双荧光素酶报告系统 _百替生物

双荧光素酶报告系统

作者：windyrain2008-05-2921:54:33

标签：杂谈

双荧光素酶报告基因测试∶结合萤火虫和海洋腔肠荧光素酶先进的共报告基因测试技术

在用萤火虫荧光素酶定量基因表达时,通常采用第二个报告基因来减少实验的变化因素。但传统的共报告基因(比如CAT,β-Gal,GUS)不够便利,因为各自的测试化学,处理要求,检测特点存在差异。Promega提供一种先进的双报告基因技术,结合了萤火虫荧光素酶测试和海洋腔肠荧光素酶测试。双荧光素酶报告基因测试系统,结合pRL载体系统,表达第二个报告基因海洋腔肠荧光素酶,在单管中进行双荧光素酶报告基因测试,快速,灵敏,简便。系统还提供PLB裂解液,用来裂解在多孔板中培养的哺乳细胞,不需操作单个样品。对于正在使用萤火虫荧光素酶报告基因载体的研究人员。双荧光素酶报告基因测试系统将使他们立即体会到该系统的便利。

介绍

双报告基因用于实验系统中作相关的或成比例的检测,通常一个报告基因作为内对照,使另一个报告基因的检测均一化。检测基因表达时双报告基因通常用来瞬时转染培养细胞，带有实验报告基因的载体共转染带有不同的报告基因作为对照的第二个载体。通常实验报告基因偶联到调控的启动子,研究调控基因的结构和生理基础。报告基因表达活力的相对改变与偶联调控启动子转录活力的改变相关，偶联到组成型启动子的第二个报告基因，提供转录活力的内对照,使测试不被实验条件变化所干扰。

通过这种方法,可减少内在的变化因素所削弱的实验准确性,比如,培养细胞的数目和活力的差别,细胞转染和裂解的效率。

使用萤火虫荧光素酶,结合氯霉素乙酰转移酶(CAT),β-半乳糖苷酶(β-Gal),或葡萄醛酸糖苷酶(GUS)的双报告基因,近几年已普遍使用。但这些双报告基因组合削弱了荧光

GUS S 素酶操作的优势,比如荧光素酶测试和定量可在几秒钟内进行,但CAT,β-Gal和GU 测试法,则在定量前需要长时间的保温。另外,这些报告基因受限于它们的灵敏度和线性应答范围,必须注意不要超过这些范围,内源性细胞活力也会干扰这类报告基因的使用。许多类型的细胞有内源β-Gal或GUS表达,不利于准确定量报告基因表达,胞内去乙酰

-Gal l 酶活力干扰CAT活力测试。尽管在高温下预处理细胞裂解液(1,2),会降低内源性β-Ga 和CAT测试的干扰，但这些处理也会快速失活荧光素酶。因此,在此类双报告基因检测中,必须以不同的步骤分别处理共转染的细胞裂解液。

理想的双报告基因方法应该使用户能够以萤火虫荧光素酶所具有的速度,灵敏和线性范围对同一样品中的两个报告基因同时测定。这在传统的报告基因,如CAT,β-Gal和GUS是不可能的,由于它们测试化学,处理要求所固有的局限。相反,结合萤火虫(Photinus pyralis)和海洋腔肠(Renilla reniformis)双荧光素酶，Promega的双荧光素酶报告基因测试(DLR)系统可满足这些要求，在单管中完成这些测试。

双荧光素酶报告基因测试化学

荧火虫和海洋腔肠荧光素酶都具有生物发光报告基因的卓越的测试特点,但它们在进化上的起源不同,因此,具有不同的酶学结构和底物要求。这些差别用来发展了DLR 测试化学,选择性地区别这两种发光报告基因的活力。萤火虫荧光素酶是一个61kDa 单亚基蛋白质,酶活力不需翻译后修饰(3,4),在翻译后即可作为遗传报告基因。在ATP,Mg2+和O2存在下，通过甲虫荧光素的氧化反应发光(图1)。在常规反应条件下,荧光素的氧化发生时,以荧光素-AMP作为中间体,转换非常缓慢。结果,在底物和酶混合后,测试化学产生"闪烁"的光,并迅速衰减。专利化的测试试剂,定量萤火虫荧光素酶活力,掺入了辅酶A(CoA),增强快速酶转换来提高反应动力学(5),导致持续的"闪烁"发光信号(图2)。

图1由萤火虫和Renilla荧光素酶催化的生物发光

海洋腔肠荧光素酶，一个36kDa单亚基蛋白质，纯化自天然来源的Renilla reniformis (6)，含有3%的碳水化合物，但是和萤火虫荧光素酶一样，酶活力不需翻译后修饰，在翻译后即可作为遗传报告基因。海洋腔肠荧光素酶所催化的发光反应，利用O2和海样腔肠荧光素(coelenterazine)(图1)。当用DLR测试化学作实验时，海洋腔肠荧光素酶反应的动力学产生闪烁型发光信号，在检测过程中缓慢地衰减(图2)。

在DLR测试系统中，用单个裂解液分步测定萤火虫和海洋腔肠荧光素酶活力。在完成萤火虫荧光素酶活力("实验"报告基因)的测定后，萤火虫发光被快速湮灭，并同时激活海洋腔肠荧光素酶的发光反应("对照"报告基因)。因此，DLR测试系统整合了两个测试化学，对共表达的两个报告基因作快速地定量，酶来自转染细胞裂解液，或无细胞转录/翻译反应。

萤火虫荧光素酶测试的线性范围延伸达酶浓度的8个数量级，可测定≤1fg(大约10 -20摩尔)的实验报告基因酶(图3A)。用双荧光素酶报告基因测试系统，海洋腔肠荧光素酶的线性范围达酶浓度的7个数量级，较低的底限是≤10fg(大约3×10-19摩尔)的对照报告基因酶(图3B)，并且这两个酶的特异活力相似。

图2用双荧光素酶报告基因测试由萤火虫和Renilla荧光素酶产生的发光。CHO细胞(1×106/60mm培养板)共转染pGL3

Control和pRL SV40载体DNA。细胞用PBS洗涤后，加入400μl PLB制成裂解液。将20μl小量细胞裂解液和100μl荧光素酶测试试剂II(LARII)混合，萤火虫荧光素酶的活力立即用荧光照度仪检测(细线示踪)。100μl Stop&Glo TM试剂加入到荧光照度仪管中，湮灭萤火虫荧光素酶反应，同时激活Renilla荧光素酶反应，并立即检测Renilla荧光素酶的活力(粗线示踪)。Turner Designs型号20/20荧光照度仪配有计算机用来示踪荧

光发射，12秒内完成两次测试。

双荧光素酶报告基因测试系统的方式

定量两个报告基因荧光素酶的发光信号，可在制备裂解液后立刻进行，不需将样品分成小组分或作额外的处理。因海洋腔肠和萤火虫荧光素酶均呈现闪烁型反应动力学，作双荧光素酶报告基因测试不需要有试剂注射器的荧光照度仪。

通常DLR测试，大约需要30秒钟完成，如图4所说明。起始萤火虫荧光素酶报告基因测试时，将一份裂解产物和荧光素酶测试试剂II(LAR II)混合。在完成萤火虫荧光素酶测试时，此时萤火虫发光被湮灭，同时激活海洋腔肠荧光素酶的发光，加入Stop& Glo TM试剂到样品管。在1秒钟内，Stop&Glo TM试剂湮灭大于105滴度萤火虫反应的发光信号(图5)，并同时激活海洋腔肠荧光素酶。

Renilla a 图3萤火虫荧光素酶和Renilla荧光素酶发光反应的线性范围。纯化的萤火虫和Renill 荧光素酶连续地用含1mg/ml BSA的1×PLB稀释，配有计算机的Turner Designs荧光照度仪用来检测10秒钟的总荧光，在最初2秒的预读延迟后。直接检测高浓度的两种荧光

100fg g 素酶的发光反应时，在荧光照度仪的样品室中加入中性密度滤光片。在含10fg和100f 的Renilla荧光素酶反应中测试发光，需减去来自海洋腔肠荧光素自发光的背景信号。两种荧光素酶的发光活力对各自的测试变化浓度作图。

图4用手工荧光照度仪或配有试剂加样器的荧光照度仪的双荧光素酶测试方式。如荧光照度仪配有两个加样器，将裂解液预先分装到荧光照度仪的管子中，随后按序自动加入Luciferase Assay Reagent II(LAR II),Stop&GloTM试剂。

PLB裂解液

PLB裂解液(Passive Lysis Buffer)，经特别设计可有效裂解培养的哺乳细胞，而不必刮下贴壁细胞或作冻融循环。尽管PLB设计应用于被动裂解过程中，但它可靠的裂解效果同样有益于使用常规处理方法制作的裂解液。无论使用何种裂解方法，对培养的哺乳细胞而言，释放到PLB裂解液中的萤火虫和海洋腔肠荧光素酶报告基因酶是定量和可靠的(图6)。被动裂解液的一个明显优点，是可以抑制低水平的非酶促发光(自发光)，这是海洋腔肠荧光素在水溶液中的固有特点。通常用来制备细胞裂解液的试剂可增强海洋腔肠荧光素自发光，包括Triton?X-100,Promega的细胞培养裂解试?(CCLR)和报告基因裂解试剂(RLB)，这些试剂还会显著抑制海洋腔肠荧光素酶的发光反应。PLB经特别设计用来最大地增强荧光素酶活力，使自发光减弱到最低，可提供最优的测试灵敏度，定量很低水平的海洋腔肠荧光素酶。另外，PLB抑制发泡，非常适合高通量应用，可用于自动化系统中将培养在多孔板中的细胞组制备成裂解液并测试。

图5双荧光素酶报告基因测试系统湮灭萤火虫荧光素酶发光和激活Renilla荧光素酶发光。CHO细胞裂解液有共转染pGL3-Control和pRL SV40载体DNA，按图2描述的方法制备。萤火虫荧光素酶(报告基因1)和Renilla荧光素酶(报告基因2)活力检测在10秒内完成，最初有2秒的预读延迟。为了显示Stop&Glo TM试剂湮灭报告基因1的高效率，加入等体积的Stop&Glo TM试剂(缺少海洋腔肠荧光素无法激活Renilla荧光素酶反应)，萤火虫荧光素酶发光被湮灭而又不激活Renilla荧光素酶发光。在这一实验中，湮灭萤火虫荧光素酶反应的残留发光，小于未湮灭反应值的0.0004%

图6用PLB裂解哺乳细胞的高效率和被动或主动裂解方法。用pGL3-Control和pRL-SV40载体DNA共转染图示的培养哺乳细胞，制备裂解液时，向贴壁细胞加入PLB，温和摇动培养液达15分钟(被动细胞裂解)，或从培养板中刮下贴壁细胞，在-80℃进行1次冻/融循环(主动细胞裂解)。萤火虫和Renilla荧光素酶活力用DLR方法确定，如图4所示。为了便于比较，报告基因活力用主动裂解方法对每种细胞进行归一化。图A：萤火虫荧光素酶报告基因活力。图B：Renilla荧光素酶报告基因活力。

海洋腔肠荧光素酶对照载体pRL系列

设计的pRL载体系列可在哺乳动物细胞中，组成型地表达海洋腔肠荧光素酶。这些载体含有克隆自Renilla reniformis(7)海洋腔肠荧光素酶的cDNA(R luc)，在R luc基因中导入了3个碱基替换，消除了内Bgl II,Bam H I和Nar I酶切位点，这些突变不造成海洋腔肠荧光素酶表达的氨基酸序列的改变。提供的pRL载体有几种启动子构型，可同萤火虫荧光素酶载体组合，作为报告基因活力的内对照。

pRL-TK

载体pRL-TK(图9)，在Rluc上游含有单纯疱疹病毒胸腺嘧啶激酶(HSV-TK)的启动子区域。HSV-TK启动子在胚胎和成熟的哺乳组织细胞中，可低水平和组成型地表达(8,9)。

pRL-SV40

载体pRL-SV40含SV40早期增强子/启动子区域，在多种细胞中，可高强度、组成型表达Rluc。载体pRL-40还含有SV40的复制起始区，在诸如COS-1或COS-7细胞中(10)，可瞬时、附加体式地复制，表达SV40大抗原。

pRL-CMV

载体pRL-CMV含CMV早早期增强子/启动子区域，在多种细胞类型中，可高强度、组成型表达Rluc。在转基因小鼠中，CMV增强子/启动子具有泛主特点，在检测的28种小鼠组织中，24种有转录活力。

pRL-Null

载体pRL-null无真核启动子和增强子序列，在Rluc上游有一些单一酶切位点，可提供最大灵活性来克隆所需的启动子序列，启动海洋腔肠荧光素酶的表达。

图9所显示的pRL-TK载体代表了pRL载体所共有的特点，在每个pRL载体的指定启动子的紧下游是一个嵌合的内含子，可提供海洋腔肠荧光素酶的增强表达。内含子由人β-珠蛋白质内含子1的5′-供体剪切位点和免疫球蛋白基因重链可变区域的分枝点和3′-受体剪切位点组成(12)。供体和受体剪切位点、分枝点的序列均作了改变以匹配最适剪切位点的共有序列(3)。在Rluc的紧上游是T7启动子序列，可在体外合成海洋腔肠荧光素酶的转录物。Rluc的下游是SV40晚期poly(A)序列,提供有效的转录终止和mRNA多腺苷酸化(14)。载体含有原核的复制起始区和β-内酰胺酶基因，可在大肠杆菌中选择质粒的扩增。

图8用Passive Lysis Buffer制备细胞裂解物中萤火虫和Renilla荧光素酶的稳定性。用

CHO O细胞(2.5×

DNA A共转染培养在标准6孔板中的CH

pRL-SV400载体DN

pGL3-Control和pRL-SV4

105细胞/孔)。培养30小时后，将培养液吸干，每孔中的附着细胞用PBS洗涤一次。制备裂解液时加入500μl Passive Lysis Buffer到每一个培养板中，在室温温和地震荡15分钟。立即测试小组份的每一种裂解物中萤火虫和Renilla荧光素酶活力，然后分装，保存在22℃(室温)、4℃，或-20℃。保存的样品在指示的时间间隔内重新测试。测试按图5所描述的方法进行，每一个方框代表3个重复的细胞裂解物，作2次重复测试的均值。

图9pRL-TK载体的环形图。附加描述：内含子的位置，Rluc，编码Renilla荧光素酶的cDNA，Ampr,在E.coli中编码氨苄抗性，ori,在E.coli中质粒复制起始区。Rluc和Amp r基因中的箭头表示转录的方向。

小结

在双遗传报告基因的应用中，一个报告基因活力的改变，与基因表达的特定实验条件相关，而第二个报告基因的组成性活力提供了内对照，使实验值可以规一化。Promega的新的双报告基因测试系统，在单管中测试两个荧光素酶报告基因，此两个荧光素酶报告基因具有兼容的化学特性、操作条件、速度、灵敏度、线性范围、和仪器需要。荧火虫和海洋腔肠荧光素酶测试的组合，匹配pRL载体，提供了双遗传报告基因应用的理想测试系统。使用标准的手工荧光照度仪可在30秒内完成测试。特别设计的新的被动裂解液，可快速、高效地将培养在多孔板中的细胞裂解，并使萤火虫和海洋腔肠荧光素酶具有最适测试灵敏度和稳定性。双报告基因测试系统在体内报告基因应用的优势，也同样体现

在无细胞系统的应用，比如体外转录/翻译反应。

荧光素酶报告基因实验自我总结

荧光素酶报告基因实验自我总结 实验原理： 目前由两个主要的应用方向： 第一是检测转录因子与目的基因启动子区DNA相互作用，转录因子是一种具有特殊结构、行使调控基因表达功能的蛋白质分子，也称为反式作用因子。某些转录因子仅与其靶启动子中的特异顺序结合，这些特异性的序列被称为顺式因子，转录因子的DNA结合域和顺式因子实现共价结合，从而对基因的表达起抑制或增强的作用。荧光素酶报告基因实验（luciferase Assay）是检测这类转录因子和其靶启动子中的特异顺序结合的重要手段。 第二是研究微小RNA(microRNA)对于靶基因的调控，通过生物信息学方法预测microRNA潜在的靶基因以及干预位点序列，并设计合适的microRNA质粒或干预片段，同时构建靶基因的报告基因质粒，二者同时转染细胞，这是确定microRNA是否能影响（上调或下调）靶基因的首选研究方法。 实验流程： 1）构建一个将靶启动子的特定片段插入到荧光素酶表达序列前方的报告基因质粒，如pGL3-basic（转录因子与靶基因）或pMIR-REPORT Luciferase质粒（微小RNA与靶基因）2）将要检测的转录因子表达质粒（或microRNA质粒）与报告基因质粒共转染293细胞或目的细胞。如果此转录因子（或microRNA）能够激活靶启动子，则荧光素酶基因就会表达，荧光素酶的表达量与转录因子的作用强度成正比。 3）加入特定的荧光素酶底物，荧光素酶与底物反应，产生荧光素，通过检测荧光的强度可以测定荧光素酶的活性，从而判断转录因子是否能与此靶启动子片段有作用。 实验目的：研究转录因子和MicRNA对于靶基因调控的首先方法 实验步骤： （1）用生物信息学方法分析并预测启动子区可能的转录因子结合位点。 （2）设计引物用PCR法从基因组DNA中克隆所需的靶启动子片段，将此片段插入到荧光素酶报告基因质粒中。 （3）筛选阳性克隆，测序，扩增克隆并提纯质粒备用。 （4）扩增转录因子质粒（或microRNA质粒），提纯备用，同时准备相应的空载质粒对照。（5）培养293细胞（或其它目的细胞），并接种于12孔板中，生长24小时（80%汇合度）。（6）将报告基因质粒与转录因子表达质粒共转染细胞。 （7）用适当的方法提取蛋白并用于荧光素酶检测。 （8）加入酶作用底物，于荧光计数仪上测定荧光素酶的活性。 （9）计算相对荧光强度，并与空载对照比较，判断影响因子是否有效的作用于靶基因。

双荧光素酶测试系统及海肾类对照报告基因载体

双荧光素酶测试系统及海肾类对照报告基因载 体 Company Document number：WTUT-WT88Y-W8BBGB-BWYTT-19998

双荧光素酶测试系统及海肾类对照报告基因载体 1.什么是双荧光素酶报告基因测试系统（DLR）？ DLR测试系统灵敏，方便，在一个系统中用于测量两个单独的荧光素酶报告基因，萤火虫荧光素酶及海洋海肾荧光素酶(Renilla reniformis)，DLR测试系统可用于细胞裂解物及无细胞的翻译系统。 2.有哪些海肾荧光素酶载体？ 海肾荧光素酶载体pRL用于在转染的哺乳细胞中组成性地表达海肾荧光素酶。这类载体还有T7启动子，可用T7RNA聚合物在体外合成海肾荧光素酶，有4个不同的载体： A pRL-SV40载体pRL-SV40载体含SV40增强子及早期启动子区域，可在多种细胞中组成性地高表达海肾荧光素酶。pRL-SV40载体还含有SV40的复制起始区，可在表达SV40大T抗原的细胞中，如COS-1，COS-7细胞中，瞬时及附加体似地复制。 B pRL-CMV载体pRL-CMV载体含有CMV极早增强子及启动子，可在多种细胞中组成性地高表达海肾荧光素酶。 a pRL-TK载体 pRL-TK载体含HSV胞嘧啶激酶启动子区域，在多种细胞中组成性地弱表达海肾荧光素酶。 b pRL-null载体 pRL-null载体缺真核启动子及增强子，在海肾荧光素酶基因的上游含有多克隆位点。 3.用双报告基因有何优点？ 一般地说，实验报告基因用于测试实验条件下基因的表达，而另一个报告基因作为内对照，以提供实验报告基因测试的归一化。将实验报告基因的活力与内对照报告基因的活力作归一化可消除实验中不同测试间所固有的变化，这些变化减弱实验准确度，其中包括培养细胞的数目及活力的差异，细胞转染及裂解的效率。海肾荧光素酶可用作对照报告基因及实验报告基因。在双荧光素酶报告基因测试中，将萤火虫荧光素酶作为实验报告基因，海肾荧光素酶作为对照报告基因。 4.相比用CAT或β-半乳糖苷酶对表达数据作归一化，双荧光素酶报告基因测试系统有何优点

荧光素酶报告系统

亦称发光酶。是催化生物发光的酶系的总称。它是光物质的冷水抽提物在氧中发光时，底物虫荧光素被消耗以后残余的对热不稳定的高分子成分。现在对萤虫相海萤以及发光细菌的虫荧光素酶结晶物的研究得最多。它们属于加氧酶（oxygenase），不含金属和辅酶。对于发光，有的酶必须以ATP等作为辅助 因子，有的则不需要。其发光机制等已了解到可因种的不同而有很大的差异，虫萤光素酶具有高度的特异性，一般仅作用于来自近缘种的虫荧光素。当然，萤虫、海萤的酶是不能互相代替引起发光的。海萤的虫荧光素酶在干燥状态下相当稳定，可以保存 双荧光素酶报告基因测试∶结合萤火虫和海洋腔肠荧光素酶先进的共报告基因测试技术 在用萤火虫荧光素酶定量基因表达时,通常采用第二个报告基因来减少实验的 变化因素。但传统的共报告基因(比如CAT,β-Gal,GUS)不够便利,因为各自的测 试化学,处理要求,检测特点存在差异。Promega提供一种先进的双报告基因技术,结合了萤火虫荧光素酶测试和海洋腔肠荧光素酶测试。双荧光素酶报告基因测试系统,结合pRL载体系统,表达第二个报告基因海洋腔肠荧光素酶,在单管中进行 双荧光素酶报告基因测试,快速,灵敏,简便。系统还提供PLB裂解液,用来裂解在多孔板中培养的哺乳细胞,不需操作单个样品。对于正在使用萤火虫荧光素酶报 告基因载体的研究人员。双荧光素酶报告基因测试系统将使他们立即体会到该系统的便利。 介绍 双报告基因用于实验系统中作相关的或成比例的检测, 通常一个报告基因 作为内对照, 使另一个报告基因的检测均一化。检测基因表达时双报告基因通常用来瞬时转染培养细胞，带有实验报告基因的载体共转染带有不同的报告基因作为对照的第二个载体。通常实验报告基因偶联到调控的启动子, 研究调控基因的结构和生理基础。报告基因表达活力的相对改变与偶联调控启动子转录活力的改变相关，偶联到组成型启动子的第二个报告基因，提供转录活力的内对照, 使测试不被实验条件变化所干扰。 通过这种方法, 可减少内在的变化因素所削弱的实验准确性, 比如, 培养细 胞的数目和活力的差别, 细胞转染和裂解的效率。 使用萤火虫荧光素酶,结合氯霉素乙酰转移酶(CAT), β-半乳糖苷酶(β-Gal), 或葡萄醛酸糖苷酶(GUS)的双报告基因,近几年已普遍使用。但这些双报告基因 组合削弱了荧光素酶操作的优势, 比如荧光素酶测试和定量可在几秒钟内进行, 但CAT, β-Gal和GUS测试法, 则在定量前需要长时间的保温。另外,这些报告 基因受限于它们的灵敏度和线性应答范围, 必须注意不要超过这些范围, 内源性

双荧光素酶报告基因分析promega

双荧光素酶报告基因分析 1. 介绍 荧光素酶报告基因表达的转录调控常被用来研究培养细胞的生物学特性。荧光素酶是理想的报告基因，因为哺乳动物细胞中不含内源性荧光素酶，一旦转录完成立刻就生成功能性的荧光素酶。 Dual-Luciferase?双荧光素酶报告基因检测系统中含有在同一细胞中同时表达的两种荧光素酶。通常，报告基因实验中往往会受到各种实验条件的影响，共转染的“对照”报告基因会作为内对照，为试验提供一基准线。实验报告基因经过内参照的处理可以减小细胞活性和转染效率对实验的影响，因此双报告系统减少了外部干扰，使得实验数据更可信。实验中报告基因和对照基因的酶没有种源同源性，萤火虫荧光素酶和海肾荧光素酶对应不同的反应底物，反应中没有任何的交叉干扰。

萤火虫荧光素酶底物和海肾荧光素酶底物分别与检测试剂反应可以使灵敏度最大化。由于超强的光信号和超高的信噪比，本系统被广泛用于制药和生物技术产业中。双荧光素酶报告基因检测系统适配于各种培养哺乳细胞的培养基，如1640，MEM，DMEM，F12等。这些试剂与被动裂解液所附带的试剂盒，可以从Promega试剂盒中分开，单独使用。 具有超高灵敏度和超宽线性范围的Veritas?微孔板发光检测仪特别适合DLR 报告基因检测系统，Veritas?软件中预装了DLR 的检测程序使得安装更为方便，内置自动加样器使得应用更为简单。 Veritas?微孔板发光检测仪使用荧光素酶检测试剂II (LAR II)最低可以检测到1X10-19 mol 荧光素酶分子，使用Stop & Glo?试剂可以检测到1X10-18 mol 海肾荧光素酶分子，检测线性范围分别为8 和6 个数量级。所有的检测均采用纯化的重组萤火虫荧光素酶 (E1701)和纯化的重组海肾荧光素酶。

荧光素酶报告实验

荧光素酶报告实验 1 扩增目的片段 扩增包含靶基因与miRNA互补位点的3’UTR序列以及mutant序列，上下游引物5’端各含有不同的酶切位点和保护碱基（如Pme I，Spe I）；电泳检测目的条带，看大小是否正确，然后用试剂盒纯化PCR产物备用。主要采用了2 种方法进行序列突变及扩增，如下图所示：第一种方法： 第二种方法： 1.2 取1-2 μg纯化的目的片段或pMIR-REPORT载体，按酶切反应体系配制混合液进行酶切（加0.01% BSA），酶切3h后，80℃灭活5 min，冰上降温。酶切产物进行胶回收。

酶切体系连接体系Component V olume (μl) Component V olume (μl) H2O 16-x H2O 8-m-n Vector or DNA x Vector m NEB Buffer I或IV 2 DNA n Spe I 1 10×T4 Ligase Buffer 1 Pme I 1 T4 DNA Ligase 1 Total voloume 20 Total voloume 10 1.3 配制连接反应混合液（DNA和Plasmid的molar ratio为3:1到6:1），16℃连接过夜或室温连接10 min。连接完毕后，将连接产物转化入感受态大肠杆菌（热激法）。Amp（100 μg/ml）抗性培养板筛选阳性克隆，菌落PCR鉴定目的片段，送3个样本测序，提取质粒酶切鉴定等。并扩繁阳性克隆。重组Luc-3’UTR 质粒主要元件和组成如下图所示（重组Luc-3’UTR-Mut 原理相同）： pLuc-MET 3'UTR 荧光素酶报告基因载体的构建 4.接种对数生长期的HEK293细胞（10% FBS+90% DMEM培养）于96孔板，3×103个/孔，每个实验组设置6个复孔，37℃，5% CO2培养箱中培养24h； 5.根据Lipofectamine 2000转染试剂说明书，配制转染液，转染HEK293细胞； A 液B液 pLuc-3’UTR 0.1 μg Lipofectamine 2000 0.5 μl pRL-SV40 0.05 μg OPTI-MEM 25 μl Mimic/NC 100 nM终浓度 OPTI-MEM 25 μl 6 转染48 h后，吸除96孔板中的培养液，用ddH2O稀释Passive Lysis Buffer至1×浓度，在96孔板中加入1×Passive Lysis Buffer，20 μl/孔，用移液枪反复吸打裂解细胞； 7 在白色不透明的96孔板中加入100 μl/孔的Luciferase Assay Substrate； 8 从每孔裂解好的细胞悬液中吸出11.5 μl加入Luciferase Assay Substrate中混匀； 9 在酶标仪500 ms条件下检测，并记录数据； 10 用Stop & Glo? Buffer稀释Stop & Glo? Substrate至1×使用浓度； 11 在第7步完成后，加入Stop & Glo? Substrate 100 μl/孔，混匀； 12 在酶标仪500 ms条件下检测，并记录数据，两次测得数据的比值代表各孔样本的相对荧光强度。

双荧光素酶报告基因检测试剂盒使用说明

双荧光素酶报告基因检测试剂盒使用说明 产品说明： 报告基因检测，是真核基因表达调控研究的常用方法。由于检测光量子的方法非常敏感，采用生物发光(bioluminescent)法，是报告基因检测最常用的有效手段。荧光素酶(luciferase)催化底物荧光素的转化，发射出光子。萤火虫荧光素酶(Firefly luciferase)和海肾荧光素酶(Ranilla luciferase)催化的发光反应，具有相似的光学特征和很好的浓度线性范围(7~8个数量级的线性范围)，酶的检测灵敏度达10-18mol到10-20mol，但两者催化的化学反应底物和最适反应条件完全不同。这两种荧光素酶配合形成了十分有效的双荧光素酶报告基因系统，其中Ranilla luciferase通常作为内参照。 本试剂盒提供了一体化形式的双荧光素酶检测系统。采用通用裂解缓冲液，适合于两种荧光素酶活性的保持，且与其他类型的报告基因检测和蛋白含量检测兼容；优化的两种酶反应体系，使每种发光反应持续数十分钟，以便于手工操作多个样品；并保证Firefly luciferase发光及时淬灭，不影响后续Ranilla luciferase的测定；优化的反应体系还使两种荧光素酶活性比值趋于合理的敏感范围，更有利于后续数据的比较。 产品内容： 名称数量保存条件5x Universal Lysis Buffer(通用裂解液)25ml-20℃ Fassay Buffer I(虫酶缓冲液)10ml-20℃ Fassay Substrate I(虫酶底物)0.5ml-20℃ Rassay Buffer II(海酶缓冲液)10ml-20℃ Rassay Substrate II(海酶底物)0.2ml-20℃可作100次双荧光素酶检测。低温运输，-20℃或-80℃避光保存。有效期6个月。

双萤光素酶报告基因的应用-常见载体及案例简介

双萤光素酶报告基因的应用，常见载体及案例简介双萤光素酶报告基因检测（Dual-Luciferase Reporter Assay）通常以萤火虫萤光素酶(Firefly luciferase)为报告基因，以海肾萤光素酶(Renilla luciferase)为内参基因。所构成的报告系统具有灵敏度高、动态范围广、应用灵活等优势，广泛用于基因调控、非编码RNA靶向互作等研究领域。 Firefly luciferase（简称F-Luc）以萤光素(luciferin)为底物，在Mg2+、ATP和氧分子存在条件下，催化luciferin氧化成oxyluciferin，在此过程中发出最强波长在560nm 左右的生物萤光(bioluminescence)。F-Luc表达框的上游启动子区域插不同功能序列，可以通过转录起始条件造成其报告萤光的变化。在F-Luc的3’UTR区域插入待验证的靶序列，通过其翻译抑制或mRNA稳定性降低，可以反映是否存在靶向互作。 Renilla luciferase（简称R-Luc）以腔肠素（coelenterazine）为底物，在氧分子存在的条件下催化coelenterazine氧化生成coelenteramide，此过程中发出最强波长在465nm 左右的生物萤光。R-Luc通常由固定组成型启动子驱动，在报告系统中作为校正input误差的内参信号。 生物萤光产生反应式 一、应用方向 1. 验证microRNA同mRNA靶向互作。将待测mRNA的3’UTR序列插入报告基因载体，再共转入该microRNA，如果萤光素酶活性下降，则提示为其靶序列。 2. 验证microRNA同lncRNA靶向互作。将候选的lncRNA序列插入报告基因载体中F-Luc的3’UTR区域，检测萤光素活性。 3. 启动子结构分析。将启动子区域序列（通常2k左右）进行分段截短，或对特定位点进行突变，再分别构建入luciferase报告载体，检测其启动子活性。 4. 启动子SNP分析。一些基因的启动子区域存在单核苷酸多态性，可运用萤光素酶报告系统分析其相对活性。

双荧光素酶报告基因检测系统-promega

Dual-Luciferase? Reporter Assay 试剂准备 Luciferase Assay Buffer II 10ml Luciferase Assay Substrate 1vial Stop & Glo? Buffer 10ml Stop & Glo? Substrate, 50X 200ul Passive Lysis Buffer (PLB), 5X 30ml 1.1X PLB: 加1体积的5X Passive Lysis Buffer (PLB)到4体积的dH20中，40C 保存（一个月）。 https://www.sodocs.net/doc/ea8623284.html,R II：将Luciferase Assay Substrate重悬于10ml Luciferase Assay Buffer II 中（-200C保存1个月，-700C保存1年）。 3.1X Stop & Glo 试剂：1体积50X Stop & Glo? Substrate加入49体积的 Stop & Glo? Buffer中（-200C保存15天）。（每次试验需要100ul） 细胞处理 1. 吸除细胞培养液 2. 1X PBS轻柔的冲洗细胞 3. 加入1X PLB（推荐用量） 4.细胞溶解 室温条件下，轻摇细胞15min，

瞬时转染和报告基因实验 采用脂质体介导技术转染。重组质粒分别为p-629/+100，p-401/+100，p-238/+100，p-80/+100，p-25/+100。pGL3- basic为阴性对照;同时以转染phRL-tk(海肾荧光素酶)作内对照。具体转染方法参照转染(Polifectamine Reaent)说明书进行。 1. 将质粒DNA(3.2μg)与phRL-tk (0.8μg)按1:4混合后为A液，混匀30s， PolyFect(QIAGEN)与无血清无抗生素的DMEM按1:50混匀后为B液，混匀30s; 2. A+B混匀(B加入A)15s，室温下孵育5-10 min; 3. 吸出六孔板中的培养液，用无血清无抗生素的DMEM洗3遍，然后加入AB 混合液，每孔0.8mL; 4. 6h后，加入2mL完全DMEM; 5. 24h后，倒出旧培养液，换为完全DMEM; 6. 100μg H2O2或B(a)P处理lh或24h;（200 μM MMS，24h-溶解于Me2SO, Sigma)； （H2O2不引起OGG1升高）

双荧光报告系统

报告基因 Promega中文通讯第2期 2002 荧光素酶 双荧光素酶报告基因测试∶ 结合萤火虫和海洋腔肠荧光素酶先进的共报告基因测试技术 在用萤火虫荧光素酶定量基因表达时 ,通常采用第二个报告基因来减少实验的变化因素。但传统的共报告基因(比如CAT,β-Gal,GUS)不够便利,因为各自的测试化学,处理要求,检测特点存在差异。Promega提供一种先进的双报告基因技术,结合了萤火虫荧光素酶测试和海洋腔肠荧光素酶测试。双荧光素酶报告基因测试系统,结合pRL载体系统,表达第二个报告基因海洋腔肠荧光素酶,在单管中进行双荧光素酶报告基因测试,快速,灵敏,简便。系统还提供PLB裂解液,用来裂解在多孔板中培养的哺乳细胞,不需操作单个样品。对于正在使用萤火虫荧光素酶报告基因载体的研究人员。双荧光素酶报告基因测试系统将使他们立即体会到该系统的便利。 介绍 双报告基因用于实验系统中作相关的或成比例的检测, 通常一个报告基因作为内对照, 使另一个报告基因的检测均一化。检测基因表达时双报告基因通常用来瞬时转染培养细胞，带有实验报告基因的载体共转染带有不同的报告基因作为对照的第二个载体。通常实验报告基因偶联到调控的启动子, 研究调控基因的结构和生理基础。报告基因表达活力的相对改变与偶联调控启动子转录活力的改变相关，偶联到组成型启动子的第二个报告基因，提供转录活力的内对照, 使测试不被实验条件变化所干扰。 通过这种方法, 可减少内在的变化因素所削弱的实验准确性, 比如, 培养细胞的数目和活力的差别, 细胞转染和裂解的效率。 使用萤火虫荧光素酶,结合氯霉素乙酰转移酶(CAT), β-半乳糖苷酶(β-Gal), 或葡萄醛酸糖苷酶(GUS)的双报告基因,近几年已普遍使用。但这些双报告基因组合削弱了荧光素酶操作的优势 , 比如荧光素酶测试和定量可在几秒钟内进行, 但CAT, β-Gal和GUS测试法, 则在定量前需要长时间的保温。另外,这些报告基因受限于它们的灵敏度和线性应答范围, 必须注意不要超过这些范围, 内源性细胞活力也会干扰这类报告基因的使用。许多类型的细胞有内源β-Gal 或GUS表达, 不利于准确定量报告基因表达, 胞内去乙酰酶活力干扰CAT活力测试。尽管在高温

双荧光素酶报告基因

启动子活性分析（双荧光素酶报告基因实验） 一、实验目的：分析启动子活性 二、实验原理：荧光素酶报告基因的活性用Dual-Luciferase?Reporter Assay System（Promega）试剂盒来检测。利用单通道多标记荧光检测仪测定荧 光素酶活性。在双荧光素酶系统中，除了用于检测启动子活性的萤火虫 荧光素酶外，另外一种组成型表达的Renilla荧光素酶质粒PRL-TK也被 同时转染入细胞内作为内参。 三、实验材料：Dual-Luciferase?Reporter Assay System（Promega）试剂盒， PBS，细胞裂解液，96孔， 四、实验设备：单通道多标记荧光检测仪 五、实验方法及步骤： 1）启动子萤光素酶报告载体与共转染质粒按照质量等比例、总量0.8μg的原则转染细胞，36h后收获细胞； 2）96孔板吸弃细胞培养基，PBS冲洗细胞一次，加入1×PLB细胞裂解液20μl，置于室温震荡裂解20min； 3）轻轻吹打细胞，取10μl细胞裂解液加入50μl Luciferase Assay Reagent，轻轻震荡混匀，立刻置于单通道多标记荧光检测仪中测定Firefly Luciferase活性； 4）读数后立即加入50μl Stop & Glo?Reagent轻轻震荡混匀，读取Renilla Luciferase活性； 5）所得的结果为各个实验样品的Firefly Luciferase活性与Renilla荧光素酶活性的比值。每个实验组重复3-4孔，整个实验独立重复3次。实验结 果均为3次独立的实验结果的平均值。所有的结果均以平均值±标准差 (mean±S.D.)表示。 六、注意事项 1.做好对照。 2.多做几个复孔，求平均值。 七、补充知识点 双荧光素酶报告基因实验

双荧光素酶报告基因分析

双荧光素酶报告基因分析 转载请注明来自丁香园 发布日期：2010-04-08 10:59 文章来源：北京原平皓生物技术有限公司 关键词：双荧光素酶基因表达报告基因检测 1. 介绍 荧光素酶报告基因表达的转录调控常被用来研究培养细胞的生物学特性。荧光素酶是理想的报告基因，因为哺乳动物细胞中不含内源性荧光素酶，一旦转录完成立刻就生成功能性的荧光素酶。 Dual-Luciferase?双荧光素酶报告基因检测系统中含有在同一细胞中同时表达的两种荧光素酶。通常，报告基因实验中往往会受到各种实验条件的影响，共转染的“对照”报告基因会作为内对照，为试验提供一基准线。实验报告基因经过内参照的处理可以减小细胞活性和转染效率对实验的影响，因此双报告系统减少了外部干扰，使得实验数据更可信。实验中报告基因和对照基因的酶没有种源同源性，萤火虫荧光素酶和海肾荧光素酶对应不同的反应底物，反应中没有任何的交叉干扰。 萤火虫荧光素酶底物和海肾荧光素酶底物分别与检测试剂反应可以使灵敏度最大化。由于超强的光信号和超高的信噪比，本系统被广泛用于制药和生物技术产业中。双荧光素酶报告基因检测系统适配于各种培养哺乳细胞的培养基，如1640，MEM，DM EM，F12等。这些试剂与被动裂解液所附带的试剂盒，可以从Promega试剂盒中分开，单独使用。 具有超高灵敏度和超宽线性范围的Veritas?微孔板发光检测仪特别适合DLR 报告基因检测系统，Veritas?软件中预装了DLR 的检测程序使得安装更为方便，内置自动加样器使得应用更为简单。

Veritas?微孔板发光检测仪使用荧光素酶检测试剂II (LAR II)最低可以检测到1 X10-19 mol 荧光素酶分子，使用Stop & Glo?试剂可以检测到1X10-18 mol 海肾荧光素酶分子，检测线性范围分别为8 和6 个数量级。所有的检测均采用纯化的重组萤火虫荧光素酶(E1701)和纯化的重组海肾荧光素酶。 图1－3 使用Promega 公司Dual-Luciferase?双荧光素酶报告基因检测系统，萤火

双荧光素酶报告系统

双荧光素酶报告系统 双荧光素酶报告基因测试∶ 结合萤火虫和海洋腔肠荧光素酶先进的共报告基因测试技术 在用萤火虫荧光素酶定量基因表达时 ,通常采用第二个报告基因来减少实验的变化因素。但传统的共报告基因(比如CAT,β-Gal,GUS)不够便利,因为各自的测试化学,处理要求,检测特点存在差异。Promega提供一种先进的双报告基因技术,结合了萤火虫荧光素酶测试和海洋腔肠荧光素酶测试。双荧光素酶报告基因测试系统,结合pRL载体系统,表达第二个报告基因海洋腔肠荧光素酶,在单管中进行双荧光素酶报告基因测试,快速,灵敏,简便。系统还提供PLB 裂解液,用来裂解在多孔板中培养的哺乳细胞,不需操作单个样品。对于正在使用萤火虫荧光素酶报告基因载体的研究人员。双荧光素酶报告基因测试系统将使他们立即体会到该系统的便利。 介绍 双报告基因用于实验系统中作相关的或成比例的检测, 通常一个报告基因作为内对照, 使另一个报告基因的检测均一化。检测基因表达时双报告基因通常用来瞬时转染培养细胞，带有实验报告基因的载体共转染带有不同的报告基因作为对照的第二个载体。通常实验报告基因偶联到调控的启动子, 研究调控基因的结构和生理基础。报告基因表达活力的相对改变与偶联调控启动子转录活力的改变相关，偶联到组成型启动子的第二个报告基因，提供转录活力的内对照, 使测试不被实验条件变化所干扰。 通过这种方法, 可减少内在的变化因素所削弱的实验准确性, 比如, 培养细胞的数目和活力的差别, 细胞转染和裂解的效率。 使用萤火虫荧光素酶,结合氯霉素乙酰转移酶(CAT), β-半乳糖苷酶(β-Gal), 或葡萄 醛酸糖苷酶(GUS)的双报告基因,近几年已普遍使用。但这些双报告基因组合削弱了荧光素酶操作的优势 , 比如荧光素酶测试和定量可在几秒钟内进行, 但CAT, β-Gal和GUS测试法, 则在定量前需要长时间的保温。另外,这些报告基因受限于它们的灵敏度和线性应答范围, 必须注意不要超过这些范围, 内源性细胞活力也会干扰这类报告基因的使用。许多类型的细胞有内源β-Gal或GUS表达, 不利于准确定量报告基因表达, 胞内去乙酰酶活力干扰CAT活力测试。尽管在高温下预处理细胞裂解液(1,2), 会降低内源性β-Gal和CAT测试的干扰，但这些处理也会快速失活荧光素酶。因此,在此类双报告基因检测中, 必须以不同的步骤分别处理共转染的细胞裂解液。 理想的双报告基因方法应该使用户能够以萤火虫荧光素酶所具有的速度,灵敏和线性范 围对同一样品中的两个报告基因同时测定。这在传统的报告基因, 如CAT, β-Gal和GUS是不可能的, 由于它们测试化学,处理要求所固有的局限。相反 , 结合萤火虫 ( Photinus pyralis ) 和海洋腔肠 ( Renilla reniformis ) 双荧光素酶， Promega 的双荧光素酶报告基因测试 (DLR) 系统可满足这些要求，在单管中完成这些测试。 双荧光素酶报告基因测试化学 荧火虫和海洋腔肠荧光素酶都具有生物发光报告基因的卓越的测试特点 , 但它们在进化 上的起源不同 , 因此 , 具有不同的酶学结构和底物要求。这些差别用来发展了 DLR 测试化学 , 选择性地区别这两种发光报告基因的活力。萤火虫荧光素酶是一个 61kDa 单亚基蛋白质 , 酶活力不需翻译后修饰 (3,4), 在翻译后即可作为遗传报告基因。在 ATP,Mg 2+ 和 O 2 存在下，通过甲虫荧光素的氧化反应发光 ( 图 1) 。在常规反应条件下 , 荧光素的氧化发生时 , 以荧光素 -AMP 作为中间体 , 转换非常缓慢。结果 , 在底物和酶混合后 , 测试化学产生"闪烁"的光 , 并迅速衰减。专利化的测试试剂 , 定量萤火虫荧光素酶活力 , 掺入了

双荧光素酶测试系统及海肾类对照报告基因载体

双荧光素酶测试系统及海肾类对照报告基因载体 1.什么是双荧光素酶报告基因测试系统（DLR） DLR测试系统灵敏，方便，在一个系统中用于测量两个单独的荧光素酶报告基因，萤火虫荧光素酶及海洋海肾荧光素酶(Renilla reniformis)，DLR测试系统可用于细胞裂解物及无细胞的翻译系统。 2.有哪些海肾荧光素酶载体 海肾荧光素酶载体pRL用于在转染的哺乳细胞中组成性地表达海肾荧光素酶。这类载体还有T7启动子，可用T7RNA聚合物在体外合成海肾荧光素酶，有4个不同的载体： A pRL-SV40载体??? pRL-SV40载体含SV40增强子及早期启动子区域，可在多种细胞中组成性地高表达海肾荧光素酶。pRL-SV40载体还含有SV40的复制起始区，可在表达SV40大T抗原的细胞中，如COS-1，COS-7细胞中，瞬时及附加体似地复制。 B pRL-CMV载体pRL-CMV载体含有CMV极早增强子及启动子，可在多种细胞中组成性地高表达海肾荧光素酶。 a pRL-TK载体 pRL-TK载体含HSV胞嘧啶激酶启动子区域，在多种细胞中组成性地弱表达海肾荧光素酶。 b pRL-null载体 pRL-null载体缺真核启动子及增强子，在海肾荧光素酶基因的上游含有多克隆位点。 3.用双报告基因有何优点 一般地说，实验报告基因用于测试实验条件下基因的表达，而另一个报告基因作为内对照，以提供实验报告基因测试的归一化。将实验报告基因的活力与内对照报告基因的活力作归一化可消除实验中不同测试间所固有的变化，这些变化减弱实验准确度，其中包括培养细胞的数目及活力的差异，细胞转染及裂解的效率。海肾荧光素酶可用作对照报告基因及实验报告基因。在双荧光素酶报告基因测试中，将萤火虫荧光素酶作为实验报告基因，海肾荧光素酶作为对照报告基因。 4.相比用CAT或β-半乳糖苷酶对表达数据作归一化，双荧光素酶报告基因测试系统有何优点

双萤光素酶报告基因检测 靶基因验证 实验报告

合同号：HY-XXXX 双萤光素酶报告基因检测 （miRNA靶基因验证）实验 和元生物技术（上海）有限公司，2013年4月21日 摘要：本实验使用双萤光素酶报告基因检测系统验证hsa-mir-21对目的基因Tropomyosin 1（TPM1）的抑制作用；通过检测带有TPM1的3’UTR的luciferase在hsa-mir-21过表达时的表达情况，同时结合带有突变预测结合位点的3’UTR的luciferase的表达，进一步确定了hsa-mir-21与TPM1靶基因3’UTR的作用位点。 关键词：hsa-mir-21，3’UTR，Tropomyosin 1（TPM1），Dual-Reporter Assay

1.实验原理: 萤光素酶是理想的报告基因，因为哺乳动物细胞中不含内源性萤光素酶，一旦转录完成立刻就生成功能性的萤光素酶。单报告基因实验往往会受到各种实验条件的影响，而双报告基因则通过共转染的“对照”作为内参为试验提供一基准线，从而可以在最大程度上减小细胞活性和转染效率等外在因素对实验的影响，使得数据结果更为可信。Dual-Luciferase双萤光素酶报告基因检测系统在细胞中同时表达萤火虫萤光素酶和海肾萤光素酶，两者没有种源同源性并对应不同的反应底物，故而没有交叉干扰。得益于超强的光信号和超高的信噪比，本系统被广泛用于miRNA靶基因验证。 由于miRNA主要通过作用于靶基因的3’UTR起作用，可以将目的基因3’UTR区域构建至载体中报告基因luciferase的后面，通过比较过表达或者干扰miRNA后，报告基因表达的改变（监测萤光素酶的活性变化）可以定量反映miRNA对目的基因的抑制作用；结合定点突变等方法进一步确定miRNA与靶基因3’UTR的作用位点。 2.实验目的: 验证hsa-mir-21与靶基因Tropomyosin 1 3’UTR是否发生作用并进一步确定hsa-mir-21与靶基因Tropomyosin 1 3’UTR的作用位点。

双荧光素酶报告基因检测系统的开发

Dual-luciferase reporter assay kit (1) Promega公司双荧光素酶报告基因(DLR TM)检测系统 试剂盒组分： Promega的DLR TM检测试剂盒专利给出了Luciferase assay bufferII和Stop & Glo? buffer的相关组分和浓度范围，没有具体的数值。我在专利和文献中也没有找到针对DLR TM检测试剂盒中的passive lysis buffer的成分。Assay protocol： (2) 文献中用到的几种非商业性双荧光素报告基因检测系统 细胞裂解液（cell lysis buffer）配方： (a)源自promega公司的单荧光素酶报告试剂盒： T ris-phosphate（PH7.8）25mM EGTA or EDTA 2mM DTT 2mM BSA 1mg/ml Triton X-100 1% Glycerol 10%

(b) Make the following stock solutions. 1M HEPES pH 8 (室温RT) 1M DTT (4℃) 100mM MgCl2 (RT) 裂解液第二种配方（100ml体系）：来自 https://www.sodocs.net/doc/ea8623284.html,/cgi-bin/prot/view_cache.cgi?ID=2507 10ml 1M HEPES PH8 0.5ml 1M DTT 2ml 100mM MgCl2 2ml Triton X100 85ml distilled water 反应缓冲液：Firefly Luciferase Assay；Renilla Luciferase Assay Reagent。 a>“A noncommercial dual luciferase enzyme assay system for reporter gene analysis”文献作者给出了2种荧光素酶活性检测的反应试剂配方，并与promega公司试剂盒进行了效果比较，检测效率和灵敏度都很高，不逊于promega产品。目前也有很多文献采用了该法。细胞裂解液仍使用promega 的passive lysis buffer。 Firefly Luciferase Assay Reagent： glycylglycine 25mM KxPO4 (pH 8.0) 15mM EGTA 4mM DTT 1mM MgSO415mM ATP 2mM

双荧光报告基因分析

双荧光报告基因分析 实验目的： 研究转录因子的活性和调控元件的活性。 实验原理： 通过将感兴趣的目的基因转录调控元件构建到带荧光素酶（firefly luciferase）的表达载体，如pGL3，构建成报告基因质粒，使这段DNA序列调控luciferase的转录。然后将报告基因质粒转染细胞，适当刺激或处理后裂解细胞，并加入底物荧光素后（luciferin），luciferase可以催化荧光素发出荧光，从而可以通过测量荧光值的高低判断刺激前后或不同刺激对感兴趣的调控元件的影响。为避免由于质粒转细胞时效率的差异而带来的误差，可以同时转入Renilla荧光素酶的报告基因质粒作为内参，即双荧光报告系统。该实验可以用于研究转录因子对promoter或enhancer序列的调控，也可以用于研究受体活性，细胞内信号通路，或者microRNA对基因表达的调控。 实验过程： 1．质粒构建 1.1载体的选择常用的载体有pGL3系列，包括pGL3-basic(附图1a)，pGL3-promoter(附图1b)，pGL3-enhancer(附图1c)。如果要研究的序列是promoter，可选择将目的片段插入pGL3-enhancer载体；若要研究的序列是enhancer，则可选择pGL-promoter载体。 1.2抽提基因组DNA，并以基因组DNA为模板PCR，克隆目的片段，通过合适的酶切，插入载体，构建报告基因表达质粒。 2．转染 将报告基因质粒和作为内参的Renilla以及待研究的转录因子的表达质粒共转染

细胞，并根据需要刺激或处理细胞，24h-48h后收细胞。在共转染时，由于内参质粒Renilla有很强的promoter/enhancer，因此报告基因质粒:Renilla转染量一般为10：1到50：1。 3．Luciferase活性的测定（以promega的双荧光报告试剂盒为例） 3.1 细胞裂解 试剂盒中提供的裂解液为5X PLB（passive lysis buffer），使用前取1体积的PLB，加4体积的dH2O混匀。去掉细胞培养液，用PBS洗一遍以去掉残留的培液，加入1X PLB。并将培养板于摇床上室温摇15min，使细胞充分裂解。将细胞裂解液转移至ep管，12000g X 30sX 4℃离心。上清中即含有firefly luciferas 和Renilla luciferase，用于测定酶活性；而沉淀为核蛋白，可用于western blot检测转录因子的表达。 3.2LAR II 和Stop&Glo LAR II（luciferase assay reagent）是firefly luciferase 的底物，在使用新的KIT时，将LAR II 溶解在LA II buffer中，并分装保存。 Stop&Glo 是Renilla luciferase 的底物，同时能终止LAR II的反应。在试剂盒中提供的是50X Stop&Glo substrate 以及Stop&Glo buffer。可以一次将substrate 与buffer混匀，然后分装保存，也可以每次使用前取1体积的substrate，加入50体积的buffer。 3.3测定 在指形管中加入40 μl 的LAR II，10 μl细胞裂解液，用枪头上下打匀2-3次，于发光仪中测量，读数，即为firefly luciferase的值。每管依次测量完后，加入40μl Stop&Glo，再次测量读数，即为Renilla luciferase的值。

Luciferase报告基因系统

Luciferase报告基因系统 Luciferase报告基因系统是以荧光素(luciferin)为底物来检测萤火虫荧光素酶(fireflyluciferase)活性的一种报告系统。荧光素酶可以催化luciferin氧化成oxyluciferin，在luciferin氧化的过程中，会发出生物荧光(bioluminescence)。然后可以通过荧光测定仪也称化学发光仪(luminometer)或液闪测定仪测定luciferin氧化过程中释放的生物荧光。荧光素和荧光素酶这一生物发光体系，可以极其灵敏、高效地检测基因的表达。是检测转录因子与目的基因启动子区DNA相互作用的一种检测方法。 实验原理： 转录因子是一种具有特殊结构、行使调控基因表达功能的蛋白质分子，也称为反式作用因子。某些转录因子仅与其靶启动子中的特异序列结合，这些特异性的序列被称为顺式作用元件，转录因子的DNA结合域和顺式作用元件实现共价结合，从而对基因的表达起抑制或增强的作用。荧光素酶报告基因实验（luciferase assay）是检测这类转录因子和其靶启动子中的特异顺序结合的重要手段。 其原理简述如下： （1）构建一个将靶启动子的特定片段插入到荧光素酶表达序列前方的报告基因质粒，如pGL3-basic等。 （2）将要检测的转录因子表达质粒与报告基因质粒共转染HEK293T细胞或其它相关的细胞系。如果此转录因子能够激活靶启动子，则荧光素酶基因就会表达，荧光素酶的表达量与转录因子的作用强度成正比。 （3）加入特定的荧光素酶底物，荧光素酶与底物反应，产生荧光，通过检测荧光的强度可以测定荧光素酶的活性，从而判断转录因子是否能与此靶启动子片段有作用。 Luciferase原理示意图 基本实验步骤：

荧光素酶报告

荧光素酶报告检测结果：

双萤光素酶报告基因检测（miRNA靶基因验证）实验 摘要：本实验使用双萤光素酶报告基因检测系统验证hsa-mir-21对目的基因Tropomyosin 1（TPM1）的抑制作用；通过检测带有TPM1的3?UTR的luciferase在hsa-mir-21过表达时的表达情况，同时结合带有突变预测结合位点的3?UTR的luciferase的表达，进一步确定了hsa-mir-21与TPM1靶基因3?UTR的作用位点。 关键词：hsa-mir-21，3?UTR，Tropomyosin 1（TPM1），Dual-Reporter Assay 一、实验原理: 萤光素酶是理想的报告基因，因为哺乳动物细胞中不含内源性萤光素酶，一旦转录完成立刻就生成功能性的萤光素酶。单报告基因实验往往会受到各种实验条件的影响，而双报告基因则通过共转染的“对照”作为内参为试验提供一基准线，从而可以在最大程度上减小细胞活性和转染效率等外在因素对实验的影响，使得数据结果更为可信。Dual-Luciferase双萤光素酶报告基因检测系统在细胞中同时表达萤火虫萤光素酶和海肾萤光素酶，两者没有种源同源性并对应不同的反应底物，故而没有交叉干扰。得益于超强的光信号和超高的信噪比，本系统被广泛用于miRNA靶基因验证。 由于miRNA主要通过作用于靶基因的3?UTR起作用，可以将目的基因3?UTR区域构建至载体中报告基因luciferase的后面，通过比较过表达或者干扰miRNA后，报告基因表达的改变（监测萤光素酶的活性变化）可以定量反映miRNA对目的基因的抑制作用；结合定点突变等方法进一步确定miRNA与靶基因3?UTR 的作用位点。 二、实验目的 验证hsa-mir-21与靶基因Tropomyosin 1 3?UTR是否发生作用并进一步确定hsa-mir-21与靶基因Tropomyosin 1 3?UTR的作用位点。 三、实验步骤 1. 质粒转染细胞： 1) 细胞铺板：将细胞按70%的汇合度接种到96孔板。 2) 转染：16h后转染萤光素酶报告基因质粒，每个样品设置6个复孔。 a) 配制DNA和转染试剂: 96孔板转染质粒时每孔比例为Firefly：Renilla：转染试剂=0.1μg：0.01μg：0.25μL b) 配制RNA和转染试剂稀释液，RNA的终浓度为100nM，转染试剂每孔0.25μL c) 稀释好的DNA和RNA及转染试剂，常温孵育5min d) 将稀释好的DNA和RNA分别和转染试剂混匀，常温孵育20min e) 每孔弃去50μL培养基，将25μL DNA转染混合液和25μL RNA转染混合液分别添加到每孔细胞样品中， f) 转染6h后，换新鲜完全培养基 2. 双报告基因检测 3) 质粒共转染48h后，弃去培养基，用100μL 1XPBS洗1遍 4) 倾斜96孔板，吸干剩余的PBS 5) 去离子水将5XPLB稀释成1XPLB，使用前放到常温 6) 每孔加50μL稀释好的1X PLB，摇床常温条件下摇15min，进行裂解 7) 白色不透光的96孔酶标板中每孔加步骤4的上清液10μL，加入100μL预先混好的LAR II，2s后测数据 8) 每孔添加100μL预先混好的Stop&Glo Reagent，静止2s后，测数据 注意：进行Luciferase活性检测时，需在避光条件下进行。 四、实验结果 表1. 空白校准后的数据