成纤维样滑膜细胞原代培养方法的优化论文
原代细胞的培养与建系
原代细胞的培养与建系(一) 细胞的来源多样，培养方法也各不相同，凡是来源于胚胎、组织器官及外周血，经特殊分离方法制备而来的原初培养的细胞称之为原代细胞。原代细胞经分散接种之手段称为传代。凡能经传代方式进行再次培养的细胞称为传代细胞。若能稳定生长传至10~20代以上的细胞可确立为细胞系。若有条件能开展单细胞克隆、纯化，经大量扩增后所形成的生物学特性稳定的克隆化细胞群，称之为细胞株或克隆细胞。此过程称为细胞的纯化或细胞克隆。这些基本技术是从事细胞培养工作的基础，只有熟悉和掌握了基本技术，才可能更快捷地学习和掌握其他方法，本章重点叙述常用的基本技术。 第一节原代细胞的取材 人和动物细胞的取材是原代细胞培养成功的首要条件，是进行细胞培养的第一步，若取材不当，将会直接影响细胞的体外培养，现将取材的基本要求和注意事项叙述如下： 一、取材的基本要求 （1）取材要注意新鲜和保鲜新鲜组织易于培养成功，取材时应尽量在4~6h内能制作成细胞，尽快入箱培养，若不能即时培养，应将组织浸泡于培养液内，于4℃存放。若组织块较大，应在清除表面血块、坏死组织、脂肪和结缔组织后，切碎于培养液内4℃存放，但时间不能超过24h.对于已切碎的组织或血液、淋巴组织应加入含10%二甲基亚砜的培养基，按细胞冻存方式于液氮中冷冻保存。 （2）取材应严格无菌所取标本材料应在无菌条件下进行，为了确保无菌，对所取材料若疑有污染的可能，应将所取组织在含高浓度抗菌素（400单位/mL）甚至加入适量的两性霉素B或10%达克宁液的培养液内于4℃下存放2小时以上，再用PBS洗2~3次，以确保所取材料无菌。要用无菌包装的器皿或事先消毒好的带少许培养液（内含400单位/mL抗菌素）的小瓶等便于携带的物品来取材，所取材料应避免接触有毒有害的化学物质，如碘、汞等。 （3）取材和原代细胞制作时，要用锋利的器械，如手术刀或剃须刀片切碎组织，尽可能减少对细胞的机械损伤。 （4）要仔细去除所取材料上的血液（血块）、脂肪、坏死组织及结缔组织，切碎组织时应避免组织干燥，可在含少量培养液的器皿中进行。 （5）取材应注意组织类型、分化程度、年龄等，一般来讲，胚胎组织较成熟个体组织容易培养，分化低的较分化高的组织容易生长，肿瘤组织较正常组织容易培养。取材时应尽量选用易培养的组织进行培养。 （6）原代细胞取材时要同时留好组织学标本和电镜标本。对组织的来源、部位、包括供体的一般情况要做详细的记录，以备以后查询。 二、各类组织的取材技术
原代细胞培养与分离
原代细胞的培养与建系 凡是来源于胚胎、组织器官及外周血，经特殊分离方法制备而来的原初培养的细胞称之为原代细胞。细胞的纯化或细胞克隆技术是细胞培养工作的基础。 原代细胞的取材 人和动物细胞的取材是原代细胞培养成功的首要条件，直接影响细胞的体外培养。 一、取材的基本要求 .1．取材要注意新鲜和保鲜 .2．应严格无菌 .3．防止机械损伤 .4．去除无用组织和避免干燥 .5．应注意组织类型、分化程度、年龄等 .6．作好记录 二、各类组织的取材技术 皮肤和粘膜的取材 内脏和实体瘤的取材 血液细胞的取材 骨髓、羊水、胸/腹水细胞取材 动物组织取材 人胚体组织取材 鸡（鸭）鸟类胚胎组织取材鸡（鸭）鸟类胚胎组织取材 皮肤和粘膜的取材 主要取自于手术过程中的皮片，方法似外科取断层皮片手术操作，但面积一般2~4平方厘
米。 内脏和实体瘤的取材 内脏除消化道外基本是无菌的，但取材时要明确和熟悉所需组织的类型和部位，实体瘤取材时要取肿瘤细胞丰富的区域，要避开破溃、坏死液化部分，以防污染，尽量去除混杂的结缔组织。 血液细胞的取材 血细胞、淋巴细胞的取材，一般多抽取静脉外周血，或从淋巴组织中（如脾、扁桃体、胸腺、淋巴结等）分离细胞，取材时应注意抗凝。 骨髓、羊水、胸/腹水细胞取材 严格无菌，注意抗凝，还要尽快分离培养，离心后，用无钙、镁PBS洗两次，再用培养液洗一次后即可培养，不宜低温存放。 动物组织取材 1、鼠胚组织取材 首先用引颈或气管窒息致死法处死孕期合适的动物，然后将其整个浸泡在含有75%酒精的烧杯中，5分钟后（注意时间不能太长，以避免酒精从口或其他通道进入体内，影响组织活力），取出动物，在消毒过的木板上可用无菌的图钉或大头针固定四肢，切开皮肤，用无菌操作法解剖取胚或用无菌止血钳挟起皮肤、用无菌眼科剪沿躯干中部环形剪开皮肤，用止血钳分别挟住两侧皮肤拉向头尾，把动物反包，暴露躯干，然后再固定，更换无菌解剖器材，采用无菌操作法解剖取出胚胎。 2、幼鼠胚肾（或肺）取材 幼鼠采用上述方法处死消毒后，腹部朝上固定在木板上，先切开游离毛皮并拉开至两侧：然后采用无菌法打开胸腔取肺，或背部朝上固定在木板上，先将背部毛皮切开游离并拉向两侧，
原代细胞培养和传代培养的方法及其注意事项
初代培养 原理 将动物机体的各种组织从机体中取出，经各种酶（常用胰蛋白酶）、螯合剂（常用EDTA）或机械方法处理，分散成单细胞，置合适的培养基中培养，使细胞得以生存、生长和繁殖，这一过程称原代培养。 仪器、材料及试剂 仪器：培养箱（调整至37℃），培养瓶、青霉素瓶、小玻璃漏斗、平皿、吸管、移液管、纱布、手术器械、血球计数板、离心机、水浴箱（37℃） 材料：动物组织块 试剂：1640培养基（含20%小牛血清），0.25%胰酶，Hank′s液，碘酒 初代消化培养法 1. 准备：取各种已消毒的培养用品置于净化台面，紫外线消毒20分钟。开始工作前先洗手、75%酒精擦拭手至肘部。 2. 布局：点燃酒精灯，安装吸管帽。 3. 处理组织：把组织块置于烧杯中，用Hanks液漂洗2~3次，去除血污；如怀疑组织可能污染，可先置于含有青链霉素的混合液中30~60分钟。 4. 剪切：用眼科剪把组织切成2~3毫米大小的块，以便于消化。加入比组织块总量多30~50倍的胰蛋白酶液，然后一并倒入三角烧瓶中，结扎瓶口或塞以胶塞。 5. 消化：或用恒温水浴，或置于37℃温箱消化均可，消化中每隔20分钟应摇动一次，如用电磁恒温搅拌器消化更好。消化时间依组织块的大小和组织的硬度而定。 6. 分离：在消化过程中见消化液发混浊时，可用吸管吸出少许消化液在镜下观察，如组织已分散成细胞团或单个细胞，立即终止消化，随即通过适宜不锈钢筛，滤掉尚未充分消化开的组织块。低速 （500~1000转/分）离心消化液5分钟，吸出上清，加入适量含有血清的培养液。 7. 计数：用计数板计数，如细胞悬液细胞密度过大，再补加培养液调整后，分装入培养瓶中。对大多数细胞来说，pH要求在7.2~7.4范围，培养液呈微红色，如颜色偏黄，说明液体变酸，可用NaHCO3调整。 8. 培养：置于36.5℃温箱培养，如用CO2温箱培养，瓶口需用纱布棉塞或螺旋帽堵塞，纱布塞易生霉菌，每次换液时需要换新塞。 初代组织块培养法 1. 剪切：把组织小块置于小烧杯或青霉素小瓶中，用Hanks液漂洗二三次以去掉表面血污，吸静Hanks液，用眼科剪反复剪切1mm3块为止。 2. 摆布：用弯头吸管吸取若干小块，置于培养瓶中，用吸管弯头把组织小块摆布在培养瓶底部，小块相互距离以0.5cm为宜，每一25ml培养瓶底可摆布20~30块。 3. 轻轻翻转培养瓶，另瓶底向上，注意翻瓶时勿另组织小块流动，塞好瓶塞，置36.5℃温箱培养2小时左右（勿超过4小时），使小块微干涸。 4. 培养：从微箱中取出培养瓶，开塞，46度斜持培养瓶，箱瓶底脚部轻轻注入培养液少许，然后缓缓再把培养瓶翻转过来，让培养液慢慢覆盖附于瓶地上的组织小块。置温箱中静止培养。待细胞从组织块游出数量增多后。再补加培养液。
成纤维细胞
本页已使用福昕阅读器进行编辑。 福昕软件（Ｃ）２００５－２００９，版权所有， 仅供试用。 成纤维细胞（fibroblast）成纤维细胞是疏松结缔组织的主要细胞成分，细胞呈梭形或扁 的星状，具有突起。根据不同的功能活动状态，将细胞分为成纤维细胞和纤维细胞二型：成 纤维细胞乃是功能活动旺盛的细胞，细胞和细胞核较大，轮廓清楚，核仁大而明显，细胞质 弱嗜碱性，具明显的蛋白质合成和分泌活动；纤维细胞（fibrocyte）功能活动不活跃，细胞 轮廓不明显，核小着色深，核仁不明显，细胞质少。此二型细胞可互相转化。 成纤维细胞：数目最多，胞体大，为多突的纺锤形或星形的扁平细胞，细，细胞核呈规 则的卵圆形，细胞轮廓不清。 成纤维细胞摄取所需的氨基酸，如脯氨酸和赖氨酸等，在粗面内质网的核蛋白体上合成 前α多肽链（proalpha polypeptide chain），多肽链输送到高尔基复合体后，组成前胶原分子（procollagen）。前胶原分子由分泌囊泡带到细胞表面，然后通过胞吐作用释放到细胞外。 在前胶原肽酶催化下，将每一前α多肽链的尾段除去，成为原胶原分子（tropocollagen）。 许多原胶原分子成行平行排列，结合成具有周期性横纹的胶原原纤维。由胶原原纤维互相结 合形成胶原纤维。 是结缔组织中最常见的细胞，由胚胎时期的间充质细胞(mesenchymal cell)分化而来。在 结缔组织中，成纤维细胞还以其成熟状态—纤维细胞(fibrocyte)的形式存在，二者在一定条 件下可以互相转变。不同类型的结缔组织含成纤维细胞的数量不同。通常，疏松结缔组织 中成纤维细胞的数量比同样体积的致密结缔组织中所含成纤维细胞的数量要少，故分离培养 成纤维细胞多以真皮等致密结缔组织为取材部位〔2，3〕。成纤维细胞形态多样，常见的有 梭形、大多角形和扁平星形等，其形态尚可依细胞的功能变化及其附着处的物理性状不同而 发生改变。成纤维细胞胞体较大，胞质弱嗜碱性，胞核较大呈椭圆形，染色质疏松着色浅， 核仁明显。电镜下，其胞质可见丰富的粗面内质网、游离核糖体和发达的高尔基复合体，表 明它具有合成和分泌蛋白质的功能。成纤维细胞尚可合成和分泌胶原纤维、弹性纤维、网状 纤维及有机基质。它合成的前胶原蛋白分子经内切酶作用，聚合和重排，可形成与成骨细胞 合成分泌的胶原原纤维一样具有64nm(640?)周期横纹的胶原原纤维，胶原原纤维经互相粘 合形成胶原纤维。经检测，这两种细胞合成分泌的胶原纤维均是Ⅰ型胶原纤维，在形态和生 化结构上完全相同。处于成熟期或称静止状态的成纤维细胞，胞体变小，呈长梭形，粗面 内质网和高尔基复合体均不发达，被称为纤维细胞。在外伤等因素刺激下，部分纤维细胞可 重新转变为幼稚的成纤维细胞，其功能活动也得以恢复，参与组织损伤后的修复。另外，在 结缔组织中，仍保留着少量具有分化潜能的间充质细胞，它们在创伤修复等情况下可增殖分 化为成纤维细胞。2 成纤维细胞在一般创伤修复中的表现各种创伤均会造成不同程度的细 胞变性、坏死和组织缺损，必须通过细胞增生和细胞间基质的形成来进行组织修复。在此修 复过程中，成纤维细胞起着十分重要的作用。以伤口愈合过程为例，成纤维细胞通过有丝分 裂大量增殖，并从4～5天或6天开始合成和分泌大量的胶原纤维和基质成分，与新生毛细 血管等共同形成肉芽组织，填补伤口组织缺损，为表皮细胞的覆盖创造条件。在伤口愈合中， 成纤维细胞主要来源于真皮乳头层的局部成纤维细胞和未分化的间充质细胞，以及血管周围 的成纤维细胞和周细胞。内脏损伤时，参与修复过程的成纤维细胞多来自间质和包膜，以及 粘膜下或浆膜下层的结缔组织。有人认为创伤愈合过程中伤处聚集的大量成纤维细胞，一方 面是由成纤维细胞通过分裂增殖而来，另一方面，更多地是由邻近的间充质细胞、纤维细胞 和毛细血管周细胞等演变或游走到伤处。在创伤修复的后期，成纤维细胞通过分泌胶原酶参 与修复后组织的改建。在某些病理条件下，以成纤维细胞为主要细胞成分的肉芽组织或增生 组织块还可以在非骨组织内发生钙化，引起异位骨化(ectopic ossification)。但对于异位骨化 的参与细胞及其机制尚不十分清楚，未分化间充质细胞、成纤维细胞、内皮细胞和毛细血管 周细胞等可划归为诱导性骨祖细胞的细胞都有可能参与这一过程
一 人皮肤成纤维细胞培养
Ist. Nazionale Neurologico Carlo Besta Laboratory Procedures for Human Cell Culture August 2004 _______________________________________________________________ PRIMARY FIBROBLAST CULTURE FROM HUMAN SKIN BIOPSY This protocol describes the steps for obtaining a primary fibroblast cell line from human skin biopsies. Fibroblasts are derived directly from excised skin as explants; enzyme digestion by collagenase may help obtain cells in a shorter time. This protocol describes the different steps for obtaining a primary cell line from a skin biopsy. Equipment and materials ?Laminar flow hood ?CO2 incubator ?Inverted microscope ?Sterile surgical Instruments for microdissection ?BME fibroblast medium +2 or Mg+2 ?PBS 10x without Ca ?Collagenase type II (4mg/ml) ?Petri dishes 100 mm ?Pasteur pipettes 2 ?Culture flask, 25 cm ?15 ml sterile plastic tube BME Fibroblast medium BME 80 ml Foetal bovine serum 20 ml Penicillin-streptomycin solution 100x 1 ml Filter and store at +4°C, up to 1 month. The skin biopsy sample should be shaped as a diamond and about 5-10 mm in diameter. Collect the tissue sample in sterile BME fibroblast medium. Procedure 1 1.Rapidly wash the skin biopsy in PBS in a Petri dish, cut into small fragments and transfer these to a flask. https://www.sodocs.net/doc/fb5855925.html,ing a sterile Pasteur pipette with flame-rounded tip, distribute the small tissue fragments over the bottom surface of the culture flask. 3.Pass the flask rapidly and carefully through the Bunsen flame in order to evaporate the medium so that the minced tissue pieces adhere to the plastic surface, but so as not to heat-damage the minced tissue. Take care not to cook the tissue! 4.Carefully add BME medium for fibroblast growth, firmly close the lid of the flask and place in CO2 incubator. 5.The next day, slightly unscrew the lid of the flask so that the tissue can “breathe.” 6.Replace the culture medium after two days and, from this point on, replace it three times a week.
细胞原代培养细胞生物学实验报告
细胞生物学实验报告 细胞原代培养 姓名： 学号： 班级： 专业： 同组成员： 一、实验原理
细胞培养是生物学和医学研究中最常用的手段之一，可分为原代培养和传代培养两种。原代培养是直接从生物体获取组织或器官的一部分进行培养。由于培养的细胞刚刚从活体组织分离出来，故更接近于生物体内的生活状态。这一方法可为研究生物体细胞的生长、代谢、繁殖提供有力的手段。同时也为以后传代培养创造条件。 原代培养的方法： 1、组织块法在平皿中用弯头剪把组织尽量剪碎，每个组织块小于1mm3大小。用Hanks 液洗涤2—3次，自然沉淀。用吸管吸去上清液。将组织块贴于培养瓶进行培养。 2、酶消化法将1mm3大小的组织块放入1个三角瓶内加入10—30ml的%的胰蛋白酶。370C磁棒搅拌消化20－30分钟。然后终止消化。用几层无菌纱布过滤。取过滤液，离心800rpm 5—10分钟收集细胞。弃上清，加入带有双抗的培养基，放入培养瓶培养。 取材注意事项： 取材要注意新鲜和保鲜。取材应严格无菌。取材和原代细胞制作时，要用锋利的器械，如手术刀或剃须刀片切碎组织，尽可能减少对细胞的机械损伤。要仔细去除所取材料上的血液（血块）、脂肪、坏死组织及结缔组织，切碎组织时应避免组织干燥，可在含少量培养液的器皿中进行。取材应注意组织类型、分化程度、年龄等，一般来讲，胚胎组织较成熟个体组织容易培养，分化低的较分化高的组织容易生长，肿瘤组织较正常组织容易培养。 二、实验目的 1、理解细胞原代培养原理 2、熟悉细胞原代培养方法与过程 3、了解细胞原代培养的应用 4、独立进行细胞原代培养操作 三、实验材料 手术小直剪刀、眼科直镊子、眼科弯镊子、玻璃平皿、培养瓶、试管、移液管、巴斯德吸管、废液缸、75%酒精棉球、酒精灯。 动物：9-12日龄的鸡胚蛋 四、实验步骤
成纤维细胞的培养
成纤维细胞的培养 1前言 成纤维细胞（fibroblast）是疏松结缔组织的主要细胞成分，细胞呈梭形或扁的星状，具有突起。根据不同的功能活动状态，将细胞分为成纤维细胞和纤维细胞二型：成纤维细胞乃是功能活动旺盛的细胞。 成纤维细胞是结缔组织中最常见的细胞，由胚胎时期的间充质细胞(mesenchymal cell)分化而来。在结缔组织中，成纤维细胞还以其成熟状态—纤维细胞(fibrocyte)的形式存在，二者在一定条件下可以互相转变。不同类型的结缔组织含成纤维细胞的数量不同。通常，疏松结缔组织中成纤维细胞的数量比同样体积的致密结缔组织中所含成纤维细胞的数量要少，故分离培养成纤维细胞多以真皮等致密结缔组织为取材部位[1,2]。 成纤维细胞的分离培养一开始并不涉及成骨作用，而主要是用于研究细胞的老化、各种外来因子对细胞的损伤、细胞在体外条件下的恶性转化、以及某些先天性代谢异常、酶缺陷等。由于皮肤成纤维细胞易于获取，又易于在体外生长，故目前皮肤成纤维细胞培养已在基础医学和临床医学研究中得到较广泛的运用，其分离培养技术已相对成熟，对其体外生长规律也有了较全面的认识。成纤维细胞的原代培养可用酶消化法或组织块法，其中组织块法又因其操作简便、条件易于控制而应用更为普遍[3]。 2材料和方法 2.1材料 玻璃器材：细胞培养瓶、500ml盐水瓶、青霉瓶、刻度吸管 塑料器材：细胞培养板 橡胶器材：细胞培养瓶胶塞、青霉素瓶塞、翻口胶塞和胶管 滤器；玻璃漏斗、微孔滤膜 2.2试剂的配制 水、0.4%酚红液、Hank’s液、MEM、无钙PBS液、双抗的配制、NaHCO3配制、新生犊牛血清（FCS)、原代和传代细胞分散液、3％谷氨酰胺、细胞生长液和细胞维持液、其他液体；洗液、无钙PBS胰酶液、Hank's液、 2.3方法 2.3.1试剂配制 （1）细胞分散液：无钙胰蛋白酶加4倍无菌蒸馏水 （2) 组织冲洗液：无血清MEM （3）细胞生长液：含10％FCS MEM 2.3.2实验分配：每人1枚鸡胚，每人制备1瓶100mL培养瓶细胞。 2.3.3细胞制备过程 碘酊消毒气室处蛋壳，去除蛋壳，撕开壳膜、尿囊膜和羊膜，取出鸡胚，用无血清MEM 冲洗3次，将鸡胚置于无菌平皿内，去除头、四肢和内脏，并将胚体置于另一个平皿内，用无血清MEM冲洗3次，剪碎胚体，静止片刻，吸净上清，加入5－10倍无钙胰蛋白酶，并吸入于无菌青霉素小瓶内，用橡皮膏封严瓶口，37 ℃消化至细胞呈毛球样，吸净消化液，加入细胞生长液，将细胞置于细胞培养瓶中，并用大口吸管吹打细胞使之充分分散，分装2个细胞培养瓶内。 4、换液或接毒 细胞于37℃培养过夜，次日换细胞维持液，或单层接种病毒，每日观察CPE。
滑膜性病变与骨性关节炎_陈智能
滑膜性病变与骨性关节炎 陈智能1 ,杨连梓 2 (1.福建中医学院骨伤系,福建福州350003;2.福建中医学院附属第二人民医院,福建福州350003)收稿日期:2003-03-29 作者简介:陈智能(1979)),男,2002级骨伤专业硕士研究生。 关键词:骨性关节炎;滑膜;细胞因子;细胞凋亡;综述 中图分类号:R84.3 文献标识码:A 文章编号:1004-5627(2003)04-0053-03 骨性关节炎(Osteoarthritis,OA )是一种严重危害人类健康的慢性进行性骨关节疾病,近几年 来随着对OA 的深入认识,开始注意到滑膜在OA 中的重要地位,从滑膜细胞的生物学特性与滑膜组织屏障这个新角度来探讨骨关节炎的发病机制,本文对近几年的文献作一综述。 1 中医对OA 的认识 中医学认为骨性关节炎属/骨痹0,/痹证0等的范畴。OA 的病因病机为本痿标痹。5内经6最早论述痹病的病因病机及其分类。5素问#脉要精微论6曰:/膝者,筋之府,曲伸不能,行则偻附,筋将惫矣。05素问#上古天真论6曰:/七八肝气衰,筋不能动,,肾脏衰惫,形体皆极。05素问#痹证6曰:/风寒湿三气杂至,合而为痹。0精辟地论述了骨关节病的内在因素和外在因素。随着增龄,肝肾日渐衰惫,难以充盈筋骨,骨枯髓减,筋不得滋润则出现关节疼痛,活动不利。2 滑膜组织的病理生理特性 滑膜是被覆关节腔内面的纤维结缔组织,可以分为靠近关节腔的滑膜内层(滑膜衬里层或滑膜细胞层)及其滑膜下层(滑膜衬里下层)。滑膜内层由多形性的滑膜细胞和滑膜细胞间颗粒状无定型的基质组成,无血管和淋巴管。由A 型(巨噬样滑膜细胞)、B 型(成纤维样滑膜细胞)以及C 型细胞(树突细胞样滑膜细胞)组成[1] 。滑膜细胞的功能:具有清除作用,如吞噬并降解关节腔内的异物及细胞碎片等;合成作用,如合成透明质酸、纤维结合素、?型、ò型胶原、潜在的胶原酶蛋白酶促进因子、中性蛋白酶的抑制剂、润滑素以及其他小的未确定的基质成分,参与滑膜免疫应答;保持关节结构稳定;分泌滑液营养和润滑关节软 骨;重吸收滑液,保持关节腔内环境稳定[1]。滑膜切除可导致软骨病变[2] 。3 滑膜细胞与细胞因子 3.1 IL -1 IL -1可干扰及抑制软骨细胞代谢,促进软骨降解。正常的滑膜能诱导产生IL -1刺激软骨细胞合成和分泌降解软骨蛋白聚糖的酶,从而参与关节软骨的代谢;滑膜细胞在受到脂多糖(LPS)刺激时,IL -1B 的分泌量则显著增加,而在OA 滑膜细胞培养中,在无丝裂原或其它因素刺激时,其上清液中始终可检测出较高水平的IL -1,其中以IL -1B 为主[3],说明滑膜细胞的异常分泌状态可能在OA 中起着重要作用。在鉴定IL -1B 的分布时发现,主要分布于骨关节炎滑膜的衬里层细胞、软骨与血管强交界处[3],进而反映了病理性滑膜分泌IL -1的重要作用。炎性滑膜大量合成IL -1B 等炎症前细胞因子,进而对软骨细胞功能进行调节,影响了软骨细胞外基质的稳态,炎症前细胞因子通过诱导蛋白溶解酶合成,加速软骨基质降解。IL -1通过增加胰岛素样生长因子1(IGF -1)受体蛋白的产生,干扰IGF -1等生长因子功能,从而对软骨及滑膜正常的修复和代谢功能产生影响。IL -1Ra 可与IL -1竞争结合滑膜细胞上的IL -1受体,是IL -1的天然拮抗剂,IL -1Ra 拮抗剂蛋白可阻止软骨破坏[4]。OA 和RA 滑膜的衬里层细胞、炎症浸润细胞以及血管内皮细胞中均强烈表达IL -1Ra 蛋白,表达的水平基本类似,说明IL -1Ra 参与了OA 和RA 的病理过程[5]。有研究表明IL -1Ra 阳性细胞主要局限于滑膜的衬里层细胞及血管内皮细胞,产生IL -1Ra 的滑膜细胞主要局限于A 型滑膜细胞,B 型滑膜细胞零星表达,而在正常软骨和滑膜中均未见明 53 福建中医学院学报2003年8月第13卷第4期Journal of Fujian College of T CM August 2003,13(4)
小鼠滑膜细胞使用说明
小鼠滑膜细胞 小鼠滑膜细胞产品说明： 为使客户能尽快开展实验，派瑞金发货的原代细胞均处于对数生长期，且每次发货为汇合率达到70%的细胞，收到细胞后即可开展实验。 派瑞金提供的小鼠滑膜细胞取自新鲜的组织，按照标准操作流程分离培养。研发的小鼠滑膜细胞完全培养基能提供细胞最佳的生长条件，降低杂细胞污染，保证不同批次间细胞质量的稳定。 同时，派瑞金还建立了严格的细胞鉴定流程，所提供的原代细胞均需经过细胞类型特异性标记物、细胞形态学等检测，保证细胞纯度在90%以上；同时也需经过微生物检测，保证不含有HIV、HBV、HCV、支原体、真菌及其他类型的细菌。 注意事项： 1. 收到细胞后首先观察细胞瓶是否完好，培养液是否有漏液、浑浊等现象，若有上述现象发生请及时和我们联系。 2. 仔细阅读细胞说明书，了解细胞相关信息，如细胞形态、所用培养基、血清比例、所需细胞因子等。 3. 请客户用相同条件的培养基用于细胞培养。培养瓶内多余的培养基可收集备用，细胞传代时可以一定比例和客户自备的培养基混合，使细胞逐渐适应培养条件;建议使用派瑞金的完全培养基。 4. 建议客户收到细胞后前3天各拍几张细胞照片，记录细胞状态。 5. 该细胞只能用于科研，不得用于临床应用。 小鼠滑膜细胞产品简介： 产品名称：小鼠滑膜细胞（Mouse Gastric Fibroblasts Cells） 组织来源：小鼠滑膜组织 产品规格：5×105cells / 25cm2培养瓶 小鼠滑膜细胞简介： 小鼠滑膜细胞分离自4-6周龄正常小鼠的滑膜组织，滑膜细胞主要功能：（1）滑膜细胞产生润滑液成分，并且与关节腔的吸收和血液/润滑液交换有关。（2）滑膜细胞增生，表现为不依赖于支持物生长，并且分泌大量的效应分子来促进炎症和关节损坏。 （3）是自身自分泌和旁分泌网络中效应因子的一部分。 本公司生产的小鼠滑膜细胞采用混合酶消化制备而来，细胞总量约为5×105cells/瓶，细胞纯度可达90%以上，且不含有HIV-1、HBV、HCV、支原体、细
人皮肤成纤维细胞的获取-
人皮肤成纤维细胞的获取 一、材料：手术过程中获取的老年人皮肤组织 二、所需试剂：DMEM高糖培养基，胎牛血清，胰蛋白酶，PBS缓冲液，青霉素，链霉素 三、方法： 1.提前准备好含有添加过青霉素和链霉素的PBS缓冲液的15ml离心管低温放置。 2.将得到的皮肤组织置于含有PBS（添加300U/ml青霉素和300μg/ml链霉素）的15ml 离心管中，并以冰盒存放拿至实验室立马进行实验。 3.在生物安全柜中将得到的皮肤组织于培养皿内用（含300U/ml青霉素和300μg/ml链霉 素）的PBS缓冲液反复漂洗3-5次。 4.用无菌手术刀片和镊子轻轻剪除、刮去皮下肌肉和脂肪组织。或在PBS清洗前，用70% 酒精浸泡半分钟。 5.清理干净的皮肤组织转移至新培养皿内，用含抗生素的PBS反复清洗后，取出皮肤组织 转移到新的皿中。 6.用剪刀将皮肤剪成体积约1mm3大小的组织块。 7.将小组织块贴附于一新的培养皿底部，每平方厘米均匀接种10-15块组织。 8.5-10分钟后（以团块贴紧培养皿为准），加入少量含10%FBS的DMEM培养液，使组织 块刚刚接触培养液即可（不能浸没组织，防止组织块飘起来），置于CO2培养箱。 9.2-3h后沿培养皿边缘缓慢加入含10%FBS的DMEM培养液浸没组织块，随后将培养皿 轻轻放置于培养箱内，在移动过程中严禁剧烈晃动培养皿影响组织块的贴壁。 10.间隔2-3天观察组织块贴壁情况，并进行换液。 11.观察细胞爬出情况，当组织块周边细胞生长汇合率达90%以上时进行胰蛋白酶的消化传 代。剩余的组织块加入10%FBS的DMEM培养液继续培养，细胞达到融合后，再消化传代，然后剩余组织块加入10%FBS的DMEM培养液继续培养，反复上面的步骤。
《细胞实验》02 原代细胞培养和传代培养的方法
原代细胞培养和传代培养的方法 原代培养 原理 将动物机体的各种组织从机体中取出，经各种酶（常用胰蛋白酶）、螯合剂（常用EDTA）或机械方法处理，分散成单细胞，置合适的培养基中培养，使细胞得以生存、生长和繁殖，这一过程称原代培养。 仪器、材料及试剂 仪器：培养箱（调整至37℃），培养瓶、青霉素瓶、小玻璃漏斗、平皿、吸管、移液管、纱布、手术器械、血球计数板、离心机、水浴箱（37℃） 材料：动物组织块 试剂：1640培养基（含20%小牛血清），0.25%胰酶，Hank′s液，碘酒 初代消化培养法 1. 准备：取各种已消毒的培养用品置于净化台面，紫外线消毒20分钟。开始工作前先洗手、75%酒精擦拭手至肘部。 2. 布局：点燃酒精灯，安装吸管帽。 3. 处理组织：把组织块置于烧杯中，用Hanks液漂洗2~3次，去除血污；如怀疑组织可能污染，可先置于含有青链霉素的混合液中30~60分钟。 4. 剪切：用眼科剪把组织切成2~3毫米大小的块，以便于消化。加入比组织块总量多30~50倍的胰蛋白酶液，然后一并倒入三角烧瓶中，结扎瓶口或塞以胶塞。 5. 消化：或用恒温水浴，或置于37℃温箱消化均可，消化中每隔20分钟应摇动一次，如用电磁恒温搅拌器消化更好。消化时间依组织块的大小和组织的硬度而定。 6. 分离：在消化过程中见消化液发混浊时，可用吸管吸出少许消化液在镜下观察，如组织
已分散成细胞团或单个细胞，立即终止消化，随即通过适宜不锈钢筛，滤掉尚未充分消化开的组织块。低速（500~1000转/分）离心消化液5分钟，吸出上清，加入适量含有血清的培养液。 7. 计数：用计数板计数，如细胞悬液细胞密度过大，再补加培养液调整后，分装入培养瓶中。对大多数细胞来说，pH要求在7.2~7.4范围，培养液呈微红色，如颜色偏黄，说明液体变酸，可用NaHCO3调整。 8. 培养：置于36.5℃温箱培养，如用CO2温箱培养，瓶口需用纱布棉塞或螺旋帽堵塞，纱布塞易生霉菌，每次换液时需要换新塞。 初代组织块培养法 1. 剪切：把组织小块置于小烧杯或青霉素小瓶中，用Hanks液漂洗二三次以去掉表面血污，吸静Hanks液，用眼科剪反复剪切1mm3块为止。 2. 摆布：用弯头吸管吸取若干小块，置于培养瓶中，用吸管弯头把组织小块摆布在培养瓶底部，小块相互距离以0.5cm为宜，每一25ml培养瓶底可摆布20~30块。 3. 轻轻翻转培养瓶，另瓶底向上，注意翻瓶时勿另组织小块流动，塞好瓶塞，置36.5℃温箱培养2小时左右（勿超过4小时），使小块微干涸。 4. 培养：从微箱中取出培养瓶，开塞，46度斜持培养瓶，箱瓶底脚部轻轻注入培养液少许，然后缓缓再把培养瓶翻转过来，让培养液慢慢覆盖附于瓶地上的组织小块。置温箱中静止培养。待细胞从组织块游出数量增多后。再补加培养液。 传代培养法 原理 细胞在培养瓶长成致密单层后，已基本上饱和，为使细胞能继续生长，同时 也将细胞数量扩大，就必须进行传代（再培养）。传代培养也是一种将细胞种保存下去
增生性瘢痕成纤维细胞与正常皮肤成纤维细胞生长差异比较
论著 【收稿日期】2004-10-12;【修回日期】2004-12-03 【作者简介】李卫华(1971-),男,籍贯河北,硕士,主治医师,主要研究方向为瘢痕的形成机理。 增生性瘢痕成纤维细胞与正常皮肤成纤维细胞生长差异比较 李卫华1,李德水2,刘洪琪2 (武警医学院:11整形美容中心;21烧伤整形科;天津300162) 摘 要: 【目的】探讨增生性瘢痕成纤维细胞与正常皮肤成纤维细胞基因表现型的差异以及EGF 、PD GF 和 bF GF 对其的影响。【方法】测定细胞生长曲线;应用液闪计数测定成纤维细胞胶原蛋白的合成。【结果】增生性 瘢痕成纤维细胞增殖速度比正常皮肤成纤维细胞慢;胶原蛋白的合成高于正常皮肤成纤维细胞。EGF 、PD GF 和 bF GF 均对两种成纤维细胞的增殖具有强烈的刺激作用。EGF 和bF GF 可减少增生性瘢痕成纤维细胞的胶原蛋白 合成,PD GF 可以使两种成纤维细胞的胶原蛋白合成增加。【结论】增生性瘢痕成纤维细胞是一种特殊基因表现型的成纤维细胞,它具有自己特殊的生物学特性。EGF 、PD GF 和bF GF 在增生性瘢痕的形成过程中可能具有重要作用。 关键词:增生性瘢痕;成纤维细胞;胶原蛋白;表皮细胞生长因子;血小板衍生生长因子;碱性成纤维细胞生长因子 【文章编号】 100825041(2005)022******* 【中图分类号】 R32912 【文献标识码】 A The study of the phenotypic differences of hypertrophic scar f ibroblasts versus normal dermal f ibroblasts by cytokine stimulation L I Wei 2hu a ,L I De 2shui ,L IU H ong 2qi (Department of Plastic and Esthetic Surgery ,The A ff iliated H ospital of Medical College of Chinese People ′s Armed Police Force ,Tianjin 300162,China) Abstract :【Objective 】To study the phenotypic differences between the hypertrophic scar fibroblasts and normal dermal fibroblasts by determining their responsiveness to EGF 、PD GF and bF GF 【Methods 】Hypertrophic scar fibroblasts and normal dermal fibroblasts were propagated in culture.Their proliferative behaviors were studied.The collagen synthetic rates were determinedwith liquid scintillation technology.【R esults 】Hypertrophic scar fibroblasts grew at a lower rate than that of normal dermal fibrob1asts.The collagen synthetic rate of the hypertrophic scar fibroblasts was higher than that of the normal dermal fibroblasts.EGF 、PD GF and bF GF stimulated the proliferation of both cells violently.The col1agen synthesis of hypertrophic scar fibroblasts was inhibited by EGF and bF GF whereas PD GF increased both cells ′collagen synthesis.【Conclusion 】The hypertrophic scar fibroblast is a different phenotype from the normal dermal fibrob 2last.EGF 、PD GF and bF GF may play important roles in the formation of hypertrophic scars.K ey Words :Hypertrophic scar ;Fibroblasts ;Collagen ;EGF ;PD GF ;bF GF 增生性瘢痕一直是限制患者正常愈合的一个主要问题,其病因尚未完全明了。Worrall 1的研究结果显示将正常皮肤成纤维细胞长期暴露于可溶性单核细胞提取物的环境中可使成纤维细胞发生红斑 狼疮样基因表现型改变。G arner 2的研究结果揭示增生性瘢痕成纤维细胞与正常皮肤成纤维细胞可能具有不同的基因表现型。为了进一步明确增生性瘢痕成纤维细胞基因表现型,我们应用体外细胞培养技术研究了增生性瘢痕及正常皮肤成纤维细胞的形态、生长曲线以及胶原蛋白的合成,并就表皮细胞生长因子(EGF )、血小板衍生生长因于(PD GF )和碱性成纤维细胞生长因子(bF GF )对增生性瘢
改良组织块法培养细针活检滑膜组织成纤维样滑膜细胞
改良组织块法培养细针活检滑膜组织成 纤维样滑膜细胞 (作者：__________ 单位：___________ 邮编：___________ ) 作者：李婷戴冽杨斌郑东辉朱浪静莫颖倩张白玉【摘要】【目的】探讨体外分离培养细针活检滑膜组织成纤维样 滑膜细胞(FLS)的方法。【方法】滑膜组织来自接受盲式细针滑膜活检术的活动期类风湿关节炎患者，分别采用消化酶培养法、组织块培养法和改良组织块培养法分离培养FLS。采用台盼蓝染色进行细胞计数及活性鉴定，并应用倒置相差显微镜、透射电镜、免疫细胞化学染色、流式细胞术对第3?4代FLS进行鉴定。【结果】3种原代分离培养的方法均可成功培养出FLS。台盼蓝染色示FLS细胞计数约(8.30 士 1.65) X 105/瓶，活细胞百分率95%。传代可使FLS达到形态学上的纯化要求，倒置相差显微镜、透射电镜观察均符合FLS 的形态结构特征，免疫细胞化学染色示Vimentin阳性、CD68阴性、CK 阳性，流式细胞术检测示CD55+细胞占(95.34 士 2.47)%。改良组织块法培养FLS成功率较高，细胞游出时间较早，所需传代时间较短。【结论】改良组织块法特别适合于细针滑膜活检标本FLS的
培养，第3?4代细胞的数目、活性及纯度符合进一步实验的要求。 【关键词】成纤维样滑膜细胞；细胞培养；细针活检 Abstract : 【Objective ] To explore the culture method for fibroblast-like synoviocytes (FLS) from needle biopsied synovium tissue. 【Methods ] Synovium tissue obtained from patients with active rheumatoid arthritis by blind needle synovium biopsy were cultured with three different methods (digestive enzyme culture , tissue culture and modified tissue culture). Cell count and the perce ntage of viable cells were observed by trypa n blue sta ining. FLS were ide ntified by morphology , immuno cytochemical stai ning and flow cytometry. 【Results ] All three methods could culture FLS successfully , of which modified tissue culture method was better than the other two methods. FLS cell count was (8.30 士1.65) x 105 per flask with more than 95% viable cells by Trypan blue staining. FLS of the third or forth generation showed typical morphological characters un der inv erted phase con trast microscope and tran smissi on electro n microscope with Vimentin+/CD68-/CK+ staining and (95.34 士2.47)% CD55+ cells. Modified tissue culture method has higher successful rate with earlier and more quickly cell emigration from synovium tissue.
原代细胞培养：原代肝细胞
【嘉美生物】肝是生物转化和蛋白质合成的主要器官，也是药物毒性作用发挥的主要场所。因此许多的体外测试都选用肝细胞来研究药物间的相互作用和其他一些生化过程。 嘉美生物用于培养原代细胞的组织采集于各大医院（包括协和医院、301医院、北三医院等），采集根据美国IRB 和HIPAA批准的方案进行。这些原代细胞均来自新鲜组织，并采用公司专利的技术来优化目的细胞生长条件，降低杂细胞（如脂肪细胞、纤维细胞等）的污染。分离的细胞经过短暂培养、传代，然后迅速冻存。这些保持分化状态的细胞可以用于评估体外药物模型系统和调节特定基因的遗传功能。 嘉美生物原代肝细胞产品均经过严格的QA/QC检测，可以直接用于药物优化和筛选、基因克隆、表达图谱分析以及各种分子生物学和药物学实验的研究。 凭借着先进的技术设备和资深的专业经验，嘉美生物能为您提供高品质的原代细胞产品和特殊的定制服务： 1、各种新鲜原代肝细胞 嘉美生物除提供多种人、小鼠、大鼠、猴等新鲜肝细胞产品外，嘉美生物还可以为您提供特定动物、特定组织、特定年龄的新鲜肝细胞定制服务。 2、各种原代细胞提取物 嘉美生物除提供的人、小鼠、大鼠、猴等四大类的肝微粒体、肝S9、CYP450酶和其他亚细胞提取物外，嘉美生物还可以为您提供专业的原代细胞提取物定制服务。 嘉美生物可以同时提供高质量的原代细胞产品和专业的个性化定制服务，为您的研究提供最新鲜优质的实验材料，提供其他原代细胞相关专业服务（原代肝细胞靶药分析服务、原代细胞靶药优化服务和原代细胞药物筛选等）。嘉美生物能完美整合各类原代细胞类服务，是原代细胞分离，原代细胞提供，原代细胞实验课题服务中的佼佼者。