海洋微生物来源的天然活性物质的筛选策略1

海洋微生物来源的天然活性物质的筛选策略

New Technologies for Discovery of Natural Rroducts from Marine

Mcrooganisms

摘要：细菌耐药性产生和新药退化的速度越来越快，使得寻找新型抗菌药物迫在眉睫。目前上市的新药数量很少且基本都是对已上市药物的结构进行改造，很难从本质上改变细菌的耐药性问题。自然界中微生物（尤其是海洋微生物）的多样性及其代谢产物的多样性，为发现新药以及先导化合物提供了不竭动力。海洋微生物在所处环境和代谢途径上与陆地微生物有很大不同，人类在陆地资源开发陷入瓶颈之际，应更多地关注新生境、新资源给天然药物开发带来的活力。面对日益严重的病原微生物耐药性，以及天然药物筛选过程中大量的重复发现，如何采用新技术、新资源、新模型筛选发现新的活性次生代谢产物，已成为天然药物开发中亟待研究的重要课题。

关键词：细菌耐药性；海洋微生物；先导化合物；药物筛选；次生代谢产物

20世纪，虽然新型抗生素的发现和临床开发已经在医学上迈进了一大步，但抗生素耐药性问题也日趋严重，耐药性产生的速度远远快于新型抗生素的发现的速度。1962年以来，只有三类新型抗生素应用于临床：2000年上市的利奈唑胺（linezolid，噁唑烷酮类抗菌药，辉瑞制药），2003年上市的达托霉素（daptomycin，环酯肽类抗生素，Cubist制药公司）以及最新上市的瑞他帕林（retapamulin，截短侧耳素衍生物，葛兰素史克制药公司）。随着耐药菌株和新型病原菌的出现，迫切需要发现具有新型抗菌机制的药物。自然界中含有丰富的微生物资源，有学者认为，其中99%以上的微生物是不可培养的。微生物（尤其是海洋微生物）的多样性及其代谢产物的多样性，为发现新药以及先导化合物提供了不竭动力。面对日益严重的病原微生物耐药性，以及天然药物筛选过程中大量的重复发现，如何采用新技术、新资源、新模型筛选发现新的活性次生代谢产物，已成为天然药物开发中亟待研究的重要课题。前人给我们提供了大量可信的工作和易于理解的综述。本文主要对从可培养的微生物与不可培养的微生物中发现

新化合物的研究方法方面进行综述。

1 从可培养的微生物中发现新的化合物

1.1 Genome-mining为导向的微生物来源的天然产物的发现

近年来，基于结构相似的次生代谢产物的合成基因簇也有一定程度相似性的假设，基因筛选成为寻找新化合物的重要手段之一。通过将特定基因作为筛选标记，可以在基因水平上评估相应菌株的活性物质产生能力,从而筛选到在初始条件下菌株低表达或不表达的活性物质；另一方面，通过对基因筛选所获得的次生代谢产物合成相关基因(簇)进行生物信息学分析，可以初步预测产物结构，在一定程度上避免化合物的重复发现。放线菌的大部分次生代谢产物是通过聚酮合酶(polyketide synthase，PKS) 和非核糖体多肽合成酶(non-ribosomal peptide synthetase，NRPS) 途径形成主要结构模块；而活性产物更重要的一个特性—结构多样性，则是由一类称为后修饰酶的蛋白决定的，其中包括卤化酶。卤化作为赋予次生代谢产物生物活性的一种重要修饰行为，常常通过依赖黄素腺嘌呤二核苷酸(FADH2)的卤化酶引入。基于上述假说，这种同源基因可以被用作合适的标记在分子水平上预测产物结构。目前已有将此策略成功应用于筛选天然含卤化合物产生菌的报道。

1.1.2 FADH2-依赖型卤化酶序列特异性

通过对FADH2 -依赖型卤化酶氨基酸序列（约550AA）比对发现，在氨基酸末端有两个保守区域[1]（图1），其中一个为靠近氨基端的保守序列GxGxxG，该序列与黄素的结合相关；另一个为位于蛋白中间包含两个色氨酸残基的保守序列WxWxIP，两个色氨酸残基与黄素相邻，可能是起到阻止底物与黄素结合的作用[2]。

图1. FADH2-依赖型卤化酶氨基酸序列保守区域

1.1.2 FADH2-依赖型卤化酶在寻找天然卤化物方面的应用

很多卤化物的生物合成基因簇中的卤化酶为FADH2-依赖型卤化酶。Hornung等[3]利用avilamycin、simocyclinon、complestatin、balhimycin、calicheamicin和ansamitocin的卤化酶保守区域设计一对简并引物，对550株随机选择的放线菌进行筛选，发现其中103株（约20%）含有潜在的FADH2依赖型卤化酶基因。并通过与已知的卤化酶进行比对，根据具有相似结构的次级代谢产物的生物合成基因簇中往往含有某些同源性很高的基因这一假说，Hornung等通

过对一株含有与糖肽类balhimycin卤化酶相似性为93%的放线菌进行研究，发现了一个糖肽类抗生素cb2364（图2a）新的产生菌。另外，将其中一株放线菌假定的卤化酶基因及其连锁的PKSII型基因簇在背景较清楚的白色葡萄球菌中异源表达，发现了一种新的聚酮类卤化物CBS40（图2b），其对VRE的抗菌活性为万古霉素的100倍。高鹏和黄英[4]也利用Hornung 等人设计的引物，对228株放线菌进行筛选，并研究其分布与进化规律，为寻找天然卤化物奠定了一定的基础。通过以上的研究表明，寻找新的FADH2-依赖型卤化酶可成功应用于新的含卤素抗生素及其生物合成基因簇的发现与预测。

图2. A) CB2364化学结构，B）CBS40化学结构

1.2. Transcriptome-mining为导向的微生物来源的天然产物的发现

微生物来源的天然产物(NPs)是一种具有结构多样性的小分子物质，它们在先导化合物的发现和新型药物的发展中起了举足重轻的作用。NPs的产生依赖于微生物生物合成基因簇中相关基因的协调转录，形成的mRNA再翻译成相关的多肽链，这种多肽链正确折叠后形成具有功能的蛋白质，协调催化小分子的前体物质形成复杂结构的化合物（图3）。在过去十年内，由于放线菌基因组的不断测序发现，每个菌株的基因组中至少存在十几个生物合成基因簇，但是只有10%的基因簇被鉴定能够产生相应的次级代谢产物[5]。生物转化为导向的研究已经成功的发现了十几种生物合成基因簇能够产生新的代谢产物，这些化合物包括PKS，NRPS和萜类合成酶催化产生的。在新化合物发现已举步维艰的趋势下，通过新的方法钓取基因组中隐藏的基因簇，使之能够产生相应的化合物。在后基因组时代，通过新的策略靶向的发现新的天然产物已变的尤为重要。因此，中国科学院有机所刘文教授[6]用S. flaveolus DSM 9954作为模式系统，在转录水平，钓取活性生物合成途径和他们相关的产物。这种有效的mRNA-based mining 策略，在提高新的天然化合物的发现效率方面，具有潜在的应用价值。

整个过程如下所示：

（1）首先估计了S. flaveolus DSM 9954在不同培养基中的化学成分。分别用6中培养基进行发酵4天。HPLC分析培养液，显示产物成分的区别。对产生产物最多样性的培养基成分进行时程分析，第四天大部分产物产量达到最高。这些点被选择做转录组学分析。从第四天培养液中分离总RNA，反转录成cDNA，这样就组成一个条件性转录组。

（2）对cDNA进行PCR扫描，引物设计根据产生不同结构基序的多种生物合成基因而来。PCR产物通过280到550bp的退化性引物扩增产生，这些引物包括组装多聚乙酰碳骨架的PKS I型模块的酮酯酰合成酶（KS）区域，活化氨基酸底物的线性NRPS途径中的腺苷酸区域，核糖体肽途径中负责噻唑琳部分的硫肽环化脱水酶，脱氧糖形成相关的(d) NDP-d-glucose-4,6-dehydrase 以及负责添加卤原子的FDH。然而，对tcdh，dgdh和fdh的扩增没有得到产物，pks和nrps扩增得到不同产物。PCR产物克隆到质粒，转化进E. coli.。随即选择50克隆测序。所有序列都与一直的PKS和NRPS基因有同源性。对产物进行分组：7pkss和3nrpss。mRNA表达得到的产物中有5pkss和1nrpss是全新的，在已报告的产物中没有发现类似物，他们可能编码未知的多聚酮，多肽链或者它们的杂交。

（3）重复上述提到的程序，用基因组DNA代替cDNA比较这种基于转录组的方法和传统PCR依赖性的基因组扫描方法的效率。同样没有tcdh和fdh反应，说明在S. flaveolus 基因组中不存在或者没有足够分散阻止变形引物的退火。ngdh有，说明基因组存在但在本发酵过程中不表达。对pkss和nrpss扩增分别得到11中基因，随即测序15个克隆，在SF 生物合成基因簇中之发现了1个。说明基于cDNA比Genomic DNA得到的产物更具多样性。这说明在钓取生物合成基因是这个策略在效率方面有很大优势。

（4）为了建立基因和位置化合物之间的联系，对每个基因进行敲除。

（5）用pcr1-5和pcr8为探针，将负责MTYCs合成的生物合成基因簇从基因组文库中克隆。结果说明了cDNA方法在NPs相关活性生物合成途径的加快和鉴定方面具有优势。

这种新的转录组扫描方法可用从位置基因组序列的菌体发现NP产物或者从生物合成途径中组装NP。这个方法省时，并且适合特定的感兴趣的化合物，比如改变培养条件来活化特定代谢产物的产生或设计心的引物来扩增特定的生物合成原件。这中可以整合到可行的基因组吊取策略中来唤醒隐藏的基因簇，使NPs扫描和它们生物合成研究变的更灵活。

图3.Transcriptome-mining为导向的微生物来源的天然产物的发现

1.3 质谱为导向的genome-mining途径筛选的肽类天然产物（PNPs）的发现[7]

肽天然产物是一种普遍存在的化合物，在所有的生物形式中都有发现，并且在这些生物体的生长、防御以及信息传递方面发挥多样的生物功能。自然界中已经发现包括核糖体和非核糖体在内两种生物合成途径来合成这些多修饰的肽类。尽管非核糖体肽类分布相对有限，这种限制主要对具有大的基因组的微生物而言，而核糖体合成并经翻译后修饰的肽在自然界中具有广泛的分布，这也包括人体内的肽。然而，PNPs的多样性、分布的广泛性及其相关的功能直到今年才被人们认识，这主要因为该研究过程需要大量的时间。我们报道了一种新的质谱指导的基因组挖掘方法，该方法能够快速的建立PNPs的化学型跟其生物合成途径之间的联系，因此能够在一个流线型的筛选平台上快速鉴定具有活性PNP的生物合成基因簇进而对其产物进行分组。

在PNPs中，核糖体肽作为一个天然产物组其数量快速增加。通过生物合成途径，已经鉴定了多组原核生物起源的核糖体肽天然产物（RNPs）。通过这些途径合成的产物经多种翻译后修饰得到含羊毛硫氨酸的肽，含硫环状多肽，cyanobactins，套索状肽和其他的小菌素。鉴于此，依据生物活性、产生菌以及结构的传统RNP分类方法向主要依据生物合成途径的新的分类方法改变。在RNP生物合成过程中，肽段氨基酸序列是由前体基因编码的，该基因经核糖体直接翻译后形成包括前导肽和核心肽的区域。前导肽作为支架并且包含加工酶的识别位点参与RNP生物合成系统的翻译后修饰，而该系统中的核心肽是经修饰的天然产物的主要部分。生物合成酶对核心肽翻译后修饰现象十分广泛并且能够丰富这些肽类的结构，粗略一看并不能

辨认出它们就是核糖体合成的分子。与此相反，非核糖体肽由一系列多功能的蛋白模块通过腺苷酰化酶作用编码氨基酸前体。这些蛋白能够选择性的向转运蛋白传送其底物以便非核糖体肽合成酶（NPRS）对肽类的合成。这一过程能够捕获除20种基本氨基酸外的其他底物，生成一些值得关注的例如万古霉素、达托霉素以及环孢菌素等具有临床应用价值的物质，而RNPs仅有20种基本氨基酸组成。

为了估算细菌中PNP的化学多样性，我们系统的分析了截至到2010年9月the Joint Genome Institute(JGI)数据库中跟RNP及NRPS途径相关的1035个已经完成的基因组。通过搜索Pfam(蛋白家族)数据库中具有RNP特征结构域的RNP生物合成基因簇，我们估计至少71%已经确认的基因组具有合成RNP的特征。我们还鉴定了1966个候选RNP基因簇，其中637个基因簇含有2到3个在RNP基因簇中频繁出现的区域，这些区域共有9个。相比而言，在我们已经研究的基因组中69%含有NRPS的Pfam区域并且53%具有NRPS/PKS杂合特征。因为在该训练组中我们的运算法则只有24个已知的RNP基因簇，所以对于RNPs的估计是不全面的。尽管如此，这一分析表明在大多数细菌中具有普遍的生产RNPs的能力，因此RNPs代表了一大类未被充分认识的生物活性分子家族。

1.3.1 NPP概念

NPP是一个易于操作并且没有偏好性、以质谱为基础的从化学型到基因型的基因组挖掘方法，能够快速鉴定已测序列生物中核糖体和非核糖体肽天然产物及其合成基因簇。简而言之，NPP目的是实现假定PNP串联质谱图中的物质偏转（mass shift）跟编码基因之间的匹配。NPP 的基因组挖掘操作包括许多标准步骤，它们能够保证肽的串联质谱数据跟基因组来源的肽结构相互匹配（图4）。在这个过程中，NPP充分利用了过去十年中获得的关于PNP生物合成的大量知识。在实际使用过程中，NPP操作流程开始于利用机制辅助激光解析电离飞行时间质谱（MALDI-TOF MS）来分析生物或者提取物以鉴定未知物质。我们的目标是分子量范围1500-5000Da的物质，因为微生物中该范围内的大多数物质还没有化学水平的描述，因此这正好需要NPP方法。然而，NPP方法在检测方面不受大小的影响，只要串联质谱数据能够作为检测生物合成途径的一种的方法。MALDI-TOF MS对丙醇粗提物或者琼脂培养物的分析能够保证活跃表达的化合物从半固体培养基上被捕获。尽管在PNP搜索过程中不是必须的，MALDI 图像联系跟微生物形态有关的分泌代谢物可以减少人工提取过程。在质谱的指导下，假定的肽可以通过分子排阻色谱及随后的富集和脱盐操作而得到富集。经富集的假定PNP随后通过串

联质谱在序列标签步骤进行分析。通常来说，NPP序列标签是一种从头序列标签能够从PNPs 的基因组挖掘空间里面被查找到。这包括在串联质谱图谱中依据物质偏转生成一个氨基酸顺序和随后根据该串联质谱顺序标签确定找寻标签。物质偏转从所有可能的单体中限定了候选的氨基酸残基，这些单体包括RNP为基础的前提基因的编码单体以及对应于NRPS的单体。串联质谱物质偏转到基因组挖掘单体的过程需要确认PTMs、非核糖体底物、气相片段的行为以及在纯化和质谱分析过程的氨基酸残基的化学修饰。NPP为基础的RNP基因组挖掘引入候选前体肽基因组的六框翻译来确认可能的搜索标签。因为5-10个氨基酸长度的搜索标签可能形成很多的配对情况，正确的RNP前体基因再应用生物合成知识进行确定，这个认识是搜索标签应该跟小于100个氨基酸长度的开放阅读框C末端相互联系，而这个阅读框跟RNP生物合成基因形成基因簇。NPP为基础的NRP基因挖掘需要查询所有目的基因组中可能的非核糖体肽作为搜索标签。

NPP在建立PNP结构跟生物合成基因方面联系上得有效性有赖于遵循生物合成逻辑多次匹配串联质谱为基础的结构跟基因组为基础的候选结构，例如每次搜索标签的匹配必需结合串连质谱分析在物质的量、顺序和生物合成标签方面进行确定。为了说明该方法的有效性，我们比较了NPP方法跟目前使用的蛋白质组方法在从RNP基因组中鉴定前体基因的实验。所有的像Mascot和InsPecT这样的标准的蛋白质组平台都不能鉴定NPP确定的RNPs，这些RNPs 是一些具有平常的RNP PTMs或者从未知或没有限制的的情况下去发现未知的PTMs。InsPecT 在预设了用于NPP分析的PTMs后才能够鉴定两个RNPs。

图4. 天然产物肽基因组学总流程图

1.3.2 NPP鉴定核糖体肽AmfS

为了证明NPP在RNPs发现上面的能力，作者以灰色链霉菌IFO 13350中的AmfS作为研究目标，因为它是一种已知的含有四个PTMs的含羊毛硫氨酸的肽。对灰色链霉菌的MALDI 成像以及MALDI-TOF MS分析提取物鉴定了一个分泌分子量为2212Da的物质。我们最后将这种肽进行CID的片段化（图5）。在串联质谱图中，我们确定了序列片段离子的电荷状态并确认物质偏移的顺序是99-99-113-69-101。我们随后将这些物质偏转信息跟候选的可能氨基酸相互匹配，在可能的位点初步用基本氨基酸取代偏转信息获得序列标签。我们接下来利用已知PTMs中的RNP单体来替换非基本氨基酸物质。我们用非基本氨基酸脱氢丙氨酸（Dha）取代69Da的偏转。Dha是核糖体肽中的一个候选氨基酸，这是因为脱氢的丝氨酸和苏氨酸或者脱硫的半胱氨酸在串联质谱中经常看到，这一过程可能是翻译后修饰的结果也可能是串联质谱的气相重排所致。从确认的序列标签VVI（L）S（C）T,我们总结了一个包括正反方向的所有八种可能的PNP的序列标签来搜索灰色链霉菌的基因组序列。在以六框翻译为基础的成百万计的所有可能肽序列中，我们只确认了一条包含43个氨基酸的以VVLCT为搜索标签的前体。这一结果满足RNP生物合成所要求的搜索标签位于一个小于100个氨基酸长的肽产物的C末端。接下来我们比较了预测的核心肽跟串联质谱中获得的物质的量，其中对于串联质谱的结果考虑到了PTMs,比如脱氢。22个氨基酸长的核心肽的计算物质的量跟预测的含有四个假定PTM脱氢的结果不一致，但是跟形成两个Dha和两个二硫键的AmfS一致。另外，预测的核心肽序列还能够在接下来跟串联质谱数据的对比中进一步确认。通过序列比对分析能够确认AmfS生物合成基因簇的其余部分的相邻基因可以进一步确定RNP化学型跟基因的联系。以基因簇的原件为基础，特别是AmfS的核心肽及其PTM的相关酶AmfSA和AmfSB，从已知RNP 生物合成基因簇，我们可以确定这个分析的肽属于含羊毛硫氨酸的肽的家族Ⅲ。最后，依据已知的核心肽序列、串联质谱数据以及有关AmfS样的含羊毛硫氨酸肽的PTMs，我们确定了一个AmfS的结构。对AmfS及其基因簇的确定说明了NPP这种利用串联质谱数据和基因数据能够将PNP的化学型跟基因型相互联系起来。

图5. NPP鉴定核糖体肽AmfS流程

1.3.3 NPP确定非核糖体脂肽

对NPP的操作流程做一微调后可以用于发现NRPs。我们又将该方法用于由MADIL图像从灰色链霉菌ATCC 53653的一个菌落里面检测到的多个脂肽（图6）。串联质谱对SHY-1628的分析获得一个99-99-83-83-71-113-99-57-115的序列片段，因为高序列中的大多数物质偏转跟基本氨基酸相对应，开始是被置于RNP的工作流程得到V-V-83-83-A-I(L)-V-G的序列标签。我们用Dhb代替83-Da的物质，而Dhb的合成前体是苏氨酸。用搜索标签VVTTA(I)VG从灰色链霉菌的六框翻译中查询，在已经描述的RNPs中我们没有合适的前体肽。利用长的序列标签找寻前体肽的失效说明以SHY-1628为基础的肽被一系列的非核糖体肽所替代。为了验证这一猜测，我们修订了最初的序列标签使它包括NRP特异的非基本氨基酸来进行NRP的基因组挖掘。因此，这个83-Da的物质偏转可能对应于Dhb、NMe-Dha或者高丝氨酸内酯（HseL）。因为HseL通常是位于NRP的C末端，因此我们排除该物质。Dhb和NMe-Dha很可能是在NRP的组装过程或者组装后分别来源于苏氨酸和丝氨酸，这是因为假定的Dha和Dhb单体中的烯氨的不稳定性。此外，Dhb的物质偏转也可能是从MS气相诱导的从苏氨酸-大内酯跟NRP 的C端切除一个开环后形成的。我们推测出VVT(S)T(S)A(L)VG这样一个序列标签而不是像NP.searcher和antiSMASH运算法则那样对NRP的预测要从基因组大重叠群中来预测NRPS基

因簇和它们的NRP产物。这一分析结果得到的还原的、全长8个氨基酸的序列标签跟灰色链

霉菌基因组中5个预测的NRPS的一个候选NRP序列相匹配。通过反复的检验过程，我们发现对应的基因簇包含一个N末端的跟脂肽生物合成相关的酰基连接，这跟发现的14-Da的分离母离子（parent ions）具有脂肽特征完全一致。进一步的串联质谱以及核磁共振分析确认这个脂肽作为lipotetradecapeptides中涂链霉素抗生素家族的膜，包含一个其次跨膜的大内酯并且总共有七个修饰位点。除了来源于Streptomycetes endus的涂链霉素Ⅰ，我们还鉴定了5个新的涂链霉素类似物（Ⅱ-Ⅵ），它们在酰胺链以及5位和13位的缬氨酸或者异亮氨酸的取代物跟灰色链霉菌ATCC 53653中的原始结构均不同。已鉴定基因簇的生物合成特征跟NRPS的底物及修饰物中的涂链霉素Ⅰ的结构相匹配。因此，正如我们对RNPs的研究，串联质谱分析跟基因组挖掘方法也能够快速、准确地用于NRP化学型跟基因型的联系。例如，我们在涂链霉素Ⅰ的2级串联质谱中检测到一个低分辨率的115Da的物质偏转，并且首次鉴定为天冬氨酸。假定的涂链霉素NRPS相应模块取代了以前的NMe-苏氨酸，这样串联质谱的物质偏转就能够解释了。这个例子说明在NRP序列标签中，像基本氨基酸的N-甲基化甚至非基本氨基酸如果在第一个循环中不能够识别，还是可以通过进一步的分析得到序列标签。

我们还成功的通过NPP方法得到了许多其他的NRPS衍生物。最近，NPP甚至还能够在只有两个氨基酸序列标签的前提下成功的发现arylomycin。

图6. NPP确定非核糖体脂肽流程

1.3.4 NPP鉴定新的RNP化学型和基因型

利用NPP方法，研究人员还从测序的涂链霉素菌中发现了许多其它未鉴定的RNPs。从

七个涂链霉素菌株中，研究人员鉴定了许多未知的RNPs及其基因簇，其中第一个被鉴定的RNP及其基因簇是套索肽家族Ⅰ中一个命名为SSV-2083的肽物质。对SSV-2083的发现和分离主要借助了MALDI成像跟MALDI-TOF MS。串联质谱分析该未修饰化合物没有得到序列信息。之所以得不到结果，主要因为这些分子中含有二硫键或者生成硫醚连接。所以，研究人员就采用NaBH4及NiCl2脱硫处理后进行串联质谱分析。从除去限制的SSV-2083谱图中获得一个10个氨基酸长度的串联质谱序列标签，利用该标签研究人员鉴定了SSV-2083生物合成基因簇（图7）。

图7. 从7个链霉菌中鉴定新的RNP化学型和基因型

NPP的创新之处在于有效地将目的肽跟它们的基因簇联系起来，这种联系的建立主要以修饰肽的从头串联质谱序列标签搜索前体肽或者预测的NRPS产物，并进一步应用生物合成知识以及利用串联质谱和PNP基因组挖掘之间的多个步骤来确定化学型跟基因型的匹配。

总之，NPP是一个新的、以MS为基础的基因组挖掘平台用于指导核糖体肽和非核糖体肽的发现。这种方法能够从多个生物体中流线化的筛选肽的化学型并能方便的研究它们的分离、结构解析以及生物方面的性质和途径从而充分理解肽天然产物的生物学作用和治疗潜能。

1.4 基于反义RNA技术抗菌新模型筛选的天然活性物质的发现

细菌耐药性产生和新药退化的速度越来越快，使得寻找新型特异性靶标药物迫在眉睫。

自然界中微生物的多样性及其代谢产物的多样性，为发现新药以及先导化合物提供了不竭动力。但由于微生物次级代谢产物往往含量极低，采用常规抗生素的筛选模型，发现自然界中含量较低的新型药物变得越来越困难。因此，建立一个针对特定新靶标且灵敏度极高的全细胞筛选技术成为发现新型抗菌药物的关键。近年来，反义RNA技术在构建特异性靶标的超敏细胞新药筛选模型中的应用备受关注。

1.4.1 反义技术在建立抗菌药物新筛选模型中的应用

反义RNA是指与mRNA或DNA互补的小型单链RNA分子，其长度一般不到200bp。它是一种本身缺乏编码能力，但能与特异靶RNA(主要是mRNA)互补的RNA分子，可通过配对碱基间氢键作用与靶RNA的特定互补区域结合形成双链复合物，抑制靶RNA的功能，从而调控基因的正常表达。反义RNA广泛存在于各类生物中。反义RNA技术的基本原理是利用自然存在的或人工合成的反义RNA，通过基因重组技术反向插入到合适的表达载体形成重组DNA，然后转染受体细胞，则这一反向插人的序列就会随细胞周期产生大量反义RNA，对基因的表达进行调控，从而抑制、封闭或破坏靶基因的表达。选择具有明显的生物学效应的靶序列后，反义RNA即通过和相应的RNA互补而达到阻断其功能的目的（图8）。

图8 反义RNA作用机制

对于新型抗菌药物的研发而言，细菌必需基因的鉴定为发现大量新的抗菌药物靶点提供了可能，但并非所有的细菌必需基因都是理想的药物靶点。理想的药物靶点必须具备以下特征：（1）为细菌生长所必需，其抑制将导致细菌死亡（或者是毒性因子，其抑制可使细菌毒性丧失）；（2）在多种细菌中存在，这有利于广谱抗菌药物的研发；（3）具有较高的特异性，其抑制剂对人体无毒或毒性较弱；（4）为了能够高效地进行药物筛选，最好能够建立体外的高通量筛选模型。

图9. 大肠杆菌脂肪酸合成途径

脂肪酸是细胞生物膜等的重要组成成分，故在生物体内，脂肪酸的合成是必须的。根据参与脂肪酸生物合成（FAS）酶的不同（图9），可以将脂肪酸的合成途径分为I型和Ⅱ型两种，I 型脂肪酸合成途径存在于哺乳动物体内，而Ⅱ型脂肪酸合成途径存在于细菌和植物中的。I型脂肪酸合成途径中，参与脂肪酸合成反应的酶是由一条多肽链构成的，这条链包括了合成脂肪酸所需的所有催化活性中心；而在Ⅱ型脂肪酸合成途径中，每一步反应都有一个单独的酶催化，而且这些酶在不同种属的细菌中具有高度的专一性。但两类脂肪酸合成酶系总的序列同源性差异较大。正是因为Ⅱ型FAS酶在细菌中的广泛存在以及在活性位点组织结构上的差异，使得催化该途径的酶成为较为理想的靶点，进行抗菌药物的筛选。

1.4.

2. ACP是抗菌模型中的重要新型靶标

目前，以E.coli为模型的Ⅱ型脂肪酸合成途径已经得到了广泛的研究。FASⅡ主要包括7 种单功能酶：酰基载体蛋白(ACP) ,丙二酸单酰-CoA :ACP转酰酶(FabD), β-酮脂酰-ACP合成酶

(FabH ,FabB ,FabF), β-酮脂酰-ACP还原酶(FabG), 羟脂酰-ACP脱水酶(FabA／FabZ), 烯脂酰-ACP还原酶(FabI／Fab/FabL)，以及酰基硫酯酶(PlsB)。参与细菌ACP（FAS II）在总的序列及蛋白三维结构上完全不同于哺乳动物的酶系（FAS I），且细菌和人体内的ACP在结构、组成和脂肪酸合成中的作用的显著不同，使ACP成为一种引人关注的的新型抗感染药物作用的靶点。下面对已报道的此途径中可以作为抗菌药物筛选靶点的几种酶进行简单介绍。

(1) β-酮脂酰-ACP还原酶(FabG)

FabG催化乙酰乙酰-S-ACP的还原。E.coli中FabG单体的分子质量为25.5 kD，在溶液中以四聚体的形式存在，NADP是其辅酶。E.coli FabG晶体结构的研究结果表明，FabG结合其辅酶NADP后引起FabG构象的变化，使3个与其催化活性有关的氨基酸(Serl38、Tyrl51、Lysl55)进入活性口袋，行使催化功能。目前尚未见以FabG为靶点的抑制剂研究的报道。

(2) 羟脂酰-ACP脱水酶(FabA／FabZ)

FabA／FabZ可以催化D-β-羟丁酰-S-ACP的脱水反应。它们是同功酶，FabA还具有异构酶的功能，参与不饱和脂肪酸的生物合成，而FabZ则不能。它们在氨基酸的一级序列上具有很高的相似性，但是生物信息学的研究表明它们属于不同的家族。

针对FabA和FabZ酶抑制剂的研究报道较少。有研究表明，3-癸炔酰-N-乙酰半胱胺(3-decynoyl-N-acetylcysteamine，NAS)可以抑制FabA的活性，它是关于FabA的一个典型的自杀性的抑制剂。最近以NAS为模板，合成了2个小分子化合物，分别命名为NAS-75和NAS-91，它们在分子水平具有抑制FabZ的活性，通过与酶的活性口袋附近的氨基酸残基相互作用与底物竞争活性中心，从而抑制酶活性。

(3) 烯脂酰-ACP还原酶(FabI／FabK/FabL)

目前，已发现了三种细菌烯脂酰-ACP还原酶（FabI、FabL和FabK），不同种属的细菌可能含有不同的烯脂酰-ACP还原酶，某些细菌中含有不止一种烯脂酰-ACP还原酶，大肠杆菌只含有一种烯脂酰-ACP还原酶（FabI），是一种必需酶。

FabI 是fabI基因编码的还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADH) 或还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸酯(NADPH) 依赖型单功能酶[5][5][5]。其催化机制是一个氢转移过程, FabI 将NADH中H 转移到烯酰基C-3 位上，底物经过重排形成烯醇化阴离子中间体，再得到一个质子形成还原产物。

应用高通量筛选技术在已有化合物库中对具有细菌FabI 抑制活性的化合物进行筛选，发

现了一些活性先导化合物，对其进行结构修饰确定相关的药效团,然后通过衍生化得到另一些具有FabI 抑制活性的新化合物，根据其结构大致可分为5 类:1,4-二取代咪唑类、2,9-二取代-1,2,3,4-四氢吡啶并[3,4-b]吲哚类、氨基吡啶类、吲哚萘啶酮类以及3-氰基-4,6-二取代-2-吡啶硫醚类。

目前以FabI为靶点的抑制剂有DBZ(diazaborines)、三氯生(triclosan)和异烟肼(isoniazid)等[8]。一直以来，三氯生被当作一种非特异性的、广谱的抗细菌和抗真菌杀虫剂，存在于包括肥皂、漱口水、纺织品和塑料等消费品中。已知三氯生抗性常常与包括异烟肼（一线抗肺结核药物）在内的其他FabI抑制剂的抗性相伴。异烟肼对分支杆菌具有强烈的抑制作用，有研究表明，异烟肼对结核分枝杆菌Ⅱ型脂肪酸合成酶系中的多个组分均有影响。

(4) β-酮脂酰-ACP合成酶(FabB／FabF／FabH)

FabB／FabF催化丙二酸单酰-ACP形成乙酰乙酰-S-ACP反应，FabF具有与FabB相似的结构和催化机理，但是它们在对于不同底物的结合能力上存在很大的差别。FabH也是一个β-酮脂酰-ACP合成酶，它在起始反应阶段起着关键作用。目前以FabB／FabF为靶点的抑制剂有硫乳霉素(thiolactomycin，TLM)和浅蓝菌素(cerulenin，CER)。以FabH为靶点的抑制剂有TLM和SB418011，但CER却不能抑制FabH的活性。

默克公司汪俊研究组[9,10,11]以细菌脂肪酸合成过程中的关键酶FabH/FabF 为靶点建立的全细胞筛选方法。该研究组将FabH/FabF编码基因反向插入在木糖诱导的启动子下游，获得反义RNA表达载体，将其导入金黄色葡萄球菌内诱导表达。反义RNA分子能够有效降低靶基因的表达水平，因此从理论上讲，表达反义RNA分子的菌株对脂肪酸合成酶特异性抑制剂的敏感性增强，即为敏感菌。采用双平板敏感性差异实验，将敏感菌和携带空白载体的对照菌分别接种于两块平板，杯碟法测定抑菌圈大小。抑菌圈大小反映了样品抑菌活性高低，两块平板抑菌圈的差异则可以揭示样品作用的选择性高低，即如果所筛样品对敏感菌的抑制活性较强，而对携带空白载体的对照菌抑制活性较弱或没有抑制作用，则可以说明该天然产物为FabF/FabH抑制剂。该研究组采用这一方法筛选了几十万种天然产物发酵液，先后获得了全新活性化合物平板霉素和平板素（图10）。平板霉素的作用靶点为FabF，平板素是FabF和FabH的双重抑制剂，这两种化合物均具有新颖的化学骨架、良好的广谱抗革兰阳性菌活性，对多种重要的抗生素耐药菌株也具有活性，包括MRSA和VRE等，在体内实验中平板霉素和平板素也都显示出了良好的抗菌活性，非常有希望发展成为具有全新作用机制和化学结构的新型抗菌药物。

图10. 平板霉素（A）和平板霉素（B）的结构式

2 从不可培养的微生物中发现新化合物的技术-宏基因组学

从环境中分离微生物是一个令人惊异的来源。迫于生存竞争和环境压力形成的保卫性，攻击性和信号多样性进化，这些进化会产生化学和生物多样性和新药物产生的潜能。环境微生物，主要是放线菌，杆菌和丝状真菌，有产生次级代谢产物的巨大能力，并应用于新药开发。地球上的微生物细胞的总数估计为1030。原核生物占生物个体的比例最大，包括106至108个独立基因型群[12]。这些主要的还未开发物种的基因整套基因排列，为新型酶和代谢研究提供了很大的一个积蓄。宏基因组学省略掉了微生物的分离或培养的需要。宏基因组方法基于直接从环境样本中分离核酸，已被证明是一个非常强大的工具，它被用于比较和探索分析复杂环境微生物群落的生态代谢，以及利用由分离的核酸组成的总库来发现识别新型生物分子。随着新技术的发明和发展，使得我们更有信心从“非培养微生物”中发现新的可成药物质。多学科方法结合不同技术可加速从非培养微生物进行新药发现的研究发生革命性的变革。

2.1宏基因组学方法作为从非培养微生物中发现新药的方法

大量未被利用的自然环境中非培养微生物基因组贮金库中，宏基因组在探索和开发做出了非常大的努力。这种方法涉及直接从环境样品中提取总遗传物质，不需要培养。然后将遗传物质连接到载体上转移至新的宿主细胞，一般是E.coli，产生宏基因组库。之后这些文库可通过DNA序列研究结构和功能的多样性，或者基于序列钓取或功能表达发现新产物。然而，非常重要的是用于宏基因组研究的样品必须定向的采取于特殊的地方，从而增加成功率。因为同这种方法发现代谢产物直接依赖于样品中存在的微生物。例如，如果目标是抗肿瘤药物，那么应该选择海洋系统中的宏基因组，因为陆地样品显示非常低的抗肿瘤潜能（0.01%），而海洋样品1%。相似的，如果意向解毒剂，那么应该从有毒的地方选择样品来增加命中率[13]。

2.2环境基因组提取

未被切断的高质量DNA是必须的，这要求不能用过于激烈的方法如玻璃珠。最好是高分子量DNA，因为编码抗生素或其他工业感兴趣化合物的生物合成基因簇大小通常在30-100kb。

有两种常用方法：1）是反复冻融直接裂解环境样品[14]。2）是间接法，在裂解之前先将微生物细胞分离出来[15]。直接法使用更为广泛，因为它可以更快速高效，并且能够得到更多DNA 产量。但是，这种方法提取的总DNA不能区分细菌、古细菌、真和生物来源的DNA，过多的信息会降低筛选效率。另外对不希望的化合物的共提取，如腐殖质，会导致下游进程的受抑制。对裂解产物的纯化可能导致DNA的产量下降。另一种选择是间接裂解法。这种方法中，细菌细胞从环境混合物中分离，然后再进行裂解。虽然这种方法耗时较长，但是可以避免干扰性污染物如腐殖质，并且能够增加后续筛选的效率。进一步的问题是，总DNA的提取会导致某优势基因的过表达。这可以通过采用CsCl2密度梯度离心通过DNA中GC含量的不同来分离基因组，DNA解离方法，差减杂交来克服[16]。

2.3构建宏基因组DNA文库

可用来构建文库的载体：小片段0.5-5kbp，质粒。>35kbp，cosmid or fosmid （都允许插入35-45kbp）vector 或者BAC载体（100kbp）。Cosmid和BAC最常用；但是当插入原核或真核片段时cosmid文库不稳定，fosmid更好。

2.4 宏基因组文库的表达载体

遗传操作容易，工业发酵使用广泛，E.coli 通常作为表达载体宿主细胞。在Ecoli中已经成功的：羟基丁酸的利用，羰基产生和抗生素产生。但是也有局限性：当高GC含量的片段对扰乱含低GC宿主的转录，如抗生素的产生。插入片段和表达宿主的GC含量要相近更容易成功表达。其他可选择的宿主为链霉菌Streptomyces spp., 假单孢菌Pseudomonas spp. and 杆菌Bacillus spp. 链霉菌适合：检测次级代谢产物因为链霉菌基因组中富含GC。缺点是生长较慢，这可能会影响其工业效率。

2.5宏基因组文库筛选

2.5.1基于序列的筛选

以基因序列为基础方法，是根据已知的基因或蛋白质家族的保守区域设计DNA探针或引物来实现的。通过这种方式，只能识别那些功能已知的蛋白的新变异体。然而这一方法可以成功的鉴定那些编码新型酶的基因，例如二甲基巯基丙酸降解酶[17]，双加氧酶[18,19]，亚硝酸盐还原酶[20]等。

(1)基于序列的筛选-PCR

Bartossek等人[20]使用PCR的方法，通过对来自不同的环境的样品，如土壤，沉积物，淡

水，鸡粪和无脊椎动物进行研究，在氨氧化古细菌中检测到了编码依赖铜的亚硝酸盐还原酶（NirK）的同源基因。根据对细菌NirK蛋白质的氨基酸序列的推断和两个同源古细菌，为古细菌nirK相关基因的扩增设计出了两套不同的简并引物。通过这个途径，作者证明了古亚硝酸盐还原酶无处不在，为促进全球生物地球化学氮循环作出贡献。为了分析在土壤动力学中TFDA类基因编码的除草剂降解的双加氧酶的多样性和丰富性，Zaprasis等人设计了定量PCR 检测方法[19]。共分析了437 tfdA类似序列，分别采用5对不同的引物，从而有针对性的确定保守tfdA区域。计算得出每克干土中约有1.0×106至65×106份tfdA类似基因的拷贝。这表明在土壤中存在着未知的会降解双加氧酶除草剂。

(2) 基于序列的筛选-基因靶向宏基因组学

为了对兴趣基因的序列空间获得更全面的了解，采用了PCR为基础的筛查方法，并结合大规模的扩增产物的焦磷酸测序方法。随后可以利用已收集的序列信息设计适合的探针来获得靶基因的全长。这个方法是由Iwai等人[21]介绍的。作者称它为基因靶向宏基因组学（GT - 宏基因组学）。这是适用于从多氯联苯污染的土壤样品中获得编码芳香双加氧酶的基因。作者利用一对针对524 bp的保守区域的PCR引物，来赋予底物对联苯双加氧酶的特异性。总计分别回收了PCR产物5`和3`端的2000和604个序列。根据队列，序列被分配到225`端），3（3`端）新的聚簇，不包括以前已知的序列。因此，可以参与碳循环的基因的丰富性不再是假设。为了评估细菌的多样性，即与β 二甲基巯基丙酸内盐去甲基化有关的基因研究，在海洋环境中类似的方法已应用。Varaljay等人[17]通过利用针对10个不同DmdA的类型和亚类型的引物，对不同的自由生活的沿海浮游细菌的复合DNA进行扩增，获得编码β 二甲基巯基丙酸内盐脱甲基的dmdA基因。随后，对焦磷酸序列的PCR产物进行了测序。随着 90％的核苷酸序列的鉴定，约62,000序列被分配到700多个环境中基因dmdA序列的聚簇。

(3) 基于功能的筛选

大多数编码新型生物分子的新基因分离筛选的工作都是基于宏基因组库中克隆的代谢活性。由于不需要序列信息，这是唯一的策略，它蕴藏着可以识别到完整的拥有已知或全新功能的基因。三种不同的功能的方法已用于探索新型生物分子：预期活性的表型检测，异源互补的宿主菌或突变体，以及基因的诱导表达。

i.预期活性的表型检测

在大多数情况下，表型检测采用化学染料、不溶的或生色团衍生物的酶反应底物纳入到

生长介基质中，负责单一克隆特定的代谢功能。近期的一个研究案例中，依靠活性筛选编码细菌的β-D-葡萄糖醛酸酶的目的基因，β-D-葡萄糖醛酸酶是人体肠道微生物的一部分。这些酶是公认的对人类身体健康是有利的[22]。一个包括有4600个克隆的宏基因组，是从来自粪便池的细菌DNA进行筛选，即利用缺乏β-D-葡萄糖醛酸酶的大肠杆菌菌株进行的筛选。通过这种方式，获得的19个阳性克隆，在被克隆到相应的基因表达载体后，表现出很强的β-D-葡萄糖醛酸酶的活性[22]。另一个研究案例，利用基于活性的筛选，直接对表型检测，已经由Beloqui等发表[23]。为了发现新的糖基水解酶，大肠杆菌克隆拥有的宏基因组fosmid库，是从依赖消耗纤维素的微生物群落(蚯蚓的新鲜脱落物)得到的，用于检测它们水解P -硝基苯基- D -葡萄糖苷和P -硝基苯基- L-吡喃阿拉伯糖苷的能力。其中发现的两种糖基水解酶与已知的糖基水解酶没有任何的相似性，代表了两个新的家族即β-半乳糖苷酶/ 吡喃阿拉伯糖苷酶。

ii.异源互补的宿主菌或突变体

与功能性筛选的不同之处是基于异源互补的宿主菌或突变型宿主菌，在有选择性条件下，这类突变型宿主需要目标基因才能生长。这种技术可以简单而快速的筛选复杂的数以百万计的克隆宏基因组库。由于几乎没有误报的发生，这种做法对目的基因[24]具有高度选择性的。近期的研究表明，以互补为基础的446000克隆的筛选，它们包括土壤衍生的宏基因组文库的基因，赋予了抵抗四环素-内酰胺类或氨基糖苷类抗生素的抗性，从而发现了13种不同的抗生素耐药性克隆[25]。更多类似的研究，如用人异源互补的筛选包括：鉴定基因编码的赖氨酸消旋酶[26]，抗生素抗性[27]，参与聚3 - 羟基丁代谢的酶[28]等。

iii.基于活性的筛选

a. 底物诱导的基因表达筛选(SIGEX)

2005年，Uchiyama等人[29]引入了第三种基于活性的筛选，这被称为底物诱导的基因表达筛选(SIGEX)。这种高通量筛查方法采用一个操纵子陷阱GFP的表达载体与荧光激活细胞分选相结合。筛选是基于代谢基因的表达，它主要是由特异性底物诱导，往往受靠近代谢基因的调控元件所控制。要执行SIGEX，将绿色荧光蛋白基因克隆在宏基因组DNA上游，从而将GFP 表达受控于存在于宏基因组DNA中的启动子（图11）。

图11. 底物诱导的基因表达筛选(SIGEX)过程

b. 利用指定代谢物调节的表达（METREX）

Williamson 等人发表的一种类似的筛选类型，利用指定代谢物调节（METREX）的表达[30]。为了找出生产小分子的宏基因组克隆，生物传感器（图12）存在于同一个细胞中，如同拥有一个宏基因组DNA片段的载体，它可以检测小的扩散性的信号分子，这些信号分子诱发群体感应。生物传感器的主要组件是一个群体感应子，它可以控制报告基因GFP。当由宏基因组DNA片段编码的信号分子的阈浓度值超标，绿色荧光蛋白（GFP）就产生了。随后，通过

荧光显微镜就可以鉴定阳性克隆。

微生物在海洋中的作用

论微生物在海洋中的作用 作者：周浩王璐 中文摘要： 21世纪人类社会面临“人口剧增、资源匮乏、环境恶化”三大问题的严峻挑战，随着陆地资源的日趋减少，开发海洋，向海洋索取资源，尤其是海洋微生物资源越来越受到人们关注。本文将从海洋微生物多样性、海洋药物及保健功能的生物活性物质、海洋极端酶、海洋微生物在消除海洋污染物等方面给予介绍。 中文关键词： 海洋微生物资源生物药物资源 前言 洋中生活许许多多各种各样的微生物，它们是以单细胞或以群体形式存在，能独立生活的生物，包括病毒、细菌、真菌、单细胞藻类及原生动物等等。但按狭意所指仅为病毒、细菌和真菌等。目前研究较多的是细菌。微生物体积大多非常微，需在显微镜下才能看见。如海洋微生物，它的直经大多仅为几个微米到零点几个微米。海洋微生物种类繁多，数量颇大。如胶州湾每毫升海水中生活着几百个，多至几千万个细菌。它们对我们生活及工农业生产有着极为密切的关系。 浩瀚的海洋是地球上生命的摇篮，它覆盖着地球表面积海水总体积占地球总水量的70%，海洋中生物资源极为丰富，生物活性物质种类繁多，已引起世界各国的重视，仅在过去10年中有近5000种新的海洋天然产物被发现。大多数都分离自海洋微生物,且许多是陆地生物所没有的，显示出巨大开发潜力，因此，海洋微生物资源研究已成为海洋资源研究的重要内容之一。 正文 1海洋微生物的生物多样性 海洋是一个十分独特的生态环境，包罗了高盐、高压、低温、尤其是深海低光照、寡营养等特点，还有无光照以及局部高温的极端环境，来自海洋的微生物大部分都是适应了极端环境的极端微生物，据估计海洋微生物可达0.1~2亿种，已发现的类群主要包括病毒、古菌细菌、粘细菌、微藻、真菌，海洋微生物的物种多样性决定了其代谢产物多样性，海洋环境是新型生物活性物质的源泉 2海洋微生物药物资源

微生物学作业

微生物学作业（华师生科院06函授07号李文勇） 第一章绪论 1、什么是微生物？微生物有哪些特点？ 人们把那些形体微小（<0.1mm），结构简单，在适宜环境下能生长繁殖及发生遗传变异，用肉眼难以看到，必须借助光学显微镜或电子显微镜才能看清的低等微小生物统称为微生物。微生物有6大特点：微生物的比表面积大、转化能力强、繁殖速度快、易变异、适应性强、分布广。 第二章原核微生物 1、名词解释 原核微生物：指核质和细胞质之间不存在明显核膜，其染色体由单一核酸组成的一类微生物。肽聚糖：由两种糖衍生物，N-乙酰葡糖胺（G）和N-乙酰胞壁酸（M），以及短胎所组成。溶菌酶：又称N-乙酰胞壁酸酶。它专攻击聚糖链中的N-乙酰胞壁酸和N-乙酰葡糖胺之间的β-1,4糖苷键而使细胞壁解体 核区：细菌菌体中央大量遗传物质（DNA）所在的区域。无核膜核仁，由一环状DNA分子高度缠绕而成。 质粒：质粒是染色体外能够进行自主复制的遗传单位，包括真核生物的细胞器和细菌细胞中染色体以外的脱氧核糖核酸(DNA)分子。 荚膜：某些细菌在细胞壁外包围的一层粘液性物质。 粘液层：荚膜的类型，量大，而且与细胞表面的结合比较松散，没有明显边界，常扩散到培养基中。 菌落：单个微生物在适宜固体培养基表面或内部生长繁殖到一定程度；形成肉眼可见有一定形态结构的子细胞的群落。 2、根据革兰氏阳性与革兰氏阴性细菌细胞壁通透性来说明革兰氏染色的机制。 革兰氏染色法，主要过程为：结晶紫初染，碘液媒染，95%乙醇脱色，再以沙黄等红色燃料复染。染色结果为：革兰氏阳性菌被染成紫色，革兰氏阴性菌被染成浅红色。细菌的不同显色反应是由于细胞壁对乙醇的通透性和抗脱色能力的差异，主要是肽聚糖层厚度和结构决定的。经结晶紫染色的细胞用碘液处理后形成不溶性复合物，乙醇能使它溶解，所以染色的前二步结果是一样的，但在G＋细胞中，乙醇还能使厚的肽聚糖层脱水，导致孔隙变小，由于结晶紫和碘的复合物分子太大，不能通过细胞壁，保持着紫色。在G—细胞中，乙醇处理不但破坏了胞壁外膜，还可能损伤肽聚糖层和细胞质膜，于是被乙醇溶解的结晶紫和碘的复合物从细胞中渗漏出来，当再用衬托的染色液复染时，显现红色。红色染料虽然也能进入已染成紫色的G+细胞，但被紫色盖没，红色显示不出来。 3、什么是芽胞？它在什么时候形成？试从其特殊的结构与成分说明芽孢的抗逆性。 芽胞杆菌生长到后期，在其菌体内形成厚壁、折光性强、具抗逆性的孢子称为芽孢。芽胞是代谢活性很低，对干燥、热、化学药物和辐射等具有高度抗性的休眠体。究表明芽孢对不良环境因子的抗性主要由于其含水量低（40％）。且含有耐热的小分子酶类，富含大量特殊的吡啶二羧酸钙和带有二硫键的蛋白质，以及具有多层次厚而致密的芽孢壁等原因。 第三章真核微生物 1、名词解释 真核微生物：具有真正细胞核，具有核膜与核仁分化的较高等的微生物。 真菌：真核微生物，有细胞壁没光合色素，寄生或腐生生活，靠渗透作用吸取营养。 酵母菌：真核单细胞生物。体呈圆形、卵形或椭圆形，内有细胞核、液泡和颗粒体物质。通常以出芽繁殖；有的能进行二等分分裂；有的种类能产生子囊孢子。 霉菌：霉菌是丝状真菌的俗称

海洋生物活性物质提取

螺旋藻多糖研究综述

螺旋藻多糖研究综述 摘要：螺旋藻多糖是从螺旋藻体、螺旋藻培养液中提取分离出来的一类具有促进细胞生长、提高免疫力、抗肿瘤、抗氧化、对核酸内切酶活性和DNA修复合成有增强作用等功能的重要天然生物活性物质，也是国内外海洋药物研究开发的热点。本文对螺旋藻多糖的药理作用进行了相关综述。 关键词：螺旋藻多糖；生物活性；抗癌 Abstract:Spirulina polysaccharide from Spirulina body, spirulina culture liquid extraction and separation out of a class of functions to promote cell growth, enhance immunity, anti-tumor, anti-oxidation, enhance the role of the endonuclease enzyme activity and DNA repair synthesisan important natural biologically active substances, domestic and international marine drug research and development of hot spots. In this paper, the pharmacological effects of Spirulina polysaccharide relevant reviews. Key words: Spirulina Platensis Polysaccharide；biological activity；Anti-tumor 1.前言 螺旋藻是一种生长于30亿年前的多细胞丝状蓝藻,地球上最早进行光合作用的植物之一,还保持许多古代原始藻类的一些特点。其结构简单,没有原核,个体成丝状,因缠绕成螺旋状而得名。螺旋藻属蓝藻颤藻科中的一个“属”,约38种,广泛分布于热带、亚热带和暖温带的海洋、湖泊、温泉,特别是盐碱湖泊,生长繁殖更为旺盛。螺旋藻属中的极大螺旋藻和钝顶螺旋藻最重要,目前已得到国内外深入的研究和广泛的应用开发。 螺旋藻中含有丰富的生理活性成分,如r-胡萝卜素、叶绿素、r-亚麻酸、维生素、微量元素、藻蓝蛋白,尤其是螺旋藻多糖都具有重要的医疗保健价值。因此, 螺旋藻及其多糖开始得到广泛应用,并开发出各种产品和技术。 目前认为螺旋藻及其提取物具有多种生物学作用: (1)提高机体免疫能力, 有抗癌防癌作用; (2)抗疲劳, 抗衰老作用; (3)抗辐射作用; (4)助长体内乳酸杆菌生长; (5)改善过量金属对人体的有害影响; (6)降血脂和胆固醇 (7)促进皮肤和外伤的愈合及抗菌作用。

微生物学课后习题及答案

第一章 一.微生物有哪些主要类群？有哪些特点？ 答：类群：1.真核细胞型；2.原核细胞型：细菌，放线菌，衣原体，支原体，立克次式体； 3.非细胞型：病毒。 特点：1.体小，面积大 2.吸收多，转化快3.生长旺，繁殖快4.分布广，种类多 5.适应强，易变异二.你认为现代微生物学的发展有哪些趋势？ 答：研究领域有制药、治理环境污染等，微生物的基因科学，微生物病毒学，现代微生物学已发展出很多的分支学科，如病毒学，微生物基因组学，应用微生物（生物农药，浸矿微生物等），病源微生物（主要指细菌），海洋微生物，古细菌等，现代微生物学的研究主要集中在菌种的遗传背景，市场化应用等，食品微生物快速检测技术、食用菌的生产、功能性成分的提取等。 三.简述微生物与制药工程的关系。 答：1.人类除机械损伤外的疾病都是由微生物造成的 2.微生物又是人用来防治疾病的常用方法 3.微生物在自然环境中分布广泛来源很多 4.微生物的代谢产物相当多样，可用于生物制药 5.微生物和人之间的关系，涉及人、微生物、植物的协同进化 6.遗传学与生态学 名词对照： 古菌域：Archaea 三域学说分为古菌域、细菌域、真核生物域，古菌域为其中一大类别。（不确定）细菌域：bacteria 三域学说分为古菌域、细菌域、真核生物域，细菌域为其中一大类别。（不确定）真核生物域：Eukarya 三域学说分为古菌域、细菌域、真核生物域，真核生物域为其中一大类别。（不确定） 微生物：microorganism 是所有形态体积微小的单细胞或者个体结构简单的多细胞以及没有细胞结构的低等生物的通称。 第二章 一.比较下列各队名词 ①.原核微生物与真核微生物：原核微生物没有明显的细胞核，无核膜，核仁，无染色体，其细胞核为拟核，细胞内么有恒定的内膜系统，核糖体为70S型，大多为单细胞微生物。真核微生物有明显细胞核，有各种细胞器，核糖体为80S型。 ②.真细菌与古菌：相同点：以甲硫氨酸起始蛋白质的合成，核糖体对氯霉素不敏感，RNA聚合酶和真核细胞的相似，DNA具有内含子并结合组蛋白。 不同点：细胞膜中的脂质是不可皂化的，细胞壁不含肽聚糖等。 ③.原生质体与球形体：原生质体是脱去细胞壁的细胞，是由原生质分化而来，具体包括细胞膜和细胞质以及细胞器；球形体：指在螯合剂等存在的条件下用溶菌酶部分除去革兰氏阴性菌的细胞壁而形成的缺损型细胞。 ④.鞭毛、菌毛和性菌毛：鞭毛是一端连于细胞膜，一端游离的、细长的波形纤丝状物。菌毛为一些菌体表面的非鞭毛的细毛状物，菌毛是许多革兰氏阴性菌菌体表面遍布的比鞭毛更为细、短、直、硬、多的丝状蛋白附属器。其化学组成是菌毛蛋白，菌毛与运动无关；性菌毛在少数革兰阴性菌，比普通菌毛略微稍粗，一个菌体只有1～4根，通常由质粒编码。带有性菌毛的细菌具有致育能力。 ⑤.芽孢与孢子：芽孢是有些细菌（多为杆菌）在一定条件下，细胞质高度浓缩脱水所形成的一种抗逆性很强的球形或椭圆形的休眠体。孢子是细菌、原生动物、真菌和植物等产生的一种有繁殖或休眠作用的生殖细胞。能直接发育成新个体。 二.比较革兰氏阳性菌与革兰氏阴性菌细胞壁结构，并说明革兰氏染色的原理。

海洋微生物学作业

海洋微生物抗肿瘤活性物质 姓名： 班级：学号： 摘要：海洋多变复杂的环境导致了海洋微生物的多样性。海洋微生物因其具有产生新型生物活性产物的巨大潜力，已受到全世界海洋研究人员的重视。近年来，从海洋微生物中已分离到许多结构新颖的抗肿瘤活性物质。其中有的已进入临床试验，显示了良好的研究开发前景。 Abstract: The changeable and complex environment of the ocean leads to diversity of marine microorganism. Marine microorganisms have been proved to be potential in producing novel bioactive substances. Marine-derived microorganisms are rich sources of bioactive compounds and thus they receive extensive attention from marine researchers. In recent years many new structurally-unique anti-tumor compounds have been isolated from marine-derived microorganisms, and some of them have been in clinical trials and showed better development prospects. 关键词：海洋微生物抗肿瘤活性物质筛选方法研究模型 Key words: marine-derived microorganisms; antitumor; bioactive substance; Method of screener; research model; 一、海洋微生物 1.海洋微生物研究意义 海洋环境的特殊性(高压、高盐、低温、低光照、寡营养等)使海洋微生物具有丰富的生物多样性、独特的代谢方式和很强的再生、防御和识别能力。海洋微生物能产生一些结构新颖、活性特异的次级代谢产物以适应周围极端的生存环境。近几年，已有近万种新的海洋天然产物被发现，这些海洋天然产物具有抗癌、消炎、抗氧化、免疫调节等活性，已成为当今世界药物研发的热点，有的药物已进入临床实验阶段或已进入临床，并取得了丰硕的成果。 2.抗肿瘤活性物质 肿瘤是现代社会威胁人类健康的重要疾病。多年来，各国学者致力于寻取新型、高效、低毒的抗肿瘤化合物。对海洋微生物次级代谢产物中具有抗肿瘤活性的有关研究表明，醚类、大环内酷类、菇类、含氮杂环类、肤类、酞胺类及醌类化合物均具有良好的抗肿瘤活性。 二、海洋抗肿瘤活性物质的分类（450） 1.海洋放线菌的抗肿瘤活性物质（150） 海洋放线菌的生活环境十分特殊，如高盐、高压、低营养、低温等。在这些生命的极限环境，海洋放线菌已发展出独特的代谢方式，同时提供了产生独特的生物活性物质的潜力。例如，中国海洋大学药物与食品研究所、军事医学科学院毒物药物研究所的科研人员对海洋放线菌S1001发酵产物进行了分离和研究，并用理化手段综合分析了其中的抗肿瘤活性成分，取得了较为满意的结果。近年来，研究者从海洋放线菌中分离出的主要抗肿瘤活性物质，见表1。

海洋生物活性物质研究简述

海洋生物活性物质研究简述Brief description to active material of marine organism 学校：湛江师范学院 学院：生物科学与技术学院 专业：生物科学 学科专业名称：生物活性物质 论文题目：海洋生物活性物质研究简述 班级：11生本2班 学号：2011574212 姓名：黄丹颖 完成时间：2014年5月6日

海洋生物活性物质研究简述 摘要:海洋生物已成为天然药物的重要来源之一，从各类海洋生物中可提取分离到具有各种药用活性的化合物，具有开发成新药的潜力。该文对海洋生物活性物质主要种类、研究方法和具体应用进行了简要阐述，同时对海洋生物活性物质的研究方向及前景进行了展望。 关键词: 海洋生物; 活性物质; 抗菌; 抗肿瘤 Brief description to active material of marine organism Abstract: Marine organism has become one of important source of natural medicines.Medicinal active compounds extracted and separated from which have the potential of being new medicines．In this paper，the main kinds，research method and concrete application of marine organism were briefly expounded，and the research direction and foreground of marine organism in near future were prospected． Key words: Marine organism; active material; antibacterial; antitumor

海洋生物活性物质和其研究进展

海洋生物活性物质及其研究进展 [摘要]广阔的海洋蕴含着丰富的生物资源，特别是高活性的生物活性物质如高不饱和脂肪酸、类胡萝卜素、维生素等，对人类健康和长寿有着重要的作用，它们在未来的医药、食品、保健、畜禽及水产养殖等各个方面必将占据显著地位[1、2]。鉴于此，本文就主要海洋生物活性物质的分类及特性、当前的研究现状及进展进行了综述，并展望了该领域的发展前景。 [关键词]海洋生物活性物质高不饱和脂肪酸 EPA DHA 类胡萝卜素维生素 引言地球约有71％的表面是水，而海水总体积占地球总水量97％的海洋，生物资源丰富、种类繁多。据统计，大约有着4O多万种动、植物和上亿种微生物生存在其中。如此众多的海洋资源是我们开发医药、食品、化工产品的巨大宝库。海洋中的生物为了生存繁衍，在竞争中取胜并使自己适应海洋的独特环境，如高压、低营养、低温(特别是深海)、无光照、以及局部的高温、高盐等所谓生命极限环境，在漫长的进化中各自形成了特殊的结掏和奇妙的生理功能．为人类提供了众多结构新颖、功能独特和生理活性很强的活性物质，包括萜类、甾醇类、生物碱、甙类、多糖、肽类、核酸、蛋白质、酶等，这些生物活性物质的主要药理作用包括抗细菌、抗病毒、抗肿瘤、防治心血管疾病、延缓衰老及免疫调节等作用[1、2]。 所谓生物活性物质，是指来自生物体内的对生命现象具有影响的微量或少量物质。海洋生物活性物质，则是指海洋生物体内所含有的对生命现象具有影响的微量或少量物质、主要包括海洋药用物质、生物信息物质、海洋生物毒素产生物功能材料等海洋生物体内的天然产物[3]。 随着环境污染的加剧和人类寿命的延长，心脑血管疾病、恶性肿瘤、糖尿病、老年性痴呆症等疾病日益严重地威胁着人类健康，艾滋病、玛尔堡病毒病、伊博拉出血热等新的疾病又不断出现，仅病毒病世界上平均每年就新增2－3种。人类迫切需要寻找新的、特效的药物来治疗这些疾病。人们纷纷将目光投向海洋。此外，人们还希望利用海洋生物活性物质开发出增进健康、预防疾病的营养食品、保健食品，有些海洋生物活性物质还可用于化妆品中，有的可制成特殊的生物功能材料，使得海洋生物活性物质成了研究热点[3、4]。

微生物学第10-11章作业

第十章传染与免疫 1简述宿主对病原菌的防御机制。 答：机体对侵入体内的病原微生物有固有免疫和适应性免疫两种应答方式。病原微生物感染与宿主的免疫状态密切相关，免疫力完全正常的宿主，固有性免疫应答足以将抵达病原微生物清除；而当感染趋向于慢性，或者宿主曾经被致敏，则适应性免疫应答迅速启动。 1.固有性免疫应答模式识别受体固有性免疫应答起始于免疫细胞表面模式识别受体对病原微生物的识别，通过分泌或膜结合受体对微生物进行识别是固有免疫系统的一个重要功能。识别微生物后，固有免疫系统释放杀微生物分子、细胞因子、趋化因子等。吞噬细胞通过膜表面多种受体与病原微生物结合来实现吞噬作用。宿主对真菌的免疫反应依赖于几类激发信号级联反应的跨膜受体。识别这些菌体可促进机体的保护性应答反应，包括对真菌的摄取及杀伤(通过呼吸爆发介导)，以及产生大量的细胞因子和趋化因子包括肿瘤坏死因子、白细胞介素1、白细胞介素6以及粒细胞一单核细胞集落刺激因子等。巨噬细胞许多研究表明，吞噬细胞的数量和功能的下降，是导致宿主对烟曲霉易感的主要因素。吞噬细胞在保护宿主免受烟曲霉感染方面起着重要作用。巨噬细胞作为吞噬细胞系统的一部分，构成了机体抵抗病原微生物侵袭的第一道防线。 2.在固有性免疫机能完好的情况下，T细胞抵抗病原微生物感染的作用是可以忽略的，只有在固有性免疫受损的宿主，适应性免疫应答的重要性才得以体现。目前，对两种类型细胞因子的调节研究较深入，Thl型细胞因子的产生伴随着细胞免疫为主的反应，Th2型细胞因子的产生则有助于以抗体为主的体液免疫。总的来说，抗真菌反应以细胞免疫为主，Thl型有利于对真菌感染的免疫防护。研究中发现，Th2型细胞因子，机体对病原微生物越不易感。对于Thl类细胞引起的保护性免疫反应的机制，目前有一个共识，即在识别病原微生物抗原之后，T细胞活化引起大量细胞因子的释放，增强巨噬细胞和中性粒细胞的杀伤功能。当病原微生物与T细胞、抗原呈递细胞、中性粒细胞共孵育时，对菌丝的杀伤要明显强于T细胞缺席时的效果。 2决定传染结局的三因素是什么简述三者的相互关系。 答：1 传染源，传播途径，易感人群； 2 传染源是作为传播的起点，没有传染源，就不会有传染病发生； 3 传播途径是病原体传播的媒介，没有这个媒介病原体就不会在传染源和健康人群中传播，比如通过血液传播，消化道传播、呼吸道传播等等。 关系：病原体和宿主免疫力是决定传染结局的关键因素。当病原体致病性弱、宿主的免疫力强时往往导致隐性传染；当病原体致病性强、宿主的免疫力弱时，往往导致显性传染。环境因素在传染中起着间接作用，良好的环境因素有助于增强宿主的免疫力，也有利于限制或切断病原体的传播，因而可以防止传染病的发生；不利的环境因素则导致与其相反的结果。

微生物学课后习题答案

微生物习题集 第一章绪论 一、术语或名词 1．微生物(microorganism)因太小，一般用肉眼看不清楚的生物。这些微小生物包括：无细胞结构不能独立生活的病毒、亚病毒(类病毒、拟病毒、朊病毒)；具原核细胞结构的真细菌、古生菌以及具真核细胞结构的真菌(酵母、霉菌、蕈菌等)、单细胞藻类、原生动物等。但其中也有少数成员是肉眼可见的。 2．微生物学(microbiology)研究肉眼难以看清的称之为微生物的生命活动的科学，分离和培养这些微小生物需要特殊技术。 3．分子微生物学(molecularmicrobiology)在分子水平上研究微生物生命活动规律的科学。4．细胞微生物学(cellularmicrobiology)重点研究微生物与寄主细胞相互关系的科学。 5．微生物基因组学(microbic genomics)研究微生物基因组的分子结构、信息含量及其编码的基因产物的科学。 6．自生说(spontaneousgeneration)一个古老的学说，认为一切生命有机体能够从无生命的物质自然发生的。 7．安东·列文虎克(AntonyvanLeeuwenhoek，1632—1723)荷兰商人，他是真正看见并描述微生物的第一人，他利用自制放大倍数为50～300倍的显微镜发现了微生物世界(当时被称之为微小动物)，首次揭示了一个崭新的生物世界——微生物界。 8．路易斯·巴斯德(LouisPasteur，1822—1895)法国人，原为化学家，后来转向微生物学研究领域，为微生物学的建立和发展做出了卓越的贡献，成为微生物学的奠基人。主要贡献：用曲颈瓶实验彻底否定了“自生说”，从此建立了病原学说，推动了微生物学的发展；研究了鸡霍乱，发现将病原菌减毒可诱发免疫性，以预防鸡霍乱病；其后他又研究了牛、羊炭疽病和狂犬病，并首次制成狂犬疫苗，证实其

海洋微生物学

1、在人类的肠道中存在一个丰富的生态系统，这是一个数量惊人和种类繁多的微生物，大约有10个微生物，包括400多种重要的细菌，有100多个物种组成。 2、定居在肠道里的微生物为人类提供了许多好处，它们帮助人类消化食物、防御病原体、获得营养，调节脂肪含量，甚至还促进肠上皮细胞的更新。第一篇关于微生物功能的文章起因于来自两个不相关的，健康人的排泄物的基因组分析。参与新陈代谢的许多基因在人类肠微生物组中是富足的，例如那些参与异质、多糖和氨基酸等物质的新陈代谢的基因。下面我将从3个方面讲解肠道微生物的功能（对异质物质和毒素的代谢、人类外在体型的调节、作为疾病的病因） 3、肠道微生物对外来物质的代谢是至关重要的，大多数的药物被看做是外来的物质。与生物除污是类似的，这些微生物可以使有害的物质降解解毒。 4、通过上千年的选择，使得人类和微生物之间拥有一个有益的酶系统，一个例子就是共同的新陈代谢。其能产生两种影响。Good 和bad。 5、早期研究，人类可以通过肠中的微生物进行划分，因为这些微生物受到不同生活习惯、生理等条件的影响。而在这些不同的影响因素中，饮食是主要的影响因素。我们摄取食物的不同改变了肠道中的微生物，然后改变了人类的外在体型。

6、进行动物研究来看待肥胖。在胖老鼠体内的微生物从食物中获取能量的能力更强，因此导致了肥胖积累。微生物代谢难以消化的多糖，将其变为短链脂肪酸，这些短链脂肪酸很容易被吸收并作为脂质储存在寄主脂肪组织中。 与瘦人相比较，在胖人的体内，拟杆菌所占的比列小。当给肥胖的人提供低卡路里的食物时，这个比率将要改变，并且他们的体重将减轻2-6%。这些发现显示，肠道微生物在肥胖中起着重要的作用。 7、ppt上 8、Hooper等将微生物与寄主的关系分为互利共生、同食共生及致病3种。互利共生就是微生物寄宿在寄主内，双方都不会危害对方，且双方受益。同食共生就是在共生中不损及对方，但是也没有明显的有益作用。共生微生物的生态失衡会使寄主致病，即使在没有外来传染性微生物侵入的条件下，共生微生物的生态失衡也会引发寄主发生炎性肠病。 寄主与肠道微生物之间的共生关系经过几十亿年的协同进化，使得平衡向互利共生移动，在正常的情况下寄主与肠道微生物之间处于一种互利共生的状态。 9、肠道微生物影响寄主的健康情况。肠道微生物在免疫系统的发育和发展中起着重要的作用，其可能产生不利的影响引起免疫失调。肠易激综合症也许是最好的例子。肠易激综合征是。。。。。 10、研究表明，在患者的体内，微生物的组成发生了变化。微生物多样性的改变会产生如下几个结果。。。。。。

医学免疫学与微生物学作业答案 在线..

1.免疫防御功能下降易发生（） A 超敏反应 B 肿瘤 C 反复感染 D 自身免疫（病） 正确答案:C 单选题 2.下列对抗毒素的叙述中，正确的是（） A 经外毒素脱毒制成 B 只能中和外毒素 C 既可中和外毒素，又可能引起超敏反应 D 用于人工自动免疫 正确答案:C 单选题 3.关于TI-Ag的描述，错误的是（） A 产生抗体不需T细胞辅助 B 只有B细胞表位 C 不引起细胞免疫 D 可引起再次应答 正确答案:D 单选题 4.下列大分子物质中，免疫原性最强的是（） A 蛋白质 B 多糖 C 核酸 D 类脂 正确答案:A 单选题

5.关于TD-Ag的描述，正确的是（） A 产生抗体不需T细胞的辅助 B 只能引起体液免疫 C 不能引起再次应答 D 具有T细胞表位和B细胞表位 正确答案:D 单选题 6.抗原的特异性取决于（） A 分子量大小 B 表位性质 C 结构复杂性 D 化学组成 正确答案:B 单选题 7.对SIgA的错误描述是（） A 是黏膜局部抗体 B 其SP能保护SIgA不被蛋白酶水解 C 初乳中含量最丰富 D 能激活补体经典途径 正确答案:D 单选题 8.适应性免疫的特征是（） A 出生时即具有 B 反应迅速 C 特异性 D 无记忆性 正确答案:C 单选题

9.新生儿可从母体初乳中获得的Ig是（） A IgG B IgM C SIgA D IgD 正确答案:C 单选题 10.对抗原特异性的描述是正确的，除了（） A 只能激活具有相应受体的淋巴细胞系 B 与相应抗体结合 C 与相应效应淋巴细胞结合 D 与MHC结合 正确答案:D 单选题 11.免疫稳定功能失调易发生（） A 超敏反应 B 肿瘤 C 反复感染 D 自身免疫（病） 正确答案:D 单选题 12.固有性免疫的特征是（） A 通过遗传获得 B 特异性 C 反应缓慢 D 有记忆性 正确答案:A 单选题

最新广东海洋大学微生物学考试

广东海洋大学微生物 学考试

绪论 ---刘晓良 科赫氏法则：1.在每一病例中都出现相同的微生物，且在健康者体内不存在；2.要从寄主分离出这样的微生物并在培养基中得到纯培养;3.用这种微生物的纯培养接种健康而敏感的寄主，同样的疾病会重复发生；4.从试验发病的寄主中能再度分离培养出这种微生物来。 曲颈瓶实验：巴斯德设计了一个既可允许空气自由进入容器又可阻止容器内肉汤“自然发生”生命（腐败）的简便、巧妙的曲颈瓶，通过实验证实了肉汤腐败产生大量细菌的原因只有接种了来自空气中的微生物“胚种”。 试述微生物的多样性。 ①.物种的多样性。②.生理代谢类型的多样性。微生物分解初级有机物的能力、微生物有最多样的产能方式、生物固氮作用、合成次生代谢产物等各种复杂有机物的能力、对复杂有机分子集团的生物转化能力、分解有毒和剧毒物质的能力、抵抗极端环境的能力③.代谢产物的多样性。④遗传基因的多样性,⑤生态类型的多样性。 微生物有哪五大共性？ 体积小，面积大。体积小面积大最基本，因为一个小体积大面积系统，必然有一个巨大的营养物质吸收面、代谢废物的排泄面和环境信息的交换面，并由此而产生其余4 个共性；②.吸收多，转化快。为微生物的高速生长繁殖和合成大量代谢产物提供了充分的物质基础；③.生长旺，繁殖快。但由于营养、空间和代谢产物等条件的限制，微生物的几何级数分裂速度充其量只能维持数小时而已；④.适应强，易变异。微生物有极其灵活的适应性或代谢调节机制。由于繁殖快，虽然其变异频率十分低，也可在短时间产生大量变异的后代；⑤.分布广，种类多。分布广：土壤、空气、海洋、人体肠道。种类多：微生物的生理代谢类型多，代谢产物种类繁多。微生物因其体积小、重量轻和数量多等原因，可以到处传播。而且微生物的种类多造就物种的多样性、生理代谢类型的多样性、代谢产物的多样性、遗传基因的多样性和生态类型的多样性。 第一章原核生物的形态、构造和功能

海洋微生物活性产物及研究方法_倪志华

海洋微生物活性产物及研究方法 倪志华 1,2 ,张玉明1,刘龙1 ,马 玻3 　 (1.河北大学生命科学学院,河北保定071002;2.河北省生物工程技术中心,河北保定071002;3.河北大学医学部基础医学教研室,河北保定071000) 摘要　海洋多变复杂的环境导致了海洋微生物的多样性。近年来,在对海洋微生物的研究中发现了许多独特的生物活性物质。通过对这些生物活性物质的提取、药理研究,为新药的开发和各种疑难疾病的治愈提供了新的希望。就海洋微生物活性物质的几种重要生物活性,如抗肿瘤、抗菌、酶及酶抑制剂活性分别进行概述,同时概括了海洋微生物活性物质的研究方法以及存在的问题。关键词　海洋微生物;活性物质;代谢产物;筛选方法中图分类号　Q93 文献标识码　A 文章编号　0517-6611(2009)07-02839-03Bioactiv e P ro ducts and R esearch Methods o f Marine Microorg anis m N I Zhi -hua et al (College of Life Sciences ,Hebei University ,B aodin g ,Hebei 071002) A bstract The en viron ment of sea is chan geable and complex ,which causes the diversity of marine microorgan is m .In recent years ,many un iq ue bioactive m aterials were found in the researches of marine m icroorganis m .The extraction an d ph armacology of these bioactive m aterials were studied ,whic h provid e ne w hop e for the d evelop ment of new medicines and the cure of d ifferent diseas es .S everal kin ds of im portant b ioactivity of active materials from marine mi -croorganism were introduced ,such as an ti -tu mor ,antibacterial ,enzyme an d enz ym e inhibitor activit y .And the research methods an d existing problems of ac -tive materials from m arine microorganism were su mm arized .Key w ords Marine microorganism ; B ioactive m aterials ;Metab olite ;Method of screening 作者简介　倪志华(1979-),女,河北唐山人,讲师,从事生物化学与 分子生物学研究。 收稿日期　2008-12-10 海洋是生命的起源地,不仅占地球表面积的71%,而且包含着地球80%的生物资源。海洋环境的多样性和特殊性共同造就了海洋生物种类的多样性和特殊性,其中,海洋微生物种类就多达100万种以上,而目前所研究和鉴定过的海洋微生物还占不到总量的5% [1] ,已发现的活性物质只占总 数的1%[2] 。经过大量研究得出,从海洋微生物中发现的生 物活性物质包括胺及酰胺类、吲哚生物碱类、乙酰配基类、环肽类及聚丙酸酯类,其生物活性包括抗菌、抗肿瘤、抗微生物、抗病毒、酶及酶的抑制活性等[3] 。海洋微生物作为活性物质的新来源,正日益被海洋研究工作者、化学研究工作者以及生物医药工作者所重视。1　海洋微生物代谢产生的重要生物活性 1.1　抗肿瘤活性　海洋微生物的代谢产物有多种活性,其中以抗肿瘤活性最为重要。近年来,科研人员对来自海洋细菌、海洋真菌、海洋放线菌的抗肿瘤活性物质作了较多研究。从海洋微生物中筛选的抗肿瘤活性物质的种类包括含氮类、内酯类、酮类、醌类、多糖类[4];按其来源又可分为海洋细菌的抗肿瘤活性物质、海洋放线菌的抗肿瘤活性物质及海洋真菌的抗肿瘤活性物质。 1.1.1　海洋细菌的抗肿瘤活性物质。海洋中常见的细菌主要属于以下几个系统类群:变形细菌(Prote obacte ria )类群、革兰氏阳性细菌类群、噬纤维菌属-黄杆菌(C ytophaga -Flav obacte rium )类群、浮霉状菌(Plancto my ce tale s )/衣原体类群、疣微菌(Ve r ruc o mic ro biales )类群等。海洋细菌是海洋微生物抗肿瘤活性物质的一个重要来源,主要集中在假单胞菌属、弧菌属(Vibrio )、微球菌属、芽孢杆菌属、肠杆菌属(En -te rubac re rium )、交替单孢菌属(Alte romonas )、链霉菌属、钦氏菌属、黄杆菌属和小单孢菌属(M ic r omonos pora )。 1966年,Burkholder 第1次从海洋细菌———假单胞菌中分离得到具抗癌作用的硝吡咯菌素(Pyrolintrin )。此后对海 洋细菌的研究一直较少,直到20世纪末,人们才对海洋细菌的筛选、培养及代谢产物的研究重视起来,以期从中得到新的特效抗癌药物。日本冈见分离到一株黄杆菌属的海洋细菌代谢产生杂多糖Mar inac ta n ,能够增强免疫功能和抑制动物移植肿瘤,并成为化疗药物治疗肿瘤的佐剂[5] 。Custa fson 等从海洋细菌中分离到大环内酯类化合物Macr o -la ctins ,它由24元内酯环、吡喃型葡萄糖和一个开链的酸构成,其中macr ola ctin A 组分是一种配糖体母体,具有抗肿瘤、抗病毒、抗菌等功能[3]。与海洋生物共生或寄生的很多海洋细菌也是抗肿瘤药物的重要来源。海绵体内的微生物最多可占其体重的70%,海绵能产生多种抗菌、抗肿瘤活性成分,从而引起国内外对于海绵生物活性成分研究的热潮。海绵中存在着复杂的微生物群落,海绵中的抗癌物质是由海绵中共生共栖的细菌所产生的,从这些细菌中可以分离出抗白血病、抗鼻咽癌的活性成分。Canedo 等从加勒比海海鞘(Ecte inasc idia turbinata )及土耳其海岸Polyc itonide 属海鞘中分离到2株土壤杆菌,并从脂溶性代谢产物中分离得到2个有显著抗肿瘤活性的生物碱类化合物Sesba nimide A 和C ,对肿瘤细胞L1210的I C 50达0.8μg /L 。 1.1.2　海洋放线菌的抗肿瘤活性物质。海洋放线菌主要包括链霉菌属(Stre pto myc ete s )、小单孢菌属(Mic ro monosp ora )、红球菌(Rhodoc oc c us )、诺卡氏菌(N oc ardia )以及游动放线菌(Ac tinoplanete s )等稀有属种。海洋放线菌主要分布在海底沉积物、海洋生物表面以及游离于海水中。海洋放线菌的生活环境十分特殊,如高盐度、高压、低营养、低温等。在这些所谓生命的极限环境中,海洋放线菌已发展出独特的代谢方式,同时也提供了产生独特的生物活性物质的潜力。 中国海洋大学药物与食品研究所、军事医学科学院毒物药物研究所的科研人员对海洋放线菌S1001发酵产物进行了分离和研究,并用理化手段综合分析了其中的抗肿瘤活性成分,取得了较为满意的结果[6]。有报道称,从我国台湾海峡采集的海洋植物、动物的表面、表皮和内部分离得到多株放线菌,其中有20.60%的放线菌对肿瘤细胞P388有细胞毒 安徽农业科学,J ou rn al of An hui Agri .Sci .2009,37(7):2839-2841,2850 责任编辑　金琼琼　责任校对　卢瑶

海洋生物活性物质

第三节 水产食品原料中的生物活性物质海洋生物有环境的特异性，决定了其特殊的结构和奇妙的生理功能，体内能够生成多种多样的化合物。这些化合具有的多种生理性功能或药效作用。如牛磺酸、EPA、DHA等。能或药效作用如牛磺酸EPA DHA等

水产活性物质?多肽类如降血压肽 ?氨基酸类如牛磺酸 ?多烯脂肪酸类如DHA、EPA ?活性多糖如海藻多糖，甲壳胺 ?蛋白脂类如降钙素、SOD ?糖蛋白如扇贝糖蛋白 ?萜类如海兔素 ?天然色素如胡萝卜素 ?皂甙类如海星皂甙、海参皂甙 ?生物碱类如甘氨酸甜菜碱 ?多酚类如褐藻多酚 ?微量元素类如有机硒、有机碘

一、活性肽 、活性肽 活性肽:由数个Aa结合成为低肽，低肽具有比Aa 更好的消化吸收功能，其营养和生理效果更为优 越。如促钙吸收肽、降血压肽、降血脂肽、免疫越如促钙吸收肽降血压肽降血脂肽免疫 调节肽等. 功能肽的制备涉及到酶的选择性、活力、酶解终 点酶解液中肽类的确认混合物的近代分离技点、酶解液中肽类的确认、混合物的近代分离技术，最终是其功能性评价，因此，活性肽的研究开发周期长、投入大。

降血压肽： 鱼贝类中被证实具有降血压功能的活性肽有：来自沙丁鱼的C8肽、C11肽。 来自沙鱼的肽肽 从南极磷虾脱脂蛋白中分离得到的C3肽。 金枪鱼中得到C8肽。 从大马哈鱼头部提取降血压的保健药品与食品。

天然存在活性肽 天然存在于鱼贝类组织中的肽类只有: 天然存在于鱼贝类组织中的肽类只有 肽的谷胱甘肽; ?三肽的谷胱甘肽; ?鹅肌肽; ?鲸肌肽等。 谷胱甘肽是一种特殊的Aa衍生物又是含有疏?谷胱甘肽是一种特殊的Aa衍生物，又是含有疏基的三肽

农业微生物学作业题参考答案

农业微生物学作业题参考答案 作业题一参考答案 一、名词解释（20分） 生长曲线：在分批培养中，以细胞数目的对数值作纵坐标，以培养时间作横坐标，就可以画出一条有规律的曲线，这就是微生物的典型生长曲线。 氨化作用：就是微生物将有机氮化物转化成氨的过程。 培养基：培养基是一种人工配制的、适合微生物生长繁殖或产生代谢产物的营养基质 拮抗作用：由某种微生物的生长而引起的其他条件改变抑制或杀死他种生物的现象。 菌落：微生物在固体培养基上局限一处大量繁殖，形成肉眼可见的群体，即称为菌落。 朊病毒：朊病毒在电子显微镜下呈杆状颗粒、直径26nm，长100～200nm(一般为125～150nm)。 生物固氮：生物固氮是指分子氮通过固氮微生物固氮酶系的催化而形成氨的过程。 衣原体：衣原体是一类在真核细胞内营专性能量寄生的小型革兰氏阴性原核生物。 根瘤：是根瘤细菌与豆科植物的共生在植物根部共生发育形成的特殊结构。 互生作用：一种微生物的生命活动可以创造或改善另一种微生物生活条件，彼此促进生长。 二、填空（20分） 1. 细菌的基本形态有球状、杆状、螺旋状 2. 放线菌的菌丝有营养菌丝、气生菌丝、孢子丝 3. 霉菌的无性孢子有节孢子、胞囊孢子、分生孢子、厚垣孢子 4. 微生物的呼吸类型有有氧呼吸、无氧呼吸、兼性呼吸 5. 地衣是蓝细菌和真菌的共生体。 6. 常用的微生物杀虫剂包括细菌、真菌、病毒 7. 根据固氮微生物与高等植物间关系，可以把固氮作用分为自生、共生、联合 三、简答题（30分） 1、举例说明微生物多样性和环境适应性及其用于农业生产中的实例 五个共性对人类来说是既有利又有弊的。我们学习微生物学的目的在于能兴利除弊、趋利避害。人类利用微生物(还可包括单细胞化的动、植物)的潜力是无穷的。通过本课程的学习，要使自己努力达到能在细胞、分子和群体水平上认识微生物的生命活动规律，并设法联系生产实际，为进一步开发、利用或改善有益微生物，控制、消灭或改造有害微生物打好坚实的基础。 2.简述温度对微生物的影响 ⑴低温对微生物的影响 大多数微生物对低温具有很强的抵抗力，当微生物所处环境的温度降低到生长最低温度以下时，微生物的新陈代谢活动逐渐降低，最后处以停滞状态，但微生物仍能维持较长的生命，当温度恢复到该微生物最适生长温度时，又开始正常的生长繁殖。所以可以采用低温保藏菌种，用冷藏方法保藏食品，以期限制其中的微生物活力，防止腐败。 ⑵高温对微生物的影响 高温可以死微生物，主要是由于它使微生物的蛋白质和核酸等重要生物高分子发生变性、破坏。所以可以采用高温进行灭菌和消毒。 3.简述革兰氏染色方法及其机理 革兰氏阳性细菌由于细胞壁较厚、肽聚糖含量较高和其分子交联度较紧密，在用乙醇洗脱时，肽聚糖网孔会因脱水而明显收缩，再加上它基本上不含类脂，故乙醇处理不能在壁上溶出缝隙，因此，结晶紫与碘复合物仍能牢牢阻留在其细胞壁内，使其呈现紫色。反之，革兰氏阴性细菌因其壁薄、肽聚糖含量低和交联松散，故遇乙醇后，肽聚糖网孔不易收缩，加上它的类脂含量高，所以当乙醇把类脂溶解后，在细胞壁上就会出现较大的缝隙，这样，结晶紫与碘的复合物就极易被溶出细胞壁，因此，通过乙醇脱色后，细胞又呈无色。这时，再经番红等红色染料进行复染，就使革兰氏阴性细菌出现红色，而革兰氏阳性菌则仍呈紫色。 四、论述题（30分） 1.论述氮素循环途径及微生物在氮素循环中的作用

浅谈微生物在环境污染治理中的作用

浅谈微生物在环境污染治理中的应用 我国是世界上环境污染最为严重的国家之一，大气、河流、湖泊、海洋和土壤等均受到不同程度的污染。当前我国社会经济仍然保持着高度发展的态势，环境保护的压力将进一步加重，由人类活动所造成的环境污染和环境质量的恶化已成为制约我国社会和经济可持续发展的障碍。如何在经济高速发展的同时控制环境污染，改善环境质量，以实现社会经济可持续发展之目标是我国目前及待解决的重要问题。 微生物技术在处理环境污染物方面具有速度快、消耗低、效率高、成本低、反应条件温和以受无二次污染等显著优点，加之其技术开发所预示的广阔的市场前景，受到了各国政府、科技工作者和企业家的高度重视，从根本上体现了可持续发展的战略思想。 应用微生物的高效降解、转化能力治理环境污染，在污水治理、固体废弃物处理、重金属降解、化合物分解、石油修复等方面均取得了良好的效果。其治理过程分为：①高效生物降解能力和极端环境微生物的筛选、鉴定；②污染物生物降解基因的分离、鉴定和特殊工程菌的构建；③生物恢复的实际应用和工程化。 一、污水治理 环境中的污染物，在自然界中经过迁移、转化，绝大多数将归入水体，引起水体不断受到污染的胁迫。尤其是高浓度生活污水和工业废水的大量倾入，使水体富营养化现象日趋严重。通常情况下，只要这种污染不超过阀值，污染的水体在物理、化学和生物的综合作用下，是可以得到净化的，这种净化主要源于水体中的微生物能直接或间接地把污染物作为营养源，在满足微生物生长需要的同时，又使污染物得以降解，达到净化水质的目的。 二、固体废弃物治理 固体废弃物污染严重影响我国的环境质量。我国同体废弃物年产量数目极大。造成的经济损失每年达千亿元以上。目前我国处理城市垃圾的方法主要是填埋、堆放和焚烧。填埋、堆放既占用土地资源，又会使有害物质渗漏、扩散，造成二次污染。固体废弃物焚烧产生的二嚼英等有害物质会严重危害人类的健康与生产。利用微生物分解固体废弃物中的有机物，从而实现其无害化和资源化，是经济而有效的处理同体废弃物方法。微生物技术治理同体废弃物的优势是：可以有选择地浓缩或去除污染物：节省运营和投资成本：废物总体积显著降低：可以将废弃物转化为再利用资源。其缺点在于反应速度慢，某些同体废弃物难以降解。尽管如此，人们相信生物降解中存在的问题会随着对微生物研究的深入很快得到解决．