基因剪切位点的统计分析研究
Hans Journal of Computational Biology 计算生物学, 2016, 6(3), 41-49
Published Online September 2016 in Hans. https://www.sodocs.net/doc/fa7595367.html,/journal/hjcb https://www.sodocs.net/doc/fa7595367.html,/10.12677/hjcb.2016.63006
文章引用: 李宏彬, 赫光中. 基因剪切位点的统计分析研究[J]. 计算生物学, 2016, 6(3): 41-49.
Research on Statistical Analysis of Gene Splicing Sites
Hongbin Li *, Guangzhong He
Medical School, Xianyang Vocational and Technical College, Xianyang Shaanxi
Received: Aug. 5th , 2016; accepted: Aug. 19th , 2016; published: Aug. 26th
, 2016
Copyright ? 2016 by authors and Hans Publishers Inc.
This work is licensed under the Creative Commons Attribution International License (CC BY).
https://www.sodocs.net/doc/fa7595367.html,/licenses/by/4.0/
Abstract
The genes of eukaryotes are composed of several exons and introns. After transcript process, se-quences of exons are retained, while sequences of introns are cleaved off. A large number of expe-riments of molecular biology validate that the splicing sites between exon and intron follow the rule of GT-AG, only a few GT or AG sequences are true splicing sites, and the accuracy of the pre-diction still needs to be improved. In this study, the training dataset of splicing site of HS 3D was downloaded, and a statistical analysis of the sequence near the splicing site of the promoter was carried out. The sequence showed high specificity when the true and false sequence lengths of the left splicing site side and right splicing site side were both more than seven, which was helpful to train the sequences characters so as to accurately identify the true and false splicing sites.
Keywords
Gene, Splice Site, Statistical Analysis
基因剪切位点的统计分析研究
李宏彬*，赫光中
咸阳职业技术学院医学院，陕西 咸阳
收稿日期：2016年8月5日；录用日期：2016年8月19日；发布日期：2016年8月26日
Open Access
*
通讯作者。
李宏彬，赫光中
摘要
真核生物的基因由若干外显子和内含子交替组成，外显子序列在转录后保留，而内含子序列转录过程中
被剪切掉。大量分子生物学实验验证基因的剪切位点遵从GT-AG规则，然而只有很少的含GT或AG序列是
真剪切位点,目前预测的准确程度仍有待提高。本研究下载了HS3D剪切位点训练数据集，对启动子剪切位点附近的序列进行了统计分析研究。当真、假序列长度在剪切位点左旁和右旁均超出各七个位点时，
序列呈现很高的特异性，可以使用这些特异性序列作为特征进行训练，从而准确地识别真假剪切位点。
关键词
基因，剪切位点，统计分析
1. 引言
基因组学是研究基因序列结构、功能分析和如何利用基因的一门学科，而基因剪切位点识别是其中重要的研究方向之一。真核生物基因是由一段段编码区和非编码区碱基序列嵌合而成，编码区又称为外显子(exon)，它们之间的非编码区被称为内含子(Intron)，基因的首尾还各有一段具备一定功能的非编码区，分别称为启动子和终止子。外显子和内含子的大小变化不定，内含子一般要远长于外显子。真核基因先转录为前mRNA (包含所有外显子和内含子序列)，然后序列中的内含子需要被除去而外显子相互链接为成熟的mRNA，这个过程称为剪接(Splicing)，如图1所示。成熟的mRNA每个三联体核苷酸构成一个密码子，将被翻译成一个氨基酸，它们决定了蛋白质的氨基酸线性顺序。因此，如果剪切不够准确，如多出或缺少一个核苷酸，下游经翻译的密码子就会出误，最终生成错误的蛋白质。大量实验数据表明绝大多数剪切位点遵从GT-AG规则(极少数个例显示遵从AT-AC规则)，外显子-内含子连接区呈现高度保守性，也就是在内含子序列的5’端(从外显子过渡到内含子)特征为GT，而在其3’端(从内含子过渡到外显子)特征为AG，然而海量基因组测序数据显示满足GT-AG规则的序列绝大多数并不是真内含子序列。基因剪接位点常用的研究方法有：人工神经网络[1]、隐马尔可夫模型[2]、动态规划[3]、支持向量机
[4]、贝叶斯网络[5]和频谱3-周期性[6]等。
2. 方法和分析
HS3D (Homo Sapiens Splice Sites Dataset) [7]是意大利Pollastro从GeneBank DNA序列数据库中提取的基因剪接位点序列数据集，数据集中的每个条目记录剪切位点从上游到下游总长为140个字符的DNA 序列数据，剪接符均遵从GT-AG规则，GT位于位点71到72，AG位于位点69到70。数据集分为四个部分：真EI (exon to intron)、假EI、真IE (intron to exon)和假IE，真EI和真IE记录的数据条目数相对较少，分别为2796和2880个，而假EI和假IE数据条目数相对极多，分别为271,928和329,360个。为了观察真假剪切位点临近序列的差异，本研究依据HS3D数据集中的数据，对140个位点真、假EI和IE (的四种碱基(A、T、C、G)出现频率进行了比较，分别如图2、图3所示。其中横坐标代表临近序列位置，纵坐标表示某位置的真(左)、假(右) EI、IE碱基A (红)、T (绿)、C (蓝)或G (黄)出现频率(0到1之间)。
从图2、图3中可以观察到，总体来说，从剪接点上游位点到下游位点，真剪接位点临近序列的碱基呈现随位置变化的出现频率，特别在剪接特征符左右十个位置(统计数据见表1)，而假的除特征符GT和AG左右一两个位置以外，在其余位点呈现近似接近的碱基出现频率。真EI序列在剪接位点的一致序列
李宏彬，赫光中
Figure 1. Structure, transcription and splicing of eukaryotic gene
图1. 真核基因的结构、转录和剪接
Table 1. The base frequency comparison in sites from ?10 to 10 between true splicing sequences and false splicing se-quences
表1. 真、假剪切位点序列?10到10各碱基出现频率比较
真EI 假EI 真IE 假IE 位置
A T C G A T C G A T C G A T C G
?10 0.24 0.21 0.27 0.28 0.25 0.26 0.23 0.26 0.08 0.43 0.37 0.12 0.24 0.28 0.25 0.23 ?9 0.27 0.18 0.26 0.28 0.26 0.27 0.23 0.24 0.07 0.48 0.34 0.11 0.25 0.28 0.24 0.23 ?8 0.23 0.22 0.28 0.26 0.27 0.26 0.23 0.23 0.08 0.44 0.38 0.11 0.24 0.28 0.23 0.24 ?7 0.24 0.21 0.28 0.26 0.26 0.27 0.24 0.23 0.07 0.43 0.39 0.11 0.25 0.28 0.23 0.24 ?6 0.27 0.19 0.27 0.27 0.27 0.26 0.23 0.24 0.09 0.38 0.41 0.12 0.26 0.28 0.22 0.24 ?5 0.26 0.23 0.27 0.24 0.27 0.27 0.25 0.21 0.09 0.39 0.42 0.09 0.25 0.28 0.23 0.24 ?4 0.27 0.18 0.30 0.26 0.25 0.26 0.27 0.22 0.06 0.40 0.47 0.07 0.24 0.29 0.24 0.23 ?3 0.33 0.11 0.36 0.19 0.26 0.26 0.24 0.23 0.07 0.47 0.39 0.07 0.22 0.29 0.26 0.22 ?2 0.58 0.14 0.14 0.14 0.29 0.24 0.25 0.22 0.21 0.22 0.35 0.23 0.24 0.27 0.24 0.24 ?1 0.09 0.07 0.03 0.81 0.31 0.34 0.08 0.27 0.04 0.19 0.76 0.01 0.26 0.17 0.34 0.23
0.00 0.00 0.00 1.00 0.00 0.00 0.00 1.00 1.00 0.00 0.00 0.00 1.00 0.00 0.00 0.00
0.00 1.00 0.00 0.00 0.00 1.00 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00 1.00 0.00 0.00 0.00 1.00
1 0.47 0.03 0.03 0.47 0.19 0.26 0.21 0.34 0.23 0.09 0.14 0.54 0.27 0.2
2 0.2
3 0.29
2 0.70 0.08 0.08 0.1
3 0.25 0.30 0.22 0.23 0.23 0.32 0.21 0.2
4 0.28 0.24 0.24 0.23
3 0.06 0.05 0.05 0.83 0.2
4 0.28 0.2
5 0.23 0.22 0.24 0.28 0.25 0.28 0.2
6 0.22 0.24
4 0.1
5 0.44 0.18 0.23 0.25 0.29 0.23 0.23 0.22 0.24 0.30 0.24 0.2
6 0.26 0.23 0.25
5 0.2
6 0.16 0.21 0.3
7 0.25 0.26 0.23 0.26 0.25 0.24 0.29 0.22 0.26 0.26 0.21 0.26
6 0.20 0.23 0.28 0.29 0.25 0.29 0.23 0.24 0.22 0.23 0.30 0.25 0.26 0.25 0.22 0.27
7 0.19 0.22 0.32 0.28 0.26 0.27 0.23 0.25 0.25 0.22 0.26 0.28 0.26 0.25 0.22 0.27
8 0.18 0.22 0.27 0.33 0.25 0.28 0.22 0.25 0.24 0.22 0.29 0.25 0.26 0.27 0.22 0.25
9 0.20 0.20 0.29 0.31 0.25 0.28 0.24 0.24 0.24 0.23 0.26 0.27 0.26 0.26 0.22 0.26
10 0.19 0.22 0.28 0.31 0.25 0.29 0.22 0.23 0.24 0.21 0.27 0.29 0.26 0.26 0.23 0.25
李宏彬，赫光中
Figure 2. The base statistical frequency comparison of sequence close to splicing site between true EI data-
set and false EI dataset
图2. 真、假EI剪接位点临近序列碱基统计频率比较
Figure 3. The base appearance frequency comparison of sequence close to splicing site between true IE da-
taset and false IE dataset
图3. 真、假IE剪接位点临近序列碱基出现频率比较
是MAG GT RAG (M: A/C, R: A/G)真IE序列在剪接位点的一致序列是YYNC AG RN (Y: T/C, N: A/T/C/G)。
参考真EI、IE数据集，本研究对以剪切位特征符(GT、AG)为中心的碱基六聚体出现百分频率进行了统计，若总频率为1，则真EI和真IE频度靠前的六聚体EI、IE数据集中真剪接位点多聚体出现频率数据分别如表2和表3所示，这些六联体总频度占真EI和真IE数据集中样本量的绝大多数，分别为82.53%
李宏彬，赫光中Table 2. The top 24 frequency statistic of 6-mer base close to splicing sites in true EI dataset
表2. 真EI剪接位点六聚体碱基出现频率统计(前24个)
真EI六聚体出现频率统计
序号六聚体出现频率序号六聚体出现频率序号六聚体出现频率
1 5'-AG GT GA-3' 0.1516 9 5'-AG GT AC-3' 0.0393 17 5'-AA GT GA-3' 0.0132
2 5'-AG GT AA-3' 0.1195 10 5'-GG GT AA-3' 0.0368 18 5'-AA GT AA-3' 0.0129
3 5'-TG GT GA-3' 0.0497 11 5'-AG GT AT-3' 0.0315 19 5'-CA GT GA-3' 0.0129
4 5'-AG GT AG-3' 0.0490 12 5'-AG GT GC-3' 0.0190 20 5'-CT GT GA-3' 0.0125
5 5'-AG GT GG-3' 0.047
6 13 5'-AG GT CA-3' 0.0154 21 5'-AG GT GT-3' 0.0104
6 5'-GG GT GA-3' 0.0465 14 5'-CT GT AA-3' 0.0154 22 5'-AT GT AA-3' 0.0097
7 5'-CG GT GA-3' 0.0454 15 5'-CG GT AA-3' 0.0143 23 5'-CA GT AA-3' 0.0097
8 5'-TG GT AA-3' 0.0401 16 5'-AT GT GA-3' 0.0136 24 5'-TG GT AT-3' 0.0093 Table 3. The top 63 frequency statistic of 6-mer close to splicing sites in true IE dataset
表3. 真IE剪接位点六聚体出现频率统计(前63个)
真IE六聚体出现频率统计
序号六聚体出现频率序号六聚体出现频率序号六聚体出现频率
1 5'-CC AG GT-3' 0.0469 2
2 5'-CT AG GT-3' 0.0128 4
3 5'-AT AG GA-3' 0.0073
2 5'-CC AG GC-3' 0.0410 2
3 5'-GC AG AC-3' 0.0128 4
4 5'-TC AG AG-3' 0.0073
3 5'-CC AG GG-3' 0.0392 2
4 5'-GC AG GC-3' 0.0128 4
5 5'-TC AG CT-3' 0.0073
4 5'-CC AG GA-3' 0.0313 2
5 5'-GC AG CT-3' 0.0125 4
6 5'-GC AG CA-3' 0.0073
5 5'-GC AG GT-3' 0.0281 2
6 5'-AC AG AT-3' 0.0118 4
7 5'-AT AG GT-3' 0.0069
6 5'-AC AG GT-3' 0.0271 2
7 5'-TC AG AT-3' 0.0115 4
8 5'-CT AG GC-3' 0.0069
7 5'-TC AG GA-3' 0.0229 28 5'-TC AG GC-3' 0.0115 49 5'-CC AG TG-3' 0.0069
8 5'-GC AG GG-3' 0.0226 29 5'-GC AG AA-3' 0.0115 50 5'-CC AG AA-3' 0.0066
9 5'-TC AG GT-3' 0.0212 30 5'-TT AG GA-3' 0.0108 51 5'-TC AG TG-3' 0.0063
10 5'-TC AG GG-3' 0.0208 31 5'-AC AG AA-3' 0.0101 52 5'-CT AG AA-3' 0.0063
11 5'-AC AG GG-3' 0.0205 32 5'-AC AG CC-3' 0.0097 53 5'-AC AG TG-3' 0.0059
12 5'-GC AG GA-3' 0.0205 33 5'-CC AG CC-3' 0.0097 54 5'-CC AG CA-3' 0.0059
13 5'-CC AG AG-3' 0.0177 34 5'-AC AG CT-3' 0.0094 55 5'-AT AG GG-3' 0.0056
14 5'-AC AG GA-3' 0.0174 35 5'-TT AG GT-3' 0.0094 56 5'-TT AG AT-3' 0.0056
15 5'-CC AG AC-3' 0.0160 36 5'-GC AG CC-3' 0.0094 57 5'-TT AG GC-3' 0.0056
16 5'-CC AG CT-3' 0.0160 37 5'-TC AG AA-3' 0.0090 58 5'-TC AG CC-3' 0.0056
17 5'-GC AG AG-3' 0.0153 38 5'-TC AG AC-3' 0.0083 59 5'-CT AG GG-3' 0.0056
18 5'-AC AG GC-3' 0.0149 39 5'-AC AG AG-3' 0.0080 60 5'-CC AG TT-3' 0.0056
19 5'-CC AG AT-3' 0.0146 40 5'-TT AG GG-3' 0.0076 61 5'-GT AG GA-3' 0.0056
20 5'-GC AG AT-3' 0.0146 41 5'-GC AG TT-3' 0.0076 62 5'-AC AG AC-3' 0.0049
21 5'-CT AG GA-3' 0.0142 42 5'-GC AG TG-3' 0.0076 63 5'-AC AG TT-3' 0.0049
李宏彬，赫光中
和82.65%。统计发现，剪切位特征符左右各有两个碱基核苷酸，应有4的4次方(256)中可能性，数据集中真，EI和IE剪接六聚体至少出现一次分别占118和181种可能性，而假EI和IE剪接六聚体覆盖所有的256种可能性，反映剪接位点临近序列的特异性。本研究依次对EI、IE数据集中真、假剪接位点多聚体重合度统计，包括6聚体、8聚体(4096种可能性，特征符前三后三)、10聚体(65,536种可能性，特征符前四后四)、12聚体(1,048,576种可能性，特征符前五后五)和14聚体(16,777,216种可能性，特征符前六后六)，如图4所示。图中反映6聚体、8聚体和12聚体，真假剪接聚体的重合度很高(重合是指，某个位于剪接位点的多聚体，若真、假数据集中都至少出现1例，则该聚体重合)，若依此聚体序列为特征进行识别会导致极高的错误率，而14聚体以上真、假聚体序列的重合度大幅度下降，特异性显著增强，有利于以此为特征进行训练和进行真剪接位点识别判断。
那么总长相同的聚体，不同的选取方式，会对重叠率有什么影响呢？本研究做了一个实验，这些多聚体总长相同，但在剪接特征符GT或AG前后选取的核苷酸数目不同，然后统计真、假多聚体的重叠率，结果如表4所示，其中示例EI和IE数据集中真、假剪接位点前五后五模式多聚体分布比较分别如图5和图6所示。十二聚体中，选取方式前6后4 (前6 GT后4)在EI真、假数据集中获得最低的重叠率，前2后8 (前2 AG后8)在IE真、假数据集中获得最低的重叠率。十四聚体中，选取方式前8后4 (前8 GT 后4)在EI真、假数据集中获得最低的重叠率，前3后9 (前3 AG后9)在IE真、假数据集中获得最低的重叠率。获得最低重叠率的十二聚体位置与十四聚体接近，但十二聚体重叠率远高于十四聚体，如果以十二聚体作为特征进行真、假剪接位点识别，虽然特征碱基数目少、速度快，但会产生过高的错误率，因此真假剪接位点识别训练应选择十四聚体以上作为特征模式。
Table 4.The overlap rate comparison between true and false dataset of 12-mer and 14-mer close to splicing sites by different selection methods
表4. 剪接临近十二和十四聚体在不同选取方式下真、假数据集的重叠率比较
选取方式EI重叠率IE重叠率
十二聚体前1后9 35.59% 39.12% 前2后8 36.10% 38.01%前3后7 35.01% 41.58% 前4后6 34.90% 43.29% 前5后5 34.81% 45.61% 前6后4 34.31%48.68% 前7后3 36.82% 48.59% 前8后2 35.11% 52.12% 前9后1 37.94% 54.75%
十四聚体前1后11 5.54% 5.92% 前2后10 4.99% 5.04% 前3后9 5.08% 5.00%前4后8 4.99% 5.93% 前5后7 4.49% 6.73% 前6后6 4.42% 6.85% 前7后5 4.70% 6.60% 前8后4 4.21% 6.98% 前9后3 4.77% 7.81% 前10后2 5.30% 8.70% 前11后1 5.67% 10.55%
李宏彬，赫光中
Figure 4. The N-mer overlap rate statistic of true and false splicing site in EI and IE dataset
图4. EI、IE数据集中真、假剪接位点多聚体重合度统计
Figure 5. The N-mer (five before and five after GT site) distribution comparison between
true and false splicing site in EI dataset
图5. EI数据集中真、假剪接位点GT前五后五模式多聚体分布比较
李宏彬，赫光中
Figure 6. The N-mer (five before and five after AG site) distribution comparison be-
tween true and false splicing site in IE dataset
图6. IE数据集中真、假剪接位点AG前五后五模式多聚体分布比较
3. 结论
本文使用公共数据库HS3D的序列数据对基因剪接位点的序列进行了统计分析。通过统计获得真假剪接位点的碱基出现频率，分析反映真剪接位点临近序列的碱基呈现随位置变化的出现频率，而假的除特征符GT和AG左右一两个位置以外，在其余位点呈现近似接近的碱基出现频率。通过统计还获得了占数据库中绝大多数的真剪接位点EI和IE六联体序列。研究还发现14聚体以上，真剪切位点临近序列的特异性显著增强，这有利于以此序列为特征进行训练，从而准确地识别真假剪切位点。
致谢
感谢陕西省科技厅社会发展科技攻关项目基金(2016SF-343)资助。
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全基因组关联分析的原理和方法
全基因组关联分析(Genome-wide association study;GWAS)是应用基因组中 数以百万计的单核苷酸多态性(single nucleotide ploymorphism ，SNP)为分子 遗传标记，进行全基因组水平上的对照分析或相关性分析，通过比较发现影响复杂性状的基因变异的一种新策略。 随着基因组学研究以及基因芯片技术的发展，人们已通过GWAS方法发现并鉴定了大量与复杂性状相关联的遗传变异。近年来，这种方法在农业动物重要经济性状主效基因的筛查和鉴定中得到了应用。 全基因组关联方法首先在人类医学领域的研究中得到了极大的重视和应用，尤其是其在复杂疾病研究领域中的应用，使许多重要的复杂疾病的研究取得了突破性进展，因而，全基因组关联分析研究方法的设计原理得到重视。 人类的疾病分为单基因疾病和复杂性疾病。单基因疾病是指由于单个基因的突变导致的疾病，通过家系连锁分析的定位克隆方法，人们已发现了囊性纤维化、亨廷顿病等大量单基因疾病的致病基因，这些单基因的突变改变了相应的编码蛋白氨基酸序列或者产量，从而产生了符合孟德尔遗传方式的疾病表型。复杂性疾病是指由于遗传和环境因素的共同作用引起的疾病。目前已经鉴定出的与人类复杂性疾病相关联的SNP位点有439 个。全基因组关联分析技术的重大革新及其应用，极大地推动了基因组医学的发展。(2005年, Science 杂志首次报道了年龄相关性视网膜黄斑变性GWAS结果,在医学界和遗传学界引起了极大的轰动, 此后一系列GWAS陆续展开。2006 年, 波士顿大学医学院联合哈佛大学等多个研究机构报道了基于佛明翰心脏研究样本关于肥胖的GWAS结果(Herbert 等. 2006);2007 年, Saxena 等多个研究组联合报道了与2 型糖尿病( T2D ) 关联的多个位点, Samani 等则发表了冠心病GWAS结果( Samani 等. 2007); 2008 年, Barrett 等通过GWAS发现了30 个与克罗恩病( Crohns ' disrease) 相关的易感位点; 2009 年, W e is s 等通过GWAS发现了与具有高度遗传性的神经发育疾病——自闭症关联的染色体区域。我国学者则通过对12 000 多名汉族系统性红斑狼疮患者以及健康对照者的GWAS发现了5 个红斑狼疮易感基因, 并确定了4 个新的易感位点( Han 等. 2009) 。截至2009 年10 月, 已经陆续报道了关于人类身高、体重、 血压等主要性状, 以及视网膜黄斑、乳腺癌、前列腺癌、白血病、冠心病、肥胖症、糖尿病、精神分 裂症、风湿性关节炎等几十种威胁人类健康的常见疾病的GWAS结果, 累计发表了近万篇 论文, 确定了一系列疾病发病的致病基因、相关基因、易感区域和SNP变异。) 标记基因的选择： 1)Hap Map是展示人类常见遗传变异的一个图谱, 第1 阶段完成后提供了 4 个人类种族[ Yoruban ,Northern and Western European , and Asian ( Chinese and Japanese) ] 共269 个个体基因组, 超过100 万个SNP( 约1
全基因组重测序数据分析
全基因组重测序数据分析 1. 简介(Introduction) 通过高通量测序识别发现de novo的somatic和germ line 突变，结构变异-SNV，包括重排 突变（deletioin, duplication 以及copy number variation）以及SNP的座位；针对重排突变和SNP的功能性进行综合分析；我们将分析基因功能（包括miRNA），重组率（Recombination）情况，杂合性缺失（LOH）以及进化选择与mutation之间的关系；以及这些关系将怎样使 得在disease（cancer）genome中的mutation产生对应的易感机制和功能。我们将在基因组 学以及比较基因组学，群体遗传学综合层面上深入探索疾病基因组和癌症基因组。 实验设计与样本 （1）Case-Control 对照组设计； （2）家庭成员组设计：父母-子女组（4人、3人组或多人）； 初级数据分析 1．数据量产出：总碱基数量、Total Mapping Reads、Uniquely Mapping Reads统计，测序深度分析。 2．一致性序列组装：与参考基因组序列（Reference genome sequence）的比对分析，利用贝叶斯统计模型检测出每个碱基位点的最大可能性基因型，并组装出该个体基因组的一致序列。3．SNP检测及在基因组中的分布：提取全基因组中所有多态性位点，结合质量值、测序深度、重复性等因素作进一步的过滤筛选，最终得到可信度高的SNP数据集。并根据参考基 因组信息对检测到的变异进行注释。 4．InDel检测及在基因组的分布: 在进行mapping的过程中，进行容gap的比对并检测可信的short InDel。在检测过程中，gap的长度为1~5个碱基。对于每个InDel的检测，至少需 要3个Paired-End序列的支持。 5．Structure Variation检测及在基因组中的分布: 能够检测到的结构变异类型主要有：插入、缺失、复制、倒位、易位等。根据测序个体序列与参考基因组序列比对分析结果，检测全基因组水平的结构变异并对检测到的变异进行注释。
全基因组从头测序(de novo测序)
全基因组从头测序(de novo测序) https://www.sodocs.net/doc/fa7595367.html,/view/351686f19e3143323968936a.html 从头测序即de novo 测序，不需要任何参考序列资料即可对某个物种进行测序，用生物信息学分析方法进行拼接、组装，从而获得该物种的基因组序列图谱。利用全基因组从头测序技术，可以获得动物、植物、细菌、真菌的全基因组序列，从而推进该物种的研究。一个物种基因组序列图谱的完成，意味着这个物种学科和产业的新开端！这也将带动这个物种下游一系列研究的开展。全基因组序列图谱完成后，可以构建该物种的基因组数据库，为该物种的后基因组学研究搭建一个高效的平台；为后续的基因挖掘、功能验证提供DNA序列信息。华大科技利用新一代高通量测序技术，可以高效、低成本地完成所有物种的基因组序列图谱。包括研究内容、案例、技术流程、技术参数等，摘自深圳华大科技网站 https://www.sodocs.net/doc/fa7595367.html,/service-solutions/ngs/genomics/de-novo-sequencing/ 技术优势: 高通量测序：效率高，成本低；高深度测序：准确率高；全球领先的基因组组装软件：采用华大基因研究院自主研发的SOAPdenovo软件；经验丰富：华大科技已经成功完成上百个物种的全基因组从头测序。 研究内容: 基因组组装■K-mer分析以及基因组大小估计；■基因组杂合模拟（出现杂合时使用）； ■初步组装；■GC-Depth分布分析；■测序深 度分析。基因组注释■Repeat注释； ■基因预测；■基因功能注释；■ ncRNA 注释。动植物进化分析■基因家族鉴定（动物TreeFam；植物OrthoMCL）；■物种系统发育树构建； ■物种分歧时间估算（需要标定时间信息）；■基因组共线性分析； ■全基因组复制分析（动物WGAC；植物WGD）。微生物高级分析 ■基因组圈图；■共线性分析；■基因家族分析； ■CRISPR预测；■基因岛预测（毒力岛）； ■前噬菌体预测；■分泌蛋白预测。 熊猫基因组图谱Nature. 2010.463:311-317. 案例描述 大熊猫有21对染色体，基因组大小2.4 Gb，重复序列含量36%，基因2万多个。熊猫基因组图谱是世界上第一个完全采用新一代测序技术完成的基因组图谱，样品取自北京奥运会吉祥物大熊猫“晶晶”。部分研究成果测序分析结果表明，大熊猫不喜欢吃肉主要是因为T1R1基因失活，无法感觉到肉的鲜味。大熊猫基因组仍然具备很高的杂合率，从而推断具有较高的遗传多态性，不会濒于灭绝。研究人员全面掌握了大熊猫的基因资源，对其在分子水平上的保护具有重要意义。 黄瓜基因组图谱黄三文, 李瑞强, 王俊等. Nature Genetics. 2009. 案例描述国际黄瓜基因组计划是由中国农业科学院蔬菜花卉研究所于2007年初发起并组织，并由深圳华大基因研究院承担基因组测序和组装等技术工作。部分研究成果黄瓜基因组是世界上第一个蔬菜作物的基因组图谱。该项目首次将传
临床试验数据分析要点(GCP)
精品 临床试验数据分析要点 5．3．1分析对象的数据集 5．3．1．1 全样本分析（Full analysis set） 计划治疗原则（intention-to-treat）是指主要分析应当包括所有进入随机化的遵循这一原则需要对所有随机受试者完成随访得到试验结果。由于各种理由，这在实际上是难以达到的，因此，全样本分析是尽可能接近于包括所有随机受试者，在分析中保留最初的随机化对于防止偏差和提供安全的统计检验基础很重要。在许多场合，它提供的对治疗效果的估算很可能反映了以后的实际观察结果。 从分析中剔除已随机受试者的情况不多：包括不符合重要入选标准，一次也没有用药，随机化后没有任何数据。从分析中剔除不符合入选条件受试者必须不致引起偏差：入选标准的测定是在随机化之后；违反合格标准的检测是完全客观的；所有受试者都受到同样的合格性调查；各组实行同样的入选标准，凡违反者均被排除。 5．3．1．2 遵循研究设计对象（Per Protocol Set） "Per Protocol"对象组，有时称之为"有效病例"、"有效样本"或"可评价受试者样本；定义为全部分析样本中较好遵循设计书的一个受试者亚组： ·完成预先说明的确定治疗方案暴露。 ·得到主要变量的测定数据。 ·没有违反包括入选标准在内的重要试验设计。 从"有效受试者"组中剔除受试者的精确理由应当在揭盲前就充分限定并有文件记载。 为得到"有效受试者"而排除对象的原因和其他一些违反研究设计的问题，包括对象分配错误、试验中使用了试验方案规定不能用的药物、依从性差、出组和数据缺失等，应当在不同治疗组之间对其类型、发生频率和发生时间进行评价。 5．3．1．3不同的分析（受试者）组的作用 在验证性试验中，通常进行全样本和"有效受试者"两种分析。这样可以对两者之间的任何差别进行明白的讨论和解释。有时候可能需要计划进一步探究结论对于选择分析受试者组的敏感程度。两种分析得到基本一致的结论时，治疗结果的可信度增加。但是要记住，需要?quot;有效受试者"中排除相当数量受试者会对试验的总有效性留下疑点。 在优越性（Superiority trial，证明新药比标准对照药物优越）试验、等效性试验或不差于（non－inferiority trial，确证新产品与对照药物相当）试验中，这两种分析有不同的作用。在优越性试验中，全样本分析用于主要的分析可以避免"有效受试者"分析对疗效的过于乐观的估算；全样本分析所包括的不依从受试者一般会缩小所估算的治疗作用。但是，在等效性或不差于试验中使用全样本分析通常是不谨慎的，对其意义应当非常仔细考虑。 5．3．2缺失值和线外值（包括异常值） 缺失值代表临床试验中一个潜在的偏差来源。因此，在实施临床试验时应当尽最大努力符合试验方案对于数据收集和数据管理的要求。对于缺失值并没有通用的处理办法，但只要处理方法合理，特别是如果处理缺失值方法在试验方案中预先写明，则不会影响试验的有效性。当缺失值数目较大时，要考虑分析结果对于处理缺失值方法的敏感程度。线外值（包括异常值）的统计学定义在某种程度上带有随意性。除了统计学判断之外加上医学判断以鉴别一个线外值（包括异常值）是最可信的方法。同样，处理线外值（包括异常值）的程序应当在方案中列出，且不可事先就有利于某一个治疗组。 5．3．3数据的类型、显著性检验和可信限 在临床试验中，对每个受试者可收集3种数据：所接受的治疗、对治疗的反应（Re-sponse）和进入试验时影响预后因子的基线值。接受同样治疗的受试者构成统计分疗组。对治疗的反应基本上有3类。 ①定性反应。根据预定的评价标准将受试者分为若干类别，如高血压治疗的"有效"。"无效"；淋巴细胞瘤化疗的"完全缓解"、"部分缓解"、"无变化"。 ②定量反应。当存在一种可靠测定方法时，受试者的治疗结果最好采用实际数值，如舒张压。但最好同时记录其基线值，以便评价治疗前后的变化量值。 ③到某事件发生的时间。如使用避孕药受试者从开始治疗到意外妊娠的时间。
临床试验的数据管理与统计分析SOP
临床试验的数据管理与统计分析SOP I目的：建立临床试验中数据管理与统计分析的流程，使其规范化、标准化。 II适应范围：所有的临床试验 III规程： 一、临床试验的数据管理 1、数据库的创建，录入、核查程序的编写。 1)根据CRF的内容，利用数据管理系统建立数据库，编写录入程序。 2)对数据库及录入程序进行数据的预录入测试，错误之处进行修改调试。 3)利用SAS或APSS等专业统计软件编写数据核查程序，并对预录入的数据进行核查，错误之处进行修改调试。 2、交接已完成的CRF，交接双方清点CRF数量，确认无误后双方签收; 3、由两名录入员分别录入本次接收的所有CRF，录入完成后进行双录入的程序比对，不同之处要查阅CRF进行修改，直至双录入比对无差异。 4、待所有CRF已录入并已完成双录入比对后，利用核查程序对数据库进行随机化、计算、逻辑等方面的核查，核查出的问题，先查阅CRF，若属录入错误可直接对数据库进行修改，若录入无误，则应就此问题发出疑问表，疑问表的基本内容应包括问题所在CRF的试验药物编号、问题所在位置、问题描述、研究者修改项、签字项及时间。 5、在进行程序核查的同时，对数据库进行人工复核，人工复核的数量不少于5份CRF，或不低于CRF总量的5%。 6、数据库所有疑问均已返回，重复程序核查无问题后，则可将数据递交生物统计人员。 二、临床试验的统计分析 1、由生物统计专业人员撰写统计分析计划书并不断修订完善。统计分析计划书的主要内容包括： 1)临床试验概述; 2)统计分析集的定义; 3)缺失值与离群值的处理; 4)数据变换方法; 5)主要指标及次要指标的统计分析方法等。 2、生物统计专业人员收到数据管理员提交的试验数据库后，进行数据的盲态核查。
人类全基因组测序
1 技术优势 全基因组测序（Whole Genome Sequencing，WGS）是利用高通量测序平台对人类不同个体或群体进行全基因组测序，并在个体或群体水平上进行生物信息分析。可全面挖掘DNA 水平的遗传变异，为筛选疾病的致病及易感基因，研究发病及遗传机制提供重要信息。 全基因组测序 平台优势 HiSeq X 测序平台 读长：PE150 通量：1.8T/run 测序周期：3 天 专为人全基因组测序准备、测序周期短、通量高
生物信息分析 技术路线 技术参数 样品要求 样本类型：DNA 样品 样本总量：≥1.0 μg DNA (提取自新鲜及冻存样本) ≥1.5 μg DNA (提取自FFPE 样本)样品浓度：≥ 20 ng/μl 测序平台及策略HiSeq X PE150 测序深度 肿瘤：癌组织(50X),癌旁组织/血液样本(30X)遗传病：30~50 X 项目周期37天
3 案例解析 该研究选取3个家系中6个患者和1个正常个体，首先使用基因芯片寻找纯合突变位点，然后对其中无亲缘关系的2例患者采用全基因组测序研究，在2例患者非编码区域均发现相同的变异，10号染色体PTF1A 末端发生一个点突变（chr10：23508437 A>G），且变异在患病人群和细胞试验中均得到了验证。研究解释了生长发育启动子隐性变异是罕见孟德尔遗传病的常见致病原因，同时说明许多疾病的致病突变也可能位于非编码区。 图1 检出的变异信息 智力障碍是影响新生儿心智发育的一类疾病。这项研究选取50个经过基因芯片和全外显子测序未确诊致病因子的trio 家系，全基因组测序检出84个de novo SNVs 和8个de novo CNVs，及一些结构变异（如VPS13B、STAG1、IQSEC2-TENM3），检出率为42%。揭示编码区的de novo SNVs 和de novo CNVs 是导致智力障碍的主要因素，全基因组测序可以作为可靠的遗传性检测应用工具。 案例一 单基因病研究——全基因组测序鉴定PTF1A末端增强子常染色体隐性突变导致胰腺 发育不全[1] 案例二 复杂疾病研究——全基因组测序解析智力障碍的主要致病因素[2] 图2 PTF1A 的家系图谱
临床试验数据分析要点GCP
临床试验数据分析要点 5．3．1分析对象的数据集 5．3．1．1 全样本分析（Full analysis set） 计划治疗原则（intention-to-treat）是指主要分析应当包括所有进入随机化的遵循这一原则需要对所有随机受试者完成随访得到试验结果。由于各种理由，这在实际上是难以达到的，因此，全样本分析是尽可能接近于包括所有随机受试者，在分析中保留最初的随机化对于防止偏差和提供安全的统计检验基础很重要。在许多场合，它提供的对治疗效果的估算很可能反映了以后的实际观察结果。? 从分析中剔除已随机受试者的情况不多：包括不符合重要入选标准，一次也没有用药，随机化后没有任何数据。从分析中剔除不符合入选条件受试者必须不致引起偏差：入选标准的测定是在随机化之后；违反合格标准的检测是完全客观的；所有受试者都受到同样的合格性调查；各组实行同样的入选标准，凡违反者均被排除。 5．3．1．2 遵循研究设计对象（Per Protocol Set） "Per Protocol"对象组，有时称之为"有效病例"、"有效样本"或"可评价受试者样本；定义为全部分析样本中较好遵循设计书的一个受试者亚组：? ·完成预先说明的确定治疗方案暴露。? ·得到主要变量的测定数据。? ·没有违反包括入选标准在内的重要试验设计。? 从"有效受试者"组中剔除受试者的精确理由应当在揭盲前就充分限定并有文件记载。? 为得到"有效受试者"而排除对象的原因和其他一些违反研究设计的问题，包括对象分配错误、试验中使用了试验方案规定不能用的药物、依从性差、出组和数据缺失等，应当在不同治疗组之间对其类型、发生频率和发生时间进行评价。 5．3．1．3不同的分析（受试者）组的作用 在验证性试验中，通常进行全样本和"有效受试者"两种分析。这样可以对两者之间的任何差别进行明白的讨论和解释。有时候可能需要计划进一步探究结论对于选择分析受试者组的敏感程度。两种分析得到基本一致的结论时，治疗结果的可信度增加。但是要记住，需要?quot;有效受试者"中排除相当数量受试者会对试验的总有效性留下疑点。? 在优越性（Superiority trial，证明新药比标准对照药物优越）试验、等效性试验或不差于（non－inferiority trial，确证新产品与对照药物相当）试验中，这两种分析有不同的作用。在优越性试验中，全样本分析用于主要的分析可以避免"有效受试者"分析对疗效的过于乐观的估算；全样本分析所包括的不依从受试者一般会缩小所估算的治疗作用。但是，在等效性或不差于试验中使用全样本分析通常是不谨慎的，对其意义应当非常仔细考虑。 5．3．2缺失值和线外值（包括异常值） 缺失值代表临床试验中一个潜在的偏差来源。因此，在实施临床试验时应当尽最大努力符合试验方案对于数据收集和数据管理的要求。对于缺失值并没有通用的处理办法，但只要处理方法合理，特别是如果处理缺失值方法在试验方案中预先写明，则不会影响试验的有效性。当缺失值数目较大时，要考虑分析结果对于处理缺失值方法的敏感程度。线外值（包括异常值）的统计学定义在某种程度上带有随意性。除了统计学判断之外加上医学判断以鉴别一个线外值（包括异常值）是最可信的方法。同样，处理线外值（包括异常值）的程序应当在方案中列出，且不可事先就有利于某一个治疗组。 5．3．3数据的类型、显着性检验和可信限 在临床试验中，对每个受试者可收集3种数据：所接受的治疗、对治疗的反应（Re-sponse）和进入试验时影响预后因子的基线值。接受同样治疗的受试者构成统计分疗组。对治疗的反应基本上有3类。? ①定性反应。根据预定的评价标准将受试者分为若干类别，如高血压治疗的"有效"。"无效"；淋巴细胞瘤化疗的"完全缓解"、"部分缓解"、"无变化"。? ②定量反应。当存在一种可靠测定方法时，受试者的治疗结果最好采用实际数值，如舒张压。但最好同时记录其基线值，以便评价治疗前后的变化量值。? ③到某事件发生的时间。如使用避孕药受试者从开始治疗到意外妊娠的时间。 5．3．3．1数据的描述性统计
临床试验中的统计学要求汇总
临床试验中的统计学要求 临床试验是以病人为研究对象，比较临床治疗干预措施和对照措施的效果及其临床价值的前瞻性研究。临床试验以人为研究对象，与动物实验不同。在临床试验中，研究者不能完全支配病人的行为，只能要求病人避免采用某些干扰试验的治疗或行为，因此必须考虑病人的依从性问题。临床试验还必须考虑医学伦理学问题，当新药已被证实对病人弊大于利，尽管试验仍未完成，也要中止。当已经存在经医学验证对试验疾病有效的药物时，使用安慰剂对照是不适当的。当病人出现紧急情况需要额外治疗措施时，也必须给予。因此临床试验要面对比动物实验更多的问题，在设计上有着更严格的特殊要求。 新药的临床试验分为Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ期：Ⅰ期临床试验是初步的临床药理学及人体安全性评价试验，观察人体对于新药的耐受程度和药物代谢动力学，为制定给药方案提供依据；Ⅱ期临床试验是随机盲法对照临床试验，对新药有效性及安全性作出初步评价，推荐临床给药剂量；Ⅲ期临床试验是扩大的多中心临床试验，遵循随机对照原则，进一步评价有效性和安全性；Ⅳ期临床试验是新药上市后的监测，在广泛使用条件下考察疗效和不良反应，尤其是罕见不良反应。本节主要讨论II期和III期临床试验的统计学要求。 例11.1 临床观察发现急性心肌梗塞后，梗塞区膨出和左心室重构常导致左心室增大和心功能不全。为研究急性心肌梗塞后长期使用卡托普利治疗对心脏的保护作用，需设计一个药物疗效评价的临床试验，在设计中要考虑以下问题。 1．观察变量的选择 (1)主要变量和次要变量主要变量 (primary variable)又称目标变量(target variable),即能够为临床试验目的提供可信证据的变量。临床试验的主要变量一般只有一个，必要时可有多个。主要变量应易于量化、客观性强、被相关研究领域所公认。次要变量（secondary variable)是指与试验主要目的有关的附加的变量，也可以是与试验次要目的有关的变量。两种变量均应在临床试验的设计方案中明确定义，并说明其被选择的理由。临床试验的样本含量估计、疗效或安全性评价应以主要变量为依据。 (2)复合变量(compound variable) 当与临床试验主要目的有关的变量很多,难以确定单一的主要变量时，可预先确定一种综合计算方法(如求和，加权求和等)，或用多元分析的方法(如主成分分析等)将多个变量综合成一个复合变量，如临床研究中采用的各种量表就是一种复合变量。当组成复合变量的某些单项变量具有临床意义时，也可以单独进行统计分析。 (3)全局评价变量(global assessment variable) 将客观指标和研究者对病人的病情及其改变总的印象综合起来所设定的变量称为全局评价变量，它通常是有序分类变量。全局评价变量往往带有一定的主观成份。因此，如果需选择全局评价变量，应在方案中明确说明它与试验的主要目的有关，有选择的依据和可靠的基础，同时具有明确判断等级的方法。客观性较好的全局评价变量应该作为主要变量之一单独加以考虑。 例11.1中，研究目的是为评价卡托普利治疗对左心室容量、收缩功能和舒张充盈的作用，因此主要指标是用多普勒超声心动图测定左心室容量和射血分数。次要变量可选择左心室充盈速率。评价左心室容量和充盈速率的变量有多个，各变量的结果不一致时，难以对药物作总的结论。因此在统计分析时可以将多个变量综合成一个变量进行分析，这综合变量就是复合变量。上例中研究的最终目的是卡托普利治疗对心功能的保护作用，因此可以选择心功能级别作为全局评价变量。 ２．对照组的选择 临床试验中对照组与试验组唯一的差别是试验组中受试者接受新药治疗, 而对照组的受试者则接受对照药物的治疗。 临床试验要求试验组和对照组来自相同的受试者总体。两组受试者不但在试验开始时要求基本情况相似, 而且在试验进行中除了试验药物不同外, 其它条件均需保持一致。临床试验中常用的对照组设置有以下3种类型: （１）安慰剂对照安慰剂(placebo)是一种虚拟药物, 其外观剂型、大小、颜色、重量、气味和口味等都与试验药尽可能保持一致, 但不含有试验药物的有效成份。设置安慰剂对照的目的在于消除研究者、受试者和参与评价人员等由心理因素等影响而形成的偏倚，分离出由试验药物所引起的真正的效应和不良反应。安慰剂可以用于平行对照或自身交叉对照。 （2）阳性药物对照在临床试验中采用已知的、已批准上市的有效药物作为试验药的对照, 称为阳性药物对照。阳性对照药物必须是合法的、公认有效的、并对所研究的适应症最为有效安全的药物。设计方案可以是平行对照也可以是自身交叉对照。 （3）剂量-反应对照将试验药物设计成几个剂量, 而受试者随机地分入其中一个剂量组；它可以包括安慰剂对照即零剂量，也可以不包括安慰剂组。剂量-反应对照主要用于研究剂量与疗效和不良反应的关系, 或者仅用于说明疗效。剂量-反应对照有助于回答给药方案中采用的剂量是否合适。 例11.1中急性心肌梗塞病人不适宜采用安慰剂对照，因此采用常规治疗包括溶栓剂、阿斯匹林等作阳性药物
基因组测序术语解释
DNA关键词： WG-BSA (全基因组重测序BSA) 对已有参考基因组序列的物种的所有作图群体（F1、F2、RIL、DH 和BC1等），对亲本进行个体重测序，对某个极端性状材料混池测序，检测SNP，获得与性状紧密关联的分子标记和精细定位区域，是目前最高效的基因定位方法。通过选取某个极端性状，利用高效率低成本的混池测序技术，勿需开发分子标记进行遗传图的构建，快速定位与性状相关的候选QTL。 MP-Reseq (多混池全基因组重测序) 针对特有的优良地方品种中的不同品种/品系，通过群体内pooling 建库的方法，进行全基因组重测序，采用生物信息学方法全基因组范围内扫描变异位点，能快速的定位不同混池样品基因组中明显经过人工或自然选择的区域，检测与性状相关的基因区域及其功能基因。 全基因组个体重测序 基于全基因组重测序的变异图谱通过测序手段结合生物信息分析研究同一物种不同个体之间的变异情况，获得大量的变异信息，如SNP、Indel、SV 等。主要可以快速地获得大量的分子标记以及不同个体在基因组水平上的差异。 全基因组关联分析-GWAS 通过重测序对动植物重要种质资源进行全基因组基因型鉴定，与关注的表型数据进行全基因组关联分析，找出与关注表型相关的SNP位点，定位数量性状基因，与数量性状相关的基因紧密连锁的SNP标记，后续可用于分子标记辅助育种，助力育种进程。 全基因组重测序-遗传进化 通过对来自全国各地、具有代表性的XX 份XX 材料进行全基因组重测序，检测SNP、Indel、SV，并利用获得的SNP 与SV 数据进行群体多样性分析，包括连锁不平衡分析、群体进化分析、群体结构分析、群体主成分分析等。 全基因组重测序-遗传图谱 基于全基因组重测序技术对已有参考基因组序列的物种进行个体或群体的全基因组测序,利用高性能计算平台和生物信息学方法，检测单核苷酸多态性位点（SNP），并计算多态性标记间的遗传连锁距离，绘制高密度的遗传图谱。通过与表型性状进行关联分析，利用获得的强关联性标记进行下游基因的精细定位。遗传图可用于分子标记辅助育种，重要性状候选基因克隆，辅助基因组组装，比较基因组学等研究。 细菌基因组de novo 测序 细菌是生物的主要类群之一，是所有生物中数量最多的一类。细菌广泛分布于土壤和水中，或者与其他生物共生，也有部分种类分布在极端环境中，例如温泉，甚至是放射性废弃物中。由于细菌自身的营
临床试验统计分析数据集
到底什么是数据集？数据集的确定原则？不同数据集的定义？可能很多CRA都搞不明白，在此我综合了大量资料作出如下总结，共非统计专业人士参考。 临床试验统计分析数据集 1.什么是数据集？ 2.数据集的确定原则？ 3.不同数据集的定义？ 用于统计的分析集需在试验方案的统计部分中明确定义，并在盲态审核时确认每位受试者所属的分析集。 统计分析集，指的是本次研究的受试者中，可以用来进行统计分析的受试者。确定统计分析集通常有两个原则： 意向性原则： Intent to Treatment，ITT，通俗的就是说受试者有接受治疗的意愿，申办者和研究者也有给予治疗的意愿。 2.符合方案原则： Per-Protocol，PP，通俗的说就是申办者、研究者和受试者的一切行为完全按方案进行，最终受试者实际接受了方案确定的一切治疗，申办者和研究者实际获得了方案要求的一切资料。 【FAS集】基于意向性原则，则全部随机化（对于单组研究则是筛选合格）的受试者都应该纳入分析，称作全分析集(Full Analysis Set，FAS)，有些方案将该集合的人群称为ITT人群。根据ITT原则，我们需要完整地随访所有随机化对象的研究结果。 FAS集是从所有随机化的受试者中，以最少的和合理的方法剔除受试者后得出的。那么为什么要剔除部分受试者，剔除哪些受试者，请看下文：ITT只是一个理论，随机化的受试者不一定使用研究药物，使用研究药物后也未必能够完整地进行所有随访，从这个角度出发，往往会对ITT原则进行修正(Modified ITT)，加上"至少使用一剂研究药物"和/或"至少有一次用药后的疗效
指标评价结果"，这样得到进行统计分析的全分析集（不同的方案有不同的剔除标准。举例“缺失主要评价指标的基线数据的病例将从FAS中剔除”、“对方案的依从性差”“入组后没有任何随访数据”等）。 在选择全分析集进行统计分析时，对主要指标缺失值的估计，可以采用最接近的一次观察值进行结转。这样的数据集经过统计分析得出结果，被认为可以尽可能接近上市后药物在实际使用患者中能取得的疗效。 。 【PPS集】基于符合方案原则，则全部随机化的受试者中，完全按方案设 计进行研究的那一部分才能纳入分析，称作符合方案集(Per-Protocol Set，PPS)。PP也只是一个理论上的原则，严格按照方案设计的受试者只占少数，大多数受试者都会有各种微小的方案违反(Minor PV)，所以一般研究中把没有重要方案违反(Major PV/Important PV)的受试者都认为是符合方案。这样的数据集经过统计分析得出结果，被认为可以尽可能接近按药品说明书使用的患者能取得的疗效。一般至少把下面几点作为重大的方案违反(Major PV/Important PV)：不符合入选标准和/或排除标准，但被随机入组；随机错误；主要疗效指标测量时间超出窗口；未服药或服药依从性差(<80%或>120%)；使用研究禁用药物。 《化学药物和生物制品临床试验的生物统计学技术指导原则》的定义为：受试者的“符合方案集”（简称PPS），亦称为“可评价病例”样本。它是全分析集的一个子集，这些受试者对方案更具依从性，依从性包括以下一些考虑，如所接受的治疗、主要指标测量的可行性以及未对试验方案有大的违反等。将受试者排除在符合方案集之外的理由应在盲态审核时阐明，并在揭盲之前用文件写明。 【SS集】对于安全性分析，不使用意向性原则和符合方案原则，而是"暴露"(Exposure)原则，即所有至少使用过一剂研究药物的受试者，都必须观察安全 性指标，且这种观察将与实际使用药物而不是方案规定药物相联系。一般表述是随机化后至少使用过一剂研究药物的受试者。在一些研究中，随机化之前就开始使用研究药物，这种情况下，在确定安全性分析集(Safety Analysis Set，SAF 或SAS)时不加随机化的限制，因为按照"暴露"(Exposure)原则，这种观察将与实际使用药物而不是方案规定的随机化分配药物相联系。
临床试验数据统计分析概述
临床试验数据统计分析概述 ㈠、统计分析计划书 统计分析计划书由生物统计学专业人员起草，并与主要研究者商定，其内容比试验方案中所规定的统计分析更为详细。 统计分析计划书上应列出统计分析集的选择、主要指标、次要指标、统计分析方法、疗效及安全性评价方法等，按预期的统计分析结果列出统计分析表备用。 统计分析计划书应形成于试验方案和病例报告表完成之后。在临床试验进行过程中，可以修改、补充和完善。在盲态审核时再次修改完善。但是在第一次揭盲之前必须以文件形式予以确认，此后不能再作变动。 ㈡、统计分析集 用于统计的分析集需在试验方案的统计部分中明确定义，并在盲态审核时确认每位受试者所属的分析集。在定义分析数据集时，需遵循以下两个原则：①使偏倚达到最小；②控制I类错误的增加。 根据意向性分析（简称ITT）的基本原则，主要分析应包括所有随机化的受试者。即需要完整地随访所有随机化对象的研究结果，但实际操作中往往难以达到。因此，常采用全分析集进行分析。全分析集（简称FAS）是指尽可能接近符合意向性治疗原则的理想的受试者集。该数据集是从所有随机化的受试者中，以最少的和合理的方法剔除受试者后得出的。在选择全分析集进行统计分析时，对主要指标缺失值的估计，可以采用最接近的一次观察值进行结转(last observation carry forward,简称LOCF)。 受试者的“符合方案集” (简称PP)，亦称为“可评价病例”样本。它是全分析集的一个子集，这些受试者对方案更具依从性，依从性包括以下一些考虑，如接受治疗，主要指标可以测定以及没有对试验方案大的违反等。将受试者排除在符合方案集之外的理由应在盲态审核时阐明，并在揭盲之前用文件写明。 在确证性试验中，对药物的有效性评价时，宜同时用全分析集和符合方案集进行统计分析。当以上两种数据集的分析结论一致时，可以增强试验结果的可信性。当不一致时，应对其差异进行清楚的讨论和解释。如果从符合方案集中排除受试者的比例太大，则对试验的总的有效性会产生疑问。
全基因组重测序数据分析
全基 1. 简 通过变（d 的功况，dise 比较 实验 （1）（2） 基因组重测序简介(Introduc 过高通量测序识deletioin, du 功能性进行综合杂合性缺失ease （cance 较基因组学，群验设计与样本 Case-Contr ）家庭成员组序数据分析 ction) 识别发现de plication 以及合分析；我们（LOH ）以及r ）genome 中群体遗传学综ol 对照组设计 组设计：父母novo 的som 及copy numb 们将分析基因及进化选择与中的mutation 综合层面上深计 ； -子女组（4 人matic 和germ ber variation 因功能（包括与mutation 之n 产生对应的深入探索疾病基人、3 人组或m line 突变，）以及SNP miRNA ），重之间的关系；以的易感机制和基因组和癌症多人）； 结构变异-SN 的座位；针对重组率（Rec 以及这些关系功能。我们将症基因组。 NV ，包括重排对重排突变和combination ）系将怎样使得 将在基因组学排突 SNP ）情在 学以及
初级数据分析 1．数据量产出：总碱基数量、Total Mapping Reads、Uniquely Mapping Reads统计，测序深度分析。 2．一致性序列组装：与参考基因组序列（Reference genome sequence）的比对分析，利用贝叶斯统计模型检测出每个碱基位点的最大可能性基因型，并组装出该个体基因组的一致序列。3．SNP检测及在基因组中的分布：提取全基因组中所有多态性位点，结合质量值、测序深度、重复性等因素作进一步的过滤筛选，最终得到可信度高的SNP数据集。并根据参考基因组信息对检测到的变异进行注释。 4．InDel检测及在基因组的分布: 在进行mapping的过程中，进行容gap的比对并检测可信的short InDel。在检测过程中，gap的长度为1~5个碱基。对于每个InDel的检测，至少需要3个Paired-End序列的支持。 5．Structure Variation检测及在基因组中的分布: 能够检测到的结构变异类型主要有：插入、缺失、复制、倒位、易位等。根据测序个体序列与参考基因组序列比对分析结果，检测全基因组水平的结构变异并对检测到的变异进行注释。 高级数据分析 1.测序短序列匹配（Read Mapping） （1）屏蔽掉Y染色体上假体染色体区域（pseudo-autosomal region）, 将Read与参考序列NCBI36进行匹配（包括所有染色体，未定位的contig，以及线粒体序列mtDNA（将用校正的剑桥参考序列做替代）)。采用标准序列匹配处理对原始序列文件进行基因组匹配， 将Read与参考基因组进行初始匹配；给出匹配的平均质量得分分布； （2）碱基质量得分的校准。我们采用碱基质量校准算法对每个Read中每个碱基的质量进行评分，并校准一些显著性误差，包括来自测序循环和双核苷酸结构导致的误差。 （3）测序误差率估计。 pseudoautosomal contigs，short repeat regions（包括segmental duplication，simple repeat sequence-通过tandem repeat识别算法识别）将被过滤； 2. SNP Calling 计算（SNP Calling） 我们可以采用整合多种SNP探测算法的结果，综合地，更准确地识别出SNP。通过对多种算法各自识别的SNP进行一致性分析，保留具有高度一致性的SNP作为最终SNP结果。这些具有高度一致性的SNP同时具有非常高的可信度。在分析中使用到的SNP识别算法包括基于贝叶斯和基因型似然值计算的方法，以及使用连锁不平衡LD或推断技术用于优化SNP识别检出的准确性。 统计SNV的等位基因频率在全基因组上的分布
宏基因组测序讲解
宏基因组测序 目的 研究藻类物种的分类，研究与特定环境与相关的代谢通路，以及通过不同样品的比较研究微生物内部，微生物与环境，与宿主的关系。技术简介 宏基因组( Metagenome)(也称微生物环境基因组Microbial Environmental Genome, 或元基因组) 。是由 Handelsman 等 1998 年提出的新名词，其定义为"the genomes of the total microbiota found in nature" , 即生境中全部微小生物遗传物质的总和。它包含了可培养的和未可培养的微生物的基因，目前主要指环境样品中的细菌和真菌的基因组总和。而所谓宏基因组学 (或元基因组学， metagenomics) 就是一种以环境样品中的微生物群体基因组为研究对象，以功能基因筛选和/或测序分析为研究手段，以微生物多样性、种群结构、进化关系、功能活性、相互协作关系及与环境之间的关系为研究目的的新的微生物研究方法。一般包括从环境样品中提取基因组 DNA, 进行高通量测序分析，或克隆DNA到合适的载体，导入宿主菌体，筛选目的转化子等工作。 宏基因组( Metagenome)(也称微生物环境基因组Microbial Environmental Genome, 或元基因组) 。是由 Handelsman 等 1998 年提出的新名词，其定义为"the genomes of the total microbiota found in nature" , 即生境中全部微小生物遗传物质的总和。它包含了可培养的和未可培养的微生物的基因，目前主要指环境样品中的细菌和真菌的基因组总和。而所谓宏基因组学 (或元基因组学， metagenomics) 就是一种以环境样品中的微生物群体基因组为研究对象，以功能基因筛选和/或测序分析为研究手段，以微生物多样性、种群结构、进化关系、功能活性、相互协作关系及与环境之间的关系为研究
药物临床试验数据管理与统计分析计划和报告指导原则
附件 药物临床试验数据管理与统计分析的 计划和报告指导原则 一、前言 规范的数据管理计划有助于获得真实、准确、完整和可靠的高质量数据；而详细的统计分析计划则有助于保证统计分析结论正确和令人信服。为保证临床试验数据的质量和科学评价药物的有效性与安全性，必须事先对数据管理工作和统计学分析原则制定详细的计划书。在试验完成时，对试验中的数据管理和统计分析工作进行全面完整的总结至关重要，通过数据管理报告真实反映临床试验过程中的数据质量和试验样本特征，通过统计分析报告为临床试验总结报告的内容和研究结论提供主要依据。因此，在药物上市注册时，监管部门将数据管理计划和报告与统计分析计划和报告视为评价临床试验结果的重要文件和依据。 虽然我国《药物临床试验质量管理规范》（Good Clinical Pr actice，GCP）中对药物临床试验数据管理与统计分析进行了原则要求，且国家食品药品监督管理总局已发布的有关药物临床试验及其统计学的相应技术指南也涉及数据管理和统计分析工作的主要环节，但针对数据管理计划和报告、统计分析计划和报告却没有详细的技术规范和指导性建议。因此，本技术指导原则对此进行了较为详细的介绍和阐述，并提出具体要求，旨在为临床试验的数据管理和统计分析人员提供技术指导，帮助其更好地完成相关工作以达到监管要求。
二、数据管理的计划和报告 （一）一般考虑 数据管理计划（Data Management Plan, DMP）是由数据管理人员依据临床试验方案书写的一份动态文件，它详细、全面地规定并记录某一特定临床试验的数据管理任务，包括人员角色、工作内容、操作规范等。数据管理计划应在试验方案确定之后、第一位受试者筛选之前定稿，经批准后方可执行。通常数据管理计划需要根据实际操作及时更新与修订。 数据管理工作涉及多个单位或业务部门，包括数据管理、临床研究者、统计分析、医学事务、临床监查、临床稽查等单位或部门。数据管理的职责可分为负责、参与、审核、批准、告知等，各单位/部门在数据管理各步骤的职责不尽相同。数据管理计划需明确参与数据管理的相关组织及人员职责。数据管理各步骤需建立并遵循相应的标准操作规程（Standard Operation Procedure，SOP），数据管理计划应列出项目所遵循的SOP清单。 数据管理报告是在临床研究结束后，数据管理人员撰写的研究项目数据管理全过程的工作总结，是数据管理执行过程、操作规范及管理质量的重要呈现手段。通常以定性和定量的参数来表达，如数据量、疑问数等，并与数据管理计划一起作为药物注册上市的申请材料提交给监管部门用于对临床试验结果的评价。 （二）数据管理计划的基本内容 数据管理计划应全面且详细地描述数据管理流程、数据采集与管理所使用的系统、数据管理各步骤及任务，以及数据管理的质量保障措施。 1.试验概述
数据统计方法与临床试验方案
1数据统计方法与临床试验方案 1．1统计在新药临床试验中的重要作用 医药产品的有效性和安全性最终应当由按照GCP原则实施的临床试验来确证。在临床试验的设计和分析中，统计学家起着必不可少的重要作用。GCP、GMP、GLP、GRP和GVP 都与统计有关。统计学是一门处理来自群体或个体的大量资料的科学，也是处理资料中变异性的科学和艺术，其目的在于取得可靠的结果。例如，一个医生偶然发现一例患偏头痛病人在喝了橙汁以后感觉有所改善，但这并不是说从这单一个病例观察就可以认为橙汁是治疗偏头痛的有效方法。医生需要统计学资料证明，是否有一组病人在服橙汁后报告症状改善者比采用其他治疗后更多。又如一个每天吸烟50支且嗜酒的人活了95岁并健康良好，但人们不能相信他的习惯能导致健康和长寿。个体对疾病的敏感性变异很大。要研究这些问题，就应当研究不同生活习惯的人群组的发病率和死亡率；也就是说应当进行统计学研究。收集数据、并用统计图表或简单统计量来描述资料的特征称之为描述性统计。但统计学的任务远不止于此，统计学可以通过仔细制订试验计划来提高数据质量；统计推断方法则是从所研究问题的大量数据中得出结论的主要客观手段。应当明白，统计学是在收集、归类、分析和解释大量数据的过程中完成使命的。如果在试验设计阶段不考虑统计原则，所获结果的统计分析不管做的如何精巧都挽救不了一个设计糟糕的临床研究这是一个必须执行的基本原则。 表1可能导致临床试验失败的原因
在新药研制过程中，按科学原则进行的临床试验是评价一种新治疗方法的有效性和安全性的惟一可靠的基础。一个临床试验，如果不能恰当地评价试验药物的安全性和/或效性，不能提供关于新药的最好使用方式的充分信息或者提供了误导信息，因而不能对药物的研制、管理、上市和安全有效地使用做出有益贡献，那么这就是一个失败的临床试验。可能导致临床试验失败的原因很多，有些原因是可以控制的，有些则是较难控制的。其中试验设计对于临床试验的成功与否起着极其重要的作用。试验假设（阳性对照）选择不当，随机化及盲法不规范，入选/排除标准过严或过宽，受试者基线值变异大，药物剂量选择不当，终点指标选择及测定时间不妥，样本数太小，数据分析方法不恰当都可能导致临床试验失败（表1）。 GCP对生物统计学的要求包括四个方面：统计学设计，统计分析计划，临床和统计学报告，以及数据处理。与临床试验其他专业人员合作的临床试验统计人员的作用和责任是确保在支持新药研制的临床试验中能恰当地应用统计原则。 1．2统计学与试验设计 临床试验按其目的大体可分?quot;“验证性（Confirmatory）”试验和“探索性ploratory）”试验，验证性试验是控制良好的试验，总是预先定义与试验目的直接有关的关键假设，并且在试验完成后对此进行检验。验证性试验必须提供疗效和安全性的可靠证据。新药临床试验中大部分是确认性试验。但一个临床试验常具有验证性和探索性两方面。对于每一个支持上市申请的临床试验，所有关于设计、实施和统计分析的要点应当于试验开始前在试验方案中写明。试验方案中的统计学设计包括：试验设计，样本大小的确定和为避免偏差而采用的技术。 1．2．1平行组设计（Parallel design） 验证性试验的最常见设计是平行组设计。受试者被随机分配到两个（或多个）组中的一个，每个组接受不同的治疗。治疗包括一个或几个剂量的研究产品，以及一个或多个对照（如安慰剂和/或阳性对照）。这种设计最有效，其假定比其他设计简单，有明确的有效性结果，完成研究时间较短。但是，这种设计需要较大的样本，有较大的受试者变异，比较复杂。试验的某些特点会使结果的分析和解释复杂化，如协变量问题、在一段时间内的重复多次测定、设计因子之间的相互作用、违反设计等等。