后把拟南芥的花序浸入进去侵