间充质干细胞向成骨细胞分化中的Wnt信号通路
中国组织工程研究 第17卷 第40期 2013–10–01出版
Chinese Journal of Tissue Engineering Research October 1, 2013 Vol.17, No.40
doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2013.40.019 [https://www.sodocs.net/doc/ea2943508.html,]
潘京华，黄浩，查振刚. 间充质干细胞向成骨细胞分化中的Wnt 信号通路[J].中国组织工程研究，2013，17(40):7144-7149.
P .O. Box 1200, Shenyang 110004 https://www.sodocs.net/doc/ea2943508.html,
7144
www.CRTER .org
间充质干细胞向成骨细胞分化中的Wnt 信号通路*★
潘京华1，黄 浩1，查振刚2 (1暨南大学第一临床医学院，广东省广州市 510000；2暨南大学附属第一医院，广东省广州市 510632)
文章亮点：
1 此问题的已知信息：在间充质干细胞向成骨细胞分化增殖的过程中，转化生长因子β/骨形态发生蛋白、MAPK 和Wnt 等信号传导通路途径在整个成骨细胞分化中起着重要的作用。
潘京华★，男，1988年生，广东省阳江市人，汉族，暨南大学在读硕士，主要从事骨关节的研究。
394805331@https://www.sodocs.net/doc/ea2943508.html, 2 文章增加的新信息：文章从Wnt 蛋白、Wnt 信号传导通路、Wnt 信号通路的调控、Wnt 参与间充质干细胞自我增殖及wnt 信号传导通路与骨生成等方面进行了详细叙述。研究已经证明了经典Wnt 信号传导通路与非经典Wnt 信号传导通路能联合调控人间充质干细胞的多向性分化，其中Wnt 信号传导通路在参与在间充质干细胞向成骨分化的过程中，Wnt11，FZD6，sFRP2，sFRP3和Ror2等因子的表达升高，而Wnt9a 和FZD7的表达下降。
通讯作者：查振刚，博士，教授，博士生导师，暨南大学附属第一医院，广东省广州市 510632 3 临床应用的意义：经典Wnt 信号、非经典Wnt 信号以及其内部多中因子都参与间充质干细胞增殖和分化的调控。
中图分类号:R318 关键词：
干细胞；干细胞综述；Wnt 蛋白质；间充质干细胞；Wnt 信号通路；成骨细胞分化；经典Wnt 信号传导通路；非经典Wnt 信号传导通路；省级基金 文献标识码:A 文章编号:2095-4344 (2013)40-07144-06
收稿日期：2013-04-11 修回日期：2013-05-30 (2
01304127/W ·W)
Pan Jing-hua ★, Studying for master’s degree, First Clinical College of Jinan University, Guangzhou 510000, Guangdong Province, China 394805331@https://www.sodocs.net/doc/ea2943508.html,
Corresponding author: Zha Zhen-gang, M.D., Professor, Doctoral supervisor, First Affiliated Hospital of Jinan University, Guangzhou 510632, Guangdong Province, China
Received: 2013-04-11 Accepted: 2013-05-30
主题词：
WNT 蛋白质类；间质干细胞；成骨细胞；细胞分化 基金资助：
广东省科技计划(2011B050300013)*
摘要
背景：研究表明Wnt 信号通路在间充质干细胞向成骨分化中具有重要作用。
目的：归纳总结Wnt 信号通路的机制、调控以及其参与间充质干细胞成骨分化的作用。
方法：应用计算机检索Pubmed 和CNKI 数据库中1998年9月至2013年3月相关文献，在标题和摘要中以“Wnt ，间充质干细胞，Wnt 信号通路，成骨细胞分化，经典Wnt 信号传导通路，非经典Wnt 信号传导通路”或“Wnt ，Mesenchymal stem cells ，Wnt signaling pathways ，osteoblastic differentiation ，canonical Wnt signaling ，non-canonical Wnt signaling ”为检索关键词进行检索。最后选择31篇符合标准的文献进行综述。 结果与结论：Wnt 信号传导通路在间充质干细胞向成骨细胞中充当着关键的角色，包括经典Wnt 信号、非经典Wnt 信号以及其内部多种因子都参与间充质干细胞增殖和分化的调控。经典Wnt 信号传导通路与非经典Wnt 信号传导通路能联合调控人间充质干细胞的多向性分化，其中Wnt 信号传导通路在参与在间充质干细胞向成骨分化的过程中，Wnt11，FZD6，sFRP2，sFRP3和Ror2等因子的表达升高，而Wnt9a 和FZD7的表达下降。但Wnt 信号的各因子如何相互影响，如何利用Wnt 信号的机制促使间充质干细胞更快、更准确地分化值得更进一步探讨与研究。
Wnt signaling pathways in osteogenic differentiation of mesenchymal stem cells
Pan Jing-hua 1, Huang Hao 1, Zha Zhen-gang 2 (1First Clinical College of Jinan University, Guangzhou 510000, Guangdong Province, China; 2First Affiliated Hospital of Jinan University, Guangzhou 510632, Guangdong Province, China)
Abstract
BACKGROUND: Studies have shown that Wnt signaling pathways play an important role in the osteogenic differentiation of mesenchymal stem cells.
OBJECTIVE: To review the mechanism and regulation of the Wnt signaling pathways, as well as Wnt signaling pathway effects on osteogenic differentiation of mesenchymal stem cells.
METHODS: A computer-based search of PuMed database and CNKI database from September 1998 to March 2013 was performed to search related articles. The key words of “Wnt, mesenchymal stem cells, Wnt signaling pathways, osteoblastic differentiation, canonical wnt signaling pathway, non-canonical signaling pathway” in English or Chinese were used to search the articles in the title and the abstract. A total of 31 articles were included to review.
RESULTS AND CONCLUSION: Wnt signaling pathways play a critical role in the osteogenic differentiation of mesenchymal stem cells. Canonical Wnt signaling pathway, non-canonical Wnt signaling pathway, and their
mutli-factors were involved in regulating the proliferation and differentiation of mesenchymal stem cells. The osteogenic differentiation of mesenchymal stem cells can be promoted effectively via specific induction of Wnt signaling pathways. Wnt11, FZD6, sFRP2, sFRP3 and Ror2 expressions increase, while Wnt9a and FZD7 decreases during the regulation. However, the relations of factors in Wnt signaling pathways and how to use the mechanism of Wnt signaling for promoting mesenchymal stem cells faster, more accurate differentiation need further studies.
Subject headings: Wnt proteins; mesenchymal stem cells; osteoblasts; cell differentiation
Funding: the Scientific and Technology Plan of Guangdong Province, No. 2011B050300013*
Pan JH, Huang H, Zha ZG. Wnt signaling pathways in osteogenic differentiation of mesenchymal stem cells. Zhongguo Zuzhi Gongcheng Yanjiu. 2013;17(40):7144-7149.
0 引言 Introduction
间充质干细胞是一种具有多潜能的成体干细胞，在一定的诱导条件下，间充质干细胞具有向成骨细胞、软骨细胞、神经细胞、脂肪细胞和心肌细胞等多向分化的能力[1]。在间充质干细胞向成骨细胞分化增殖的过程中，转化生长因子β/骨形态发生蛋白、MAPK和Wnt等信号传导通路途径在整个成骨细胞分化中起着重要的作用[2]。近年来在骨组织工程方面的研究以及骨代谢方面的研究中，Wnt信号通路对成骨细胞的影响研究较为热点。
文章主要通过综合近年来国内外关于Wnt信号传导通路的机制，以及其在间充质干细胞向成骨分化中作用的研究，简述Wnt信号通路机制与其在间充质干细胞向成骨细胞分化中的作用。
1 资料和方法 Data and methods
1.1 资料来源由第一作者应用计算机检索Pubmed 和CNKI数据库中1998年9月至2013年3月关于“Wnt 信号传导通路在间充质干细胞向成骨细胞分化中的作用”的文章，在标题和摘要中以“Wnt，间充质干细胞，Wnt信号通路，成骨细胞分化，经典Wnt信号传导通路，非经典Wnt信号传导通路”或“Wnt，Mesenchymal stem cells，Wnt signaling pathways，osteoblastic differentiation，canonical Wnt signaling，non-canonical Wnt signaling”为检索关键词进行检索。
1.2 入选标准
纳入标准：①文献具有原创性及科学性，文章的论点及论据可靠。②具有针对性强、相关度高的文献。
③对同一领域的文献选择近期或在权威杂志发表的文献。
排除标准：①重复性研究以及陈旧的理论观点。
②和本综述主题相关联不大的文章。
1.3 质量评估初检得到97篇文献，其中英文文献86篇，中文文献11篇。阅读标题和摘要进行初筛，排除与研究目的不符和重复性文章，最后选择31篇符合标准的文献进行综述。
2 结果 Results
2.1 Wnt蛋白Wnt最早是由Nusse在1982年通过果蝇wingless(Wg)基因和小鼠的Int-1基因组合而来。Wnt蛋白家族富含L-半胱氨酸、为相对分子质量39 000-46 000的分泌信号的糖蛋白，其中，Wnt蛋白家族是一个由一段信号肽及23或24个位置保守的半胱氨酸残基组成，在多种组织广泛表达，且在进化上高度保守。至今为止在人类中发现19种Wnt基因能够翻译转录成Wnt蛋白[3]。细胞膜外的Wnt蛋白有2种类型，一类能与LRP/FZD相互结合并发挥协同作用而激活Wnt/β-catenin经典途径，如Wnt1、Wnt2、Wnt3、Wnt3a、Wnt8和Wnt8b等；另一类是能与Frizzled结合激活异源三聚体G-蛋白，提高细胞内钙水平的作用，如Wnt4、Wnt5a、Wnt5b、Wnt6、Wnt7a和Wnt11等[4]。
2.2 Wnt信号传导通路
经典Wnt信号传导通路：经典Wnt信号传导通路描述当Wnt蛋白于细胞表面Frizzled(FZD)受体家族结合后的一系列反应，其中β-catenin是经典Wnt信号传导通路中的关键因子，β-catenin在细胞质中含量最多，可存在于细胞膜及细胞核中。当Wnt信号通路未被激活时，在细胞质中的β-catenin与APC、AXIN、GSK-3β这些因子结合在一起，形成结合体。因GSK-3β和CKIα能促进β-catenin的磷酸化，经磷酸化后的β-catenin随后通过启动β-TrCP介导的泛素/蛋白酶体途径降解[5]。见图1。
Wnt通路中，在细胞膜表面上的FZD受体和LRP5/6受体同样充当着相当重要的角色[6]，在当Wnt 蛋白与FZD受体和LRP5/6受体结合时，Dvl (disheveled)通过CKIε变得过磷酸化，从而获得更大的亲和力与FRAT和FZD结合，导致LRP5/ 6-Axin-FRAT结合体中的Axin得到降解，因此，结合体内部结构改变后，β-catenin从LRP5/6-Axin-FRAT 结合体中游离出来。Wnt在激活Dvl的同时，也相反
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地抑制GSK3β的活性。在这情况下，β-catenin 分子从降解中逃离出来并大量积聚，进入细胞核内，与在TCF/LEF1结合，从而导致抑制TCF/LEF1与转录抑制因子Groucho/HDACs 的结合，最后吸收组蛋白乙酰基转移酶CBP/p300从而激活目的基因的表达。见图2。
非经典Wnt 信号传导通路：与经典Wnt 信号通路相比，非经典Wnt 信号传导通路并不依赖β-catenin 在胞内的聚集而发挥作用，在某些时候甚至可以抑制细胞核β-catenin 的活性[7]。同时非经典Wnt 信号传导通路也更加复杂，非经典Wnt 信号传导通路包含着多种分子的参与，该通路Wnt 蛋白主要包括Wnt5a ，Wnt11，Wnt7a 等，内部的联系也是多样化[8]。目前发现非经典Wnt 信号通路可以通过Wnt/PCP ，Wnt/JNK ，Wnt/calcium 和Wnt/Rho 信号发挥作用。这些信号的开始是由于对FZD 和共同受体的激活，如Ror2受体和Ryk 受体；也通过潜在的多样机制如Ca 2+依赖机制和Dvl 依赖机制来进行信号转换[9]。而小鸟嘌呤核苷三磷酸酶RhoA 和它的效应器ROK 通过Dvl 激
活，然后在Wnt 信号通路参与调节肌动蛋白细胞骨架(cytoskeleton)。JNK 是另一个Dvl 的下游效应器，它能被RhoA 激活从而调控PCP 信号。
非经典Wnt 信号通路同样通过异源三聚体的G 蛋白进行，异源三聚体的G 蛋白能激活Dvl ，引起下游的钙离子聚集和PKC 的激活。Nemo 样激酶抗体NLK(Nemo-like kinase)和活化T 细胞的核因子(NFAT)在非经典Wnt 信号通路中是钙离子依赖的效应器，同样，NLK 能使TCF/LEF1磷酸化同时也抑制经典的Wnt 信号通路的表达。见图3。 图1 未激活的经典Wnt 信号通路
图3 激活后的非经典Wnt 信号传导通路
图2 激活后的经典Wnt 信号传导通路
2.3 Wnt 信号通路的调控
胞膜受体的调控：几组干扰受体、配体结合和细胞内信号传导的负调节蛋白严格地控制着Wnt 信号通路。分泌FZD 相关的多肽类sFRPs 基因和Wnt 信号抑制因子1(WIF-1)竞争性地与FZD 受体结合，同时，分泌型糖蛋白DDks (Dickkopfs)和硬化蛋白(Sclerostin)会与LRPs 结合从而阻止Wnt 信号通路。Sclerostin 蛋白是骨细胞中高度表达的SOST 基因的蛋白产物，它与LRP5/6结合在一起，阻止FZD-LRP 复合体的形成，从而阻止Wnt 蛋白激活β-catenin 途径。DDKs 与Sclerostin 相似，通过与LRP5/6结合阻止β-catenin 途径。sFRPs 和 WIF-1可以衰减Wnt 信号通路传导，有研究表明，sFRPs 和 WIF-1可以通过此机制影响肿瘤的发生[10]。sFRPs 同样可以调节骨骼发育和其他
组织的形成[11-12]
。
胞质中的调控：除了在细胞膜受体的竞争性调节外，在细胞质内许多的蛋白质同样也干扰着Wnt 信号传导通路的进行。如与β-catenin 结合着的APC 、Axin1、Axin2蛋白，需要参与β-catenin 的降解过程。GSK-3β和CKI α使β-catenin 磷酸化，直接导致了β-catenin 的降解。在非经典Wnt 信号通路中，Nkd(一种在大多数动物中的胞内蛋白)中的Nkd1和Nkd2蛋白可以和Dvl 结合，使Dvl 通过刺激JNK 的激活，促进
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Wnt/PCP通路的进行，但同时，也妨碍了Dvl在经典信号通路的作用[13]。与Nkd相类似，NLK通过对抗TCF/LEF1，在激活非经典Wnt信号通路同时，也抑制着经典Wnt信号通路。
细胞外的调控：除了在包膜受体方面和细胞质内的调控外，Wnt信号传导通路还受细胞外的因素影响，如乙酰肝素蛋白聚糖。硫酸乙酰肝素的多聚糖链与成纤维细胞生长因子、Wnt、骨形态发生蛋白这些关键因素结合，从而去调控间充质干细胞的增殖和分化[14]。通过乙酰肝素硫酸盐与Wnt配体结合，从而调整Wnt 与FZD受体的通路和调控多种发育的过程。
2.4 Wnt参与间充质干细胞自我增殖
Wnt信号传导通路参与间充质干细胞自我增殖：Wnt 信号传导通路在间充质干细胞的增殖和分化调控中具有非常重要的作用。间充质干细胞能够表达许多的Wnt配体，包括Wnt2、Wnt4、Wnt5a、Wnt11和Wnt16；也能表达几种Wnt受体，包括FZD2、FZD3、FZD4、FZD5、FZD6；还有多种的共同受体和Wnt抑制因子[15]。当Wnt蛋白在间充质干细胞中一旦被分泌后，Wnt蛋白就能附上细胞表面或者是细胞外的基质中参与其信号传导通路的机制。
Boland等[16]研究提出：Wnt信号传导通路能够保持干细胞的自我繁殖和未分化状态，外源性应用Wnt3a对间充质干细胞进行培养后，能够使间充质干细胞向多种成熟细胞分化，对人类能生成的脂肪干细胞能够增加其自我繁殖和减少凋亡。此外，对于参与经典Wnt信号通路的关键因素LRP5，能够使间充质干细胞的增殖增加。Baksh等[17]也通过研究表明：而Wnt5a能通过激活非经典Wnt信号传导通路，从而抑制β-catenin/TCF信号，从而降低间充质干细胞的增殖率。另外，Qiu等[18]研究报道提出Wnt经典信号通路可通过一个自分泌或旁分泌方式抑制人间充质干细胞的增殖。因此，这都表明经典Wnt信号传导通路与非经典信号传导通路可能在不同的条件下能够对间充质干细胞产生不同甚至相反的生物效应，使间充质干细胞能够增殖、分化，而Wnt通路中具体如何使间充质干细胞增殖，其内部因子如何调控间充质干细胞的增殖，这些问题机制比较复杂复杂，仍然需要进一步的研究去阐明这些问题。
2.5 wnt信号传导通路与骨生成研究已经证明了经典Wnt信号传导通路与非经典Wnt信号传导通路能联合调控人间充质干细胞的多向性分化，其中Wnt信号传导通路在参与在间充质干细胞想成骨分化的过程中，其中Wnt11，FZD6，sFRP2，sFRP3和Ror2等因子的表达升高，而Wnt9a和FZD7的表达下降。Yamada 等[19]的研究发现，通过骨诱导，sFRP3和sFRP4具有调节间充质干细胞向成骨细胞的分化的潜力，其中sFRP4主要参与经典Wnt信号传导通路调节成骨分化，而sFRP3则通过非经典途径抑制Wnt5a 抑制成骨分化。
Wnt3a与间充质干细胞成骨分化：Boland等[20]已经提出了经典Wnt信号中能促进间充质干细胞向骨生成的表达，在Wnt3a的参与间充质干细胞能向成骨分化的过程中，同时可以发现间充质干细胞骨基质矿化和碱性磷酸酶活性增加，还有部分增加骨表达的标记物也增加。deBoer等[21]同样研究指出：通过外源性利用Wnt3a参与间充质干细胞向成骨细胞分化时，利用GSK3β的一种抑制剂——锂，去抑制经典Wnt信号传导通路GSK3β参与调控，能够抑制利用地塞米松诱导的间充质干细胞向骨生成。Tang 等[22]研究认为Wnt3a同样与骨形态发生蛋白9存在非常密切的联系，Wnt3a与骨形态发生蛋白9能够增强彼此的能力，引导碱性磷酸酶在间充质干细胞中的生成，从而提高成骨分化。另外，Nemoto等[23]研究证实了sFRP3能减弱Wnt3a抑制碱性磷酸酶和骨形态发生蛋白的mRNA表达，而显性失活的TCF1能提高碱性磷酸酶和骨形态发生蛋白的mRNA的表达，也提高了碱性磷酸酶的活性。因此可以看出，在Wnt信号通路当中，Wnt3a是通过与受体结合之后，激活一系列的因子反应，在与骨形态发生蛋白的协同作用下，促进间充质干细胞向成骨分化的表达。
Wnt多水平、多方向调控间充质干细胞成骨分化：Sclerostin是一个非常关键的调节器，Sclerostin和Wnt竞争地与LRP相结合，通过该机制作为骨形态发生蛋白的抑制物，从而能下调骨形态发生蛋白的活性而抑制成骨，Rybchyn等[24]研究表明，锶可以通过抑制Sclerostin与LRP的结合，从而促进间充质干细胞的成骨生成。因其机制，目前Sclerostin被认为可能是下个骨质疏松治疗的靶点之一。经典Wnt 信号传导通路在间充质干细胞向成骨细胞分化的过程中的作用应该是多样化的，这基于不同级别的Wnt蛋白活性，还有在其它因素的影响之下，也会是间充质干细胞向成骨细胞分化产生不同的效果。Qiu等[18]研究指出，高剂量的外源性Wnt3a或通过过量表达的LRP5和稳定变异的β-catenin都可以增强间充质干细胞向成骨细胞分化；Hartmann等[25]提出：Wnt信号通路中的LRP5功能获得性突变，或sFRP、DKK失活，则会引起高骨密度症，LRP5的功能丧失也会导致骨质疏松-假性神经胶质瘤综合征。也有研究指出，Wnt信号传导通路可以通过上调其RUNX2，Dlx5 或 osterix(成骨相关转录因子抗体)[26]，从而促进间充质干细胞和骨先质细胞向成骨细胞分化。
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非经典Wnt信号传导通路与骨生成：非经典Wnt途径，可通过Frizzled和Rorl/2 辅助受体复合体对Wnt 的识别进行转换，可分别激活RhoA，JNK和Ca通道，从而促进间充质干细胞的多向分化。Amsdorf等[27]提出，非经典途径中尤其是通过激活小GTP酶RhoA和他们的直接效应蛋白ROCK对于决定骨髓间充质干细胞分化方向上有相当重要的作用，同时，有活力的肌动蛋白细胞骨架同样在诱导分化的基因表达中是必不可少的。参与非经典Wnt途径的Wnt11已经被证明可以对人类胚胎骨胳发育具有重要作用[28]，且Wnt5a是参与非经典Wnt信号通路中的一个重要因子，已被证明在骨髓间充质细胞中是通过抑制PPARγ来诱导成骨的。有Takada等[29]研究报道认为，非经典Wnt通路通过招募抑制性组氨酸甲基，使染色体失活而抑制PPARγ的功能，从而促进成骨细胞生成。在Wnt5a参与非经典信号传导通路的基础上，配子Ror2也被研究证明可以通过被骨髓瘤细胞激活后产生损伤骨生成的分化[30]。除此之外，Nemoto等[31]还表明了Wnt5a信号也被证明是一种实质的成分，通过骨形态发生蛋白2介导间充质干细胞的成骨发生[31]。
3 总结 Conclusion
间充质干细胞的在组织工程为临床治疗方面提供了更多的选择与发展，如何利用、诱导间充质干细胞快速向不同细胞分化对生物组织工程具有非常重要的意义。如今已经有不少研究利用各种因素去刺激充质干细胞进行诱导分化，但要想真正利用好间充质干细胞，弄清其机制是未来研究的目标。Wnt信号传导通路在间充质干细胞向成骨细胞及其他细胞分化中充当着重要作用，但因其机制较复杂，Wnt的信号通路的各种因子如何相互影响，其机制并未完全清楚，目前对经典Wnt信号传导通路参与间充质干细胞的成骨分化研究较多，而非经典Wnt信号通路的机制更加复杂，目前其通路发生机制亦未完全明确，仍需要更进一步的研究。另外，如何利用Wnt信号传导促使间充质干细胞更快、更准确地分化，外界条件、药物等因素对分化对影响等问题，值得更进一步探讨与研究。
致谢：查振刚教授对该文章在写作过程中的悉心指导，感谢老师给予的充分理解与支持。
作者贡献：第一作者查阅、分析文献，并完成本综述；通讯作者审校论文并提出了重要修改意见。
利益冲突：课题未涉及任何厂家及相关雇主或其他经济组织直接或间接的经济或利益的赞助。
学术术语：Wnt信号通路是一个复杂的蛋白质作用网络，其功能最常见于胚胎发育和癌症，但也参与成年动物的正常生理过程。Wnt信号通路包括许多可调控Wnt信号分子合成的蛋白质，它们与靶细胞上的受体相互作用，而靶细胞的生理反应则来源于细胞和胞外Wnt配体的相互作用。尽管反应的发生及强度因Wnt配体，细胞种类及机体自身而异，信号通路中某些成分，从线虫到人类都具有很高的同源性。蛋白质的同源性提示多种各异的Wnt配体来源于各种生物的共同祖先。
作者声明：文章为原创作品，数据准确，内容不涉及泄密，无一稿两投，无抄袭，无内容剽窃，无作者署名争议，无与他人课题以及专利技术的争执，内容真实，文责自负。
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间充质干细胞
间充质干细胞及来源 间充质干细胞（Mesenchymal Stem Cell，MSC）是干细胞的一种，因能分化为间质组织而得名，具有亚全能分化潜能，在特定的体内外环境下，能够诱导分化成为多种组织细胞。间充质干细胞具有干细胞的共性，即自我更新、多向分化和归巢的能力。 间充质干细胞具有向多种类型细胞分化的能力，可以分化为神经、心脏、肝脏、骨、软骨、肌腱、脂肪、上皮等多种细胞。这种多向分化的能力给人类多种疾病的治疗提供了重要的原材料。 间充质干细胞来源：间充质干细胞广泛分布于胎儿和成体的骨髓、骨膜、松骨质、脂肪、滑膜、骨骼肌、胎肝、乳牙、脐带、脐带血中，其中脐带来源的间充质干细胞质量高、纯净、数量多。 间充质干细胞生物学特性 间充质干细胞具有以下特性： 1）具有强大的增殖能力和多向分化潜能，在适宜的体内或体外环境下不仅可分化为造血细胞，还具有分化为肌细胞、肝细胞、成骨细胞、软骨细胞、基质细胞等多种细胞的能力。 2）具有免疫调节功能，通过细胞间的相互作用及产生细胞因子抑制T细胞的增殖及其免疫反应，从而发挥免疫重建的功能。 3）具有来源方便，易于分离、培养、扩增和纯化，多次传代扩增后仍具有干细胞特性，不存在免疫排斥的特性。 正是由于间充质干细胞所具备的这些免疫学特性，使其在自身免疫性疾病以及各种替代治疗等方面具有广阔的临床应用前景。通过自体移植可以重建组织器官的结构和功能，并且可避免免疫排斥反应。
间充质干细胞的临床应用 1.间充质干细胞在细胞替代治疗中的前景 以组织工程学为手段可望解决的问题几乎涉及人类面临的大多数医学难属，如烧伤、放射损伤等患者的植皮；肌肉、骨及软骨缺损的修补；髋、膝等关节的替换；血管疾病或损伤后的血管替代；糖尿病患者的胰岛植入；心脏病患者的瓣膜替代、房室间隔缺损的修补；癌症患者手术切除后组织或器官的替代；放射损伤及大剂量放疗、化疗后的造血与免疫重建；肝、肾等重要脏器因损伤或功能衰竭的置换；部分遗传缺陷性疾病的治疗等。在不久的将来，某些组织工程产品，如人造皮肤、血管、骨、软骨、肌肉、瓣膜、神经甚至胰岛、肾、肝等组织器官或细胞将相继问世，然后植入患者体内，用以恢复损伤、替代退行性组织器官以及改变遗传缺陷性组织器官的功能。人类也将进入实际应用现代组织工程产品的新时代。 目前，在组织干细胞定向分化领域取得了明显的进展。在体外可以定向诱导一些多能干细胞分化为骨、软骨、肌肉、脂肪、肌腱、神经等多种组织细胞，这些成果很令人鼓舞。造血干细胞的移植已得到广泛开展，通过输注造血干细胞来对恶性血液病患者进行造血重建已取得成功，这为组织干细胞的研究提供了成功的范例。 MSC因其具有高度的自我更新能力和多向分化潜能，以及取材方便、体内植入后不良反应较弱等优点而备受关注，将成为细胞替代治疗的理想种子细胞。 MSC与生物材料相结合，能够修复骨、软骨、肌腱等各种组织的缺损，这是组织工程中的新领域。 MSC在治疗组织09官退行性疾病方面也展示了前景。随着年龄的增长，机体的组织器官会出现退行性的改变，从而引发一些相关疾病，如肌肉萎缩、肌营养不良、脑萎缩、帕金森病、阿尔茨海默综合征等。而这些组织的再生比较固难，MSC在体内外能够分化为肌肉细胞和神经细胞，为治疗这些退行性疾病带来了希望。 遗传缺陷性疾病发病率也很高，而且治疗难度极大。利用体外分离的MSC或其诱导分化后的细胞来改善遗传缺陷组织的功能，这一治疗途径正在被尝试。 2. 间充质干细胞在基因治疗中的前景 一些干细胞不仅具有多向分化潜能，而且易于外源基因的转染和表达。将体外经过基因修饰的干细胞用于治疗，可以避免转染载体进入受体产生的不良影响。基因修饰的干细胞可以在多个靶位发挥作用。 (1)干细胞潜能的改变——干细胞靶位基因转染以后可以改变干细胞的某些特性。从成人或成年动物分离的干细胞有时会表现出年龄相关性、遗传性或获得性疾病相关性再生能力损伤，基因转录或酶切修饰可以有效地维持、加强或抑制干细胞的分化和增殖能力。 (2)器官系统性能的改善——干细胞子代靶位转入干细胞的基因可以随着干细胞的分化传代而遗传给子代细胞，在基因转导的干细胞重建的器官系统中持续表达，改善重建
人脐带间充质干细胞分离培养及向脂肪与成骨细胞的分化
中国组织工程研究与临床康复 第14卷 第14期 2010–04–02出版 Journal of Clinical Rehabilitative Tissue Engineering Research April 2, 2010 Vol.14, No.14 P .O. Box 1200, Shenyang 110004 https://www.sodocs.net/doc/ea2943508.html, 2492 1 Biomedicine Research and Development Centre of Jinan University, Guangzhou 510632, Guangdong Province, China; 2 Guangzhou (Jinan)-Hong Kong Joint Laboratory of Cell Engineering, Guangzhou 510632, Guangdong Province, China; 3 Asia-Pacific Stem Cell Research Centre Co., Ltd., Hong Kong 999077, China; 4 Department of Obstetrics and Gynecology, First Affiliated Hospital of Jinan University, Guangzhou 510632, Guangdong Province, China; 5 Department of Bioengineering, Clemson University, Clemson, SC 29634-0905, USA He Shao-qing ★, Studying for master’s degree, Biomedicine Research and Development Centre of Jinan University, Guangzhou 510632, Guangdong Province, China; Guangzhou (Jinan)-Hong Kong Joint Laboratory of Cell Engineering, Guangzhou 510632, Guangdong Province, China heshq106@https://www.sodocs.net/doc/ea2943508.html, 人脐带间充质干细胞分离培养及向脂肪与成骨细胞的分化**★△○ 何绍清1， 2，罗振宇1， 2，刘秋英1， 2，周向荣△2， 3，邓铭权△2， 3，罗 新4，姚润斯4，高 志5，王一飞○1， 2 Isolation of human umbilical cord mesenchymal stem cells and differentiation into adipocytes and osteblasts He Shao-qing 1, 2, Luo Zhen-yu 1, 2, Liu Qiu-ying 1, 2, Zhou Xiang-rong 2, 3, Deng Ming-quan 2, 3, Luo Xin 4, Yao Run-si 4, Gao Zhi 5, Wang Yi-fei 1, 2 Abstract He SQ, Luo ZY, Liu QY, Zhou XR, Deng MQ, Luo X, Yao RS, Gao Z, Wang YF. Isolation of human umbilical cord mesenchymal stem cells and differentiation into adipocytes and osteblasts. Zhongguo Zuzhi Gongcheng Yanjiu yu Linchuang Kangfu. 2010;14(14): 2492-2496. [https://www.sodocs.net/doc/ea2943508.html, https://www.sodocs.net/doc/ea2943508.html,] 摘要 何绍清，罗振宇，刘秋英，周向荣，邓铭权，罗新，姚润斯，高志，王一飞.人脐带间充质干细胞分离培养及向脂肪与成骨细胞的分化[J].中国组织工程研究与临床康复，2010，14(14):2492-2496. [https://www.sodocs.net/doc/ea2943508.html, https://www.sodocs.net/doc/ea2943508.html,] 0 引言 间充质干细胞具有自我更新能力，能分化成为成骨、软骨、肌肉和脂肪细胞等间质组织细胞[1-3]，甚至能分化为心肌、神经胶质和神经细胞[4-6]。近年来因其在组织工程和细胞替代治疗的临床前研究而备受关注。间充质干细胞分布在体内骨髓和其他组织与器官中，如脂肪组织、脐血，甚至外周血也发现有间充质干细胞 [7-10] 。 目前，骨髓间充质干细胞是最常用的种子细胞，但其数量和分化潜能随着年龄的增长显著减少 和降低[11-13]，并且取材时易对供体造成身体伤害。因此，非常有必要寻找新的自体和异体移植的细胞来源。这种新的细胞除了必须具备骨 髓间充质干细胞有更强的增殖力和多向分化潜能的特点外，还必须取材便利，不易造成病毒污染，且不受伦理道德限制等。 脐带由中胚层发育而来，是胎儿时期连接胎儿和母体的索状结构，外由羊膜包被，内有两条动脉和一条静脉及血管周围富含蛋白多糖和黏多糖的组织组成[14]。分娩后的脐带一直都被当废弃物丢弃，近年来因寻求更多来源的成体干细胞而受到关注。自Mitchell 等[15]提出
骨髓间充质干细胞研究进展(一)
骨髓间充质干细胞研究进展(一) 【摘要】骨髓间充质干细胞是干细胞领域的研究热点之一。虽然近几年来有关间充质干细胞的研究已取得了很大进展，但仍有很多问题有待进一步解决。本文主要对间充质干细胞的生物学特性、以及免疫耐受性、分化和促修复、间充质干细胞的标记等问题进行综述。 【关键词】骨髓间充质干细胞分化标记 骨髓间充质干细胞，BMSCs)是骨髓内除造血干细胞(hematopoieticstemcells，HSC)之外的另一类干细胞，是骨髓造血微环境的重要组成部分，在体内外均具有支持和调控造血的作用。因其比较容易贴壁和形成成纤维样的克隆，因此也称成纤维细胞集落形成单位(Colonyformingunitfibroblast，。又由于它们来自骨髓的支持结构，并作为滋养层支持造血干细胞的生长，因此也有人称其为骨髓基质细胞(Bonemarrowstromalcells，BMSCs)。 1骨髓MSCs的生物学特性 不同物种的BMSCs体外培养的形态学特征大致相同，主要表现为梭形、纺锤形，少数为多角形。目前，BMSCs的分离方法主要有以下几种：(1)全骨髓培养，是将无菌抽取的骨髓加入培养液制成细胞悬液并培养，原代培养培养物以造血细胞成分居多，为利于BMSCs的贴壁生长，可采用DMEM和胎牛血清培养。BMSCs对营养要求高，胎牛血清终浓度为10％～20％，有人认为红细胞会随着换液而逐渐被自然去除，对BMSCs影响不大。细胞融合后以1:2比例传代，3～4天换液一次〔1〕；(2)离心培养法，是根据骨髓中细胞成分比重的不同，采用离心分离法提取单核细胞进行培养。在新鲜无菌的骨髓抽取物中加入抗凝培养液稀释1500～2000r／min离心20～30min，采集交界处的单核细胞层，PBS洗涤2～3次后，加入培养液接种培养；(3)细胞表面分子标记分选法，主要是根据BMSCs的细胞表面分子特征来分离。一般采用流式细胞仪、免疫磁珠或免疫沉积法来进行分选。但由于目前仍未找到BMSCs 特异性的细胞表面标记物〔2〕该法较少采用。影响BMSCs扩增的主要因素：(1)血清：血清对大量扩增BMSCs起着重要的作用，不同浓度的血清对培养BMScs纯度的影响亦较大，常用1０%～20%的胎牛血清培养BMSCs;(2)接种密度：BMSCs的体外扩增速度与其接种密度也有关，一般认为较低密度种植有益于增殖。高密度接种后细胞生长较慢其原因可能是由于细胞间的接触抑制，或细胞释放到培养基中的因子影响了BMSCs的生长;(3)细胞因子：一些细胞因子对于维持BMSCs增殖和未分化状态亦十分重要;(4)动物种属：一般认为BMSCs的生长特性相似，但也有资料显示BMSCs生长特点有种属差异〔3〕。 2间充质干细胞移植后的免疫耐受性 在移植治疗中，一般情况下，移植物会引起宿主的免疫排斥反应。但对于间充质干细胞来说却不是这样。实验表明间充质干细胞可以抑制T细胞的增殖从而导致免疫耐受〔4～7〕。T 细胞与其它细胞的相互作用可以通过混和淋巴细胞反应来观察。被标记的T细胞与其它细胞混合后，如果可以引起T细胞的免疫反应，则可以观察到T细胞的增殖现象。但当把间充质干细胞与T细胞混合后却观察不到T细胞的增殖反应，而且这种现象并不是由于T细胞凋亡或其它的有害作用引起的。因为在去除间充质干细胞后，这些T细胞仍然可以对其它物质进行反应。此外，使用趋化膜将两种细胞分隔开培养后，间充质干细胞对T细胞的抑制作用依然存在，表明这种抑制作用可能通过某种可溶性的小分子起作用。另外，除了未分化的间充质干细胞可以抑制T细胞的增殖外，实验也表明，随着干细胞的分化，其抗原性并没有随之增加〔8〕。总之，间充质干细胞可以通过某种机制抑制T细胞的成熟来逃避免疫系统的清除。也暗示间充质干细胞可能在机体免疫系统的调节及骨髓中各种干细胞未分化状态的维持方面起作用。 3促组织修复和细胞分化 骨髓间充质干细胞(BMSCs)是存在于骨髓组织中的一类成体干细胞(adultstemcells，AS)，在一
间充质干细胞培养方法
间充质干细胞培养方法 1. 间充质干细胞MSC基本形态 2. 干细胞应用与干细胞调控。 3. 间充质干细胞MSC生长过程 4. 间充质干细胞MSC培养的合适气体环境 5. 细胞培养板的选择 6. 如何选用细胞培养基 7. 如何维持培养液p H 8. 血清与干细胞的培养 9. 胎牛血清（F B S ）是否需要灭活 10. 细胞的细菌、真菌污染及排除 11. 细胞培养污染的预防 12. 使用胰蛋白酶时加入E DTA的目的是什么 13. 胶原酶的种类和选型 14. 胶原酶V S胰酶 15. 干细胞的种类和表面标记 16. 间质干细胞培养原理概述 17. 间质干细胞成脂和成骨诱导分化 18. 干细胞老化的表现和处理 19. 细胞传代消化过程指导 20. 冷冻保护剂作用和选择 21. 细胞冻存指导 22. 干细胞冷冻和复 23. 移植细胞的基因修饰 1．间充质干细胞MSC基本形态 体外培养细胞根据它们在培养器皿是否能贴附于支持物上生长特征，可分为贴附型生长细胞，常表现为成纤维型细胞和上皮细胞。悬浮型细胞在培养中悬浮生长。 间充质干细胞MSC基本形态：形态与成纤维细胞类似，细胞在支持物表面呈梭形或不规则三角形生长，细胞中央有卵圆形核，胞质向外伸出2－3 厘米个长短不同的突起。可看到细胞成螺旋状生长。 2．干细胞应用与干细胞调控 干细胞的调控是指给出适当的因子条件，对干细胞的增殖和分化进行调控，使之向指定的方向发展。 2.1源性调控 干细胞自身有许多调控因子可对外界信号起反应从而调节其增殖和分化，包括调节细胞不对称分裂的蛋白，控制基因表达的核因子等。另外，干细胞在终末分化之前所进行的分裂次数也受到细胞调控因子的制约。 （1）胞蛋白对干细胞分裂的调控 干细胞分裂可能产生新的干细胞或分化的功能细胞。这种分化的不对称是由于细胞本身成分的不均等分配和周围环境的作用造成的。细胞的结构蛋白，特别是细胞骨架成分对细胞的发育非常重要。如在果蝇卵巢中，调控干细胞不对称分裂的是一种称为收缩体的细胞器，包含有许多调节蛋白，如膜收缩蛋白和细胞周期素A。收缩体与纺锤体的结合决定了干细胞分裂的部位，从而把维持干细胞性状所必需的成分保留在子代干细胞中。
骨髓间充质干细胞体外诱导分化与标记(一)
骨髓间充质干细胞体外诱导分化与标记(一) 作者：吴晓林,李冬民,马德茂,张晓田,黄石,宋天保 【关键词】骨髓 【Abstract】AIM:Tostudythedifferentiationcharacteristicsandtheoptimaldosageandtimingforbromodeoxyuridi ne(Brdu)labelingofratbonemarrowderivedmesenchymalstemcells(MSCs)invitro.METHODS:Therat marrowstemcellsisolatedbyusingPercoll(1.073kg/L)wereculturedandproliferated.Thethirdpassage cellswereinducedwithdexamethasome,βglycerophosphate,ascorbicacid2phosphate,IGF1andinsuli n.Onday21,thecellswereanalyzedbyimmunohistochemistryfortypeⅠcollagenandbyhistochemistry foralkalinephosphatase(AKP).ThepurifiedMSCswereincubatedwithBrduatdifferentconcentrations( 5,10and15μmol/L)fordifferenttimeperiods(12，24，48，72and96h),followedbyimmunohistochemistryforBrdutoidentifytheoptimalBrduconcentrationandi ncubationtimeperiod.RESULTS:Afterincubationfor21dforinduceddifferentiationintoosteoblasts,ty peⅠcollagenandAKPwerepositivelyexpressed.Theincubationwith10μmol/LBrdufor72hachievedov er98%ofthelabelingratewithoutproducingobviouscelldamages.CONCLUSION:MSCscanbeinducedt odifferentiateintoosteoblastsundercertainconditionsinvitro.TheoptimalBrdulabelingconcentration andtimeperiodare10μmol/Land72h,respectively. 【Keywords】MSCs;induceddifferentiation;osteoblast;Brdu 【摘要】目的：探讨骨髓间充质干细胞（MSCs）在体外的诱导分化及5溴脱氧尿嘧啶核苷(Brdu)标记MSCs的可行性.方法：利用密度为1.073kg/L的percoll分离骨髓的单个核细胞，体外培养与扩增MSCs；取生长良好的第3代细胞，用成骨细胞分化培养液培养21d，Ⅰ型胶原免疫组化染色和碱性磷酸酶（AKP）组化染色；分别以浓度为5，10和15μmol/L的Brdu溶液标记MSCs，孵育12，24，48，72和96h后免疫组化检测Brdu，确定最佳标记量和最佳标记时间.结果：诱导分化第21日,AKP染色呈强阳色,Ⅰ型胶原免疫染色呈阳性.10μmol/LBrdu 标记MSCs的效果最好，随着孵育时间的延长，Brdu标记率逐渐增高，标记72h后标记率在90%以上.结论：MSCs在体外一定条件下可定向诱导分化为成骨细胞，用Brdu标记MSCs的最佳浓度为10μmol/L，最佳时间是72h. 【关键词】骨髓间充质干细胞；诱导分化；成骨细胞；5溴脱氧尿嘧啶核苷 0引言 骨髓间充质干细胞(mesenchymalstemcells，MSCs)是一类具有多向分化潜能的组织干细胞.因MSCs取材方便、对机体的损伤小、具有较强的传代增殖能力和免疫耐受性等特点而受到越来越多的关注.本实验的目的是利用MSCs具有分化潜能的特点，在体外诱导该细胞定向分化为成骨细胞.并用Brdu标记连续传代的MSCs，观察最佳标记时间及标记剂量，从而为追踪Brdu标记的MSCs移植入体内后的存活、生长及分化奠定基础. 1材料和方法 1.1材料健康雄性SD大鼠，体质量55～70g.由西安交通大学医学院实验动物中心提供. 1.2方法 1.2.1大鼠骨髓MSCs的体外分离培养将大鼠引颈处死后置于750mL/L乙醇浸泡约5min，无菌条件下分离出大鼠的股骨和胫骨.用PBS冲洗出骨髓细胞，经5mL针管反复吹打制成单细胞悬液，用200目的不锈钢网过滤，收集滤液.在密度为1.073kg/L的percoll（Phamacia）分离液上缓慢加入收集的滤液，2500r/min离心20min，收集滤液与分离液之间的白膜层细胞，用DMEM（Gibco）洗涤两次，1000r/min离心5min.用加有100mL/L胎牛血清（杭州四季青公司）的DMEM重悬细胞，1×108个/L种于两个直径为6cm的培养皿中培养，2d后更换培养液，加入完全培养基.并将吸出的旧培养液分别移入另两个平皿中继续培养，再过2d更换
经典信号通路之Wnt信号通路
经典信号通路之Wnt信号通路 1、Wnt信号通路简介 Wnt信号通路是一个复杂的蛋白质作用网络，其功能最常见于胚胎发育和癌症，但也参与成年动物的正常生理过程. 2、Wnt信号通路的发现 Wnt得名于Wg (wingless) 与Int.wingless 基因最早在果蝇中被发现并作用于胚胎发育，以及成年动物的肢体形成INT 基因最早在脊椎动物中发现，位于小鼠乳腺肿瘤病毒(MMTV)整合位点附近。Int-1 基因与wingless 基因具有同源性。 果蝇中wingless 基因突变可导致无翅畸形，而小鼠乳腺肿瘤中MMTV复制并整合入基因组可导致一种或几种Wnt基因合成增加。 3、Wnt信号通路的机制 Wnt信号通路包括许多可调控Wnt信号分子合成的蛋白质，它们与靶细胞上的受体相互作用，而靶细胞的生理反应则来源与细胞和胞外Wnt配体的相互作用。尽管发应的发生及强度因Wnt配体，细胞种类及机体自身而异，信号通路中某些成分，从线虫到人类都具
有很高的同源性。蛋白质的同源性提示多种各异的Wnt配体来源于各种生物的共同祖先。 经典Wnt通路描述当Wnt蛋白于细胞表面Frizzled受体家族结合后的一系列反应，包括Dishevelled受体家族蛋白质的激活及最终细胞核内β-catenin水平的变化。Dishevelled (DSH) 是细胞膜相关Wnt受体复合物的关键成分，它与Wnt结合后被激活，并抑制下游蛋白质复合物，包括axin、GSK-3、与APC蛋白。axin/GSK-3/APC 复合体可促进细胞内信号分子β-catenin的降解。当“β-catenin 降解复合物”被抑制后，胞浆内的β-catenin得以稳定存在，部分β-catenin进入细胞核与TCF/LEF转录因子家族作用并促进特定基因的表达。 4、Wnt介导的细胞反应 经典Wnt信号通路介导的重要细胞反应包括： 癌症发生。Wnts, APC, axin，与TCFs表达水平的变化均与癌症发生相关。 体轴发育。在蟾蜍卵内注射Wnt抑制剂可导致双头畸形。 形态发生。 （此文档部分内容来源于网络，如有侵权请告知删除，文档可自行编辑修改内容， 供参考，感谢您的配合和支持）
_骨髓间充质干细胞在骨科中的应用
第9卷第18期·总第122期 2011年09月·下半月刊 87骨髓间充质干细胞在骨科中的应用※ 陈亮1陈跃平1,2* 摘要：骨髓间充质干细胞（BMSC）是一种来自中胚层发育的早期干细胞，具有多向分化潜能的特性，可分化为骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞等。临床上还运用BMSC治疗骨科疾病大量的体外实验已获成功。 关键词：骨髓间充质干细胞；骨科学；文献综述 doi：10.3969/j.issn.1672-2779.2011.18.055 文章编号：1672-2779（2011）-18-0087-03 骨髓中含有2类干细胞，①造血干细胞，它为循环血液提供前体细胞；②非造血性干细胞，它是骨髓中造血结构性和功能性支持细胞，在调节造血干细胞的长期存活，生长分化中起重要作用。早期分离培养时，发现其形状呈成纤维细胞样而称其为“成纤维细胞集落形成单位”或“骨髓基质成纤维细胞”。随着研究的深入，人们发现其对骨髓造血干细胞起支持诱导作用，又因其来自于骨髓基质，因而称其为“骨髓基质细胞”。因其在不同的诱导条件下，有向中胚层组织细胞分化的能力，又称其为“骨髓间充质干细胞”。 1 骨髓间充质干细胞多向分化特性 多向分化潜能被认为是BMSC最重要的生物学特征。大量体外实验证明，在不同诱导条件下，BMSC可以向多种中胚层来源的组织细胞分化，如成骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞等。 1.1 BMSC向成骨细胞的定向诱导分化BMSC在体外培养中，通过地塞米松、β磷酸甘油和抗坏血酸等的诱导，能够分化为成骨细胞。Ouyang等[1]在培养基内加入抗坏血酸后BMSC排列紧密呈片状生长，将BMSC片与去除矿物质的移植骨片结合植入受损部位，3周后形态学、组织学、免疫组织化学观察显示，植入物的结构与正常骨膜相似，并向成骨、软骨分化。 1.2 BMSC向软骨细胞的定向诱导分化BMSC向软骨细胞的定向诱导分化将此分离的BMSC加入无血清培养体系中培养，培养体系中加入转化生长因子β、软骨来源形态形成蛋白及整合素可促使BMSC向软骨细胞分化。舒朝锋等[2]实验证明，在单层诱导培养条件下，人骨髓BMSC能分泌软骨细胞特征性细胞外基质如Ⅱ型胶原、糖胺多糖等，具有作为软骨组织工程种子细胞来源的可能。 1.3 BMSC向脂肪细胞的定向诱导分化 1999年，Pittenger等[3]人的BMSC培养体系中加入甲基异丁基黄嘌呤、地塞米松、胰岛素和茚甲新等，结果成功地诱导出脂肪细胞，细胞内聚集脂滴，并表达过氧化物酶体增殖物激活受体，脂蛋白脂酶和脂肪酸结合蛋白aP2。在这种培养条件下，约95%的细胞向此系分化，细胞内的脂质小泡持续增加直至充满细胞，这些物质可被油红染成红色。 ※基金项目：广西壮族自治区科技厅自然基金[No：2010GXNSFA013223] 作者单位：1 广西中医学院附属瑞康医院骨科（南宁530011） 2 南方医科大学在读博士（南宁530011） *通讯作者 2 骨髓间充质干细胞的分离方法 骨髓中BMSC含量很少，仅占骨髓内单个核细胞总数的0. 001%～0.01%，并随年龄的增加而减少，因此，必须实现其体外分离培养、扩增。目前BMSC的分离方法主要以下几种：①密度梯度离心法：主要根据骨髓中细胞成分的比重不同，清除红细胞，分离提取骨髓单个核细胞进行贴壁培养。目前较常用Percoll 液（1.073 g/ml）和Ficoll 液（1.077 g/ml）进行密度梯度离心。值得注意的是，不同密度的分离液对BMSC的纯度影响极大。这种方法分离培养的BMSC大小均匀，纯度较高，Pittenger等[4]在过密度梯度离心法分离培养的BMSC在第1代纯度可达95%，第2代达98%。因此该法被广泛采用。②贴壁筛选法：即全骨髓法，是根据BMSC贴壁生长而造血系细胞悬浮生长的特性，通过定期换液除去不贴壁细胞，收集贴壁生长BMSC，其纯度可达95%。目前多用这两种方法，细胞的粘附特性仍是分离和纯化BMSC的最基本原则，物理性富集后塑料器皿内的贴壁培养仍是分离BMSC的最基本方法，更好的分离方法还有待于进一步的探索。 3 BMSC的表面标志及鉴定 3.1 表面标志到目前为止，BMSC的表面抗原具有非专一性，它表达了间质细胞、内皮细胞和表皮细胞的表面标志。主要包括：①粘附分子，如CD166、CD54、CD102、CD44、CD106等。②生长因子和细胞因子受体，如IL-1受体、IL-3受体、IL-4受体、IL-6受体、IL-7受体、干扰素γ受体、肿瘤坏死因子α等。③整合素家族成员，包括CD49a、CD49b、CD49c、CD29、CD104等。④其它，如CD90、CD105等。不表达造血细胞的表面标志，如CD34、CD45、CD14、CD3、CD4、CD8等，也不表达与人白细胞抗原识别有关的共刺激分子B721、B722及主要组织兼容性复合物Ⅱ类分子如人白细胞DR 抗原等[5,6]。此外，BMSC自身还能产生一些造血及非造血的生长因子、白细胞介素和化学激动因子，但除细胞因子是持续性产生外，其它的仅仅在受到刺激后表达，BMSC还能产生一系列的基质分子，包括纤维连接素、胶原、蛋白聚糖，还能表达基质2细胞，细胞2细胞等相互作用的反受体，其中特别有关的是对CD44强表达，CD44是多种配体的受体，其分别在骨、骨髓中对细胞外基质构建起着重要的作用[7,8 ]。 3.2 鉴定对BMSC进行鉴定可联合细胞化学和流式细胞分析方法[9]。细胞化学方法，BMSC具有独特的代谢特点，几乎所有细胞酸性萘酚酸酯酶及糖原阳性，酸
骨髓间充质干细胞向神经元样细胞分化的研究进展
３７８陕西中医２０１０年第３１卷第３期 药杂志，２００４，３２（３）：１８０—１８２， ［７３金静愉，郁仁存．乳腺癌中西医结合诊治方案口］．中国肿瘤，１９９５，４（５）：７－１０。 ［８］刘胜，吴雪卿，陈前军．４０７乳腺癌术后患者辨证分型规律探析口］．辽宁中医杂志，１９９９，２６（９）：３８７—３８８．［９］唐汉钧，高尚璞，郑勇．中医药治疗乳腺癌术后２８８例临床观察口］．上海中医药大学报，２００２，１６（３）：２３．［１０］刘燕珠，王泳，吴丹红，等．中西医结合治疗乳腺癌６８例［Ｊ］．福建中医药，２０００。３１（３）：３０—３１． ［ｎｌ万华，吴雪卿，陆德铭．扶正祛邪在治疗乳腺癌中的运用［Ｊ］．上海中医药大学学报，２００２，１６（１）：３０—３１．［１２］朱华宇，司徒红林．林毅辨治乳腺癌经验撷菁［Ｊ］．辽宁中医杂志，２００７，３４（４）：３９５—３９６． ［１３３武自力．金静愉治疗乳腺癌经验［Ｊ］．四川中医，２００７，２５（８）５—６． ［１４］刘胜，赵倩，刘佳，等．乳腺癌术后方对乳腺癌术后５年复发转移率的影响［Ｊ１．中西医结合学报，２００８，６（１０）：１０００—１００４． ［１５］刘胜，花勇强，孙平，等．乳移平抗乳腺癌术后复发转移的临床研究［Ｊ］．中西医结合学报，２００７，５（２）：１４７—１４９． ［１６］卓斌．乳康汤治疗３６例乳腺癌术后或放、化疗后的临床观察口］．湖南中医学院学报，１９９５，１５（２）：２３． ［１７］陈英．益气养血、清热解毒治疗乳癌术后４１例［Ｊ］．浙江中医学院学报，１９９９，２３（６）：３０１． ［１８］李增战，陈捷，苗文红，等．鹿仙散结汤治疗晚期乳腺癌３０例［Ｊ］．陕西中医，２００７，２８（５）：５２６—５２７． ［１９］喻伟国，程进明．抗癌汤结合化疗治疗肿瘤术后４８例总结口］．湖南中医杂志，２００３，１９（１）：１１—１３． ［２０］李景鹏，贾英杰．贾英杰治疗乳腺癌术后的经验［Ｊ］．湖北中医杂志，２００７，２９（７）：２３． ［２１］黄智芬，刘俊波，陈强松，等．健脾消积汤联合化疗对晚期乳腺癌患者生活质量及免疫功能的影响［Ｊ］．新中医，２００７，３９（５）：８８—８９． ［２２］樊淳理．中药治疗乳腺癌术后化疗患者４１例［Ｊ］．中医杂志，２００６，４７（３）：２２６． ［２３］张卫红．卞卫和教授治疗乳腺癌经验举隅［Ｊ］．南京中医药大学学报，２００７，２３（２）：１２６－１２８． ［２４１黄梅，杨海燕．益气活血汤改善脾虚挟瘀型乳腺癌患者化疗毒副作用的临床研究口］．湖北中医杂志，２００５，２７（７）：９－１０。 ［２５］周明，吴勇华，刘永达．中西医结合治疗晚期乳腺癌１４例分析口］．中国中西医结合杂志，１９９５，１５（４）：２３７．［２６］罗雪冰．益气祛邪汤治疗乳腺癌术后７６例疗效观察［Ｊ］．华夏医学，２００７，（２）：２４７—２４８． ［２７］沈哗华，宋明志，黄雯霰．中西医结合治疗７１例乳腺癌术后患者的疗效分析［Ｊ］．中西医结合学报，２００３，１（１）：３０－３１． ［２８１向丽萍，欧阳恒，肖毅良．菊藻丸抗乳腺癌术后复发转移的临床观察［Ｊ］．中国临床药理学与治疗学，２００２，７（１）：６３—６４． ［２９］王义程，丁凌，鲁志诚．三苯氧胺加中成药治疗绝经后晚期乳腺癌［Ｊ］．肿瘤研究与临床，１９９６，８（４）：２６５．［３０］ＣｏｈｅｎＩ，ＴａｇｌｉａｆｅｒｒｉＭ，ＴｒｉｐａｔｈｙＤ．ＴｒａｄｉｔｉｏｎａｌＣｈｉｎｅｓｅｍｅｄｉｃｉｎｅｉｎｔｈｅｔｒｅａｔｍｅｎｔｏｆｂｒｅａｓｔｃａｎｃｅｒ口］．ＳｅｍｉｎＯｎｃ０１．２００２，２９（６）：５６３—５６４． ［３１］ＣｕｉＹ，ＳｈｕＸＯ，ＧａｏＹ，ｅｔａｌ．ＵｓｅｏｆｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｙａｎｄａｌｔｅｒｎａｔｉｖｅｍｅｄｉｃｉｎｅｂｙＣｈｉｎｅｓｅｗｏｍｅｎｗｉｔｈｂｒｅａｓｔｃａｎｃｅｒ口］，ＢｒｅａｓｔＣａｎｃｅｒＲｅｓＴｒｅａｔ．２００４，８５（３）：２６３—２７０． ［３２］刘叙仪，孟松娘．杨敬贤，等．中药Ｒ３对耐阿霉素人乳腺癌细胞ＭＣＦＴａｄｒ多药耐药的逆转ｉ－Ｊ］．中国肿瘤临床，１９９７，２４（５）：３２５—３３０ ［３３１姜晓峰，甄永苏．大黄素逆转肿瘤细胞多药抗药性的作用［Ｊ］．药学学报，１９９９，３４（３）：１６４—１６７． ［３４］ＷａｎｇＬ．ＹａｎｇＣＨ，ＨｏｒｗｉｔｚＳＢ，ｅｔａｌ．Ｒｅｖｅｒｓａｌｏｆｔｈｅｂｕｍａｎｍｕｒｉｎｅｍｕｌｔｉｄｒｕｇ—ｒｅｓｉｓｔａｐｃｅｐｈｅｎｏｔｙｐｅｗｉｔｈｍｅｇｅｓｔｒｏｌａｃｅｔａｔｅ［Ｊ］．Ｃａｎｃｅｒ．ＣｈｅｍｏｔｈｅｒｐｈａｒｍＡｃｏｌ，１９９４，３４：９６． ［３５３李忠．临床中医肿瘤学［Ｍ］．辽宁科学技术出版社，２００２，１２４—１２５． （收稿２００９—１２—１０；修回２０１０－０１—２４） 骨髓间充质干细胞向神经元样细胞分化的研究进展’秦安清刘黎青△于娜◇周盛年△▲山东中医药大学基础医学院（济南２５０３５５） 【中图分类号】Ｑ２５【文献标识码】Ａ【文章编号】ｌＯＯＯ一７３６９（２０１０）０３～０３７８—０３ ＊山东省科技攻关课题（ＮＯ：２００７ＧＧｌ０００２０１７）；山东省中医药管理局资助课题（ＮＯ：２００７—００６） △通讯作者：刘黎青周盛年 ▲山东大学齐鲁医院神经内科（济南２０００１２） ◇山东省昌乐县中医院（昌乐２６２４００） 骨髓问充质干细胞（ＢｏｎｅＭａｒｒｏｗＭｅｓｅｎｃｈｙｍａｌｓｔｅｍｃｅｌｌｓ，ＢＭＳＣｓ）又称骨髓基质干细胞，是骨髓细胞中除去造血干细胞（非粘附细胞）之外的细胞部分，作为成体干细胞之一，具有多项分化潜能，能向骨、软骨、肌肉、神经、角膜上皮细胞等中胚层或外胚层组织细胞分化，是组织工程中重要的种子细胞之一，并且具有取材方便，扩增迅速，可自体移植等特点，因 万方数据
人类间充质干细胞库建设与管理规范
SZDB/Z 126—2015 I SZDB/Z 深 圳 市 标 准 化 指 导 性 技 术 文 件 人类间充质干细胞库建设与管理规范 2015 - 02 -06发布 2015-03 -01实施 深圳市市场监督管理局 发布 ICS 07.080 C 04 SZDB/Z 126-2015
SZDB/Z 126—2015 II 目次 前言................................................................................. I II 1 范围 (1) 2 规范性引用文件 (1) 3 术语和定义 (1) 4 生命伦理 (4) 5 人类间充质干细胞库建设 (4) 6 机构设置 (5) 7 操作规范 (6) 8 安全管理 (10) 附录A（资料性附录）供者健康信息采集 (16) 附录B（资料性附录）人类间充质干细胞样本编码规则 (17) 附录C（资料性附录）人类间充质干细胞库整体的操作流程 (18) 参考文献 (19)
SZDB/Z 126—2015 III 前言 本指导性技术文件按GB/T 1.1–2009给出的规则起草。 本标准由深圳市经济贸易和信息化委员会归口。 本标准负责起草单位：深圳华大基因研究院。 本标准主要起草人：周欣、张勇、张曦、冀旭、燕舞、林洁璇、张家文、黄海军、彭冬秀、孙长斌、 杨阳、黎苑杰。 本标准为首次发布。
SZDB/Z 126—2015 人类间充质干细胞库建设与管理规范 1 范围 本标准规定了人体来源间充质干细胞库相关的生命伦理、间充质干细胞库建设、机构设置、操作规范和安全管理的基本方法。 本标准适用于人体来源间充质干细胞库的建设与管理规范。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本 适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有修改单）适用于本文件。 GB/T 1.1-2009 标准化工作导则第1部分：标准的结构和编写 GB 2894-2008 安全标志及其使用导则 GB/T 5458-2012 液氮生物容器 GB 7000.2-2008 应急照明灯具安全要求 GB/T 12905-2000 条码术语 GB 13690-2009 化学品分类和危险性公示通则 GB 15258 化学品安全标签编写规定 GB/T 17172-1997 417 条码 GB/T 18347-2001 128 条码 GB/T 18883-2002 室内空气质量标准 GB 19489-2008 实验室生物安全通用要求 GB 19652-2005 放电灯（荧光灯除外）安全要求 GB/T 20269-2006 信息安全技术信息系统安全管理要求 GB/T 22278-2008 良好实验室规范原则 GB/T 27025-2008 检测和校准实验室能力的通用要求 GB 50016-2006 建筑设计防火规范 GB 50034-2004 建筑照明设计标准 GB 50052-2009 供配电系统设计规范 GB 50140-2005 建筑灭火器配置设计规范 GB 50346-2012 实验室建筑技术规范 GB 50351-2005 储罐区防火堤设计规范 AQ 3013-2008 危险化学品从业单位安全标准化通用规范 CNAS-CL05-2009 实验室生物安全认可准则 MH/T 1019-2005 民用航空危险品运输文件 WS/T 224-2002 真空采血管及其添加剂 WHO Third Edition 实验室生物安全手册 3 术语和定义 1
间充质干细胞分化为心肌细胞的研究进展
间充质干细胞分化为心肌细胞的研究进展 【摘要】心肌梗死等缺血性心脏病严重威胁人类生存和生活质量,组织工程技术为根治心肌梗死等心脏病提供了一种新的方法,近年来,心肌组织工程有了较大的进展,但在种子细胞等方面的难题还远没有解决。本文对关于间充质干细胞分化为心肌细胞的研究作了一下综述,为细胞替代治疗的研究提供一定的参考。 【Abstract】Ischemic heart disease such as myocardial infarction endanger human health and life,cardiac tissue engineering is one of the new radical therapy for myocardial infarction.In recent years,researchers have made great progress in cardiac tissue engineering,but the problems of seed cells and scaffold materials are far from resolved.This paper reviews research advances of mesenchymal stem cells induced into cardiomyocyets so that it may contribute to Cell therapy. 【Key words】 Mesenchymal Stem Cells;Cardiomyocyets;Cell therapy 在成人肌肉组织中,心肌细胞(Cardiomyocytes,CMs)属于终末分化期永久性细胞,不具有再生能力[1],其对有丝分裂信号作出的反应是细胞肥大[2]而不是再生,致使损伤后心肌再生和修复严重受限,由于心肌损伤后无法通过自身的增殖、分化进行修复,坏死的心肌则由纤维疤痕组织取代[3,4]。研究发现心肌中也含有干细胞[5-7],在心肌梗死(Myocardial infarction,MI)后这些细胞会发生分裂增生,但数量极少,增殖能力太小,不能完整地修复心肌组织,更不能满足心肌组织再生的需求,致使具有收缩功能的CMs减少,最终发展成充血性心力衰竭、死亡,严重影响患者的生活质量。临床上缺乏对病变冠状动脉的再造和梗死心肌的再生、重建的根本治疗方法,而细胞替代治疗通过移植功能细胞,替代、修复或加强受损的组织或器官的细胞的生物学功能已成为治疗多种组织坏死性疾病的新策略。 1 心肌细胞和间充质干细胞的特点 心肌细胞在出生后就进入了有丝分裂的后期,基本丧失了增生和再生的能力,不再进入细胞周期,而目前尚无证据支持心肌中含有干细胞[1]。成人骨髓中含有造血细胞和非造血细胞,非造血细胞与细胞外基质一起形成了支持造血的骨髓微环境(Bone marrow microenvironment,BMME)[8]。骨髓微环境中的细胞成分包括网状内皮细胞、巨噬细胞、脂肪细胞、成纤维样细胞[9],这些细胞通过分泌各种细胞因子、生长因子、以及自身细胞表面受体的表达,对造血细胞的附着、分化、自我更新起到了重要作用[10]。目前,普遍认为,在骨髓中至少存在两种干细胞群即造血干细胞(Haematopoietic stem cells,HSCs)和MSCs,前者是所有造血细胞的祖细胞[11,12],后者则是中胚层发育的早期细胞,这类细胞可以通过体外贴壁培养加以分离,不仅能分化为造血实质和基质细胞等,还分化为多种造血以外的组织,
间充质干细胞在体内的作用机制
间充质干细胞在体内的作用机制 摘要：随着细胞组织工程的研究不断深入，对干细胞在体内机制的不断了解研究，21世纪在全球多个国家药品管理局批准了干细胞制剂进入临床运用，为传统医药无法治疗和控制的疾病，提供了新的治疗途径，本文主要介绍现已广泛应用于临床的间充质干细胞制剂的作用机制。 关键词：间充质干细胞；作用机制 干细胞技术研究为人类疾病的治疗提供的新的途径、方法和手段，干细胞在生命科学、新药试验和疾病研究这三大生物医药领域发挥重要作用。目前，临床应用最为广泛之一的间充质干细胞（mesenchymal stem cells，MSC）是干细胞家族的重要成员。它可以在体内或体外特定的诱导条件下，可分化为脂肪、骨、软骨、肌肉、肌腱、韧带、神经、肝、心肌、内皮等多种组织细胞，连续传代培养和冷冻保存后仍具有多向分化潜能，可作为理想的种子细胞用于衰老和病变引起的组织器官损伤修复。 一、间充质干细胞的治疗作用机制 1.归巢作用 MSC的归巢作用可能与以下几个方面有关： 1.1.表达大量趋化因子和趋化因子受体（CXCR4）并且能够通过向炎症趋化因子和细胞因子迁移归巢到炎症部位[1，2]。 1.2.MSC表面的CD44使间充质干细胞与内皮细胞上的E-选择蛋白结合从而归巢到含内皮细胞的炎症部位[3]。 1.3.整联蛋白和黏附因子（ICAM-1、ICAM-2、VCAM-1、ALCAM）参与间充质干细胞与内皮细胞的结合[4，5]。 2.免疫调节作用（主要为免疫抑制）[6] MSC可能先通过免疫激活的T细胞释放IFNγ、TNFα和IL-1等细胞因子，进而刺激MSC产生大量不同趋化因子和一氧化氮（nitric oxide，NO）；趋化因子招募T细胞向MSC聚集，MSC生成的NO抑制T细胞增殖，产生免疫抑制效果。 3.抗炎作用 3.1.MSC可能通过CD4+CD25+FOX P3+Treg细胞和IL1-RA表达来抑制IL-1?因子的作用。