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分子生物学实验课考试

分子考试资料整理

1.质粒DNA的构型与电泳速率的关系？

答：DNA分子的迁移速率取决于由DNA分子的大小与构型而形成的分子筛效应。

①在相同的构型下，DNA分子迁移速率与其相对分子量成反比。

②相同分子量但不同构型的DNA分子迁移速率不同。当琼脂糖凝胶的浓度较低时，电泳速率为：超螺旋DNA>线性DNA＞开环DNA。

2.碱裂解法提取质粒DNA的原理以及三种溶液的作用？

①基本原理

质粒的分离是利用质粒DNA与染色体DNA在变性与复性中的差异来达到的目的。

当菌体在NaOH和SDS溶液中裂解时，蛋白质与DNA发生变性，由于染色体DNA 与质粒DNA拓朴构型不同,染色体DNA双螺旋结构解开，而共价闭环质粒DNA的氢键虽被断裂，但两条互补链彼此相互盘绕仍会紧密地结合在一起。当加入中和液后, 溶液pH调恢复至中性，在高盐浓度的情况下，染色体DNA之间交联形成不溶性网状结构并与蛋白质-SDS复合物等形成沉淀；不同的是，质粒DNA复性迅速而准确，保持可溶状态而留在上清中。这样，通过离心可沉淀大部分细胞碎片、染色体DNA、RNA及蛋白质。除去沉淀后上清中的质粒可用酚氯仿抽提进一步纯化质粒DNA。

②三种溶液的作用（溶液I，50 mM葡萄糖 / 25 mM Tris-Cl / 10 mM EDTA，pH 8.0；溶液II，0.2 N NaOH / 1% SDS (新鲜的)；溶液III，3 M 醋酸钾 / 2 M 醋酸。）

溶液I: Tris-Cl:适当pH值,

葡萄糖：增加溶液的粘度，维持渗透压，防止DNA受机械剪切力作用而降解,悬浮后的大肠杆菌不会快速沉积到管子的底部,

EDTA:抑制DNase的活性，和抑制微生物生长(是Ca2+和Mg2+等二价金属离子的螯合剂)

溶液II：NaOH：是最佳的溶解细胞的试剂。

这一步要记住两点：第一，不能用旧的NaOH；第二，时间不能过长，必须温柔混合，不然基因组DNA也会断裂。

SDS: 是离子型表面活性剂。它主要功能有：（1）溶解细胞膜上的脂质与蛋白，因而溶解膜蛋白而破坏细胞膜。（2）解聚细胞中的核蛋白。（3）SDS能与蛋白质结合成为R-O-SO3-…R＋-蛋白质的复合物，使蛋白质变性而沉淀下来。

溶液III：醋酸钾: K+离子会与SDS形成溶解度很低的盐并与蛋白质形成沉淀而除去；

高浓度的盐，使得沉淀更完全（在pH为8左右的溶液中，DNA分子是带负电荷的，加一定浓度的NaAc或KAC，使Na+中和DNA分子上的负电荷，减少DNA分子之间的同性电荷相斥力，易于互相聚合而形成DNA钠盐沉淀）。

2 M的醋酸:中和NaOH，创造质粒复性的环境。

3. 感受态细胞制备过程应注意的问题；

①细胞的生长状态和密度

最好从-70℃甘油保存的菌种中直接转接用于制备感受态细胞的菌液。

细胞生长密度以每毫升培养液中的细胞数在5×107个左右为佳。即应用对数期或对数生长前期的细菌，可通过测定培养液的OD600（0.4-0.5）控制。（应注意OD600值与细胞数之间的关系随菌株的不同而不同；受体细胞一般应是限制-修饰系统缺陷的突变株，即不含限制性内切酶和甲基化酶的突变株。并且受体细胞还应与所转化的载体性质相匹配。

②质粒DNA的质量和浓度

一般地，DNA溶液的体积不应超过感受态细胞体积的5%；对于以质粒为载体的重组分子而言，分子量大的转化效率低；重组DNA分子的构型与转化效率也密切相关，环状重组质粒的转化率较分子量相同的线性重组质粒高10-100倍。

③整个操作过程均应在无菌条件下进行，所用器皿及试剂都要灭菌。

④用纯的试剂，注意防止被其它试剂、DNA酶或杂DNA所污染

⑤整个操作均需在冰上进行，不能离开冰浴

⑥CaCl2处理后细胞很脆，动作要轻，慢。

⑦化合物及无机离子的影响：在Ca2+的基础上联合其他二价金属离子（如Mn2+或Co2+）、DMSO或还原剂等物质处理细菌，可使转化效率大大提高（100-1000倍）；

4.挖胶过程应注意什么？

①保证切下的条带没有外源DNA的污染。

②切胶时尽量只切有条带的胶，减小切胶体积。

③切胶时尽量在长波长下进行，减少紫外对DNA的损伤。

④为了减少胶的体积，可以用相对比较薄的胶来做，可采用薄而宽的梳子来跑胶。

5.如何灭活RNase？

A. RNase 灭活剂

①焦磷酸二乙酯（DEPC）：是一种强烈但不彻底的RNA酶抑制剂。它通过和RNA酶的活性基团组氨酸的咪唑环结合使蛋白质变性，从而抑制酶的活性。

②异硫氰酸胍：目前被认为是最有效的RNA酶抑制剂，它在裂解组织的同时也使RNA酶失活。它既可破坏细胞结构使核酸从核蛋白中解离出来，又对RNA酶有强烈的变性作用。

③氧钒核糖核苷复合物：由氧化钒离子和核苷形成的复合物，它和RNA酶结合形成过渡态类物质，几乎能完全抑制RNA酶的活性。

④ RNA酶的蛋白抑制剂（RNasin）：从大鼠肝或人胎盘中提取得来的酸性糖蛋白。RNasin 是RNA酶的一种非竞争性抑制剂，可以和多种RNA酶结合，使其失活。

⑤其它：SDS、尿素、硅藻土等对RNA酶也有一定抑制作用。

B.RNase灭活剂

C.玻璃器皿200℃高温烘烤2小时

D.塑料器皿焦炭酸二乙酯（DEPC）水溶液处理。

6.提取RNA和DNA时所用的饱和酚有什么不同？

①水饱和酚又叫水平衡酚。水饱和酚的PH小于7，一般是PH为5.0左右，通常与异硫氢酸胍一起使用，用于细胞RNA的提取，在酸性环境中，DNA在酚相，RNA在水相。两者就分开了。

②Tris饱和酚一般PH大于7.8，用于DNA的提取。其中，酚是强的蛋白变性剂，可以使细胞或组织中的蛋白质变性析出。由于PH值大于7，在碱性环境中DNA处于水相，RNA 处于有机相。从而分离上清，即可得到DNA。

7.如何减少蛋白诱导过程中包涵体的产生？

①降低诱导温度，一般15-25℃②降低诱导剂ITPG浓度③使用中等强度或弱的启动子④进行融合表达⑤增加蛋白质折叠的添加剂⑥与伴侣分子和折叠酶共表达⑦选择突变的菌株⑧优化培养基条件

7.单酶切时，为提高连接效率应采取什么措施？为什么？

通常选择对质粒载体用碱性磷酸酶处理，除去其５’末端的磷酸基，防止环化，通过连接反应后形成的缺口可在转化细胞后得以修复。

8.连接反应中，插入片段与载体的合适比例是多少？

载体与目的基因摩尔数之比为1：3-5 如果插入片段较小，而载体较大，和载体的摩尔比例3-6:1连接效果好，如果载体和插入片段大小相近，摩尔比1：1较好；如果插入片段和载体的摩尔比例过大，会导致多克隆的插入；如果插入片段和载体的摩尔比例过

小，会导致假阳性增多。

9.筛选阳性克隆的方法？

菌落PCR、酶切鉴定、Cracking gel、菌落原位杂交、测序

10.蓝白斑筛选的原理是什么？如何出现大量蓝斑，可能是什么原因？

蓝白斑筛选是重组子筛选的一种方法：许多载体（PUC序列）都带有一个大肠杆菌的DNA 的短区段，其中有β-半乳糖苷酶基因（lacZ）的调控序列和前146个氨基酸的编码信息。在这个编码区中插入了一个多克隆位点（MCS）。受体菌含编码β-半乳糖苷酶C端aa序列。当无外源基因插入时，载体表达的N端β-半乳糖苷酶多肽与受体菌表达的C端β-半乳糖苷酶多肽功能互补，具有β-半乳糖苷酶活性。可以将生色底物X-gal分解成蓝色物质，从而在培养基中形成蓝色菌落。然而，当外源DNA插入到质粒的多克隆位点后，造成插入失活，而使表达的产物不具有β-半乳糖苷酶活性，不能分解底物X-gal，使得带有重组质粒的细菌形成白色菌落。

原因：1）载体与目的基因连接做的不好，重组质粒太少，大量的自连载体进入感受态细胞。

2）酶切不完全，未被酶切的空载体进入感受态细胞。

11. 已知一个基因的核酸序列，如何进行蛋白表达？步骤？

①目的基因的获取：提取RNA，反转录成cDNA，以cDNA为模板，根据核酸序列设计引物，PCR扩增目的基因②克隆载体的选择与构建：提取质粒DNA③重组质粒的构建，即外源基因与表达载体的连接：双酶切，电泳检测，切胶回收目的片段，连接，获得重组质粒。

④重组DNA导入受体菌：转化，将重组质粒导入受体菌⑤重组体的筛选：用菌落PCR方法筛选阳性克隆，并将阳性菌落保存留种。

⑥克隆基因的表达：先将菌种复苏、扩繁；用IPTG分别诱导阳性克隆菌和空载体菌；取适量蛋白样，处理好后，上样、跑胶，染色、脱色、拍照。观察重组蛋白的表达情况。

a. 对于阳性克隆菌，向5ml菌液中加入IPTG至终浓度0.6mM（30ul 0.1M IPTG），继续震荡培养；

b. 对于空载体菌，向5ml菌液中加入30ul 0.1M IPTG （终浓度0.6mM IPTG）；

12.质粒的特点是什么？

结构：大多为共价、闭合环状、超螺旋（circular covalently closed DNA,cccDNA)

功能：正常生长非必须的，但赋予细菌某些性状特征（具有遗传标记）

复制和遗传：细菌内的共生型遗传因子，其复制独立于细菌染色体,但复制和转录依赖于宿主编码的蛋白和酶。

可以转移。

13.PCR的原理是什么？PCR程序通常有哪几个步骤？

聚合酶链式反应 (Polymerase Chain Reaction，PCR）是模拟体内DNA的复制过程，在体外特异性扩增DNA片段的方法，从而获得大量的同一序列DNA。每经过一轮扩增，模板分子数增加一倍，经过n次循环后，模板分子数变为原来的2n倍。

步骤：

PCR由变性--退火--延伸三个基本反应步骤构成：①模板DNA的变性：模板DNA经加热至93℃左右一定时间后，使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应作准备；②模板DNA与引物的退火(复性)：模板DNA 经加热变性成单链后，温度降至55℃左右，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合；

③引物的延伸：DNA模板--引物结合物在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP为反应原料，靶序列为模板，按碱基配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA 链互补的半保留复制链重复循环变性--退火--延伸三过程，就可获得更多的“半保留复制链”，而且这种新链又可成为下次循环的模板。每完成一个循环需2～4分钟， 2～3小时就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍。

14.当两种限制酶反应条件不同时，若要用双酶切，应采取什么措施？

答：要避免星活性及部分酶切。（1）先用低盐缓冲液中活性最高的酶切，再补盐和第二种酶；（2）用一种酶消化后，以酚：氯仿：异戊醇抽提，再经乙醇沉淀，将DNA重新溶解与适合第二种酶的缓冲液，加第二种酶消化；（3）先低温酶，后高温酶；（4）使用通用缓冲液。

15.大肠杆菌转化（CaCl2法）的原理？

0℃下，细菌处于CaCl2的低渗溶液中，菌体细胞膨胀成球形，DNA与CaCl2形成羟基-钙磷酸复合物，粘附于细胞表面，经42℃短时间热击处理，促使细胞吸收DNA复合物，在丰富培养基上生长数小时后，球状细胞复原并分裂增值，被转化的细菌中，重组子基因得以表达，在抗生素选择性培养基平板上，可选出所需的转化子。

16.感受态细胞制备及转化中的影响因素？

①细胞的生长状态和密度

最好从-70℃甘油保存的菌种中直接转接用于制备感受态细胞的菌液。

②质粒DNA的质量和浓度

③整个操作过程均应在无菌条件下进行，所用器皿及试剂都要灭菌。

④用纯的试剂，注意防止被其它试剂、DNA酶或杂DNA所污染

⑤整个操作均需在冰上进行，不能离开冰浴

⑥CaCl2处理后细胞很脆，动作要轻，慢。

17.CaCl2法制备感受态细胞转化DNA时，低温的主要目的是什么？热休克温度和目的是什么？

低温目的：

（1）抑制细胞的旺盛生理代谢；（2）有助于DNA—Ca2+吸附于细胞表面

（3）防止DNAase降解DNA 。

热休克温度是42℃；目的是使细胞摄入吸附于其表面的DNA。

18.影响PCR扩增的因素有那些？

引物的质量与特异性；PCR循环条件（退火温度）；Mg2+浓度；模板DNA的质量；酶的质量。

19.引物设计的基本原则？

①引物长度一般在18~25碱基之间。

②避免引物内和引物之间的二级结构

③两个引物的Tm值要接近。

④ G+C含量在40%~60%之间，避开局部富含GC或AT，3’端避开AT rich结构

⑤碱基要随机分布。

⑦引物之间不能有连续4个碱基的互补，特别是3’末端的3个碱基。

⑧引物应用核酸系列保守区内设计并具有特异性。

⑨引物5′端可以修饰，引物3′端不可修饰。

20.SDS-PAGE的原理？

SDS是一种阴离子表面活性剂，它能破坏蛋白质分子之间以及其他物质分子之间的非共价键，使蛋白质变性而改变原有的构象。蛋白质分子与SDS充分结合。

PAGE聚丙烯酰胺凝胶是由单体丙烯酰胺(简称Acr)和交联剂N,N-甲叉双丙烯酰胺(简称Bi )在加速剂N N N′ N′-四甲基乙二胺(简称TEMED)和催化剂过硫酸铵 (简称AP)或核黄素的作用下聚合交联成三维网状结构的凝胶。

21.SDS-PAGE电泳的速率为什么只与蛋白的分子量有关，而与所带电荷多少无关？

蛋白质分子与SDS充分结合后，所带的SDS的负电荷远远大于蛋白质本身的电荷量，因而就掩蔽或消除了不同种类蛋白质分子间的电荷差异对电泳迁移率的影响。电泳迁移率主要取决于蛋白质的分子量。

22.提取RNA过程中，怎样才能有效地降低材料本身给RNA提取带来的降解？

①新鲜细胞：如果试剂没有问题，且外源性污染也可以排除，那么降解几乎都来自裂解液的用量不足。如果将裂解液直接加入培养皿中裂解细胞，一定要使裂解液能覆盖住细胞。

②新鲜组织：某些富含内源核酸酶的样品(如肝脏，胸腺等)，即使使用电动匀浆器匀浆也不能避免RNA的降解。更可靠的方法是：在液氮条件下将组织研碎，并且匀浆时使用更多裂解液。

③冷冻样品：样品取材后应立即置于液氮中速冻，然后移至-70℃冰箱保存。样品决不能未经液氮速冻而直接保存于-70℃冰箱中。冷冻样品，即使是冷冻细胞，如果不在液氮条件下研磨碎，而直接加入裂解液中匀浆，RNA也比新鲜样品更容易降解。样品在与裂解液充分接触前决不能出现融化，所以研磨用具必须预冷，在碾磨过程中要及时补充液氮。样品研碎后，在液氮刚刚挥发完时，将样品迅速转移到含裂解液的容器中，立即混匀匀浆。

④外源RNA酶的污染：试剂，器械及实验环境中的RNA酶进入实验系统。

⑤内源RNA酶的污染：抑制剂失效或者用量不够，实验样品过多；匀浆时温度过高

23.异硫氰酸胍法提取RNA的原理？

异硫氰酸胍可以裂解细胞释放出核酸，并同时使蛋白质变性，抑制内源的RNase活性。在酸性条件下（NaAc pH4.0），RNA溶于水相，而DNA溶于有机相。这样，在加入苯酚/氯仿后，RNA就溶于上层水相中，而DNA溶于下层苯酚/氯仿中，蛋白处于中间层。含有RNA的水相被转移出来以后，在异丙醇的作用下沉淀，从而被分离出来。

24.理想状态下DNA、RNA OD260/280分别为多少？在什么范围比较合适？偏大或偏小分别说明什么？

①基因组DNA 1.7

2.0)，比值<1.8：蛋白质污染；比值>2.0: RNA污染

②理想的RNA2.0, OD260/280在1.9-2.1之间。比值如果过低，可能有蛋白质污染，过高RNA可能已发生降解。如果OD260/OD280过低（<1.7），通常可以通过减少组织和细胞的用量来实现。

OD260/OD280比值偏低？

蛋白质污染：确保不要吸入中间层及有机相。减少起始样品量，确保裂解完全、彻底。加入氯仿后首先要充分混匀，并且离心分层的离心力和时间要足够。如果所得RNA的OD260/OD280比值偏低，则用氯仿重新抽提一次，再沉淀，溶解。

苯酚残留：确保不要吸入中间层及有机相。加入氯仿后首先要充分混匀，并且离心分层的离心力和时间要足够。

多糖或多酚的残留：一些特殊的组织和植物中，多糖、多酚含量较多，这些残留也会导致OD260/OD280比值偏低。因此，从这类材料中提取RNA时，需要注意多糖、多酚杂质的去除。

设备限制：测定OD260及OD280数值时，要使OD260读数在0.1-0.5之间。此范围线性最好。用水稀释样品：测OD值时，对照及样品稀释液请使用10mM Tris，pH7.5或TE 。用水作为稀释液将导致比值偏低。

25.基因组DNA提取的一般原理？如何判断基因组DNA的浓度和质量？

①将分散好的真核生物组织细胞在含SDS和蛋白酶K的溶液中消化分解蛋白质，再用酚：异戊醇抽提的方法去除蛋白质，得到的DNA经乙醇沉淀或透析等方法进一步纯化。

②紫外分光光度法 OD280；琼脂糖凝胶电泳

③基因组DNA的质量检验：紫外分光光度法 OD260/280; OD260/230；酶切法（Hind III ）、完整性检测：基因组DNA电泳，在电场中泳动慢，如果发生降解，可出现电泳图谱脱尾现象。

26.提取基因组DNA的用途有哪些？

构建基因组文库、Southern 杂交、RFLP、基因克隆（PCR）、制作基因芯片

27.提取基因组DNA所用试剂：组织消化液(100ml)： 5ml 1M Tris-HCl、4ml 0.5M EDTA、2ml 10% SDS、 150ul 60mg/ml Protease K； Tris饱和酚；酚/氯仿（1:1）；氯仿；无水乙醇； 70%乙醇；5M NaCl； TE

28.RNase的来源？

样品、试剂、多次使用的器皿、手、说话产生的唾沫、空气

29.RNase酶注意事项

①玻璃器皿处理：量筒、试剂瓶等玻璃器皿须200℃烘烤2小时以上。

②塑料器皿处理：0.1%焦碳酸二乙酯（DEPC）水溶液处理，再用蒸馏水冲净。。

③试剂处理：实验用的所用试剂也可用DEPC处理，加入DEPC至终浓度0.1%，然后剧烈震荡混匀10分钟，然后高压灭菌以消除残余的DEPC。

④专用的RNA操作室、专用器械。

⑤操作时戴口罩、帽子、手套

一般情况下采用用DEPC配制的70%乙醇擦洗取液器的内部和外部，基本达到要求。

注意：DEPC与氨水混合后会产生致癌物，须小心在通风柜中使用。

30.组织和细胞样品收集，保存？

①组织样品收集后，需要立即保存在液氮中(1min)，或在样品中加入一定量的保护剂，有一些商业化的产品可以选用（RNA later， RNA store）。

②一般实验收集50-100mg组织就足够了。

31.RNA保存(-80℃)：DEPC-H2O 、0.1 mM EDTA、TE (10mM Tris, 1mM EDTA)

32.如何估计RNA的产量？

①RNA的含量与组织和细胞的类型有比较大的关系, 同时与抽提的方式有关

②mRNA的含量一般占总RNA含量的2-5%

③样品如果低于20mg或10000个细胞，在抽提时需要考虑加入合适的RNA沉淀载体。

④电泳，加RNA marker来定量

⑤紫外分光光度计（OD260），通常0.5-1.5ug/ul比较合适

33.常用的RNA提取方法？

异硫氰酸胍法、盐酸胍法、RNAzol法；Trizol是一种新型总RNA抽提试剂，内含异硫氰酸胍等物质，能迅速破碎细胞，抑制细胞释放出的核酸酶。

Trizol试剂含有苯酚，具有毒性和刺激性，注意操作。

34.Solution D的成分及其作用？

①4M 异硫氰酸胍（裂解细胞，抑制RNase）②25mM 柠檬酸钠， pH7.0 (缓冲液)③

0.5% 十二烷基肌酸钠（裂解细胞，抑制RNase）④DEPC水配制

35.Trizol法提取昆虫中肠总RNA需要的试剂：

氯仿：异戊醇（24:1）、异丙醇、75%乙醇（in?DEPC-treated?water ）、RNase?free 水或0.5%?SDS 溶液[准备不含 RNase的水，将其装入不含RNase的玻璃瓶中，加入diethylpyrocarbonate?(DEPC)?to?0.01%?(v/v)。静置过夜，然后高压灭菌。0.5%?SDS 溶液必须用DEPC预处理、高压灭菌的水]。

36.昆虫中肠总RNA的提取

组织匀浆、相分离、沉淀RNA、洗涤RNA、沉淀再溶解、RNA检测

37.RNA提取注意事项

①在提取液中加入巯基乙醇对降低酚类的干扰可能有所帮助

②在沉淀核酸时可用乙醇与异丙醇，乙醇的极性要强于异丙醇，所以一般用2V乙醇沉淀，但在多糖、蛋白含量高时，用异丙醇沉淀可部分克服这种污染，尤其用异丙醇在室温下沉淀对摆脱多糖、杂蛋白污染更为有效。

③溶于TE的核酸储藏稳定性要高于水溶液中的核酸。另外核酸样品保存时要求以高浓度保存，低浓度的核酸样品要比高浓度的更易降解。

④在抽提过程中，若蛋白质含量或其它的杂质还较多，可以增加抽提次数。

⑤提取RNA请尽量在低温下操作。

38.如何提高RNA提取效率？

充分匀浆，以分散细胞；选择合适的提取方法；选择新鲜的组织；选择合适的样品储存条件；避免内源和外源Rnase的污染；正确的沉淀方法：乙醇沉淀：0.1 倍体积的5 M NH4Ac + 2-2.5 倍体积的无水乙醇， -20 ℃ >25 min ；异丙醇沉淀：0.6-1倍体积的异丙醇。

39.mRNA的分离纯化：采用Oligo dT-纤维素，从总RNA中分离出mRNA。

该法利用mRNA 3‘末端有Poly（A）的特点，在总RNA流经寡聚（dT）-纤维素柱时，在高盐缓冲液的作用下， mRNA被特异地结合在柱上，当逐渐降低盐的浓度洗脱时，mRNA被洗脱下来。一般而言，经过二次Oligo dT柱后，可得到较高纯度的mRNA。

40.核酸的贮存——DNA保存：

1）短期贮存： 4℃或-20℃存放于TE（Tris和EDTA）缓冲液中。TE缓冲液(PH为8)，可减少DNA脱氨反应；EDTA可以抑制DNase的活性。

2）长期贮存：TE缓冲液中-70℃保存数年；

41.提取基因组DNA主要试剂的作用：

EDTA：二价金属螯合剂，抑制核酸酶；降低细胞膜的稳定性

SDS的作用：溶解膜蛋白和脂肪，从而使细胞膜破裂；溶解核膜和核小体，使其解聚，将核酸释放出来；对RNA、DNA酶有抑制作用；与蛋白质形成复合物，使蛋白质变性

蛋白酶K：水解蛋白质的作用，消化DNA酶和细胞中的蛋白质；蛋白酶K与其他蛋白酶相比，它具有更强的水解能力，而且在SDS、EDTA存在时仍保持较高活性，可同时使用。

苯酚的特点：

蛋白质强变性剂、抑制DNA酶活性；苯酚溶于有机溶剂，微溶于水；提取DNA前苯酚用Tris-Hcl饱和，防止吸收过多DNA，降低DNA的损失率；氧化苯酚会破坏DNA。

42.为什么苯酚要重蒸饱和后才能用于DNA的分离？

苯酚在空气中经常被氧化生成醌，它能够产生自由基，直接用于DNA分离，会使磷酸二酯键断裂，造成DNA降解。

氧化苯酚需要经过高温重蒸以除去氧化物，并用Ttis-Hcl饱和酚，并调节至中性。

PH8.0的Tris溶液可以使的抽提出的DNA进入水相，减少在蛋白质层滞留。

在酚或酚-氯仿中加入少许的异戊醇，是可以减少实验中的气泡的产生，而且利于分相，保持分相的稳定性。

无水乙醇沉淀：沉淀前往往加入NaCl等盐离子，作用是中和核酸分子表面的负电荷，有助于分子之间的聚集。无水乙醇可以吸收分子之间的水，使DNA沉淀析出。

43.一个合格表达载体的组成要素：

①复制起始位点Ori。即控制复制起始的位点。原核生物DNA分子中只有一个复制起始点。而真核生物DNA分子有多个复制起始位点。

②抗生素抗性基因。可以便于加以检测，如Amp+ ,Kan+

③多克隆位点MCS克隆携带外源基因片段

④P/E 启动子/增强子

⑤Terms 终止信号

⑥加poly（A）信号可以起到稳定mRNA作用

44.原核表达系统中的各因素：

复制子：通常情况下质粒拷贝数和表达量是非线性的正相关

筛选标记和报告基因：氨苄青霉素，卡那霉素

启动子：启动子的强弱是对表达量有决定性影响的因素之一

组成型表达 :组成型启动子

诱导调控型表达 :IPTG

融合表达：GST, His-tag

分泌表达 :信号肽，可以引导目的蛋白穿越细胞膜

可溶性表达 :

转录终止子 :控制转录的RNA长度提高稳定性，避免质粒上异常表达导致质粒稳定性下降

核糖体结合位点 :多数载体启动子下游都有SD序列

表达菌株 :不同的表达载体对应有不同的表达菌株

45.对原核表达载体应该注意3点：①选择合适的启动子及相应的受体菌；②用于表达蛋白质时注意阅读框错位；③根据表达天然蛋白质或融合蛋白来选择相应的表达载体。

46.琼脂糖凝胶电泳原理

琼脂糖凝胶电泳是以琼脂糖凝胶作为固体支持基质进行的电泳。主要利用DNA分子在电场中泳动时的电荷效应和分子筛效应来达到分离混合核酸的目的。

47.影响电泳速率的因素

DNA分子量的大小、DNA的分子构象、琼脂糖凝胶的浓度、电压、电泳缓冲液的离子强度

48.二型限制酶只需镁离子，识别切割特异性强，切割发生在识别位点。

49.限制酶切割后的DNA电泳得到的电泳条带有些扩散

有蛋白质与DNA结合、酶切条件不合适、有外切核酸酶污染、星号活性

50.连接注意事项

反应液：应有ATP和Mg2+,而不要有高盐或EDTA，应使CIP,BAP 或SAP完全失活，DNA 应具5‘磷酸基团。

DNA浓度：总DNA量应1-10ug/ml, 否则太多DNA不能形成环状DNA。目的基因：载体的摩尔浓度比应是3：1。（经验：回收插入片段浓度30ng/ul左右连接效率最好，大于10ng/ul 比较保险，小于5ng/ul连接效率很低）

转化时连接产物量：不能加太多连接产物到感受态细胞，一般是50ul细胞加1-5ul连接物(约12ng pDNA)

酶量和反应时间：根据产家定义来决定，一般16℃过夜或25℃/1h

实验结果的正确分析？

①实验一质粒DNA提取：T-easy Vector质粒DNA浓度非常低（20-80ng/ul；proB质粒DNA浓度较正常（80-220ng/ul）；电泳条带拖尾现象（加样过多，离子浓度，胶未完全凝固）；质粒DNA的带型分析；电泳条带浓度确定

②实验二：回收效率低的可能原因：

1.胶块未完全溶解；可适当延长水浴时间，并增加上下颠倒次数辅助溶解；

2. 胶块体积太大，应先将其切为小块，分多次回收；

3.电泳缓冲液pH太高，硅基质膜在高盐低pH结合DNA，如pH太高，应作适当调整；可在溶胶时加入10ul pH5.0 3mol/L的NaAC；为使DNA更好拦截在膜上，可添30%异丙醇在加热溶解后的液体里。

4.漂洗液中的乙醇未充分挥发；

5.加洗脱液时未加在膜上；

6.洗脱效率低。加洗脱液后可在55度下 5min或在50度10min再离心，等等。

实验三：连接产物转化效率低的原因

①回收产物质量（挖胶回收过程中，紫外下曝光过长，DNA或受到损伤）

②连接反应体系的问题：Buffer，ATP/Mg离子，若buffer储存时间过长，ATP降解，导致连接失败。体系中盐浓度过高或EDTA含量高会导致连接失败。

实验五GST的诱导表达：脱色不彻底；上样量稍多（蛋白浓度大）；

离心不彻底；空载体表达出条带：增加胶浓度（12-15%）、延长电泳时间，以增加分辨率。

现代分子生物学复习题

现代分子生物学一.填空题 1.DNA的物理图谱是DNA分子的限制性内切酶酶解片段的排列顺序。 2.核酶按底物可划分为自体催化、异体催化两种类型。 3.原核生物中有三种起始因子分别是IF-1、 IF-2 和IF-3 。 4.蛋白质的跨膜需要信号肽的引导，蛋白伴侣的作用是辅助肽链折叠成天然构象的蛋白质。 5.真核生物启动子中的元件通常可以分为两种：核心启动子元件和上游启动子元件。 6.分子生物学的研究内容主要包含结构分子生物学、基因表达与调控、DNA重组技术三部分。 7.证明DNA是遗传物质的两个关键性实验是肺炎球菌感染小鼠、T2噬菌体感染大肠杆菌这两个实验中主要的论点证据是：生物体吸收的外源DNA改变了其遗传潜能。 8.hnRNA与mRNA之间的差别主要有两点： hnRNA在转变为mRNA的过程中经过剪接、 mRNA的5′末端被加上一个m7pGppp帽子，在mRNA3′ 东隅已逝 2 桑榆非晚！

末端多了一个多聚腺苷酸(polyA)尾巴。 9.蛋白质多亚基形式的优点是亚基对DNA的利用来说是一种经济的方法、可以减少蛋白质合成过程中随机的错误对蛋白质活性的影响、活性能够非常有效和迅速地被打开和被关闭。 10.质粒DNA具有三种不同的构型分别是： SC构型、 oc 构型、 L构型。在电泳中最前面的是SC构型。 11.哺乳类RNA聚合酶Ⅱ启动子中常见的元件TATA、GC、 CAAT所对应的反式作用蛋白因子分别是TFIID 、SP-1 和 CTF/NF1 。 12.与DNA结合的转录因子大多以二聚体形式起作用，转录因子与DNA结合的功能域常见有以下几种螺旋-转角-螺旋、锌指模体、碱性-亮氨酸拉链模体。 13.转基因动物常用的方法有：逆转录病毒感染法、DNA 显微注射法、胚胎干细胞法。 14.RNA聚合酶Ⅱ的基本转录因子有、TFⅡ-A、TFⅡ-B、 TFII-D、TFⅡ-E他们的结合顺序是： D、A、B、E 。其中TFII-D的功能是与TATA盒结合。 15.酵母DNA按摩尔计含有32.8%的T,则A为_32.8%_,G 为_17.2%_和C为_17.2%__。 16.操纵子包括_调控基因、调控蛋白结合位点和结构基因。 17.DNA合成仪合成DNA片段时，用的原料是模板DNA 东隅已逝 3 桑榆非晚！

分子生物学实验指导(精)

分子生物学实验指导生物技术教学室编宁夏大学生命科学学院 2008年8月

实验一分子生物学实验技术多媒体演示 [目的要求] 通过多媒体试验录像进一步掌握分子生物学基本操作技术。 [教学方式] 多媒体光盘演示。 [实验内容] 基本的分子生物学实验操作技术包括核酸凝胶电泳技术；质粒提取；转化；重组体的筛选；PCR技术等。

实验二琼脂糖凝胶电泳检测DNA [目的要求] 通过本实验学习琼脂糖凝胶电泳检测DNA的方法和技术 [实验原理] 琼脂糖凝胶电泳是分离鉴定和纯化DNA片段的常用方法。DNA分子在琼脂糖凝胶中泳动时有电荷效应和分子筛效应，DNA分子在高于等电点的pH溶液中带负电荷，在电场中向正极移动。由于糖磷酸骨架在结构上的重复性质，相同数量的双链DNA几乎具有等量的净电荷，因此它们能以同样的速度向正极方向移动。不同浓度琼脂糖凝胶可以分离从200bp至50 kb的DNA片段。在琼脂糖溶液中加入低浓度的溴化乙锭（Ethidum bromide ,EB），在紫外光下可以检出 10ng的DNA条带，在电场中，pH8.0条件下，凝胶中带负电荷的DNA向阳极迁移。琼脂糖凝胶有如下特点： (1) DNA的分子大小在凝胶基质中其迁移速率与碱基对数目的常用对数值成反比，分子越大迁移得越慢。 (2) 琼脂糖浓度一个特定大小的线形DNA分子,其迁移速度在不同浓度的琼脂糖凝胶中各不相同。DNA电泳迁移率(u)的对数与凝胶浓度(t)成线性关系。 (3) 电压低电压时，线状DNA片段迁移速率与所加电压成正比。但是随着电场强度的增加，不同分子量DNA片段的迁移率将以不同的幅度增长，随着电压的增加，琼脂糖凝胶的有效分离范围将缩小。要使大于2kb的DNA片段的分辨率达到最大，所加电压不得超过5v/cm。 (4) 电泳温度DNA在琼脂糖凝胶电泳中的电泳行为受电泳时的温度影响不明显，不同大小的DNA片段其相对迁移速率在4℃与30℃之间不发生明显改变，但浓度低于0.5%的凝胶或低熔点凝胶较为脆弱，最好在4℃条件下电泳。 (5) 嵌入染料荧光染料溴化乙锭用于检测琼脂糖凝胶中的DNA，染料嵌入到堆积的碱基对间并拉长线状和带缺口的环状DNA,使其刚性更强,还会使线状迁移率降低15%。 (6) 离子强度电泳缓冲液的组成及其离子强度影响DNA电泳迁移率。在没有离子存在时（如误用蒸馏水配制凝胶，电导率最小，DNA几乎不移动，在高离子强度的缓冲液中（如误加10×电泳缓冲液），则电导很高并明显产热，严重时会引起凝胶熔化。

分子生物学实验指

DNA分离核酸包括DNA、RNA两种分子在细胞中都是以与蛋白质结合的状态存在。真核生物的染色体DNA为双链线性分子；原核生物的"染色体"、质粒及真核细胞器DNA为双链环状分子；有些噬菌体DNA有时为单链环状分子；RNA分子在大多数生物体内均是单链线性分子；不同类型的RNA分子可具有不同的结构特点，如真核自由RNA分子多数在3'端带有ploy(A)结构。至于病毒的DNA、RNA分子，其存在形式多种多样，有双链环状、单链环状、双链线状和单链线状等。 95%的真核生物DNA主要存在于细胞核内，其它5%为细胞器DNA，如线粒体、叶绿体等。RNA分子主要存在于细胞质中，约占75%，另有10%在细胞核内，15%在细胞器中。RNA以rRNA 的数量最多(80%~85%),tRNA及核内小分子RNA占10%~15%，而mRNA分子只占1%~5%，mRNA分子大小不一,序列各异。总的来说，DNA分子的总长度一般随着生物的进化程度而增大，而mRNA 的分子量与生物进化无明显关系。分离纯化核酸总的原则：①应保证核酸一级结构的完整性；②排除其它分子的污染。为了保证核酸结构与功能的研究，完整的一级结构是最基本的要求,因为遗传信息全部贮存在一级结构之内。核

酸的一级结构还决定其高级结构的形式以及和其它生物大分子结合的方式。核酸的纯化应达到的要求：①核酸样品中不应存在对酶有抑制作用的有机溶剂和过高浓度的金属离子；②其它生物大分子如蛋白质、多糖和脂类分子的污染应降低到最低程度；③排除其它核酸分子的污染，如提取DNA分子时,应去除RNA分子，反之亦然。实验过程中注意事宜: ①尽量简化操作步骤，缩短提取过程，以减少各种有害因素对核酸的破坏；②减少化学因素对核酸的降解，为避免过酸、过碱对核酸链中磷酸二酯键的破坏，操作多在pH4~10条件下进行；③减少物理因素对核酸的降解，物理降解因素主要是机械剪切力，其次是高温。机械剪切力包括强力高速的溶液震荡、搅拌,使溶液快速地通过狭长的孔道；细胞突然置于低渗液中；细胞爆炸式的破裂以及DNA样品的反复冻贮。这些操作细节在实验操作中应备加注意。机械剪切作用的主要危害对象是大分子量的线性DNA分子，如真核细胞的染色体DNA。对分子量小的环状DNA分子，如质粒DNA及RNA分子,威胁相对小一些。高温,如长时间的煮沸，除水沸腾带来的剪切力外，高温本身对核酸分子中的有些化学键也有破坏作用。核酸提取过程中,常规操作温度为0~4℃,此温度环境降低核酸酶的活性与反应速率,减少对核酸的生

分子生物学题库

分子生物学备选考题名词解释: 1.功能基因组学 2.分子生物学 3.epigenetics 4.C值矛盾 5.基因簇 6.间隔基因 7.基因芯片 8.基序（Motifs） 9.CpG岛 10.染色体重建 11.Telomerase 12.足迹分析实验 13.RNA editing 14.RNA干涉（RNA interference） 15.反义RNA 16.启动子（Promoter） 17.SD序列(SD sequence) 18.碳末端结构域（carboxyl terminal domain，CTD） 19.single nucleotide polymorphism，SNP 20.切口平移（Nick translation） 21.原位杂交 22.Expressing vector 23.Multiple cloning sites 24.同源重组 25.转座 26.密码的摆动性 27.热休克蛋白嵌套基因 28.基因家族增强子 29.终止子 30.前导肽RNAi 31.分子伴侣 32.魔斑核苷酸 33.同源域 34.引物酶 35.多顺反子mRNA 36.物理图谱、 37.载体（vector） 38.位点特异性重组 39.原癌基因（oncogene） 40.重叠基因、 41.母源影响基因、

42.抑癌基因（anti-oncogene）、 43.回文序列（palindrome sequence）、 44.熔解温度（melting temperature, Tm） 45.DNA的呼吸作用（DNA respiration） 46..增色效应（hyperchromicity）、 47.C0t曲线（C0t curve）、 48.DNA的C值（C value） 49.超螺旋(superhelix) 、 50.拓扑异构酶（topoisomerase）、 51.引发酶(primase) 、 52.引发体(primosome) 53.转录激活(transcriptional activation) 54.dna基因(dna gene)、 55.从头起始(de novo initiation) 、 56.端粒（telomere） 57.酵母人工染色体（yeast artificial chromosome, YAC）、 58.SSB蛋白（single strand binding protein）、 59.复制叉(replication fork)、 60.保留复制(semiconservative replication) 61.滚环式复制(rolling circle replication)、 62.复制原点(replication origin)、 63.切口(nick) 64.居民DNA (resident DNA) 65.有义链(sense strand) 66.反义链(antisense strand) 67.操纵子(operon) 、 68.操纵基因(operator) 69.内含子(内元intron) 70.外显子(外元exon) 、 71.突变子(muton) 、 72.密码子（codon）、、 73.同义密码（synonymous codons）、 74.GC盒(GC box) 75.增强子(enhancer) 76.沉默子(silencer) 77.终止子(terminator) 78.弱化子（衰减子）(attenuator) 79.同位酶(isoschizomers) 、 80.同尾酶(isocandamers) 81.阻抑蛋白（阻遏蛋白）(repressor) 82.诱导物（inducer）、 83.CTD尾（carboxyl-terminal domain ） 84.载体（vector）、 85.转化体(transformant)

分子生物学实验复习题附答案(最新整理)

分子生物学复习题实验一DNA的制备（1）为什么分子生物学实施时要担心EB？溴化乙锭（Ethidium bromide）是DNA诱变剂，溴化乙锭可以嵌入碱基分子中，导致错配。具有高致癌性(接触致癌) （2）DNA加样缓冲液的用途是什么？由于植物细胞匀浆含有多种酶类(尤其是氧化酶类)对DNA的抽提产生不利的影响，在抽提缓冲液中需加入抗氧化剂或强还原剂(如巯基乙醇)以降低这些酶类的活性。线状DNA大小/kb60-520-110-0.87-0.56-0.44-0.23-0.1 （4）琼脂糖凝胶电泳分离DNA的原理是什么 DNA分子在pH值高于其等电点的溶液中带负电荷，在电场中向阳极移动。DNA分子在电场中通过琼脂糖凝胶而泳动，除了电荷效应以外，还有分子筛效应。由于DNA分子可片段的相对分子质量不同，移动速度也不同，所以可将相对分子质量不同或构象不同的DNA分离。DNA片段迁移距离（迁移率）与碱基对的对数成反比，因此通过已知大小的标准物移动的距离与未知片段的移动距离时行比较，便可测出未知片段的大小。但是当DNA分子大小超过20kb时，普通琼脂糖凝胶就很难将它们分开。此时电泳的迁移率不再依赖于分子大小，因此，就用琼脂糖凝胶电泳分离DNA时，分子大小不宜超过此值。（5）琼脂糖凝胶电泳时胶中DNA是靠什么发出荧光的？为什么？溴化乙锭是一种高度灵敏的荧光染色剂,可插入DNA双螺旋结构的两个碱基之间，形成一种荧光络合物。在254nm波长紫外光照射下，呈现橙黄色的荧光。用溴化乙啶检测DNA，可检出10-9g以上的DNA 含量。（6）制备基因组DNA时用到的以下试剂分别起什么作用？ CTAB等离子型表面活性剂，能溶解细胞膜和核膜蛋白，使核蛋白解聚，从而使DNA得以游离出来氯仿有机溶剂，能使蛋白质变性，并使抽提液分相，因核酸(DNA、RNA)水溶性很强，经离心后即可从抽提液中除去细胞碎片和大部分蛋白质。无水乙醇上清液中加入无水乙醇使DNA沉淀，沉淀DNA溶于TE溶液中，即得植物总DNA溶液。75%乙醇,乙醇轻轻洗涤管壁实验二RNA的制备 1.制备RNA时通常要注意些什么？为什么？应该要注意(1)不要徒手操作,必须带手套;(2)加样时不能够大声说话,防止唾液等进入; 由于RNA分子的结构特点，容易受RNA酶的攻击反应而降解，加上RNA酶极为稳定且广泛存在，因而在提取过程中要严格防止RNA酶的污染，并设法抑制其活性，这是本实验成败的关键。 2.制备的RNA通常有哪些用途？制备的DNA通常又有哪些用途？研究基因的表达和调控时常常要从组织和细胞中分离和纯化RNA。质粒DNA构建克隆载体,分离目的基因 3.RNA制备好后是通过什么方法检测其有没有降解的？从胶上检测什么指标来判断RNA质量好坏？为什么？

分子生物学实验技术考试题库

一、名词解释 1.分配常数：又称分配系数，是指一种分析物在两种不相混合溶剂中的平衡常数。 2.多肽链的末端分析：确定多肽链的两末端可作为整条多肽链一级结构测定的标志，分为氨基端分析和羧基端分析。 3.连接酶：指能将双链DNA中一条单链上相邻两核苷酸连接成一条完整的分子的酶。 4.预杂交：在分子杂交实验之前对杂交膜上非样品区域进行封闭，用以降低探针在膜上的非特异性结合。 5.反转录PCR：是将反转录RNA与PCR结合起来建立的一种PCR技术。首先进行反转录产生cDNA,然后进行常规的PCR反应。 6.稳定表达：外源基因转染真核细胞并整合入基因组后的表达。 7.基因敲除：是指对一个结构已知但功能未知或未完全知道的基因，从分子水平上设计实验，将该基因从动物的原基因组中去除，或用其它无功能的DNA片断取代，然后从整体观察实验动物表型，推测相应基因的功能。 8.物理图谱：人类基因组的物理图是指以已知核苷酸序列的DNA片段为“路标”，以碱基对(bp，kb，Mb)作为基本测量单位(图距)的基因组图。 9.质谱图：不同质荷比的离子经质量分析器分开后，到检测器被检测并记录下来，经计算机处理后所表示出的图形。 10.侧向散射光：激光束照射细胞时，光以90度角散射的讯号，用于检测细胞内部结构属性。

11.离子交换层析：是以离子交换剂为固定相，液体为流动相的系统中进行的层析。 12.Edman降解：从多肽链游离的N末端测定氨基酸残基的序列的过程。 13.又称为限制性核酸内切酶(restriction endonuclease)：是能够特异识别双链DNA序列并进行切割的一类酶。 14.电转移：用电泳技术将凝胶中的蛋白质，DNA或RNA条带按原位转移到固体支持物，形成印迹。 15.多重PCR：是在一次反应中加入多对引物，同时扩增一份模板样品中不同序列的PCR 过程。 16.融合表达: 在表达载体的多克隆位点上连有一段融合表达标签（Tag），表达产物为融合蛋白（有分N端或者C端融合表达），方便后继的纯化步骤或者检测。 17.同源重组：发生在DNA同源序列之间，有相同或近似碱基序列的DNA分子之间的遗传交换。 18.遗传图谱又称连锁图谱(linkage map)，它是以具有遗传多态性的遗传标记为“路标”，以遗传学距离为图距的基因组图。 19.碎片离子：广义的碎片离子为由分子离子裂解产生的所有离子。 20.前向散射光：激光束照射细胞时，光以相对轴较小角度向前方散射的讯号用于检测细胞等离子的表面属性，信号强弱与细胞体积大小成正比。 21.亲和层析:利用共价连接有特异配体的层析介质分离蛋白质混合物中能特异结合配体的目的蛋白或其他分子的一种层析法。(利用分子与其配体间特殊的、可逆性的亲和结合

分子生物学实验思考题答案

分子生物学实验思考题答案实验一、基因组DNA的提取 1、为什么构建DNA文库时，一定要用大分子DNA? 答、文库的大小(即数目)取决于基因组的大小和片段的大小，片段大则文库数目小一些也可以包含99%甚至以上的基因组。而文库数目小则方便研究人员操作和文库的保存。所以构建文库要用携带能力大的载体克隆尽量大的DNA片段. 2、如何检测和保证DNA的质量？答、用凝胶电泳看，有没有质白质和RNA等物质的污染，还可以测OD，用OD260/280来判断，当OD260/OD280< 1.8，表示蛋白质含量较高当OD260/OD280> 2.0，表示RNA含量较高当OD260/OD280=1.8～2.0，表示DNA较纯。实验二、植物总RNA的提取 1、RNA酶的变性和失活剂有哪些？其中在总RNA的抽提中主要可用哪几种？答、有DEPC,Trizol，氧钒核糖核苷复合物，RNA酶的蛋白抑制剂以及SDS，尿素，硅藻土等；在总RNA提取中用PEPC,Trizol 2、怎样从总RNA中进行mRNA的分离和纯化。答、、利用成熟的mRNA的末端具有polyA尾的特点合成一段oligo(dT)的引物，根据碱基互补配对原则，可将mRNA从总RNA中分离出来实验四、大肠杆菌感受态细胞的制备 1、感受态细胞制备过程中应该注意什么？答、A）细菌的生长状态：不要用经过多次转接或储于4℃的培养菌，最好从-80℃甘油保存的菌种中直接转接用于制备感受态细胞的菌液。细胞生长密度以刚进入对数生长期时为宜，可通过监测培养液的OD600 来控制。DH5α菌株的OD600为0.5时，细胞密度在5×107 个/mL左右，这时比较合适。密度过高或不足均会影响转化效率。 B）所有操作均应在无菌条件和冰上进行；实验操作时要格外小心，悬浮细胞时要轻柔，以免造成菌体破裂，影响转化。 C）经CaCl2处理的细胞，在低温条件下，一定的时间内转化率随时间的推移而增加，24小时达到最高，之后转化率再下降（这是由于总的活菌数随时间延长而减少造成的）；D）化合物及无机离子的影响：在Ca2+的基础上联合其他二价金属离子（如Mn2+或Co2+）、DMSO或还原剂等物质处理细菌，可使转化效率大大提高（100-1000倍）； E）所使用的器皿必须干净。少量的去污剂或其它化学物质的存在可能大大降低细菌的转化效率； 2、感受态细胞制备可用在哪些研究和应用领域？答、在基因工程中将质粒导入受体细胞是如果受体细胞是细菌则将它用Ca2+处理变为感受态细胞质粒进入。实验五、质粒在大肠杆菌中的转化和鉴定 1、在热激以后进行活化培养，这时的培养基中为什么不加入抗生素？答、活化培养用的一般是SOC培养基，这种培养基比LB培养基营养，此时进行的活化培养只是为了让大肠杆菌迅速复苏，恢复分裂活性，此时的细胞还不具抗性，加入抗生素会细胞会死亡。 2、什么是质粒？根据在细菌中的复制，质粒有几种类型？用于基因重组的主要用到哪些质粒？

《分子生物学》实验指导(2015-2016)

《分子生物学》实验指导实验1 总DNA提取生物总DNA的提取是分子生物学实验的一个重要内容。由于不同的生物材料细胞壁的结构和组成不同，而细胞壁结构的破坏是提取总DNA的关键步骤。同时细胞内的物质也根据生物种类的不同而有差异，因此不同生物采用的提取方法也不同，一般要根据具体的情况来设计实验方法。本实验介绍采用CTAB法提取植物总DNA的技术。 [实验目的] 学习和掌握学习CTAB法提取植物总DNA的基本原理和实验技术。学习和掌握紫外光吸收法鉴定DNA的纯度和浓度。 [实验原理] 植物叶片经液氮研磨，可使细胞壁破裂，加入去污剂（如CTAB），可使核蛋白体解析，然后使蛋白和多糖杂质沉淀，DNA进入水相，再用酚、氯仿抽提纯化。本实验采用CTAB法，其主要作用是破膜。CTAB 是一种非离子去污剂，能溶解膜蛋白与脂肪，也可解聚核蛋白。植物材料在CTAB的处理下，结合65℃水浴使细胞裂解、蛋白质变性、DNA 被释放出来。CTAB与核酸形成复合物，此复合物在高盐（>0.7mM）浓度下可溶，并稳定存在，但在低盐浓度（0.1-0.5mM NaCl）下CTAB-核酸复合物就因溶解度降低而沉淀，而大部分的蛋白质及多糖等仍溶解于溶液中。经过氯仿/ 异戊醇(24:1) 抽提去除蛋白质、多糖、色素等来纯化DNA，最后经异丙醇或乙醇等沉淀剂将DNA沉淀分离出来。由于核酸、蛋白质、多糖在特定的紫外波长都有特征吸收。核酸及其衍生物的紫外吸收高峰在260nm。纯的DNA样品A260/280≈1.8，纯的RNA样品A260/280≈2.0，并且1μg/ml DNA 溶液A260=0.020。 [实验器材] 1、高压灭菌锅 2、冰箱 3、恒温水浴锅 4、高速冷冻离心机 5、紫外分光光度计 6、剪刀 7、陶瓷研钵和杵子 8、磨口锥形瓶（50ml） 9、滴管10、细玻棒11、小烧杯（50ml）12、离心管（50ml）13、植物材料 [实验试剂] 1、3×CTAB buffer（pH8.0） 100mM Tris 25mM EDTA 1.5M NaCl 3% CTAB 2% β-巯基乙醇 2、TE缓冲液（pH8.0） 10mmol/L Tris·HCl 1mmol/L EDTA 3、氯仿-异戊醇混合液（24：1，V/V） 4、95％乙醇 5、液氮 [实验步骤] 1、称取2g新鲜的植物叶片，用蒸馏水冲洗叶面，滤纸吸干水分。 2、将叶片剪成1cm长，置预冷的研钵中，倒入液氮，尽快研磨成粉末。 3、待液氮蒸发完后，加入15mL预热（60℃）的CTAB提取缓冲液，转入一磨口锥形瓶中，

分子生物学实验

分子生物学实验 MolecularBiology Experiments 【课程编号】021*******【课程类别】学科基础课【学分数】3学分【适用专业】生物科学、生物技术【学时数】 96学时【编写日期】 2009年6月一、教学目标本课程是在分子生物学及基因工程等理论课的基础上，开设的一门综合性兼设计性实验课程。该的教学内容主要突出实验技术的基础性和实用性，把目前最基本的分子生物学实验技术融入具体的系列实验中形成综合与设计性大实验。一方面让每个同学通过实际操作来达到更好地训练学生们的实验技术技能的目的；另一方面让学生全面地掌握基因工程的实验技术与方法、实验的设计原理、结果分析方法和分子生物学的基本原理，进一步培养学生的独立分析问题、解决问题的能力并学会如何利用实验手段实现科学研究的基本思维和目的，提高学生从事科学研究的综合素质。二、教学内容和学时分配实验一、实验总论5 学时基础性主要内容：分子生物学基本实验技术简介和实验准备（清理仪器、试剂配置、培养基的配置与灭菌）教学要求：了解分子生物学实验课的目的与要求、设计思路、评分标准及仪器操作规范；掌握试剂与培养基的配置、灭菌方法与操作技能。重点、难点：学习试剂的配置、仪器操作规范。实验二、碱性磷酸酶基因的克隆与筛选42学时综合性主要内容：质粒DNA的提取与定性分析；PCR基因扩增及扩增产物的回收；DNA重组（酶切、连接、转化与筛选）教学要求：了解原核基因克隆与筛选的全过程与实验设计策略、载体的基本结构、基因工程酶（限制性内切酶、连接酶、Taq酶）的各种特性、DNA重组以及重组子筛选与鉴定的相关技术；理解基因克隆与筛选的策略及其相关实验原理、碱裂解法质粒提取过程中各种纯化步骤的设计思想， PCR引物设计以及PCR体系设计的原则与注意事项、DNA重组时设计酶切与连接方案的一般规律、重组DNA导入受体细胞方法以及目的重组子的筛选与鉴定方法、影响DNA重组效率的因素；

分子生物学实验项目三

实验三植物基因组DNA的提取实验目的通过本实验学习从植物组织中提取DNA的方法。实验原理利用液氮对植物组织进行研磨，从而破碎细胞。细胞提取液中含有SDS溶解膜蛋白而破坏细胞膜，使蛋白质变性而沉淀下来。EDTA抑制DNA酶的活性。再用酚、氯仿抽提的方法去除蛋白，得到的DNA溶液经乙醇沉淀。仪器、材料与试剂（一）仪器 1低温离心机 2 恒温水浴锅 3 台式离心机 4 琼脂糖凝胶电泳系统 5 微量加样器（二）材料与试剂 1 三羟甲基氨基甲烷（Tris） 2 乙二胺四乙酸（EDTA） 3 氯化钠（Nacl） 4 β-巯基乙醇 5 氯化钾（KCl） 6 异丙醇

7 乙醇 8 琼脂糖 9 十二烷基硫酸钠（SDS） 10 50mL离心管 11陶瓷研钵 12 吸头、小指管 13 细胞提取液 100mmol/L Tris.HCl(PH 8.0) 5 mmol/L EDTA(PH 8.0) 500 mmol/L Nacl 1.25% SDS 1 mmol/L β-巯基乙醇 14 5 mol/L KCl 15 TE缓冲液 10 mmol/L Tris.HCl(PH 8.0) 1 mmol/L EDTA(PH 8.0) 16 哥伦比亚野生型拟南芥（Arabidopsis Columbia）三周幼叶。 17 TIANGEN基因组DNA提取试剂盒（Plant Genomic DNA Kit）（离心柱型）。实验步骤一、自配试剂提取步骤

1 取4g新鲜叶片，在液氮中充分研磨成粉末状（越细越好）。 2 将研磨好的粉末转移至50mL的离心管中，加入16mL细胞提取液，充分混匀，65℃水浴保温20min。 3 从水浴中取出离心管，加入5mL5mol/L的KCl溶液，混匀，冰浴20min。 4 4000r/min离心20min。 5 降上清液转移到另一50mL的离心管中。 6 加等体积的酚/氯仿混匀，12000 r/min离心5min，取上清。 7 加等体积氯仿，混匀，12000r/min离心5min，取上清。 8 加入0.6-1倍体积的异丙醇（沉淀DNA），混匀。 9 离心获得沉淀，加70%乙醇洗涤3次，风干沉淀。 10加入500μLTE缓冲液，溶解DNA。 11取3 mL上清液，琼脂糖凝胶电泳检测DNA的浓度和质量。二植物基因组DNA提取试剂盒提取步骤 1、拟南芥基因组DNA的提取以野生型拟南芥(Arabidopsis Columbia)2周幼叶为材料（称取叶片约100毫克），用TIANGEN基因组DNA提取试剂盒（Plant Genomic DNA Kit）（离心柱型）按以下步骤提取基因组DNA： 1) 取干净幼叶100mg，加入液氮充分研磨。 2) 将研磨好的粉末迅速转移到预先装有700μL65℃预热缓冲液GP1的离心管中（实验前在预热的GP1加入巯基乙醇，使其终浓度为0.1%），迅速颠倒混匀后，将离心管放在65℃水浴中20分钟，水浴过程中颠倒离心管以混合样品数

分子生物学实验心得体会

关于分子生物学实验的体会梁慧媛（生技01 级）不知不觉间，一年的时间就这样流逝了，与分子生物实验相伴，对我而言，的确不同寻常。并不仅仅是学习生物学实验技术和方法的宝贵经历，它意味着更多。首先是实验条件、实验过程、实验设计的完备性，从这里可以初步感受到生物学研究的科学性与严肃性，自己可以得到宝贵的机会，亲身体会生物学研究的苦辣酸甜。一直一直喜欢，得到正确实验结果时刻的畅快感，那是无法言明的欣慰感，一次身心彻底地放松，可以将所有一整天来积累的疲劳抛之身后，即使仅仅是小小的成功，也会让我们兴奋不已。在整理资料，将一年来保存的记录一遍一遍的翻看，重温其中的特别滋味，我，轻轻地笑了。我，喜欢这里，喜欢生物学。失误是常有的，经历过吃惊、后悔、无奈，检讨分析，最后重新开始。一波三折的记忆清晰的印在脑海中，这种深深的挫折感，再试一次的勇气，我会一生记取的。一年间，随着对生物学实验知识和技能的进一步学习，我更坚定了自己学习生物学的志向，感谢分子生物学实验的"试炼" 。分子生物学实验心得体会刘东强（生科01 级）分子生物学实验室本科生第一次接触到了真正培养实验能力的实验课，它不同于我们在大二开的植物、动物、微生物等实验课。在这些课上，主要以制备样品并观察样品的形态、结构特征为主，这是由于我们当时正值大二，专业知识还远不够。随着以后理论课学习的深入，我们开始了分子生物学实验的学习，这无疑对于深刻巩固我们理论课上学到的知识是有帮助的，也进一步加深了对原有知识的理解，如启动子的概念、类型、PCR的原理等。另外，在实验课中，我们掌握并学会如何运用分子生物学研究中的一些基本实验技术，如质粒的提取、总RNA 的制备、PCR 技术等。我们的实验动手能力通过亲身接触实验过程并亲自设计一些实验得到了提高，使我们不再象刚开始做分子生物学实验的时候照搬实验指导上的实验步骤，而是通过我们自己的思考，根据现有的实验条件，对原有的步骤作必要的改进。此外，通过这门实验课的学习，我们形成了严谨的态度，如有时得出的实验结果与理论不符，我们渐渐养成了仔细分析实验结果的习惯，查找在实验设计或操作过程中出现的问题，同时对理论知识认识得更清楚。总之，我认为，分子生物学实验课，是称得上实用、精彩、有意思的好实验，对于今后我的研究或工作很有价值刘佳凝（生技01 级）一学期的分子生物学实验对我来说很重要，同时通过一学期的实践让我给分子生物学有了较深入地体会： 1、很感谢由我系生化组老师们编写的这本实验指导。里面的实验原理与操作步骤都清晰易懂，有助于我

分子生物学试验基础知识

分子生物学实验基础知识分子生物学是在生物化学基础上发展起来的，以研究核酸和蛋白质结构、功能等生命本质的学科，在核酸、蛋白质分子水平研究发病、诊断、治疗和预后的机制。其中基因工程（基因技术，基因重组）是目前分子生物学研究热点，这些技术可以改造或扩增基因和基因产物，使微量的研究对象达到分析水平，是研究基因调控和表达的方法，也是分子水平研究疾病发生机制、基因诊断和基因治疗的方法。转化（trans formation）、转染、转导、转位等是自然界基因重组存在的方式，也是人工基因重组常采用的手段。基因重组的目的之一是基因克隆（gene clone），基因克隆可理解为以一分子基因为模板扩增得到的与模板分子结构完全相同的基因。使需要分析研究的微量、混杂的目的基因易于纯化，得以增量，便于分析。外来基因引起细胞生物性状改变的过程叫转化（transformation），以噬菌体把外源基因导入细菌的过程叫转染（transfection）。利用载体（噬菌体或病毒）把遗传物质从一种宿主传给另一种宿主的过程叫转导（transduction）。一个或一组基因从一处转移到基因组另一处的过程叫转位（transposition），这些游动的基因叫转位子。一、基因工程的常用工具（一）载体载体（Vector）是把外源DNA（目的基因）导入宿主细胞，使之传代、扩增、表达的工具。载体有质粒（plasmid）、噬菌体、单链丝状噬菌体和粘性末端质粒（粘粒）、病毒等。载体具有能自我复制；有可选择的，便于筛选、鉴定的遗传标记；有供外源DNA插入的位点；本身体积小等特征。质粒存在于多种细菌，是染色体（核）以外的独立遗传因子，由双链环状DNA组成，几乎完全裸露，很少有蛋白质结合。质粒有严紧型和松弛型之分。严紧型由DNA多聚酶Ⅲ复制，一个细胞可复制1-5个质粒。而松弛型由DNA多聚酶Ⅰ复制，一个细胞可复制30-50个质粒，如果用氯霉素可阻止蛋白质合成，使质粒有效利用原料，复制更多的质粒。质粒经过改造品种繁多，常用的有pBR322、pUC系列等。这些质粒都含有多个基本基因，如复制起动区（复制原点Ori），便于复制扩增；抗抗生素标记（抗氨芐青霉素Ap r、抗四环素Tc r等）或大肠埃希菌部分乳糖操纵子（E.coli LacZ）等，便于基因重组体的筛选；基因发动子（乳糖操纵子Lac、色氨酸操纵子Trp等）和转录终止序列，便于插入的外源基因转录、翻译表达。质粒上还有许多限制性内切酶的切点，即基因插入位点，又叫基因重组位点，基因克隆位点。常用噬菌体载体有单链噬菌体M13系统；双链噬菌体系统。噬菌体应和相应的宿主细胞配合使用。以上载体各有特点，便于选择，灵活应用。（二）工具酶

分子生物学实验设计实验

分子生物学实验设计实验题目：在大肠杆菌中表达绿色荧光基因（EGFP ）学院：生命科学学院专业：生态学教师：吴传芳姓名/学号：余光辉/20 方成/20

一、实验目的在大肠杆菌中表达绿色荧光蛋白二、实验流程三、实验试剂、材料及步骤 (一)质粒DNA的提取 1.原理碱裂解法是一种应用最为广泛的制备质粒DNA的方法，其基本原理为：当菌体在NaOH和SDS溶液中裂解时，蛋白质与DNA发生变性，当加入中和液后，质粒DNA分子能够迅速复性，呈溶解状态，离心时留在上清中；蛋白质与染色体DNA不变性而呈絮状，离心时可沉淀下来。经过苯酚、氯仿抽提，RNA酶消化和乙醇沉淀等简单步骤去除残余蛋白质和 RNA，所得纯化的质粒DNA已可满足细菌转化、DNA片段的分离和酶切、常规亚克隆及探针标记等要求 2.试剂 LB培养液:胰蛋白胨（Tryptone）10g，酵母提取物（Yeast extract）5 g，NaCl 5g，琼脂（固体培养基）15g，用1N NaOH调pH 7.5。溶液Ⅰ：50mmol/L 葡萄糖， 10mmol/ EDTA-Na， 25mmol/L Tris-HCl (pH8.0) 溶液Ⅱ：0.4mol/L NaOH ， 2% SDS 临用前1：1配制。溶液Ⅲ：5mol/L 醋酸钾60ml 冰醋酸11.5ml 双蒸水28.5ml 卡那霉素(20mg/mL) 抽提液（饱和酚：氯仿：异戊醇=25：24：1 ）无水乙醇 70%乙醇 TE缓冲液或ddH2O

3.材料含质粒pET-28a和pEGFP-N3菌液 1.5ml塑料离心管 EP管架微量取液器和取液器吸头常用玻璃器皿 4.实验步骤（1）将带有质粒pET-28a和pEGFP-N3的大肠杆菌接种在液体培养基中（加氨苄青霉素50μg/mL），37℃培养过夜（2）取培养菌液1.5mL置Eppendorf小管中，10000rpm×2min，弃上清液（3）加入100μL溶液I，漩涡器上充分混匀，在室温下放置10 min （4）加入200μL新配制的溶液Ⅱ，轻轻翻转2~3次，使之混匀，冰上放置5 min （5）加入150μL冰冷的溶液Ⅲ，加盖后温和颠倒数次使混匀，产生白色絮状物，冰上放置15 min （6）10000rpm×5 min，取上清液于另一干净的离心管中（7）向上清液中加入等体积（约400μL）酚/氯仿/异戊醇（25:24:1，v/v），振荡混匀，10000rpm ×10 min，将上清液转移至新的离心管中（8）加入等体积（约370μL）氯仿/异戊醇（24:1），混匀，离心2min ,取上清液于新离心管中（9）向上清液加入2倍体积无水乙醇，混匀，-200C放置1h （10）12000rpm × 5 min，倒去上清液，把离心管倒扣在吸水纸上，吸干液体（11）加0.8mL70%乙醇，离心1 min，倒去上清液，真空抽干或室温自然干燥30min （12）加30μL ddH2O ，-200C保存备用 5.注意（1）饱和酚（取下层）单独吸200μL，氯仿：异戊醇（24：1）吸200μL （2）制备质粒过程中，所有操作必须缓和，不要剧烈振荡（特别是加入溶液II 和III ），以避免机械剪切力对DNA的断裂作用 (二)DNA琼脂糖凝胶电泳检测 1.原理在质粒提取的过程中，由于操作原因，提取的质粒可能有三种：线性DNA、开环DNA 、闭环超螺旋DNA 。当提取的质粒DNA电泳时,同一质粒DNA泳动速度：闭环超螺旋〉线状〉开环。但有时也有也会出现相反情况，因为与琼脂糖浓度、电流强度、离子强度及核酸染料含量有关。 2.试剂 Gold view（DNA染料） 0.5×TBE缓冲液上样缓冲液（6×） 3.材料提取的pEGFP-N3和pET-28a ，琼脂糖，锥形瓶，一次性手套，胶铲，封口膜，

分子生物学常用实验指南

生命科学系 2011-2012学年度分子生物学实验（0801班）

2011-2012学年度分子生物学实验指导实验一大肠杆菌感受态细胞的制备 (3) 实验二质粒DNA的转化 (4) 实验三质粒DNA的提取 (5) 实验四琼脂糖凝胶电泳检测DNA (7) 实验五PCR基因扩增 (9) 实验六DNA重组 (10) 实验七蓝白斑筛选实验 (11) 实验八DNA酶切技术 (13)

实验一大肠杆菌感受态细胞的制备一、实验目的：掌握大肠杆菌感受态细胞的制备技术二、实验原理：感受态——细菌处在容易吸收外源DNA的状态。我们选用经过基因改造的生物工程菌株——大肠杆菌top10菌株为材料，在0℃、CaCl2低渗溶液处理，细胞壁破坏，细胞成为球型原生质体。因而具备了吸收外源DNA的能力。三、仪器：1.超净工作台 2.低温离心机 3.恒温摇床 4.紫外分光光度仪四、材料与试剂： 1.大肠杆菌top10菌株 2. 0.1mol/L CaCl2溶液500mL、 0.2mol/L CaCl2溶液50mL 3..LB液体及固体培养基 4.50%甘油500mL（灭菌）五、实验操作步骤： 1.从大肠杆菌top10菌株平板上挑取一个单菌落，接种于3mL LB液体培养基中， 37℃振荡（200r/min）培养过夜。 2.次日早上取0.4mL菌液转接到40mL LB液体培养基中，37℃震荡培养2～3h.(A600 应在0.4～0.5之间) 3.将菌液置冰浴中10min。（同时将0.1mol/L CaCl2溶液、50%甘油预冷） 4.取菌液1.5mL，4℃离心2min（3500r/min）.弃上清，再加菌液1.5mL，4℃再离心一次，弃上清，倒置以便使培养液流尽。 5.用冰冷的0.1mol/L CaCl2溶液1mL悬浮细胞（轻轻涡旋使悬浮），立即置冰浴保温30min。 6.4℃离心2min（3500r/min），弃上清，加入100μL冰冷的0.2mol/L CaCl2溶液、 100μL50%甘油轻轻手摇悬浮，置冰浴上，接着进行质粒DNA转化，或-70℃保存。

(整理)分子生物学1``1题库.

核酸的生物合成一、试题题目 (一)名词解释 1．中心法则 2．半保留复制 3．DNA聚合酶 4．解旋酶 5．拓扑异构酶 6．单链DNA结合蛋白 7．DNA连接酶 8．引物酶及引物体 9．复制叉 10．复制眼、θ结构11.前导链 12．冈崎片段、后随链 13．半不连续复制14．逆转录 15．逆转录酶 16．突变 17，点突变 18．结构畸变 19．诱变剂 20．修复 21．光裂合酶修复 22．切除修复 23．重组修复 24．诱导修复和应急反应 25．DNA 重组 26．基因工程 27．转录 28．模板链(反意义链) 29．非模板链(编码链) 30．不对称转录 31．启动子 32．转录单位 33．内含子 34．外显子 35．转录后加工 36．核内不均一RNA 37．RNA复制 (二)问答题 1．试述Meselson和Stahl关于DNA半保留复制的证明实验。 2．描述大肠杆菌DNA聚合酶I在DNA生物合成过程中的作用。 3．试述DNA复制过程，总结DNA复制的基本规律。 4．什么是逆转录?病毒中的单链RNA如何利用逆转录酶合成双链DNA，并整合到寄主细胞的基因组中?

5．DNA的损伤原因是什么? 6．简述基因工程的基本操作步骤及其应用意义。 7．试比较转录与复制的区别。 8. 试列表比较常染色质DNA与端粒DNA的复制。 9. 将大肠杆菌从37度转移到42度时，其基因表达如何变化？ 10.简述原核生物转录作用的过程。 11.试比较真核生物与原核生物mRNA转录的主要区别。 (三)填空题 1．Meselson-Stahl的DNA半保留复制证实试验中，区别不同DNA用_______方法。分离不同DNA用_______方法，测定DNA含量用_______方法， 2．DNA聚合酶I(E．coli)的生物功能有_______、_______和_______作用。用蛋白水解酶作用DNA聚合酶I，可将其分为大、小两个片段，其中_______片段叫Klenow 片段，具有_______和_______作用，另外一个片段具有_______活性。 3．在E．coli中，使DNA链延长的主要聚合酶是_______，它由_______亚基组成。DNA聚合酶Ⅱ主要负责DNA的_______作用。 4．真核生物DNA聚合酶有_______，_______，