荧光显微镜和普通显微镜有何区别

荧光显微镜和普通显微镜有何区别

细胞中有些物质，如叶绿素等，受紫外线照射后可发荧光；另有一些物质本身虽不

能发荧光，但如果用荧光染料或荧光抗体染色后，经紫外线照射亦可发荧光，荧光显微镜就

是对这类物质进行定性和定量研究的工具之一。

荧光显微镜和普通显微镜有以下的区别：

1.照明方式通常为落射式，即光源通过物镜投射于样品上；

2.光源为紫外光，波长较短，分辨力高于普通显微镜；

3.有两个特殊的滤光片，光源前的用以滤除可见光，目镜和物镜之间的用于滤除紫外线，用以保护人目。荧光显微镜照片（微管呈绿色、微丝红色、核蓝色）

倒置荧光显微镜配置如下：

用途：

GFM-800 系列无限远倒置荧光显微镜是由倒置生物显微镜系统和落射荧光显微镜系统组成。采用优良的无限远光学系统，操作性Array能按人机工程学要求设计，紧凑稳定的高刚性

主体，充分体现了显微操作的防振要求, 旋转摆

入摆出式聚光系统，使操作过程中更加舒适与

轻松。GFM-800倒置荧光显微镜配有无限远长

工作距离平场消色差物镜、大视野目镜、长工

作距离聚光镜、同时配有相衬装置及长工作距

离平场相衬物镜可对高培养瓶或培养皿内进行

无沾染培养显微观察的特点;GFM-800系列倒

置荧光显微镜系统采用模块化设计理念，可以

安全、快揵地调整照明系统，切换荧光滤色片

组件。特别适用于对活体细胞和组织、流质、

沉淀物等进行显微研究，是生物学，细胞学，

肿瘤学，遗传学，免疫学等研究工作的理想仪

器。可供科研、高校、医疗、防疫和农牧等部

门使用。

成像系统简介：

GFM-800P 倒置电脑型荧光显微镜GFM-800S倒置数码荧光显微镜是将精锐的光学显微镜技术、先进的光电转换技术、尖端的计算机图像处理技术完美地结合在一起而开发研制成功的一项高科技产品。可以在计算机显示器上很方便地观察荧光图像，从而对荧光图谱进行分分析，评级等对图片进行输出、打印。

技术规格：

1．目镜：大视野目镜10X(Ф22) 1对对中望远镜1个（相衬装置用）

2．物镜

3．总放大倍数：100X~400X

4．聚光镜：特长工作距离聚光镜（带相衬装置）：工作距离50mm

5．固定载物台尺寸：227mmX208mm.

6．移动范围：纵向77mm，横向114mm

7．玻璃圆载物台板尺寸：Ф118mm.

培养皿托板一内槽尺寸：86mm（宽）X129.5mm（长），可适配圆形培养皿Ф87.5mm 培养皿托板二内槽尺寸：34mm（宽）X77.5mm（长），可适配圆形培养皿Ф68.5mm 培养皿托板三内槽尺寸：57mm（宽）X82mm（长）

8．调焦机构：同轴粗微动调焦系统，带限位和调节松紧装置；微动手轮格值为：0.002 mm 9．目镜筒：45?倾斜,瞳距调节范围53~75mm.

10．照明系统：A.透射照明光源6V30W 卤素灯(亮度可调) 磨砂玻璃，蓝、绿滤色片

B.落射荧光光源100W 超高压直流汞灯，汞灯电源箱(110V 或220V) 11．激发滤色片组：

紫光发片波长：330nm~400nm 发射片波长：425nm

紫外激发片波长：395nm~415nm 发射片波长：455nm

蓝光激发片波长：420nm~485nm 发射片波长：515nm

绿光激发片波长：460nm~550nm 发射片波长：590nm

系统配套件：

电脑型倒置荧光显微镜(GFM-800P): 1.倒置荧光显微镜2.适配镜 3.摄像器(CCD)

4.A/D(图像采集)

5.计算机(选配)

数码型倒置荧光显微镜(GFM-800S): 1、倒置荧光显微镜2、适配镜3、数码相机

仪器选配件：1、分划刻度目镜10X(Ф22) 物镜：5X 60X ) 4、300万像素成像器

2、超长工作距离聚光镜：工作距离70mm 5、细胞分析软件

3、长工作距离聚光镜（带相衬装置）：工作距离30mm.

显微镜荧光波长详解

人肉眼对光源波长的颜色感觉红色770-622 nm 橙色622~597 nm 黄色597~577 nm 绿色577~492 nm 蓝靛色492～455nm 紫色455～350nm

?常见显微镜滤光片的波长 在激发波长在Ex范围内才能被激发，只有发射光波长大于BA/EM才能被观察到，背景光的波长只有大于DM才能被观察到。 红色滤光片G-2A Ex 510-560 DM 575 BA 590 绿色滤光片B-2A Ex 450-490 DM 505 BA 520 蓝色滤光片UV-2A Ex 330-380 DM 400 BA 420 ?其它荧光染料介绍 【菁类染料-Cyanine dyes(Cy2,?Cy3,?Cy5)】 Cy2耦联基团激发波长为492nm，发光为波长510nm的绿色可见光。Cy2和FITC使用相同的滤波片。由于Cy2比FITC在光下更稳定。要避免使用含有磷酸化的苯二胺的封片剂，因为这种抗淬灭剂和Cy2反应，在染色片储存后会导致荧光微弱和扩散。Cy3和Cy5比其他的荧光团探针要更亮，更稳定，背景更弱。Cy3耦联基团激发光的最大波长为550nm，最强发射光为570nm。因为激发光和发射光波长很接近TRITC, 在荧光显微镜中，可使用和TRITC一样的滤波片。

Cy3在氩光灯(514nm或528nm)下可以被激发出50％的光强，在氦氖灯(543nm)或者汞灯(546nm)下则约75％。Cy3可以和荧光素一起作双标。Cy3还可以和Cy5一起在共聚焦显微镜实验中作多标记。Cy5耦联基团的激发波长最大650nm，发光波长最大670nm。在氪氩灯(647nm)下它们可被激发出98％的荧光，在氦氖灯下(633nm)为63％。Cy5可以和很多其他的荧光基团一起用在多标记的实验中。由于它的最大发射波长在670nm，Cy5很难用裸眼观察，而且不能用汞灯作理想的激发。通常观察Cy5时采用具有合适激发光和远红外检测器的共聚焦显微镜。在水相封片剂中应当加入抗淬灭剂。使用传统的表面荧光显微镜时，不推荐使用Cy5。 【藻红蛋白或藻胆色素蛋白-Phycoerythrin(PE)荧光标记二抗】 存在于被称为藻红的多聚微粒中，位于叶绿素的反应中心，在自然结构中，藻红蛋白吸收光能，吸收后转化成能量，供其发育生长。当藻红蛋白被分离和纯化后，其蛋白质变得具有很强的荧光，能吸收不同波长的光，发出亮红色的荧光，此时不再接受任何外来的光，也不能转移光能。藻红蛋白PE的吸收波长范围较广，最大的吸收波长为566nm，最大的发射波长为574nm。藻红蛋白作为荧光标记物具有以下优点：首先具有强的长波长激发和发射荧光，可避免来自其他生物材料荧光的干扰；并且具有极高的发射量子产率；另外PE具有非常高的水溶性而且与许多生物学或合成材料的多位点稳定交联。【Aminomethylcoumarin Acetate (AMCA)】 耦联的AMCA吸收光波长最大为350nm，发荧光则为450nm。对于荧光显微镜来说，AMCA可以用汞灯来激发，用紫外滤板来观察。由于AMCA的信号相对较弱，单标实验中不推荐使用AMCA。AMCA和荧光素的荧光波长只有很小的重叠范围，而和发出长波长荧光的荧光基团没有或者只有极少的重叠，因此它最常用于多标记实验中，比如免疫荧光显微镜和流式细胞仪。由于人眼不能很好的检测蓝色荧光，在多标记的实验中，AMCA耦联的二抗应当被用于检测大量的抗原。AMCA和荧光素一样很快淬灭，使用抗淬灭剂可以减轻。且由于肉眼不能很好的检测AMCA所激发的蓝色荧光，因而AMCA耦联的二抗更适用于检测大量存在的抗原。如果使用在流式细胞仪中，AMCA可以用汞灯或者水冷却的氩光灯激发，因为它们发出的光线是在光谱的紫外区。 注：由于观察荧光需要一定波长的激发光，必须根据实验室已有的仪器可发光的波段进行选择。另外，多标记中对探针色彩区分程度的要求。例如，若丹明红-X (RRX)和德克萨斯红(TR)荧光素的区别就比四甲基若丹明(TRITC)或者Cy3的区别明显。如果对灵敏度有更高的要求，则Cy3和Cy5就比其他的荧光团探针要亮。 西美杰备有全面的二抗现货产品并能提供最完整的二抗产品线。主要二抗品牌为全球最大的二抗和底物生产厂商KPL以及前沿抗体生产商ProteinTech。针对荧光标记二抗，有FITC、TRITC、Rhodamine、PE、Cy3/5、AMCA、Dylight等多种荧光标记二抗；按照检测物种分，有抗人、大鼠、小鼠、猪、驴、绵羊、山羊、小鸡、马、兔、仓鼠、狗、牛，以及多种细菌类二抗；另外，还有IgG、IgA、IgM以及IgG(Fc)、IgG(ab’)2等不同类型抗体。 The role of filters in epi-fluorescence microscopy 在激发波长在Ex范围内才能被激发，只有发射光波长大于BA/EM才能被观察到，背景

Nikon ECLIPSE Ti倒置荧光显微镜使用说明

Nikon ECLIPSE Ti倒置荧光显微镜使用说明 操作步骤： 本显微镜的荧光光路与明视场（相差、DIC也属明视场）光路相对独立。当使用明视场时，无需打开荧光光源，进打开总电源即可。当使用荧光观察时，可同时打开总电源和荧光电源。 明视场观察： 1.开机：按动总电源开关“1”处接通电源，此时开关和指示灯点亮，打开显微镜底座左侧的透射照明器开关，从小到大调节照明器开关下方的亮度调节旋钮，使照明亮度适当。 2.首先将聚光器模板A放入光路，用10×物镜对样品进行对焦，调节目镜的屈光度调节环，然后换用40×物镜观察样品。 3.关机：将亮度调节旋钮旋至亮度最暗位置，关掉显微镜底座左侧的透射照明器开关，然后按动总电源开关“0”处关闭电源。 DIC微分干涉观察： 开机、关机等与明视场观察相同，区别是要使用聚光器相对应的DIC模板N1及起偏器、检偏器，将其放入光路后，再使用专用的银白色DIC物镜对焦观察。在观察过程中可旋转起偏器，达到最佳的观察效果。 相差观察： 开机、关机等与明视场观察相同，区别是要使用聚光器相对应的相差模板PH1。 荧光观察： 1.开机：先打开荧光灯电源开关，然后按住电源开关上方的荧光灯激发按钮3秒钟后松开，即可见荧光灯点亮。 2.打开荧光转盘上的荧光拨杆至“0”位置，此时荧光光路打开。旋转荧光转盘，转入所对应的滤光片位置即可进行荧光观察；在观察过程中可插入位于荧光灯源前方的减光片，以改变荧光强度，减弱对活细胞样品的损伤。 3.关机：直接关掉荧光灯电源开关即可。 注意事项： 1.短时间内频繁开关荧光灯电源，将极大的缩短荧光灯寿命。 2.荧光光源打开后即可使用，但必须使用20分钟才可以关闭；关闭30分钟以后才可以再次打开，否则会导致荧光灯损坏。 3.不要同时反方向转动显微镜左右两侧的调焦钮，否则会导致显微镜损坏。 4.粗动调焦钮达到限定位置后，如果继续向同一方向旋转会引起显微镜故障。请不要旋转过度。 5.显微镜光源在工作时会产生高温，因此小心不要接触光源以防烫伤，也不要将易燃品如纸张、布、塑料和酒精等放置于光源附近。

实验三 叶绿体的分离与荧光观察

实验三叶绿体的分离与荧光观察 一、实验目的 1．了解差速离心法分离细胞成分的一般原理和方法。 2．掌握从植物叶组织中分离叶绿体的方法。 3．熟悉荧光显微镜的使用方法，并观察叶绿体的自发荧光和次生荧光。 4．熟悉利用叶绿体得率来测量叶绿素含量。 二、实验原理 叶绿体是是植物细胞中由双层膜围成，含有叶绿素能进行光合作用的能量转换细胞器。由于具有这一重要功能，所以它一直是植物学、细胞生物学和遗传学等的重要研究对象。 植物细胞被细胞壁所包围，因此实验中必须破碎细胞壁的同时保持叶绿体的完整。叶绿体是植物细胞中较大的一种细胞器。将组织匀浆后悬浮在等渗介质中进行差速离心，是分离叶绿体等细胞器的常用方法。 差速离心就是根据一个颗粒在离心场中的沉降速率取决于颗粒的大小、形状和密度，及离心力以及悬浮介质的粘度等因素进行的。在一给定的离心场中，同一时间内，密度和大小不同的颗粒其沉降速率不同。依次增加离心力和离心时间，就能够使非均一悬浮液中的颗粒按其大小、密度先后分批沉降在离心管底部，分批收集即可获得各种亚细胞组分。 叶绿体的分离应在等渗溶液（0.35 mol/L氯化钠或0.4 mol/L蔗糖溶液）中进行，以免渗透压的改变使叶绿体受到损坏。先将匀浆液在1 000 rpm的条件下离心2 min（以去除其中的组织残渣和一些未被破碎的完整细胞），然后在 3 000 rpm的条件下离心5 min，即可获得沉淀的叶绿体（混有部分细胞核）。分离过程最好在0～4℃的条件下进行；如果在室温下，要迅速分离和观察。 有些生物体内的物质受激光照射后可直接发出荧光，称为自发荧光（或直接荧光），有的生物材料本身不发荧光，但它吸收荧光染料后同样也能发出荧光，这种荧光为次生荧光（或间接荧光）。叶绿体含有的叶绿素发出火红色荧光属于自发荧光，叶绿体吸附吖啶橙后可发桔红色荧光属于次生荧光。 三、实验仪器、材料和试剂 1．设备与器材

电子显微镜的景深和显微镜的分辨率

电子显微镜的景深和显微镜的分辨率 显微镜由于电子的波动性，当它通过小孔光阑时会发生衍射现象。衍射结果表现为每个物点形成的像是一个圆斑(周围的副光环可忽略不计)。定义这个衍射圆斑的半径为衍射像差。在像方或物方可分别表示为: (Ar&ff),=0.611/a(1一22a) (1rdff)o=0.61A/ao(1一22b) 式中各符号的意义同前。可以看出加大光阑孔径角as，可以减小衍射差。但实际工作中还应注意这样会带来的不利影响。 景深和焦探(11) 景深就是在保持像清晰的前提下，可允许物面在轴上的移动距离，或者说可允许物上不同部位处的凹凸差。根据图1-10，理想情况下物点P成像在Q点.如果物面在P点前后P’P"之间移动，则在Q看到的物有一定横向宽度。如果透镜有各种像差。该系统实际存在一个对物的可分辨极限(分辨率8)。显微镜价格只要P’P,,间平面上的物点宽度小于或等于s，则在Q处的成像效果与P点处几何物点造成的像斑是相同的，即其清晰度相同。因此可允许的物在轴上最大距离PP"称景深Do，它由下式定出: D0二 (1一23) 式中d一电子光学系统对物的分辨率; ao一电子束的物方有效孔径角. 对于100kV的电镜，偏光显微镜如果分辨率为lnm，物镜孔径角为5X10-1rad，则景深Do=200nm.这表示样品厚度或表面凹凸起伏不超过200nm时，能得到均匀清晰的图像.由此可见景深也常常成为对样品厚度的限制因素之一。

把景深这一特性转换到像方便可得到焦深Df。它就是为了得到清晰度相同的像，可允许的图像显示或记录平面的轴向位移量。参照(1一23)可得: Df=B;/a(1一24) 式中S;一像方的分辨率;a;一电子束的像方有效孔径角。 显微镜像方分辨率S;受观察荧光屏的分辨率所限制。通常荧光屏的分辨率为505m。如电镜最高放大倍数M=10`X，电子束孔径角ao=5X10-’rad，则最长焦深(D1),o,==100M。即使在最低放大倍数M=10’X，相应的ao=1X10-’rad时，最低焦深(Df).二50cm。可见电镜的焦深值很大.这就说明了在透射电镜中为什么我们只对荧光屏调焦，而把像记录在其下方的电子感光板或其上方的35mm胶片上时，总能得到清晰的像。 本文由广州深华实验室仪器设备整合发布

叶绿体的分离及荧光染色观察

叶绿体的分离及荧光染色观察 泮力菁 2011级生物基地 201100140091 同组者：商倩倩【实验目的】 1、通过植物细胞叶绿体的分离，了解细胞器分离与纯化的原理和方法； 2、熟悉荧光显微镜的使用方法，观察叶绿体的自发荧光和间接荧光； 3、复习巩固制片及染色的基本技术。 【实验原理】 1、真核细胞由细胞膜、细胞核和细胞质组成。细胞质中含有若干细胞器和细胞骨架，这些结构被称为亚细胞组分。分离亚细胞组分的方法主要有差速离心和密度梯度离心两种。 2、差速离心和密度梯度离心： 差速离心法是在密度均一的介质中由低速到高速的逐级离心用于分离不同大小的物体。离心速度逐渐提高，样品会按先大后小的顺序沉淀。在差速离心中细胞器沉降的顺序为：细胞核、线粒体、溶酶体和过氧化物酶体、内质网和高尔基体。最后为核糖核蛋白复合体。由于各种细胞器在大小和密度上可能相互重叠。一般差速离心2-3次，分离效果会好一些。差速离心只用于分离密度和大小悬殊的细胞或细胞器，并且得到的产物纯度较低。若对产物纯度的要求较高，则需要密度梯度离心来分离纯化。 密度梯度离心法是利用一定的介质在离心管内形成连续的密度梯度，将细胞悬浮液或匀浆置于介质的顶部，通过离心力的作用使细胞或细胞器分层、分离，最后不同密度的细胞或细胞器位于与自身密度相同的沉降区带中。这种离心技术又可分为速度沉降和等密度沉降两种。速度沉降主要用于分离密度相近而大小不同的物体，而等密度沉降用于分离密度不同的物体。 叶绿体是植物细胞所特有的能量转换细胞器。它是一种比较大的细胞器，利用差速离心即可分离收集，然后用密度梯度离心纯化，便可用于各种研究。 3、荧光： 光致发光：某些物质在照射下，吸收光能进入激发态，当从激发态进入基态时，可以以电磁辐射的形式释放出吸收的光能，这种现象称之为“光致发光”。紫外辐射，可见光及红外辐射均可引起光致发光，如磷光与荧光。 荧光：在光致发光中，如果一定波长的短波光（如紫外光）照射某种物质，这种物质吸收光能后进入激发态，并立即激发在极短的时间内能发射出比照射光波长更长的光（如可见光），这种光就称为荧光。一旦停止入射光，发光现象也随之立即消失。 荧光的性质：A、吸收光，必须有激发光源；B、荧光波长大于激发波长（损失热能）；C、荧光强度小于激发光的强度；D、有不同程度的衰减（影响因素：如温度、光。猝灭剂等，因此可以先拍照，后观察）；E、荧光强度取决于激发光强度，被检物浓度、荧光效率（在制作荧光显微标本时最好使用无荧光载玻片、盖玻片和香柏油）。 荧光显微镜的光源有汞灯光源（提供激发光：U,V,B,G），疝灯光源：高峰值更宽，更稳定）。

叶绿体的分离与荧光观察

实验二叶绿体的分离与荧光观察 一、实验目的 了解叶绿体分离的一般原理和方法，并熟悉应用荧光显微镜方法观察叶绿体荧光现象。 二、实验原理 1、叶绿体的分离应在等渗溶液(0.35mol/L氯化钠或0.4mol/L蔗糖溶液)中 进行,?以免渗透压的改变使叶绿体受到损伤。利用差速离心法将匀浆液离心，从而使叶绿体得到分离。分离过程最好在0～5℃的条件下进行；如果在室温下，要迅速分离和观察。 2、有些生物体内的物质受激发光照射后直接发出荧光，称为自发荧光(或直 接荧光)，如叶绿素的火红色荧光和木质素的黄色荧光等。有的生物材料本身不发荧光，但它吸收荧光染料后同样也能发出荧光，这种荧光称为次生荧光(或间接荧光)，如叶绿体吸附吖啶橙后可发桔红色荧光。本实验利用荧光显微镜对叶绿体的荧光进行观察。 三、实验步骤 1.选取新鲜的嫩白菜叶片，洗净擦干后去除叶梗和粗脉，撕成小碎块，称 3g放于玻璃研钵中，加入10ml0.35mol/LNaCl溶液，匀浆3～ 5min。 2.匀浆液用2层尼龙布过滤于50ml烧杯中。 3.将滤液平分到2个离心管中，天平配平，1000r/min下离心2min。弃去沉 淀。 4.将上清液在3000r/min下离心5min。弃去上清，沉淀即为叶绿体。 5.将沉淀用0.35mol/LNaCl溶液悬浮，做两张临时装片：①取一滴叶绿体 悬液滴于载片上，加盖片观察；②取一滴叶绿体悬液滴于载片上，再滴加1-2滴0.01%吖啶橙荧光染料，加盖片观察： ①在普通光镜下观察； ②在荧光显微镜下观察：先用明视野（白炽光灯下）和用低倍镜头观察， 找到适当的标本后，再转高倍镜头，并将白炽光灯转换成以汞灯激发光 作光源，用暗视野观察。 6.撕取白菜叶片下表皮一小片置于滴有清水的载片上，盖上盖玻片，在普通 光镜下观察气孔的形状，保卫细胞里面的叶绿体；随后转置荧光显微镜下观察。 四、结果与分析

实验二生物样品的荧光观察

实验二生物样品的荧光观察 一、实验目的 1、初掌握荧光显微镜和激光共聚焦扫描显微镜的结构、原理、使用方法及其在细胞生物学研究中的应用。 2、掌握生物材料的荧光染色和活体荧光蛋白的观察方法。 3、了解激光共聚焦的原理。 二、实验原理 1、某些物质经短波光照射后，分子被激活，吸收能量后呈激发态。其能量除部分转换为热量外，相当一部分则以波长较长的光能辐射出来，这种波长长于激发光的可见光称为荧光。细胞内的某些物质经过短波光照射后，可以发出自发荧光。在生物学研究中，能将发荧光的有机化合物-荧光染料与特定的细胞组分 相结合，通过激发后产生的荧光对细胞组分进行定性和定位。 2、生物样品的荧光观察采用荧光显微镜或激光共聚焦显微镜。荧光显微镜以波长较短的光为光源，照射被检样品，激发被检物品内的荧光物质发出可见的荧光，通过物镜和目镜放大成像。激光共聚焦显微镜也是来观察样品中荧光分布状况的。激光共聚焦显微镜是以激光为光源，在某一瞬间只用很小一部分光照明，通过检测器的一个小孔或裂缝后成像，保证只有来自该焦平面的光成像，而来自焦平面外的散光则被小孔和裂缝挡住，成像异常清晰。此外，激光共聚焦显微镜可以在同一样品的不同焦平面进行扫描得到不同焦平面的图像，然后通过计算机重构出样品的三维结构。 3、本实验中微丝的荧光观察采用荧光素标记的鬼笔环肽( phalloidin )，鬼笔环肽可以专一的结合在聚 合状态的肌动蛋白丝上，起到稳定微丝的作用。细胞核的观察用DAPI(diamidino-2-phenylindole )染色。DAPI 能与DNA双螺旋的凹槽部分相互作用，从而与DNA双链紧密结合。结合后产生的荧光基团的吸收峰358nm , 而散射峰是461 nm。而植物细胞的花粉管、筛板和胞间连丝含有胼胝质成分，经苯胺蓝染色后，用紫外光激发，可以发出黄绿色荧光。 4、激光共聚焦扫描显微镜(laser scanning confocal microscope，LSCM)原理：用激光作扫描光源，逐点、逐行、逐面快速扫描成像，扫描的激光与荧光收集共用一个物镜，物镜的焦点即扫描激光的聚焦点，也是瞬时成像的物点。由于激光束的波长较短，光束很细，所以共焦激光扫描显微镜有较高的分辨力，大约是普通光学显微镜的 3 倍。系统经一次调焦，扫描限制在样品的一个平面内。调焦深度不一样时，就可以获得样品不同深度层次的图像，这些图像信息都储于计算机内，通过计算机分析和模拟，就能显示细胞样品的立体结构。 三、实验材料、试剂和仪器 1 、材料：烟草悬浮细胞、拟南芥、蚕豆 2、试剂：3.6%多聚甲醛、Pipes 缓冲液、100nm Alexa Fluo488 phalloidin、DAPI 染色液、0.1%苯胺蓝 3、仪器：Olympus 荧光显微镜、恒温培养箱、移液器、载玻片、盖玻片、镊子 四、实验内容 (一)荧光标记观察烟草悬浮细胞微丝骨架的分布 1 、烟草悬浮细胞继代培养。 MS 培养基的基本成分： MS 无机盐+KH2P04200mg/L;烟酸10mg/L ;维生素B11mg/L ； 肌醇100mg/L ；2，4-D 0.1mg/L;蔗糖30g/L 在室温、黑暗生长，120~130rpm 2、固定：取300 □细胞液放入离心管中，静置沉降，3000rpm离心30 s,吸出培养基，加入500^3.6%

提高显微镜分辨率的方法简述

目录 1 选题背景 (1) 2 方案论证及过程论述 (1) 2.1 像差 (1) 2.1.1 球面像差 (1) 2.1.2 慧形像差 (2) 2.1.3 色像差 (2) 2.2 照明对显微镜分辨率的影响 (2) 2.2.1 非相干光照明 (2) 2.2.2 相干光照明 (2) 2.2.3 部分相干光照明 (3) 2.2.4 临界照明 (3) 2.3 衍射 (3) 2.3.1 对两个发光点的分辨率 (3) 2.3.2 对不发光物体的分辨率 (4) 2.4 光噪声 (6) 3 结果分析 (6) 4 结论 (7) 4.1 提高光学显微镜与电子显微镜分辨率的方法 (7) 4.1.1 提高光学显微镜分辨率的方法 (7) 4.1.2 如何提高电子显微镜分辨率 (7) 参考文献 (9)

1 选题背景 显微镜是实验室最重要的设备之一，对观察微小物体细节的显微镜来说，评价光学显微镜及电子显微镜的重要指标之一是分辨本领。显微镜的分辨能力是指其分辨近距离物体细微结构的能力，它主要是显微镜的性能决定。通常是以显微镜的分辨率级即显微镜能分辨开两个物点的最小距离d来表示，d值越小，则显微镜的分辨能力越强。 人眼本身就是一台显微镜，在标准照明条件下，人眼在明视距离(国际公认为25cm)上的分辨率约等于1/10mm。对于观察两条直线来说，由于直线能刺激一系列神经细胞，眼睛的分辨率还能提高一些，这就是显微镜的分划板使用双线对准的原理所在。人眼的分辨率只有1/10mm，那么比1/10mm小的物体或比1/10mm近的两个微小物体的距离，人眼就无法分辨了。这时人们开始研制出放大镜和显微镜，显微镜的分辨率计算公式为：d=0.61入/NA；式中：d为分辨率(μm)；入为光源波长(μm)；NA为物镜的数值口径(也称镜口率)。 造成显微镜光学像欠缺的因素主要在物镜组，有像差、衍射和光噪声等，它们是影响显微镜分辨率的主要因素，其次照明对显微镜的分辨率也有一定的影响。 对于显微镜的使用者来讲，应该对造成显微镜分辨率下降的因素有比较清楚的认识，并知道克服和减少这些因素的方法。本文从几何像差、色像差、衍射、干涉和照明几个方面分析了对显微镜分辨率的影响,指出了孔径数的增加，从衍射角度看对显微镜分辨率的提高有好处，但从几何像差的角度看则会降低显微镜的分辨率;并指出了照明对显微镜分辨率的影响是不可忽略的等。 2 方案论证及过程论述 2.1 像差 像差可分为单色像差和色像差两大类。单色像差有五种：（1）球面像差；（2）彗形像差；（3）像散；（4）像场弯曲；（5）畴变。其中（1）和（2）是由大孔径引起的，（3）、（4）、（5）是由大视场引起的。显微镜需要大孔径，但不需要大视场，所以显微镜的单色像差主要是（1）和（2）。 2.1.1 球面像差 单球面公式只有在满足近轴光线的条件下才能成立。当孔径较大时，有许多远轴光线也进入了透镜，近轴光线和远轴光线经透镜折射后不能在同一点上会聚。换句话说，主轴上一物点经透镜成像后，像不是一个点，而是一个圆斑，这样就产生了球面像差。消除的方法有二：一是在透镜前加一光阑，用以限制远轴光线的进入。这样做，会使显微镜的孔径数降低，从而降低了显微镜的分辨率。二是用复合透镜法，显微镜物镜就是采用这种方法制作的。

荧光显微镜使用方法和荧光显微镜操作规程

荧光显微镜使用方法和荧光显微镜操作规程 荧光显微镜是中的一种。 关键字： 荧光显微镜使用方法 荧光显微镜操作规程 荧光显微镜使用 使用方法和荧光显微镜操作规程 1. 用窗帘遮蔽光线，关闭房间内的灯光，除去显微镜的防尘罩，确保显微镜灯室通风良好、无遮盖。装上汞灯灯箱，并转动灯箱卡圈上的拨杆，将灯箱与镜臂连接。 2. 将汞灯灯箱的电源插头插入荧光电源箱后的插座，再将荧光电源箱的插头插入220V外接电源。 3. 打开电源开关，电压表显示出电源电压，如电源电压波动不大于额定电压值的±5%，即可按下启动开关点燃汞灯，如因天气太冷或电压不稳定等原因，一次启动未点燃汞灯，可以多揿动几次。待超高压汞灯弧光达到稳定状态并达到最大发光效率，即可开始工作。 4. 灯泡的调中： （1）任选一块标本放在载物台上. （2）转动镜臂上的聚光镜旋钮使聚光镜移出光路，转动滤色片组转换手轮，将紫光（Ｖ）或蓝光（Ｂ）或绿光（Ｇ）激发滤色片组转入光路，并将10×荧光物镜转入光路。

（3）调节粗微调手轮，将标本像调焦清晰。 （4）前后推动垂直照明器右边的聚光镜调焦推杆，使视场光栏成像清晰，转动视场光栏拨杆将视场光栏收小，调节视场光栏调中螺钉使视场光栏居中，然后再将视场光栏开至最大。 （5）转动镜臂上的聚光镜旋钮使聚光镜移入光路，前后调节灯箱上的聚光镜拨杆，使汞灯的弧光在视场内成像清晰。 （6）调整灯箱上的灯泡水平调节螺钉和垂直调节螺钉，使汞灯的弧光居中。 （7）调整反光镜水平调节螺钉和垂直调节螺钉，使光源的反射像与汞灯的弧光分开。 （8）转动聚光镜旋钮把聚光镜移出光路，此时视场照明均匀。 5. 荧光观察： （1）将荧光染色标本放到载物台上。 （2）将10×平场物镜或40×荧光物镜转入光路，调节载物台纵横移动手轮，将标本移入光路。 （3）转动滤光片转换拨轮，将荧光染色标本所需要的激发滤光片组转入光路。激发滤光片组编号刻在滤片组转换拨轮上。 滤光片选择正确与否，是荧光显微镜能否得到正确应用的关键。选用滤光片时，必须遵守斯托克斯定律：激发滤光片的透射波长＜双色束分离器的透射波长＜阻断滤光片的透射波长。 由于激发滤光片、双色束分离器和阻断滤光片，出厂时已按其用途和本身的光学特性进行了严格的组合匹配，在观察和摄影时，只需选择滤光片组即可。 （4）调节粗调手轮，当看清荧光图像轮廓后，再用微调手轮调焦，直至看到清晰的荧光图像。 （5）当需要得到较强的荧光图像时，可转动聚光镜旋钮把聚光镜移入光路，可获得较明亮的荧光图像。

实验1 叶绿体的分离与荧光观察

中国海洋大学实验报告 2019年 3 月30 日姓名杨慧慧学号17050031803 系年级海洋生命学院2017 专业生物技术科目细胞生物学实验上课时间周六12节题目实验一叶绿体的分离和荧光观察 一、实验目的 1. 通过植物细胞叶绿体的分离, 了解细胞器分离的一般原理和方法。 2. 观察叶绿体的自发荧光和次生荧光, 并熟悉荧光显微镜的使用方法。 二、实验原理 1. 将组织匀浆后悬浮在等渗介质中进行差速离心，是分离细胞器的常用方法。 2. 叶绿体的分离应在等渗溶液中进行, 以免渗透压的改变使叶绿体受到损伤。 3. 因为叶绿体有自发荧光，因此用荧光显微镜进行观察。 三、实验用品 1. 材料：新鲜菠菜。 2. 试剂：0.35mol/L氯化钠溶液，0.01%吖啶橙(acridine orange)。 3. 器材： (1)主要设备: 普通离心机、组织捣碎机、粗天平、荧光显微镜。 (2)小型器材: 烧杯, 量筒, 滴管, 刻度离心管, 纱布，无荧光载片和盖片。 四、实验步骤与方法 一、叶绿体的分离与观察 1.选取新鲜的嫩菠菜叶，洗净擦干后去除叶梗脉，称30g于150ml 0.35mol/L NaCl溶液中，装入组织捣碎机。 2.低速匀浆3~5min。 3.将匀浆用6层纱布过滤于500ml烧杯中。 4.每组取滤液4ml，1000r/min下离心2min，弃去沉淀。 5.将上清液在3000r/min下离心5min，弃去上清液，沉淀即含叶绿体(混有部分细胞核)。 6.将沉淀用0.35mol/L NaCl溶液悬浮。 7.取叶绿体悬液一滴滴于载玻片上，加盖玻片后即可在普通光镜和荧光显微镜下观察。 (1)在普通光镜下观察。 (2)在荧光显微镜下观察叶绿体的直接荧光。 (3)在荧光显微镜下观察叶绿体的间接荧光：取叶绿体悬液一滴滴在无荧光载片上，再滴加一滴0.01%吖啶橙荧光染料, 加盖片后即可在荧光显微镜下观察。 二、菠菜叶手撕片观察 轻轻撕取新鲜嫩菠菜叶的表皮，展平置于载玻片上，滴加1~2滴0.35mol/L NaCl溶液，加盖片后置显微镜下观察。 (1)在普通光镜下观察。 (2)在荧光显微镜下观察其直接荧光。 (3)观察其间接荧光：向所制手撕片上滴加1~2滴0.01%吖啶橙染液，染色1min，洗去余液, 加盖片后即可在荧光显微镜下观察其间接荧光

显微镜荧光波长详解

?人肉眼对光源波长的颜色感觉 红色770-622 nm 橙色622~597 nm 黄色597~577 nm 绿色577~492 nm 蓝靛色492～455nm 紫色455～350nm ?常见显微镜滤光片的波长 在激发波长在Ex围才能被激发，只有发射光波长大于BA/EM才能被观察到，背景光的波长只有大于DM才能被观察到。 红色滤光片G-2A Ex 510-560 DM 575 BA 590 绿色滤光片B-2A Ex 450-490 DM 505 BA 520 蓝色滤光片UV-2A Ex 330-380 DM 400 BA 420

其它荧光染料介绍 【菁类染料-Cyanine dyes(Cy2, Cy3, Cy5)】 Cy2耦联基团激发波长为492nm，发光为波长510nm的绿色可见光。Cy2和FITC使用相同的滤波片。由于Cy2比FITC在光下更稳定。要避免使用含有磷酸化的苯二胺的封片剂，因为这种抗淬灭剂和Cy2反应，在染色片储存后会导致荧光微弱和扩散。Cy3和Cy5比其他的荧光团探针要更亮，更稳定，背景更弱。Cy3耦联基团激发光的最大波长为550nm，最强发射光为570nm。因为激发光和发射光波长很接近TRITC, 在荧光显微镜中，可使用和TRITC一样的滤波片。 Cy3在氩光灯(514nm或528nm)下可以被激发出50％的光强，在氦氖灯(543nm)或者汞灯(546nm)下则约75％。Cy3可以和荧光素一起作双标。Cy3还可以和Cy5一起在共聚焦显微镜实验中作多标记。Cy5耦联基团的激发波长最大650nm，发光波长最大670nm。在氪氩灯(647nm)下它们可被激发出98％的荧光，在氦氖灯下(633nm)为63％。Cy5可以和很多其他的荧光基团一起用在多标记的实验中。由于它的最大发射波长在670nm，Cy5很难用裸眼观察，而且不能用汞灯作理想的激发。通常观察Cy5时采用具有合适激发光和远红外检测器的共聚焦显微镜。在水相封片剂中应当加入抗淬灭剂。使用传统的表面荧光显微镜时，不推荐使用Cy5。 【藻红蛋白或藻胆色素蛋白-Phycoerythrin(PE)荧光标记二抗】 存在于被称为藻红的多聚微粒中，位于叶绿素的反应中心，在自然结构中，藻红蛋白吸收光能，吸收后转化成能量，供其发育生长。当藻红蛋白被分离和纯化后，其蛋白质变得具有很强的荧光，能吸收不同波长的光，发出亮红色的荧光，此时不再接受任何外来的光，也不能转移光能。藻红蛋白PE的吸收波长围较广，最大的吸收波长为566nm，最大的发射波长为574nm。藻红蛋白作为荧光标记物具有以下优点：首先具有强的长波长激发和发射荧光，可避免来自其他生物材料荧光的干扰；并且具有极高的发射量子产率；另外PE具有非常高的水溶性而且与许多生物学或合成材料的多位点稳定交联。 【Aminomethylcoumarin Acetate (AMCA)】 耦联的AMCA吸收光波长最大为350nm，发荧光则为450nm。对于荧光显微镜来说，AMCA 可以用汞灯来激发，用紫外滤板来观察。由于AMCA的信号相对较弱，单标实验中不推荐使用AMCA。AMCA和荧光素的荧光波长只有很小的重叠围，而和发出长波长荧光的荧光基团没有或者只有极少的重叠，因此它最常用于多标记实验中，比如免疫荧光显微镜和流式细胞仪。由于人眼不能很好的检测蓝色荧光，在多标记的实验中，AMCA耦联的二抗应当被用于检测大量的抗原。AMCA和荧光素一样很快淬灭，使用抗淬灭剂可以减轻。且由于肉眼不能很好的检测AMCA所激发的蓝色荧光，因而AMCA耦联的二抗更适用于检测大量

人眼、光学显微镜以及电子显微镜成像原理、分辨率及其影响因素

人眼、光学显微镜以及电子显微镜成像原理、分辨率及其影响因素 文章主要从人眼成像原理入手，逐步介绍光学显微镜以及电子显微镜的成像原理、分辨率和分辨率的影响因素。分三部分作简要说明。 一人眼成像 1 、人眼结构 人眼成像原理图如下，所取的距离为250米，则人眼成像见下图1： 图1 人眼结构原理图 2 、成像原理 自然界各种物体在光线的照射下，不同颜色可以反射出明暗不同的光线，这些光线透过角膜、晶状体、玻璃体的折射，眼球中的角膜和晶状体的共同作用，相当于一个“凸透镜”，在视网膜上形成倒立、缩小的实像，构成光刺激。视网膜上的感光细胞（圆锥和杆状细胞）受光的刺激后，经过一系列的物理化学变化，转换成神经冲动，由视神经传入大脑层的视觉中枢，然后我们就能看见物体了,经过大脑皮层的综合分析，产生视觉，人就看清了正立的立体像。 人的眼睛是个复杂的成像系统，而人的大脑像CPU处理这些图像，让人能在视觉上感知到图像。人眼成像最主要的是晶状体和视网膜。晶状体调整眼睛的焦距是光束集中到富有视锥细胞和视柱细胞的视网膜上，在进行光电（生物电）变化，由视觉神经把信号传至大脑生成图像。人类的目标就是能制造出能过可以和眼睛相媲美的视觉系统，这是机器智能化的关键部分。

3 、分辨率 说及人眼分辨率首先需要知道如下几个概念： （1）视角：观看物体时，人眼对该物体所张的角度。 （2）分辨角：人眼的分辨角：指刚能看出两黑点时，两黑点对人眼的张角。（3）分辨力：人眼分辨图像细节的能力称为分辨力，可用分辨角来衡量，分辨角的倒数为分辨力。它也反映了人眼的视力。分辨力还与照度及景物相对对比度有关。 人眼分辨率指的是人眼能够分辨两个相邻的点或者线的能力，通常以刚能被分开的两点或两线与眼睛瞳孔中心所成的张角表示。其最小分辨的距离在0.2mm 左右。要观察和分析更小的距离时，就必须借助于专门仪器。观看物体时，能清晰看清视场区域对应的分辨率为2169 ×1213。再算上上下左右比较模糊的区域，最后的分辨率在6000×4000。 4 、分辨率影响因素 分辨率的大小由视网膜分辨影像能力的大小来判定,具体是由眼的屈光介质 决定如角膜、晶体、玻璃体等，如果屈光介质变得混浊或存在不正即近视、远视、散光等时,即使视网膜功能良好，也会看不清。 二光学显微镜 1 、成像原理图 图2 光学显微镜成像原理图 2 、成像原理

荧光显微镜操作手册

荧光显微镜操作手册 Olympus BX51 物镜： 4 ×0.16 （无DIC） 10×0.40 20×0.75 40×1.00 oil 100×1.40 oil 荧光滤色块转盘： 1. WU 蓝 2. WIB 绿（长通） 3. WIBA 绿（带通） 4. WIG 红 5. CFP 青 6. YFP 黄 操作步骤：（注意：样品须在低倍镜下放置和取下） DIC观察：

1.打开明场电源开关（“︱”为开，“○”为关） 2.将样品置于载物台上，用样品夹夹好 3.将起偏器、检偏器、DIC棱镜推入光路，荧光滤块转盘拨到“1”位置，DIC棱镜应 与相应的物镜倍数相匹配 4.先选用低倍物镜（“10×”） 5.调节透射光的强度，调节焦距，找到视野 6.换到高倍镜头，观察样品 7.DIC观察时，光路选择拉杆拉到中间位置，既可观察，也可拍照 荧光观察： 1.打开明场电源开关 2.打开汞灯电源开关 3.将样品置于载物台上，用样品夹夹好 4.检偏器、DIC棱镜在光路外 5.将荧光光路shutter打开（“○”为开，“●”为关），需保护样品时关闭shutter 6.光路选择拉杆推至最里边 7.根据样品的标记情况将荧光滤块转盘转到相应的位置 8.通过两组减光滤片调节激发光强度 9.从低倍镜开始观察，调焦，找到预观察视野， 10.依次换到高倍镜头，观察样品 11.拍照时光路选择拉杆完全拉出 普通明场观察： 1.打开明场电源开关（“︱”为开，“○”为关） 2.将样品置于载物台上，用样品夹夹好 3.起偏器、检偏器、DIC棱镜在光路外，荧光滤块转盘拨到“1”位置，DIC棱镜拨到 明场（BF）位置 4.先选用低倍物镜（“4×”） 5.调节透射光的强度，调节焦距，找到视野 6.依次换到高倍镜头，观察样品 7.光路选择拉杆拉到中间位置既可观察，也可拍照 关机： 1.关闭汞灯电源（注意：汞灯需使用半小时以上方可关闭，关闭半小时以后方可再次 开启） 2.将透射光调到最小，关闭明场电源开关 3.将镜头转到低倍镜，取出样品，若使用过油镜用干净的擦镜纸擦拭镜头 4.确认数据已经保存，关闭软件 5.使用光盘拷贝数据（禁止使用移动储存设备拷贝数据） 6.关闭电脑，登记使用时间、荧光数字等使用情况

离体叶绿体荧光观察实验的改进研究_黄国文

第33卷第12期湖南科技学院学报 V ol.33 No.12 2012年12月Journal of Hunan University of Science and Engineering Dec.2012 离体叶绿体荧光观察实验的改进研究 黄国文 （湖南科技学院 生命科学和化学工程系，湖南 永州 425100） 摘 要：“叶绿体的分离和荧光观察”实验是为生物学相关专业学生开设的一个综合性实验。本文根据教学实际情况，针对用差速离心法制备离体叶绿体及其荧光观察这一步骤存在的问题进行了研究，建立了用质壁分离法制备离体叶绿体来观察叶绿体荧光的新方法，在学生分组实验教学中运用这一方法取得了较好的实验结果。 关键词：离体叶绿体；制备；叶绿体荧光；观察 中图分类号：Q291文献标识码：A 文章编号：1673-2219（2012）12-0044-03 叶绿体是植物特有的细胞器，是光合作用的场所。1931年Kaustky和Hirsch用肉眼观察并记录了叶绿素荧光诱导现象[1]。将暗适应的绿色植物或含有叶绿素的组织突然暴露在可见光下，叶绿体的荧光快速上升然后下降到一个稳定状态，这一现象称为Kautsky效应。荧光强度随光照时间变化的曲线称为叶绿素荧光诱导动力学曲线。在普通生物学实验的教学中开设了综合性的“叶绿体的分离和荧光观察”实验[2]，目的是使学生了解叶绿体的制备方法和叶绿体荧光产生的机理，了解荧光强度与光合作用的关系以及叶绿体活性与荧光强度的关系，培养学生对生物现象的观察和理解能力以及运用知识解决实际问题的能力。但是在这个实验中对于用差速离心法制备离体叶绿体和观察其荧光现象的步骤，大多数学生不能很好地和独立地完成。本人根据这种实际情况，研究了存在这种现象的原因，设计了一个离体叶绿体的制备和荧光现象观察的新方法—质壁分离法分离离体叶绿体并观察其荧光。应用这种方法取得的实验结果较好。 1 建立本方法的依据 1.1 叶绿体荧光现象的产生机理 当叶绿体中叶绿素分子吸收光能（光量子）后，其中的电子由低能级（基态）激发为高能电子（激发态）。不同光质激发的高能电子出现在不同的轨道中旋转。如果叶绿素分 收稿日期：2012－09－10 基金项目：湖南省普通高校“十二五”专业综合改革试点项目（湘教通[2012]266号—57）；《教育部财政部关于实施高等学校本科教学质量与教学改革工程的意见》（教高〔2010〕15号-TS12336）。 作者简介：黄国文（1965－），男，湖南郴州人，博士，讲师，主要研究方向为生物学领域的教学和科研工作。子被蓝光（430nm）激发，叶绿素中的电子跃迁到能量较高的轨道称为第二单线态；如果被红光（670 nm）激发，电子跃迁到能量较低的轨道旋转称为第一单线态。处于第一和第二单线态的电子，其自旋方向保持原来状态，如果电子在激发或退激过程中自旋方向发生变化，该电子就进入能级较单线态低的轨道称为三线态。这些高能态电子很不稳定，经过一定时间后，其能量可以同时向三个方面转化[3]。一种形态是第二单线态的高能电子返回第一单线态以及第一单线态和三线态的高能电子返回基态时产生热量，第二种形态是第一单线态的高能电子会传递给内囊体膜上的电子传递链参与光化学反应和叶绿体基质中进行有机物合成，第三形态是第一单线态和三线态高能电子返回基态产生荧光和磷光。荧光的寿命很短，只有10-8 - 10-10s。这三种能量形态以竞争的方式出现，以至任何一种能量形态效率的增加会导致其它两个种能量形态产量的减少[4]。正常条件下植物捕获的光能主要用于光化学反应，剩余的能量以荧光、热耗散等方式被耗散掉[5]。叶绿素分子吸收蓝光后跃迁到较高能级第二单线态的高能电子要返回能级较低的第一单线态才能用于光合作用，多余的能量也是以热的形式耗散。因此，植物进行光合作用时对红光的能量利用率的高于对蓝光的能量利用率。 1.2 叶绿体荧光淬灭现象 在叶绿素荧光诱导过程中，荧光由最高值降至稳态，这种荧光产量的下降称为叶绿素荧光淬灭。在叶绿体的分离过程中，在2 min内叶绿体的荧光减少到稳定态[6]。在有机溶剂中叶绿素的荧光产量大约为30%，然而在进行光合作用的叶绿体的荧光产量为0.5-3%，这种现象也称为荧光淬灭。它包括光化学淬灭和非光化学淬灭。光化学淬灭是指叶绿体的电子传递链处于氧化态，反应中心开放，会发生电子传递和电荷分离，形成ATP等产生荧光淬灭，反映出PSⅡ天线色素吸 44

细胞生物学实验②荧光显微镜——生物样品的荧光观察

生物样品的荧光观察 生物122 祝洪晨1202040220 目的：①初步掌握荧光显微镜和激光共聚焦扫描显微镜的结构、原理使用方法及其在细胞生物学研究中的应用。②掌握生物材料的荧光染色和活体荧光蛋白的观察方法。 原理：本实验中微丝的荧光观察采用荧光素标记的鬼笔环肽(phalloidin)，鬼笔环肽专一的结合聚合状态的肌动蛋白丝上，起到稳定微丝的作用。花粉细胞核的观察采用DAPI染色。DAPI(4，6—联眯—2—苯基吲哚)是一种荧光染料，它与DNA双螺旋的凹槽部分相互作用，从而与DNA双链紧密结合，结合后产生的荧光基团的吸收峰是358nm。植物细胞的花粉管、筛板、和胞间连丝含有胼胝体成分，其经过苯胺蓝染色后，用紫外线激发，可发出黄绿色荧光。 实验内容及结果 （一）荧光标记观察烟草花粉管内微丝骨架的分布 1）烟花新鲜花粉萌发液已由教师完成。 2）固定：取200ul萌发液放入离心管中，静置沉降，3000rpm离心30秒，吸出培养基，加入200ul 3.6%多聚甲醛（50 mmol/L Pipes配制）固定20分钟。再吸出固定液，用Pipes 缓冲液清洗三次，每次5分钟。 3）染色:3000rpm离心1分钟，吸净缓冲液，加入100nm Alexa Fluo 488 phalloidin 50ul，37度染色20分钟，洗去染液，加入50ul缓冲液，吸取10ul直接进行封片。 4）荧光显微镜观察（激发光波长：蓝光激发，检测的发射光波长:510-530nm） 5）观察结果如下表所示： 花粉管微丝呈荧光绿 （二）DAPI染色观察花粉细胞核 1）DAPI 染色液的配置： 2）制作装片：用镊子夹住拟南芥的花，将花粉粘在载玻片上，加入20ul DAPI染色液染液，3-5分钟后，临时封片。 3）激发光：紫外光,发射光461nm。

荧光显微镜使用说明及注意事项

荧光显微镜使用说明及注意事项 （1）严格按照荧光显微镜厂家说明书要求进行操作，不要随意改变程序。 （2）观察对象必须是可自发荧光或已被荧光染料染色的标本。 （3）应在暗室中进行检查。进入暗室后，接上电源，点燃超高压汞灯5～15min，待光源发出强光稳定后，眼睛完全适应暗室，再开始观察标本。 （4）载玻片、盖玻片及镜油应不含自发荧光杂质，载玻片的厚度应在0.8～1.2mm之间，太厚可吸收较多的光，并且不能使激发光在标本平面上聚焦。载玻片必须光洁，厚度均匀，无油渍或划痕。盖玻片厚度应在0.17mm左右。 （5）防止紫外线对眼睛的损害，在调整光源时应戴上防护眼镜。 （6）选用效果最好的滤光片组。 （7）检查时间每次以1～2h为宜，超过90min，超高压汞灯发光强度逐渐下降，荧光减弱；标本受紫外线照射3～5min后，荧光也明显减弱；所以，最多不得超过2～3h。 （8）荧光标本一般不能长久保存，若持续长时间照射（尤其是紫外线）易很快褪色。因此，如有条件则应先照相存档，再仔细观察标本。 （9）荧光显微镜光源寿命有限，启动高压汞灯后，不得在15min内将其关闭，一经关闭，必须待汞灯冷却后方可再开启。严禁频繁开闭，否则，会大大降低汞灯的寿命。标本应集中检查，以节省时间，保护光源。天热时，应加电扇散热降温，新换灯泡应从开始就记录使用时间。灯熄灭后欲再用时，须待灯泡充分冷却后才能点燃。一天中应避免数次点燃光源。 （10）标本染色后立即观察，因时间久了荧光会逐渐减弱。若将标本放在聚乙烯塑料袋中4℃保存，可延缓荧光减弱时间，防止封裱剂蒸发。 （11）若暂不观察标本时，可拉过阻光光帘阻挡光线。这样，既可避免对标本不必要的长时间照射，又减少了开闭汞灯的频率和次数。 （12）荧光亮度的判断标准：一般分为四级，即“一”—无或可见微弱荧光。“+”—仅能见明确可见的荧光。“++”—可见有明亮的荧光。“+++”—可见耀眼的荧光。 （13）较长时间观察荧光标本时，一定要戴能阻挡紫外光的护目镜，加强对眼睛的保护。在未加入阻断滤光片前不要用眼直接观察，否则会损伤眼睛。 (14) 激发光长时间的照射，会发生荧光的衰减和淬灭现象，因此尽可能缩短观察时间，暂时不观察时，应用挡板遮盖激发光。 (15) 作油镜观察时，应用“无荧光油”。 (16) 荧光几乎都较弱，应在较暗的室内进行。