内参选择

Western Blot内参的选择,老司机都不知道这些窍门

每日生物评论2017-01-31 21:15:13

内参即是内部参照（Internal Control），对于哺乳动物细胞来说一般是指由管家基因编码表达的蛋白（Housekeeping Proteins），它们在各组织和细胞中的表达相对恒定，在检测蛋白的表达水平变化时常用它来做参照物。

一、为什么要使用内参呢？

Western blot除了能证明某样品含有某种蛋白之外，其最为重要的作用是比较不同条件下或者不同组织中，目的蛋白表达量的相对多少。即为蛋白表达水平最直接的证据。要衡量蛋白的表达水平，前提条件就是等量的上样量。

然而如果仅将蛋白浓度测定作为规范需相互比较的各种样品间上样量等同的唯一方法，显然是不可取的。

首先各种蛋白质浓度定量方法都存在局限性，不能完全准确的确定各种样品的蛋白浓度。如UV法直接定量，适合测试较纯净、成分相对单一的蛋白质，相对于比色法来说，操作简单，但是容易受到平行物质如DNA的干扰，且敏感度低，要求蛋白的浓度较高。比色法测定蛋白浓度一般有BCA、Bradford、Lowry等几种方法。BCA法与Lowry法都容易受到蛋白质之间以及去污剂的干扰。Bradford法敏感度最高，且与一些列干扰Lowry、BCA反应的还原剂（如DTT、巯基乙醇）相溶，但是对去污剂依然是敏感的，其最主要的缺点是不同的标准品会导致同一样品的结果差异较大，无可比性。另外，蛋白质定量以后进行电泳时需要等量上样，此步骤也存在操作误差。在Western Blot实验时使用内参，即可简便地对定量和上样步骤产生的误差进行校正。

在Western Blot中使用内参其实就是在WB过程中另外用内参对应的抗体检测内参，这样在检测目的产物的同时可以检测内参的表达，由于内参在各组织和细胞中的表达相对恒定，借助检测每个样品内参的量就可以用于校正上样误差，这样半定量的结果才更为可信。此外使用内参可以作为空白对照，检测蛋白转膜情况是否完全、整个Western Blot显色或者发光体系是否正常。

二、如何选择合适的内参呢？

有些人提取蛋白会选择胞浆、胞核分开提取，不提取总蛋白。β-actin在胞浆中表达高效稳定，而总蛋白主要成分就是胞浆蛋白，所以β-actin可以作为总蛋白的内参。理论上细胞核内不表达β-actin，所以不能用于核蛋白内参。同理，细胞核内的蛋白用于做总蛋白内参，自然也不合理，内参自当选择与目的蛋白表达部位相同的蛋白才能有说服力。

而实际情况中，无论什么试剂盒，都不可能完全将胞浆、胞核蛋白完全分离开，提取时总会有交叉污染。即提取的核蛋白肯定会有β-actin，而胞浆蛋白也会有核蛋白的存在，所以你用两种蛋白做内参都能有结果，只是有的科学合理，有的不科学，没有说服力。

此外很多公司的内参抗体是用抗原片段制备的，不同的公司选择的片段不一样。以最常用的β-actin为例，有的公司选择N端，有的选择C端。选用N端的抗体均不能检测心肌和横纹肌中的actin条带。选用C端的抗体可以在肌肉细胞中检测到actin阳性信号。有时候在实验中检测内参时产生“组织特异性”，就是由于抗体选择不对造成的。

那么应该如何选择合适的内参呢，一般遵循以下原则：

1）样本种属来源

首先要考虑的就是实验样本来源于什么物种。哺乳动物的组织或者细胞样本，通常选择

β-actin、Tubulin、GAPDH、Lamin B、PCNA、Na+/K+-ATPase等。植物来源实验样本则可以选择Plant actin、Rubisco等。其他来源样本研究较少，所以就应该参照文献报道，选择合适的蛋白作为内参。

2）目的蛋白分子量

选择内参抗体时，应该考虑目的蛋白分子量的大小。通常应该保证目的蛋白与内参蛋白分子量相差5KD以上。比如检测目的蛋白分子量为45KD，此时不适宜选择β-actin（42KD）作为内参，可以考虑选择GAPDH（36KD）作为内参。

3）目的蛋白表达部位

a、胞浆和全细胞蛋白：β-actin（43KD）、GAPDH（37KD）、Tubulin（55KD）等；

b、胞核蛋白：PCNA（29KD）、Histone H3（17KD）等；

c、核膜蛋白：Lamin B（66KD）等；

d、胞膜蛋白：Na+/K+-ATPase（120KD）等；

e、线粒体蛋白：COX IV（17KD）、VDAC1（30KD）等。

4）实际的实验环境

有些细胞在某些条件下内参表达会出现异常，使其不适合做内参。比如某些细胞中，由于组织缺氧、糖尿病等因素会导致GAPDH的表达增高，不适合做内参。在凋亡实验时，Lamin 等也不适合作为内参。在加入抗癌和抗真菌药物时，Tubulin的表达易受影响，不适合作为内参。Lamin B不适合作为胚胎干细胞的内参，而PCNA不适合作为非增殖细胞的内参等。因此设计实验方案的时候应该考虑这些因素并查询相应文献，在实验过程中也应该注意如果内参表达出现异常，应考虑这方面因素。

5）不同的组织特异性

actin 即肌动蛋白，是细胞的一种重要骨架蛋白。actin 大致可分为六种，其中四种是不同肌肉组织特异性的，包括alpha-skeletal muscle actin、alpha-cardiac muscle actin、alpha-smooth muscle actin和gamma-smooth muscle actin，其余两种广泛分布于各种组织中，包括beta-actin（β-non-muscle）和gamma-non-muscle actin。这些不同的亚型组织分布是不一样的，在肌肉组织中beta-actin分布就很少，心肌主要是alpha-cardiac muscle actin。因此不同的组织本来就应该选择不同的内参，不能一概而论。

三、Western Blot中怎样使用内参呢？

在Western Blot实验过程中使用的内参的方法有：

超级简便的标记内参使用法：只要在二抗孵育时加入HRP标记内参抗体（一抗孵育时不加抗体，即HRP直接标记于内参一抗上），按照正常操作即可。

普通内参：当目的蛋白的分子量大小与选用的内参蛋白分子量相差不大时，可以先进行目的蛋白的抗体温育显色和检测。然后使用Strip缓冲液洗掉膜上的抗体，重新进行内参蛋白的抗体温育、显色检测。

当目的蛋白的分子量大小与选用的内参蛋白分子量大小相差比较明显情况下，可以在转膜后预染，根据蛋白质Marker的大小将膜剪为大分子量和小分子量两部分，使内参蛋白与目的蛋白分开。然后两块膜分别与内参蛋白抗体以及目的蛋白抗体进行温育，二抗温育以及显色。

ImageJ对WesternBlot进行灰度分析

Image J 对Western blot 条带进行灰度分析 Image J软件：Windows 版本 第一步：软件安装 1.下载地址：https://www.sodocs.net/doc/ec7759670.html,/ij/download.html 2.下载windows 32位带Java版本，双击软件安装。 第二步：界面介绍 1.软件界面 第三步：图片分析 1.下图为样板图片 2.导入图片：File> Open> Sample1.jpg 图片导入后，Sample1.jpg在新的窗口中打开

3.图片类型设置：Image> Type> 8 bit 4.去除图片背景：Process> Subtract Background> …

4.1Subtract Background 窗口：Rolling ball radius 设为50 pixels， 勾选light background，可选preview，点击“OK”确定 5.工具栏:选择“矩形选框”

6.最大化“Sample1.jpg”窗口，便于矩形选择，矩形选择第一个泳道 7.标记“矩形选框”为1：矩形选择后，调整矩形至合适大小，按下数字键 “1”，或者Analyze> Gels> Select Fist Lane。 8.选择“泳道2”：拖动“1”的矩形框，会出现两个矩形选框，拖动矩形框 至泳道2，调整位置，并按下数字键“2”，Image J 会自动调整大小使“矩形框2”与“矩形框1”保持同一水平。 9.继续拖动，会出项新的“矩形选框”，调增至泳道3，并按下数字键“2” （注意：是按下数字键“2”），重复9至6个泳道全部选择。 10.所有泳道选择后，按下数字键“3”，出现分析图谱。

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央行放水难解楼市之渴刺激需求料将持续 央行降息之后，楼市再出新政。全国30个城市相继松绑公积金，在政策叠加的背景之下，不难看出政府挽救楼市的意图。 中投顾问产业与政策研究中心主任扈志亮指出，央行降息以及公积金贷款新政的出台，意味着楼市政策逐渐松动。“不可否认，这些政策有利于楼市的回暖。”扈志亮说。 那么，房地产市场又是否能在政策叠加之下得到拯救？答案似乎也不那么肯定。 据最新发布的百城房价数据显示，11月全国100个城市新建住宅均价为10589元/平方米，相比10月份10629元/平方米的均价环比下跌约0.38%，连续第七个月实现环比下降。 环比下跌城市数量也在持续增加。11月，住宅价格环比下跌的城市达76个，较上月增加3个。其中，中山、绍兴、日照跌幅最大，下降3%以上。环比上涨的城市有23个，环比减少4个。仅衡水一城住宅均价与上月持平。 除此之外，百城房价同比数值也在持续走低。数据显示，全国100个城市住宅均价与去年同期相比下跌1.57%，跌幅较上月扩大1.05个百分点。分析师指出，11月份，100个城市中，82个城市住宅价格同比下跌，下跌城市个数较上月增加4个。也就是说，超过八成城市房价已回调至一年前水平。其中，三亚等10个城市跌幅较大，约10%-18%。 “虽然从各地限购松绑，到10月后房贷新政、央行降息、公积金调整等举措，楼市利好政策相继出台。在此影响下，近来不少城市楼市成交出现回暖迹象。”房地产分析师章程表示，“不过，从百城房价数据看来，下跌的趋势没有结束。准确地说，颓废的楼市并没有得到扭转。” 究其原因，业内人士认为，从供应情况看，年内大部分城市高库存的现状仍未改变。另外，在链家地产市场研究部张旭看来，上半年市场低迷已造成了多数开发商较大的业绩压力，因而涨价动力并不大，平价走量仍为当前主流。 银监会新规被误读:银行理财产品资金不能炒股 本报讯:一则有关“银监会新规使万亿理财资金入市”的消息日前让不少股市淘金的人倍感兴奋。不过，北京青年报记者昨天从业内人士处了解到，近日，银监会的确向部分银行下发《商业银行理财业务监督管理办法》(征求意见稿)，在业内征求意见。不过这一征求意见稿对银行理财资金不能投资于境内二级市场股票等的相关规定未有任何改变。 早在2009年7月，银监会发布《关于进一步规范商业银行个人理财业务投资管理有关问题的通知》(银监发〔2009〕65号)就明确指出，“理财资金不得投资于境内二级市场公开交易的股票或与其相关的证券投资基金”、“理财资金不得投资于未上市企业股权和上市公司非公开发行或交易的股份”。但是，风险承受能力较强的高资产净值客户、私人银行客户、机构客户产品不受这两条限制。

western blot条带分析

近几天回答了蛋白版几个有关压片和显影的帖子，发现在这一块还没有比较系统的论述。特贡献了western显影常见问题及解决方案，是我的经验总结，以供大家参考。其中绝大部分问题是我所遇到过的，其他个别我没遇到过的是参照pierce公司的说明书。限于字数，语言比较简洁，如对其中内容有疑问或建议可跟帖。 Western荧光检测取决于抗原含量—一抗敏感度—二抗敏感度—底物敏感度—显影和定影效率这一系统。我的经历认为确保万无一失的做法是如果看到荧光则压10~30s，看不到则同时压两张，10~30min洗一张，如果无则再补一张,1h后洗。再无，则压过夜。共3张片，根据每次结果调整。 其中两张片子的压法如下描述: 先剪一张比膜长2~3厘米的片子（以供贴胶带），然后剪2片细小透明胶带贴到片子的左右两边（贴时胶带留一半用于粘到封口膜上），然后将片子压到膜上，并使透明胶带留出的一半粘到封口膜上。这样就固定了第一张胶片，就不会因为放、取第二张胶片而使第一张移动了。然后放第二张胶片，与第一张片子贴在一起就行，注意片子要干燥，压片前用纸擦干封口膜，以避免被底物液体污染导致与下面一张粘在一起。取时用手轻轻拂过就可以把上面片子与下面一张错开了，不要用手抠，否则下面一张也移动了。在洗下面一张片子时一定要取掉粘在片子上的胶带，否则在胶带的地方会影响显影。荧光经过下面一张胶片会稍微有些衰减，所以下面一张胶片感光稍微比上面一张强一些。 现象-- - - - - - - - - - - - - - - - - - --原因- - - - - - - - - - - - - - - - --- -- -- --- -- ---解决 反影(白色条带,黑色背景) ---- -- -1 HRP过高(背景较高) - - - - - - - - ---- - - - 至少成倍稀释一抗/二抗(可4~10倍)*注1 显影后膜上条带处变为黄色---- - -2 HRP过高(敏感性太高)- - - - - - - - - ---- -至少成倍稀释一抗/二抗(可4~10倍)*注2 信号弱或无---- - - - - - - - - - ---- 3 HRP过高引起底物迅速耗竭- - - - - -- - - -至少成倍稀释一抗/二抗(可4~10倍)*注3 --- - - - - - - - - - - - - - ---- - - - --4 抗体-抗原系统敏感性过低- --- - - - - - - 提高抗体浓度/蛋白上样量*注4 - - - - - - - - - - - - - - - ---- - - - --5 转膜不充分/过转- -- -- - - -- - - - - ---- -优化转膜条件*注5 -- - - - - - - - - - - - - - ---- - - - - -6 HRP或底物活性降低---- - - -- - - -- - ----测试活性或选用敏感底物*注6 高背景---- - - - - - - - - - - - - - - -7 HRP过高(背景较高) - -- - - - - - - - - - -- 至少成倍稀释一抗/二抗(可4~10倍)*注7 ---- - - - - - - - - - - - - - --- - - ----8 封闭时间不足- - - - - - - - - - - -- - - - -- 延长封闭时间4度过夜最好*注8 --- - - - - - - - - - - - - - --- - -- -- -9 抗体与封闭液有交叉----- - - - - - - - - - -更换封闭液(如3%BSA的TBST)*注9 --- - - - - - - - - - - - - - - -- - -- - -10 TBST洗脱不足- - - - - - - ---- - --- - - -增加洗脱时间、次数、用量*注10 ---- - - - - - - - - - - - - - -- - -- - --11 暴光时间过长- - - - - ---- - - ------ -- --降低暴光时间*注11 - - - - - - - - - - - - - - - - -- - - ----12 抗原-抗体浓度过高- - - - - - -- --- - - - 降低抗体浓度或蛋白上样量*注12

westernblot详细图解

Western免疫印迹（Western Blot）是将蛋白质转移到膜上，然后利用抗体进行检测的方法。对已知表达蛋白，可用相应抗体作为一抗进行检测，对新基因的表达产物，可通过融合部分的抗体检测。 与Southern或Northern杂交方法类似，但Western Blot采用的是聚丙烯酰胺凝胶电泳，被检测物是蛋白质，“探针”是抗体，“显色”用标记的二抗。 经过PAGE分离的蛋白质样品，转移到固相载体（例如硝酸纤维素薄膜）上，固相载体以非共价键形式吸附蛋白质，且能保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变。以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原，与对应的抗体起免疫反应，再与酶或同位素标记的第二抗体起反应，经过底物显色或放射自显影以

检测电泳分离的特异性目的基因表 达的蛋白成分。该技术也广泛应用 于检测蛋白水平的表达。 实验材料蛋白质样品 试剂、试剂盒丙烯酰胺SDS Tris-HCl β-巯基乙醇 ddH2O 甘氨酸Tris 甲醇PBS NaCl KCl Na2HPO4 KH2PO4 ddH2O 考马斯亮兰乙酸脱脂奶粉硫酸镍胺H2O2 DAB试剂盒 仪器、耗材 电泳仪电泳槽离心机离心管硝酸纤维素 膜匀浆器剪刀移液枪刮棒 实验步骤一、试剂准备 1. SDS-PAGE试剂：见聚丙烯酰胺凝胶电泳实验。 2. 匀浆缓冲液：1.0 M Tris-HCl(pH 6.8) 1.0 ml；10%SDS 6.0 ml；β-巯基乙醇0.2 ml；ddH2O 2.8 ml。 3. 转膜缓冲液：甘氨酸2.9 g；Tris 5.8 g；SDS 0.37 g；甲醇200 ml；加ddH2O定容至1000 ml。

《金融机构内参》2011-3-11

金 融 机 构 内 参 【博览观察】专供金融投资、资管、投行参阅（2011/03/11） ★《投资中的物理学》：就像苹果会落到地面一样，股票市场中疯狂的板块最终会落到均值水平——今年涨多了意味着明年可能要跌，反之则反是。与此同时，即使是获得最好的收益最终也会落到正常的水平——今天的好收成意味着明年可能是坏收成，反之也反是。博格先生说，牛顿的万有引力定律以及适用于各种金融市场上的均值回复，将有助于我们深思熟虑地制定明智的投资策略，然后再用简单的常识来执行它。当我们积累资本的时候，千万要从运用这一概念中受益。…… ★《美国两房改革内幕揭秘》：2011年2月中甸，美国财政部向国会提交了住房金融系统改革报告，这份长达31页的白皮书有三套方案。均显示出美国政府退出房地产抵押贷款市场。两房改革的神秘面纱真正是什么？…… 投资中的物理学 【博览资讯特稿】约翰·博格先生对均值回复（RTM ）原则理解得很独到，他并不只是简单地将之看成一种反趋势策略。博格先生认为，这条来自学术界的理论原则在实际金融市场上是完全适用的，不论是整个股市的相对收益还是绝对收益都证明了这个定律。均值回复代表了金融市场上的某种“万有引力定律”，因为通常收益会很神奇地回到某种均值水平。投资者为了获得长期超额收益，是不是一定要投资于股票市场某几个业绩比较好的板块呢？不是，没有一个持久的系统性偏差会支持某个特定的板块。即使时间长，均值回复也会使得每个板块风水轮流转，只不过每个板块持续的时间不一样而已。 先看成长股和价值股。传统的投资理念认为价值型投资哲学优于成长型投资哲学，这是因为很少有人真正研究过投资历史。市场记录显示，在1937-1968年间成长型投资策略完全占支配地位，是明显的赢家。那时投资于价值型股票所获得的收益只有成长型股票的62%。接下来到1976年左右，价值型股票才开始有了巨大的转机，几乎全部弥补了早期收益的不足。然后又是成长型股票在1977-1980年占据了优势，而1981-1997年是价值型股票业绩突出的时期，到1998年成长型股票又开始崭露头角了。在这整个60年的周期性波动中，投资于价值型股票上的最终收益相当于在成长型股票上的90%。在整个60年的时间中，成长型股票的复利总收益率是11.7%，而价值型股票的复利总收益率是11.5%，差别微乎其微，双方刚好电 邮 版

WesternBlot结果条带分析

W e s t e r n B l o t结果条带 分析 Revised final draft November 26, 2020

W e s t e r n B l o t结果条带全面分析 1.空白 原因：比较多，如果单纯一张没有任何显色，最可能是一抗加成其他抗体，或者二抗种属加错了，比如兔的加成鼠的。 解决办法：仔细检查抗体是否加错，确认转膜没有问题。上面的图片展示的是一点信号都没有，如果是这样大部分情况是抗体加错了。如果中间出现了细微的条带，可能原因是蛋白上样量太少，一抗浓度过低，显色液失效。另外如果转膜出现了问题，比如膜放反了，自然是一个白片。 2.高背景 原因：封闭不够好，一抗浓度高，洗膜时间和次数不够。 解决办法：降低一抗浓度，增加洗膜时间和次数。 3.非特异性条带 原因：一抗非特异性与蛋白结合 解决办法：更换一抗 4.条带中出现边缘规则的白圈 原因：电转中膜和胶之间存在气泡。 解决办法：转膜前去掉膜和胶之间的气泡 5.出现黑点和黑斑 原因：膜上其他部位与一抗或者二抗非特异性结合 解决办法：封闭结束之后要洗。 6.条带拖尾 原因：蛋白量太大，一抗浓度和时间太长 解决办法：根据情况调整蛋白量，同时一抗浓度和时间也可以缩短。 7.出现非均一性背景 原因：膜可能曾经干过 解决办法：在每一步的操作过程中，都需要注意不要让膜干。 8.某个条带变形 原因：SDSPAGE胶中存在气泡或者某不溶性颗粒 解决办法：配胶过程中要小心，使用无杂质的液体。另外配胶用的水，SDS，Tris缓冲液要注意不要有杂质。 9.条带呈哑铃状 原因：配置胶有问题，胶凝固后不均一 解决办法：把胶配好，不合格的胶坚决不用 10.最边缘条带弯曲 原因：电泳电流不均一 解决办法：换用新的电泳槽；不使用两边的两孔 其他问题 （1）蛋白分子量偏高或者偏低。可能是胶的浓度与目的蛋白的浓度不对应。 （2）蛋白质降解。蛋白质降解后很可能会在比原来位置低的地方出现主带，然后会出现一些其他带，最主要特点是所有的条带比正常的都低，并且条带模糊不清晰。 （3）所有条带连成一片没有间隔。原因最可能是上样量过多，其次是样品弥散（比如电泳长时间停止样品弥散）。 （4）整个条带呈“︶”状：凝胶冷却不均一，电泳槽老化。 （5）整个条带呈“︵”：凝胶左右两头没有凝固好 （6）溴酚蓝拖尾：样品溶解不好。 （7）纵向的纹理：上样样品中存在不溶性颗粒 （8）溴酚蓝很粗：浓缩胶浓缩效果不好，可能是浓缩胶太短，或者是浓缩胶配错。

内参即是内部参照

内参即是内部参照，它们在各组织和细胞中的表达相对恒定，在检测基因的表达水平变化时常用它来做参照物。常用的PCR内参有GAPDH 、β- actin 、18sRNA、28sRNA 、B2M、ACTB、SDHA、HPRT1、ARBP内参基因等 正向引物（上游引物）是沿着负链进行不间断延长的 反向引物（下游引物）是沿着正链进行一段段延长的 正链是含有目的基因的那条链。 RT-PCR 为反转录RCR（reverse transcription PCR）和实时PCR（real time PCR）共同的缩写。逆转录PCR，或者称反转录PCR(reverse transcription-PCR, RT-PCR)，是聚合酶链式反应(PCR)的一种广泛应用的变形。在RT-PCR中，一条RNA链被逆转录成为互补DNA，再以此为模板通过PCR进行DNA扩增。 由一条RNA单链转录为互补DNA(cDNA)称作“逆转录”，由依赖RNA的DNA聚合酶（逆转录酶）来完成。随后，DNA的另一条链通过脱氧核苷酸引物和依赖DNA的DNA聚合酶完成，随每个循环倍增，即通常的PCR。原先的RNA模板被RNA酶H降解，留下互补DNA。RT-PCR的指数扩增是一种很灵敏的技术，可以检测很低拷贝数的RNA。RT-PCR广泛应用于遗传病的诊断，并且可以用于定量监测某种RNA的含量。（检测基因表达的方法，参见Northern Blot法。 RT-PCR的关键步骤是在RNA的反转录，要求RNA模版为完整的且不含DNA、蛋白质等杂质。常用的反转录酶有两种，即鸟类成髓细胞性白细胞病毒（avian myeloblastosis virus,AMV）反转录酶和莫罗尼鼠类白血病病毒（moloney murine leukemia vrius,MMLV）反转录酶。 RT-PCR有时候也会指代实时PCR(real-time PCR)。为了与逆转录PCR相区别，通常被写作“定量PCR”(quantitative PCR)或者RTQ-PCR(real-time quantitative PCR)。 3实时PCR 实时PCR(real-time PCR)，属于定量PCR（Q-PCR）的一种，以一定时间内DNA的增幅量为基础进行DNA的定量分析。 real time PCR 的定量使用荧光色素，目前有二种方法。一种是在ds DNA中插入特异的荧光色素，例如SYBR Green荧光染料；另一种使用一种能与增幅DNA序列中特定寡核酸序列相结合的一种荧光探针（probe），如Taqman探针。两种方法原理不同。SYBR Green荧光染料游离时不发光，当反应体系中存在双链DNA时，SYBR Green与双链DNA结合，此时才发光。Taqman探针带有一个荧光基团和一个淬灭基团，荧光基团连接在探针的5’末端，而淬灭基团则在3’末端。PCR扩增时在加入一对引物的同时加入一个特异性的荧光探针，探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收；PCR扩增时，T aq酶的5'－3'外切酶活性将探针酶切降解，使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离，此时荧光基团发出的荧光信号可以被检测到。 real time PCR 与reverse transcription PCR 相结合，能用微量的RNA来找出特定时间、细胞、组织内的特别表达的遗传基因。这两种RT PCR的组合又被称之为“定量RT-PCR

蛋白质印迹法westernblot

蛋白质印迹法 蛋白质印迹法(免疫印迹试验)即Western Blot。它是分子生物学、生物化学和免疫遗传学中常用的一种实验方法。 其基本原理是通过特异性抗体对凝胶电泳处理过的细胞或生物组织样品进行着色。通过分析着色的位置和着色深度获得特定蛋白质在所分析的细胞或组织中表达情况的信息。 蛋白免疫印迹(Western Blot )是将电泳分离后的细胞或组织总蛋白质从凝胶转移到固相支持物NC膜或PVDF膜上，然后用特异性抗体检测某特定抗原的一种蛋白质检测技术，现已广泛应用于基因在蛋白水平的表达研究、抗体活性检测和疾病早期诊断等多个方面。 中文名蛋白质印迹法外文名Western Blot 蛋白免疫印迹Western Blot 类似方法1 Southern Blot 杂交方法 类似方法2 Northern Blot 杂交方法 使用材料聚丙烯酰氨凝胶电泳⑴

原理 与Southern Blot 或Northern Blot 杂交方法类似，但Western Blot法采用的是聚丙烯酰胺凝胶电泳，被检测物是蛋白质，“探针”是抗体,“显色”用标记的二抗。经过PAG（聚丙烯酰胺凝胶电泳）分离的蛋白质样品，转移到固相载体（例如硝酸纤维素薄膜）上，固相载体以非共价键形式吸附蛋白质，且能保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变。以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原，与对应的抗体起免疫反应，再与酶或同位素标记的第二抗体起反应，经过底物显色或放射自显影以检测电泳分离的特异性目的基因表达的蛋白成分。该技术也广泛应用于检测蛋白水平的表达。⑴ 分类 Western Blot 显色的方法主要有以下几种: i. 放射自显影 ii. 底物化学发光ECL iii. 底物荧光ECF iv. 底物DAB呈色

18关于《李翔商业内参》年度金句的清单5.27

18关于《李翔商业内参》年度金句的清单【商业化】 1.传奇歌手莱纳德〃科恩接受采访，被问到有没有觉得自己被商业化时，他说：“当我接受了自己录制唱片，并且进入商业世界的时候，我既没有负罪感，也不觉得快乐，但我可以说，这个体系跟我互相利用。我们彼此合作。我想要把自己的音乐传递给听众，就得屈从游戏规则。因为对于我想做的事情，这是唯一的途径”。2016年11月11日，莱纳德〃科恩去世。就在10月21日，82岁的科恩刚刚发布了新专辑《You Want It Darker》。（2016年5月27日） 李翔：在很长一段时间内，我遭受的最大质疑是，你是否已经完全商业化。 【用户】 2. Line创始人森川亮说：“一件商品，最重要的是质量。但我们不可错误地理解这句话。想提高质量，最关键的是要精准地把握用户需求的本质”；“无论品质有多高，无论功能有多丰富，如果不是用户所需要的，那这些产品就是劣质的，最终只是制造方的自我满足而已。我们决不能为这些东西浪费时间，牺牲速度。”（2016年10月20日） 3.亚马逊创始人杰夫〃贝佐斯说：”我们的客户很忠诚，直到有人提供更好的服务。”（2017年2月27日） 李翔：我这一年，学到的最重要的事情，正是用户思维和用户价值。如何定义用户价值，《李翔商业内参》曾引用过“百度贴吧之父”俞军的一个定义：用户价值＝（新体验—旧体验）—替代成本。新旧体验差是产品核心价值，替代成本包括认知成本、获取成本和使用成本。运营可以降低替代成本。但替代成本最多也就降到零。因此，新旧体验差越大，产品

的用户价值才越大。 【速度】 4.作家乔舒亚〃雷默说：“无法实现速度自由的人和机构，将于未来失之交臂。快的人和慢的之间不存在平等。”（2017年5月15日） 5.黑石集团董事局主席苏世民说：“生活在中国是很有挑战的，因为中国发生的变化太多。中国有很多让人取得成功的机会，因为没什么是一成不变的。世界其他地方的生活没有这种快速变化的节奏，而在中国这却稀松平常。这是中国独特的竞争优势，你们自己甚至都没有意识到，因为你们就生活在这个国家。”（2017年5月4日） 6.福特汽车董事会执行主席比尔〃福特（BillFord）说，大公司也必须快速决策，“时钟速度只会越来越快”。（2017年5月26日）李翔：我曾开玩笑说，自从开始写这个专栏，就进入了狗年：一年相当于七年。移动互联网带来的随时在线，让整个世界都加速了。 【自律和拒绝】 7.亚力克斯〃弗格森：“有些人就是比别人更善于不去理睬世界上的其他东西，那意味着他们有更多的时间培养他们的天赋，或者提高他们的团队”；“我还没碰到过有哪个取得巨大成功的人，没有把自己封闭于其他人的需求之外，并且放弃消遣。”（2016年12月30日） 8.柳传志说：“诚信不光是一种态度和意愿，也包含有能力。屡屡有意愿却达不到效果，一样是不诚信。”经常有人来找柳传志说，老柳，这件事情你一来肯定就成了。柳传志回答说：“我之所以能做成的原因，就是因为我不都做。你要是答应什么都做，就会变成什么都做不到。”（2016年12月14日） 李翔：虽然我已经把自律和拒绝列入了2017年的精进清单，但目前

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Western免疫印迹（Western Blot） 是将蛋白质转移到膜上，然后利用 抗体进行检测的方法。对已知表达 蛋白，可用相应抗体作为一抗进行 检测，对新基因的表达产物，可通 过融合部分的抗体检测。 与Southern或Northern杂交方法 类似，但Western Blot采用的是聚 丙烯酰胺凝胶电泳，被检测物是蛋 白质，“探针”是抗体，“显色”用标记 的二抗。 经过PAGE分离的蛋白质样品，转 移到固相载体（例如硝酸纤维素薄 膜）上，固相载体以非共价键形式 吸附蛋白质，且能保持电泳分离的 多肽类型及其生物学活性不变。以 固相载体上的蛋白质或多肽作为抗 原，与对应的抗体起免疫反应，再 与酶或同位素标记的第二抗体起反 应，经过底物显色或放射自显影以 检测电泳分离的特异性目的基因表 达的蛋白成分。该技术也广泛应用 于检测蛋白水平的表达。 实验材料蛋白质样品 试剂、试剂盒丙烯酰胺SDS Tris-HCl β-巯基乙醇 ddH2O 甘氨酸Tris 甲醇PBS NaCl KCl Na2HPO4 KH2PO4 ddH2O 考马斯亮兰乙酸脱脂奶粉硫酸镍胺H2O2 DAB试剂盒 仪器、耗材电泳仪电泳槽离心机离心管硝酸纤维素膜匀浆器剪刀移液枪刮棒 实验步骤一、试剂准备 1. SDS-PAGE试剂：见聚丙烯酰胺凝胶电泳实验。 2. 匀浆缓冲液：1.0 M Tris-HCl(pH 6.8) 1.0 ml；10%SDS 6.0 ml；β-巯基乙醇0.2 ml；ddH2O 2.8 ml。 3. 转膜缓冲液：甘氨酸2.9 g；Tris 5.8 g；

SDS 0.37 g；甲醇200 ml；加ddH2O定容至1000 ml。 4. 0.01 M PBS(pH7.4)：NaCl 8.0 g；KCl 0.2 g；Na2HPO4 1.44 g；KH2PO4 0.24 g；加ddH2O至1000 ml。 5. 膜染色液：考马斯亮兰0.2 g；甲醇80 ml；乙酸2 ml；ddH2O118 ml。包被液（5%脱脂奶粉，现配）：脱脂奶粉1.0 g 溶于20 ml的0.01 M PBS中。 6. 显色液：DAB 6.0 mg；0.01 M PBS 10.0 ml；硫酸镍胺0.1 ml；H2021.0 μl。 二、蛋白样品制备 1. 单层贴壁细胞总蛋白的提取 （1）倒掉培养液，并将瓶倒扣在吸水纸上使吸水纸吸干培养液（或将瓶直立放置一会儿使残余培养液流到瓶底然后再用移液器将其吸走）。 （2）每瓶细胞加3 ml 4℃预冷的PBS （0.01M pH7.2～7.3）。平放轻轻摇动1 min 洗涤细胞，然后弃去洗液。重复以上操作两次，共洗细胞三次以洗去培养液。将PBS弃净后把培养瓶置于冰上。 （3）按1ml裂解液加10 μl PMSF（100 mM），摇匀置于冰上。（PMSF要摇匀至无结晶时才可与裂解液混合。） （4）每瓶细胞加400 μl含PMSF的裂解液，于冰上裂解30 min，为使细胞充分裂解培养瓶要经常来回摇动。 （5）裂解完后，用干净的刮棒将细胞刮于培养瓶的一侧（动作要快），然后用枪将细胞碎片和裂解液移至1.5 ml离心管中。（整个操作尽量在冰上进行。） （6）于4℃下12000 rpm离心5 min。（提

western-blot条带分析及解决方法

*注1其具体问题有二：一是背景较高，二是没有条带?形成机制为条带处HRP很快将底物耗竭，则不发光不使胶片感光而为白色，周围因背景H R P较低而持续发光一段时间使胶片感光为黑色。这种常见于高浓度抗体并且封闭/洗脱不好的情况下。如果没有背景则就是原因3的现象。在暗室可以看到

条带周围荧光而条带处为暗。如是则要么通过降低抗体解决，要么动作迅速早期未耗竭底物时压片，否则一旦耗竭通过减少压片时间不能解决问题。也可以过一段时间鼿RP稍减后重加底物迅速压片。还有另外一种反影现象就是压出条带粗大模糊，但条带中心是空的白色，原因和上面的一样，主要是条带中心耗竭底物引起的，也可以在暗室看到中空的荧光带，但与上面的区别主要在于特异性要好一些，若继续发展则就是原因3的现象。其分析和解决同上。 *注2其原因主要是HRP太高超速催化底物生成的产物使膜发黄，压出的片子可以是正常的或和原因1或原因3的现象同时存在，只是一种现象，在压过的膜可以看出来（只在加底物后一段时间出现，几小时后可能还会消退，有时甚至刚加底物1~2min就可以看出来，所以要把握时机）。如果没有 达到原因1和原因3的程度，那么这种情况一定能够看到很强的荧光，是一种良好的状态，是我们所期盼的。如果压出正常片子而不出现原因1和原因3的现象，可以不予处理。但因为荧光太强极易导致条带增粗变大，所以也可以不稀释抗体而通过调整压片时间来解决，一般压10s~30s，甚至可以3~5s，即时根据结果在暗室调整，荧光持续时间长的话都可连续压十数张片子而效果良好。但也有这种情况，就是由于HRP过强无论怎么减少压片时间条带都依然粗大（如果时间过短如<3s则可因感光不足导致条带太淡，这样就不可取了，但依然是粗大的、非条带的本来面目），那么如果想获得漂亮条带则必须通过降低抗体浓度（减少上样量很不稳定且能力有限，故很少使用）来解决。原因1和3若如是则解决也是一样的。 *注3这是与1类似但抗体特异性较好时的一种表现，经常与下面的原因4、5、6混淆，特别需要注意。主要出现在HRP极高的情况下，来不及压片就已耗竭底物，往往伴有原因2的现象。可通过加入底物后迅速进入暗室观察荧光确定，也可以根据原因2的现象确定，以区分于原因4、5、6。 除非动作迅速早期未耗竭底物时压片，否则一旦耗竭通过减少压片时间不能解决问题。也可以过一段时间待HRP稍减后TBST简单洗膜重新加底物压片。这种情况下一/二抗稀释可高达10倍而依然荧光明显。 *注4提高抗体上样量以及下述的使用敏感底物/延长压片时间比较简单，在此不赘述，只提醒一下随抗体浓度增高背景和非特异性可能会增加。关于上样量的极限在此发表我的看法：对于裂解的混合蛋白以上样孔底面积（平方毫米）乘30ug作为极限上样量，而落实到每一个具体条带（同一分子量的 所有蛋白或仅做单一蛋白电泳），则以0.3ug/平方毫米底面积作为极限上样量。（见《抗体技术实验指南》的免疫印迹一章），超过此量可能会导致条带变形。条带信号弱可以通过加大上样量/提高抗体浓度/使用敏感底物/延长压片时间解决。但实际上样量的极限并不以我说的极限上样量为准，因为这个极限上样量是确保所有分子量的条带都跑的很漂亮的极限，而上样超量的表现是随量的加大变形的条带由低分子量逐渐往高分子量延伸。 所以western极限上样量的真正操作标准是以目的条带不变形作为极限。比如对于150kd，完全可以超出我所说的极限上样量的2倍而不变形（此时中低分子量条带早已融合或挤为棒槌形了）

Westernblot实验步骤及注意事项

Westernblot实验步骤及注意事项 Westernblot 实验步骤 1. 组织块称重 2. 利用液氮、研钵粉碎组织块 3. 加入RIPA缓冲液（每克组织3 ml RIPA），PMSF（每克组织30μl，10 mg/ml PMSF），利用Polytron进一步匀浆（15,000转/分*1分钟）维持4℃ 4. 加入PMSF（每克组织30μl，10 mg/ml PMSF），冰上孵育30分钟 5. 移入离心管4℃约20,000 g（约15,000转）15分钟 6. 上清液为细胞裂解液可分装-20℃保存 7. 进行Bradford比色法测定蛋白质浓度 8. 取相同质量的细胞裂解液（体积*蛋白质浓度），并加等体积的2×电泳加样缓冲液 9. 沸水浴中3分钟 10. 上样 11. 电泳（浓缩胶20mA，分离胶35mA） 12. 电转膜仪转膜（100mA 40分钟） 13. 膜用丽春红染色，胶用考马斯亮蓝染色 14. Westernblot 试剂盒显色 15. 分析比较记录 western blot的实验步骤及注意事项的资料 1. 把聚丙烯酰胺凝胶中的蛋白质电泳转移到硝酸纤维膜上。 1）转移缓冲液洗涤凝胶和硝酸纤维素膜，将硝酸纤维素膜铺在凝胶上，用5ml移液管在凝胶上来回滚动去除所有的气泡。 2）在凝胶/滤膜外再包一张3mm滤纸（预先用转移缓冲液浸湿），将凝胶夹在中间，保持湿润和没有气泡。薄膜滤纸按照厂家建议方法放入电泳装置中，凝胶面向阴极。/凝胶/）将此滤纸3．

4）将上述装置放入缓冲液槽中，并灌满转移缓冲液以淹没凝胶。 5）按照厂家所示接通电源开始电泳转移。 6）转移结束后，取出薄膜和凝胶，弃去凝胶。 2. 将薄膜漂在氨基黑中快速染色，直至分子量标准显现时取出，记录下标准位置。 3. 用100ml水洗涤纤维素膜，必要时可用脱色缓冲液。 4. 膜置印迹缓冲液中于37℃保温1小时。 5. 室温下，用PBS-Tween缓冲液洗涤薄膜。 6. 用封口机将薄膜封入塑料袋中，尽可能不留空气。 7．袋的一角剪一缓冲液的小口，用透析袋夹紧。 8．混合：NGS(100微升)，印迹缓冲液中的抗体（10毫升），加在装薄膜的袋中，于室温下摇动2小时（或4℃过夜） 9．用总体积300ml PBS-Tween缓冲液，分4次在一浅盘中洗涤薄膜，每次75ml。 10．将连接生物素的羊抗兔IgG（40微升溶于10毫升印迹缓冲液/100微升NGS）加在袋内，于室温下摇动1小时。 11．按步骤9洗涤。 12．加入抗生素蛋白-HRP（40微升溶于10毫升印迹缓冲液/100微升NGS），于室温下摇动。 注意事项： western blot中转移在膜上的蛋白处于变性状态，空间结构改变，因此那些识别空间表位的抗体不能用于western blot检测。这种情况可以将表达目的蛋白的细胞或细胞裂解液中的所有蛋白先生物素化，再用酶标记亲和素进行western blot。实验中取胶和膜需带手套。 Western实验步骤 Western，也称Western blot、Western blotting、Western印迹，是用抗体检测蛋白的重要方法之一。Western 可以参 考如下步骤进行操作。 1. 收集蛋白样品(Protein sample preparation) O 可以使用适当的裂解液，例如碧云天生产的Western及IP细胞裂解液，裂解贴壁细胞、悬浮细胞或组织样品。对于某些特定的亚 细胞组份蛋白，例如细胞核蛋白、细胞浆蛋白、线粒体蛋白等，可以参考相关文献提取这些亚细胞组份蛋白，也可以使用试剂盒 进行抽提，例如碧云天生产的细胞核蛋白与细胞浆蛋白抽提试剂盒。 O 收集完蛋白样品后，为确保每个蛋白样品的上样量一致，需要测定每个蛋白样品的蛋白浓度。根据所使用的裂解液的不同，需要 采用适当的蛋白浓度测定方法。因为不同的蛋白浓度测定方法对于一些去垢剂和还原剂等的兼容性差别很大。如果使用碧云天生

股票操盘手 培训教程(内参：2011版)

机构股票操盘手培训教程 控：ZI 1118 号 (内参) 重新编辑：2011-9-26 第一节：操盘策划书 第二节：如何在熊市砸盘打压建仓 第三节：如何洗出散户 第四节：如何在不控盘的状态下参与竞争？结合对方主力行为看盘、跟进。 第五节：庄家介绍、分类、跟庄、破庄 第六节：游资操盘手法介绍、如何跟随游资做短线？ 第七节：波段理论最新实战用法 操盘策划书 这份策划书可令投资者对主力如何在证券市场上呼风唤雨及其操盘思路,策略和手法有一个大致的了解，对投资者识破主力在股价炒作过程中设置的美丽的陷阱大有助益。因为原操盘方案涉及太多内容、太多细节和专业术语，本人只能节选该操盘方案的精彩部分，并对该内容作了整理和删改。 这份方案中的前言是这样说的，证券市场既是一个“非理性的市场”，又是一个只有少数人突出成功的市场；既是政府干预的市场，又是主力引导潮流的市场。因此，作为一名操盘手，不但必须具有超凡的操盘能力，而且必须具有高瞻远瞩、谋划大局和掌控局势的能力。 第一、能够大体准确地预见未来大盘总体趋势，从而完成总体布局和运作周期； 第二、能够把握并成功地利用市场“非理性的狂热”和“非理性的恐惧”的情绪； 第三、能够立足最坏最危险的角度，制定周密的投资策略和风险控制方案； 第四、能够洞察未来的重大金融政策趋势的动向，准确估量其正负面影响，进行一系列高超的运作。 厦门空港（600897）操盘计划书 前奏： 一、选定目标个股： 某上市公司总股本1.8亿股，流通股5000万股。盘子适中，流通市值较低。法人股较集中，第一大股东持有32%股权。前100名流通股东的筹码相当分散，目前还没有其他机构介入。公司的财务状况和经营管理等基本面总体较稳健，现金流较充沛，资产负债率较低(30%)，资产出让容易等。目前股价较低，介入风险相当低。

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条带周围荧光而条带处为暗。如是则要么通过降低抗体解决，要么动作迅速早期未耗竭底物时压片，否则一旦耗竭通过减少压片时间不能解决问题。也可以过一段时间鼿RP稍减后重加底物迅速压片。还有另外一种反影现象就是压出条带粗大模糊，但条带中心是空的白色，原因和上面的一样，主要是条带中心耗竭底物引起的，也可以在暗室看到中空的荧光带，但与上面的区别主要在于特异性要好一些，若继续发展则就是原因3的现象。其分析和解决同上。 *注2 其原因主要是HRP太高超速催化底物生成的产物使膜发黄,压出的片子可以是正常的或和原因1或原因3的现象同时存在，只是一种现象，在压过的膜可以看出来（只在加底物后一段时间出现，几小时后可能还会消退，有时甚至刚加底物1~2min就可以看出来，所以要把握时机）。如果没有达到原因1和原因3的程度，那么这种情况一定能够看到很强的荧光，是一种良好的状态,是我们所期盼的。如果压出正常片子而不出现原因1和原因3的现象,可以不予处理。但因为荧光太强极易导致条带增粗变大，所以也可以不稀释抗体而通过调整压片时间来解决，一般压10s~30s，甚至可以3~5s，即时根据结果在暗室调整,荧光持续时间长的话都可连续压十数张片子而效果良好。但也有这种情况，就是由于HRP过强无论怎么减少压片时间条带都依然粗大（如果时间过短如<3s则可因感光不足导致条带太淡，这样就不可取了，但依然是粗大的、非条带的本来面目），那么如果想获得漂亮条带则必须通过降低抗体浓度（减少上样量很不稳定且能力有限，故很少使用）来解决。原因1和3若如是则解决也是一样的。 *注3 这是与1类似但抗体特异性较好时的一种表现，经常与下面的原因4、5、6混淆，特别需要注意。主要出现在HRP极高的情况下，来不及压片就已耗竭底物，往往伴有原因2的现象。可通过加入底物后迅速进入暗室观察荧光确定，也可以根据原因2的现象确定，以区分于原因4、5、6。除非动作迅速早期未耗竭底物时压片，否则一旦耗竭通过减少压片时间不能解决问题。也可以过一段时间待HRP稍减后TBST简单洗膜重新加底物压片。这种情况下一/二抗稀释可高达10倍而依然荧光明显。 *注4 提高抗体上样量以及下述的使用敏感底物/延长压片时间比较简单,在此不赘述，只提醒一下随抗体浓度增高背景和非特异性可能会增加。关于上样量的极限在此发表我的看法：对于裂解的混合蛋白以上样孔底面积(平方毫米)乘30ug作为极限上样量，而落实到每一个具体条带（同一分子量的所有蛋白或仅做单一蛋白电泳），则以0.3ug/平方毫米底面积作为极限上样量。(见《抗体技术实验指南》的免疫印迹一章)，超过此量可能会导致条带变形。条带信号弱可以通过加大上样量/提高抗体浓度/使用敏感底物/延长压片时间解决。但实际上样量的极限并不以我说的极限上样量为准，因为这个极限上样量是确保所有分子量的条带都跑的很漂亮的极限,而上样超量的表现是随量的加大变形的条带由低分子量逐渐往高分子量延伸。所以western极限上样量的真正操作标准是以目的条带不变形作为极限。比如对于150kd，完全可以超出我所说的极限上样量的2倍而不变形（此时中低分子量条带早已融合或挤为棒槌形了） 文案大全

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Western Blot详解(原理、分类、试剂、步骤及问题解答) Western免疫印迹（Western Blot）是将蛋白质转移到膜上，然后利用抗体进行检测。对已知表达蛋白，可用相应抗体作为一抗进行检测，对新基因的表达产物，可通过融合部分的抗体检测。 本文主要通过以下几个方面来详细地介绍一下Western Blot技术: 一、原理 二、分类 i.放射自显影 ii.底物化学发光ECL ECF iv.底物DAB呈色 三、主要试剂 四、主要步骤 五、实验常见的问题指南 1.参考书推荐 2.针对样品的常见问题 3.抗体 4.滤纸、胶和膜的问题 的相关疑问 6.染色的选择 7.参照的疑问

8.缓冲液配方的常见问题 9.条件的摸索 10.方法的介绍 11.结果分析 一、原理 与Southern或Northern杂交方法类似，但Western Blot采用的是聚丙烯酰胺凝胶电泳，被检测物是蛋白质，“探针”是抗体，“显色”用标记的二抗。经过PAGE分离的蛋白质样品，转移到固相载体（例如硝酸纤维素薄膜）上，固相载体以非共价键形式吸附蛋白质，且能保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变。以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原，与对应的抗体起免疫反应，再与酶或同位素标记的第二抗体起反应，经过底物显色或放射自显影以检测电泳分离的特异性目的基因表达的蛋白成分。该技术也广泛应用于检测蛋白水平的表达。 二、分类 现常用的有底物化学发光ECL和底物DAB呈色，体同水平和实验条件的是用第一种方法，目前发表文章通常是用底物化学发光ECL。只要买现成的试剂盒就行，操作也比较简单，原理如下（二抗用HRP标记）：反应底物为过氧化物+鲁米诺，如遇到HRP，即发光，可使胶片曝光，就可洗出条带。

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