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超高效液相色谱法测定Ex4c的有关物质

Advances in Analytical Chemistry 分析化学进展, 2017, 7(2), 92-101 Published Online May 2017 in Hans. https://www.sodocs.net/doc/fe12898536.html,/journal/aac https://https://www.sodocs.net/doc/fe12898536.html,/10.12677/aac.2017.72013

文章引用: 杨欣茹, 张贵民, 马丽, 刘思光, 赵亮亮. 超高效液相色谱法测定Ex4c 的有关物质[J]. 分析化学进展, 2017,

Determination of Related Substances in Ex4c by UPLC

Xinru Yang 1, Guimin Zhang 1,2*, Li Ma 1, Siguang Liu 1, Liangliang Zhao 1

1Lunan Pharmaceutical Group Co., Ltd, Linyi Shandong

National Engineering and Technology Research Center of Chirality Pharmaceutical, Linyi Shandong

Received: Apr. 25th , 2017; accepted: May 14th , 2017; published: May 17th

, 2017

Abstract

Objective: To establish a method for the determination of related substances in Ex4c (the raw ma-terial of the pegylation of glucagon-like peptide-1) by UPLC. Methods: The UPLC method was de-veloped by using a Waters ACQUITY UPLC? Peptide CSH?C18 column (130 ?, 2.1 × 150 mm, 1.7 μm) with a gradient elution system. The mobile phase A was 0.05% trifluoroacetic acid aqueous solution/tetrahydrofuran (9:1), and the mobile phase B was 0.05% trifluoroacetic acid in acetoni-trile/tetrahydrofuran (9:1). The column temperature was maintained at 45?C while the detection wavelength setting at 214 nm. Furthermore, the sample injection was 2 μl via keeping a flow rate of 0.3 mL ?min ?1. The developed method was validated. Results: The resolution between Ex4c and adjacent impurities, between Ex4C and the known impurities were greater than 1.5. All four known impurities exhibited good linear relationships with their related coefficients ≥ 0.995. And their detection limits ranged from 4.0 ng to 5.6 ng, comprising 96.3%~101.1% of recovered ma-terial. Conclusion: The validation results showed that the established method was simple, accurate and reproducible. It is capable of determinating impurities in Ex4c (the raw material of the pegy-lation of glucagon-like peptide-1) and can be effectively used for quality control of this drug.

Keywords

Ex4c, UPLC, Related Substances, Method Validation

超高效液相色谱法测定Ex4c 的有关物质

杨欣茹1，张贵民1,2*，马丽1，刘思光1，赵亮亮1

1鲁南制药集团股份有限公司，山东临沂 2

国家手性制药工程技术研究中心，山东临沂

通讯作者。

杨欣茹等

收稿日期：2017年4月25日；录用日期：2017年5月14日；发布日期：2017年5月17日

摘要

目的：建立超高效液相色谱法(UPLC)测定聚乙二醇化促胰岛素分泌肽类似物原料Ex4c 有关物质的方法。方法：采用Waters ACQUITY UPLC? Peptide CSH?C18 column (130 ?, 2.1 × 150 mm, 1.7 μm)为色谱柱；以0.05%三氟乙酸水溶液-四氢呋喃(9:1)为流动相A ，0.05%三氟乙酸乙腈溶液-四氢呋喃(9:1)为流动相B ；进行梯度洗脱。柱温45℃，检测波长为214 nm ，进样量为2 μl ，流速为0.3 mL ?min ?1。结果：杂质A 、B 、C 、D 线性良好，相关系数r 均 ≥ 0.995；4种杂质的检测限范围为4.0~5.6 ng ；平均回收率为96.3%~101.1%。结论：经方法学验证，所建立的方法简便、准确、重复性好，可用于测定聚乙二醇化促胰岛素分泌肽类似物原料Ex4c 的有关物质，有效地控制药品质量。

关键词

Ex4c ，超高效液相色谱法，有关物质，方法学验证

This work is licensed under the Creative Commons Attribution International License (CC BY). https://www.sodocs.net/doc/fe12898536.html,/licenses/by/4.0/

1. 引言

糖尿病是一种常见的慢性非传染性疾病，已经成为严重威胁人类健康的体内代谢紊乱疾病，其特点是慢性高血糖，伴随由于胰岛素分泌减少或耐受所引起的糖、脂肪和蛋白质代谢紊乱[1]。目前常用的Ⅱ型糖尿病(T 2DM)治疗药物包括：双胍类、磺脲类、α-葡萄糖苷酶抑制剂、噻唑烷二酮类等[2]。尽管传统抗糖尿病药物已经在临床上广泛应用并取得良好疗效，但仍存在着诸多问题，最显著的两个问题就是在降低高血糖方面不能维持长期疗效和不能有效缓解病情达到疗效指标，此外安全性和副作用同样是这些抗糖尿病药物亟待改善的问题。因此，研究和开发新的安全有效的T 2DM 治疗药物具有重要的意义。GLP-1类似物药物[3] [4]因其独特药理作用，已成为用于治疗和缓解该疾病的最新最具潜力的新型药物。全球已上市GLP-1类似物[5]产品中，有美国礼来公司与Amylin 制药公司共同研制的艾塞那肽注射液(Byetta)和诺和诺德公司的利拉鲁肽注射液(Victoza)，但两者半衰期短，需频繁给药，且价格昂贵，患者依从性较差，并给患者(尤其是国内患者)带来极大的经济负担。本公司通过系统筛选和独特设计而获得的GLP-1类似物Ex4c 新结构，经与35 kDa 分子量无单甲氧基PEG 的同源二聚体多肽修饰，形成了具有长效、低免疫原性、低给药剂量、高安全性和低成本的新一代GLP-1的长效制剂新药。

多肽测定方法已有相关文献报道，吴小曼等[6]采用了C18色谱柱，乙腈-磷酸二氢钾为流动相体系，以10%的氢氧化钾调节pH 值，梯度洗脱，测定艾塞那肽的有关物质；石琳等[7]采用了C3色谱柱，乙腈-磷酸二氢钾为流动相体系，磷酸调节pH 值，梯度洗脱，测定醋酸艾塞那肽的含量。两种方法中艾塞那肽与相邻杂质间分离度不好，有机溶剂消耗大。超高效液相色谱(ultra performance liquid chromatography, UPLC)作为一种高效分析技术，其高分辨率，高分析效率，低溶剂消耗在色谱分析中具有显著优势。本课题组利用UPLC 开展了Ex4c 有关物质方法的研究及方法学验证，方法简便，灵敏，准确度高，有机溶剂消耗少，对环境污染小。

Open Access

杨欣茹等

2. 仪器与试药

仪器

Agilent1290超高效液相色谱仪(配有DAD检测器)，Mettler Toledo AL204型电子天平，KQ5200DE 型数控超声波清洗器(昆山市超声波仪器有限公司)。

试药

聚乙二醇化促胰岛素分泌肽类似物原料Ex4c为本公司自制，三氟乙酸(色谱纯，天津市四友生物医学技术有限公司)，四氢呋喃(色谱纯，天津市申泰化学试剂有限公司)，乙腈(色谱纯，merk)；水为超纯水。

3. 方法与结果

3.1. 色谱条件

仪器为Agilent UPLC 1290；色谱柱型号为Waters ACQUITY UPLC? Peptide CSH?C18 column，130 ?，1.7 μm，2.1 × 150 mm；流动相：以0.05%三氟乙酸水溶液-四氢呋喃(9:1)为流动相A，0.05%三氟乙酸乙腈溶液-四氢呋喃(9:1)为流动相B；梯度洗脱程序见表1。柱温45℃，检测波长为214 nm；进样量为

2 μl；流速为0.

3 mL?min?1。

3.2. 溶液配制

3.2.1. 供试品溶液

取Ex4c适量，加30%乙腈水溶液溶解并稀释成每1 ml中约含1 mg的溶液，作为Ex4c供试品溶液。

3.2.2. Ex4c储备液

精密称取Ex4c 102.8 mg，置10 ml量瓶中，加30%乙腈溶解并稀释至刻度，摇匀，作为Ex4c储备液。

3.2.3. 杂质储备液

精密称取杂质A、B、C、D各约10 mg，分别置10 ml量瓶中，分别用30%乙腈溶解并稀释至刻度，作为杂质A、B、C、D储备液。

3.3. 方法学考察

3.3.1. 专属性

1) 空白溶剂

取空白溶剂30%乙腈适量，滤过，依法测定，记录色谱图。色谱图见图1(a)。由图可知，空白溶剂不干扰本品的有关物质的检查。

2) Ex4c定位

(氨基酸序列：HGEGTFTSDLSKQMEEEAVRLFIEWLKNGGPGGSGGSC-NH2)

取Ex4c适量，加30%乙腈水溶液溶解并稀释制成1 mg?ml?1的溶液，依法测定，记录色谱图。色谱图见图1(b)。由图可知，Ex4c保留时间为11.734 min，且主峰与杂质均能有效分离。

3) 杂质A定位

(氨基酸序列：HGEGTFTS[Asu]LSKQMEEEAVRLFEWLKNGGPGGSGGSC-NH2)

取杂质A对照品适量，加30%乙腈水溶液配置成每1 ml中约含0.5 mg的溶液，作为杂质A对照品溶液。取样依法测定，记录色谱图。色谱图见图1(b)。由图可知，杂质A保留时间为16.251 min。

杨欣茹等Table 1. Gradient elution program

表1. 梯度洗脱程序

时间(time)/min

流动相A

(mobile phase A)/%

流动相B (%)

(mobile phase B)/%

0 76 24 20 73 27 35 55 45 37 76 24 45 76 24

(a) 空白溶液(Blank solution)

(b) 杂质和供试品溶液(impurity and analytical solution)

A. 杂质A (impurity A)

B. 杂质B (impurity B)

C. 杂质C (impurity C)

D. 杂质D (impurity D)

E. Ex4c

Figure 1. Chromatograms of specificity

图1. 专属性色谱图

4) 杂质B定位

(氨基酸序列：DLSKQMEEEAVRLFEWLKNGGPGGSGGSC-NH2)

取杂质B对照品适量，加30%乙腈水溶液配置成每1 ml中约含0.5 mg的溶液，作为杂质B对照品溶液。取样依法测定，记录色谱图。色谱图见图1(b)。由图可知，杂质B保留时间为7.435 min。

5) 杂质C定位

(氨基酸序列：EGTFTSDLSKQMEEEAVRLFEWLKNGGPGGSGGSC-NH2)

取杂质C对照品适量，加30%乙腈水溶液配置成每1 ml中约含0.5 mg的溶液，作为杂质C对照品溶液。取样依法测定，记录色谱图。色谱图见图1(b)。由图可知，杂质C保留时间为17.286 min。

6) 杂质D定位

(氨基酸序列：GEGTFTSDLSKQMEEEAVRLFEWLKNGGPGGSGGSC-NH2)

取杂质D对照品适量，加30%乙腈水溶液配置成每1 ml中约含0.5 mg的溶液，作为杂质D对照品溶液。取样依法测定，记录色谱图。色谱图见图1(b)。由图可知，杂质D保留时间为18.334 min。

7) 混合对照品溶液

取Ex4c约10 mg，至10 ml量瓶中，加上述各杂质定位溶液各0.4 ml，加30%乙腈水溶液稀释至刻度，摇匀。依法测定，记录色谱图。色谱图见图1(c)。由图可知，主成分和各杂质分离度均符合规定。

3.3.2. 破坏试验

1) 酸破坏

精密称取Ex4c约10 mg，置10 ml量瓶中，加1.0 ml 30%的乙腈水溶液溶解，加入0.1 mol?L?1的盐酸溶液1 ml，于80℃水浴中破坏30 min，冷却至室温后中和至中性，用30%乙腈水溶液稀释至刻度，作为供试品溶液。精密量取供试品溶液2 μl注入液相色谱仪，记录色谱图。色谱图见图2。

2) 碱破坏

精密称取Ex4c约10 mg，置10 ml量瓶中，加1.0 ml 30%的乙腈水溶液溶解，加入0.1 mol?L?1的氢

杨欣茹等

M. 高温破坏(high temperature hydrolysis) N. 酸破坏(acid hydrolysis) G. 酸破坏空白(blank solution of acid) H. 碱破坏(base hydrolysis) I. 碱破坏空白(blank solution of base) J. 氧化破坏(oxidation hydrolysis) K. 氧化破坏空白溶剂(blank solution of oxidation)

Figure 2. Chromatogram of stress condition test 图2. 破坏试验色谱图

氧化钠溶液0.5 ml ，室温放置60 min ，中和至中性，用30%乙腈水溶液稀释至刻度，作为供试品溶液。取2 μl 供试品溶液注入液相色谱仪，记录色谱图。色谱图见图2。

3) 高温破坏

精密称取Ex4c 约10 mg ，精密称定，置10 ml 量瓶中，于105℃高温破坏90 min ，冷却至室温后用30%乙腈水溶解并稀释至刻度，作为供试品溶液。精密量取供试品溶液2 μl 注入液相色谱仪，记录色谱图。色谱图见图2。

4) 氧化破坏

精密称取Ex4c 约10 mg ，置10 ml 量瓶中，加30%的乙腈水溶液1.0 ml 溶解，加入0.3%的双氧水溶液0.5 ml ，室温放置80 min ，用30%乙腈溶解并稀释至刻度，作为供试品溶液。精密量取供试品溶液2 μl 注入液相色谱仪，记录色谱图。色谱图见图2。

除不加样品外，同法配制各破坏条件的空白溶液同法测试，色谱图见图2。

结果表明，各破坏条件下所产生的降解产物均能与Ex4c 很好的分离，各降解产物之间也能较好的分离，峰纯度分析显示各破坏溶液的色谱图中Ex4c 峰纯度合格。 3.3.3. 系统适用性试验

精密量取Ex4c 储备液1 ml ，杂质A 、B 、C 、D 储备液各100 μl ，置5 ml 量瓶中，加30%乙腈稀释至刻度，作为系统适用性溶液。取系统适用性溶液，连续进样六次，分别计算各色谱图中Ex4c 主峰、杂质A 、B 、C 、D 保留时间和峰面积的相对标准偏差，考察主峰与各杂质的分离度。结果表明Ex4c 主峰、杂质A 、B 、C 、D 保留时间的相对标准偏差均小于2%，峰面积的相对标准偏差均小于3%。主峰与相邻杂质峰分离度均大于1.5，理论板数按Ex4c 峰计算均大于5000。 3.3.4. 检测限与定量限

取杂质A 、B 、C 、D 储备液，采用逐步稀释法，以S/N ≈ 10时的浓度作为定量限，以S/N ≈ 3时的浓度作为检测限，结果见表2。

-50

050100150200250M

N G H I J K t/min

A/mU

杨欣茹等

Table 2. Results of LOD and LOQ test

表2. 检测限与定量限试验结果

序号(No.) 组分(constituents) 检测限(LOD)/ng 定量限(LOQ)/ng

1 杂质A 5.4 16.4

2 杂质B 4.0 12.0

3 杂质C 5.6 17.0

4 杂质D 5.6 16.6

3.3.5. 线性关系考察

精密量取Ex4c储备液0.4 ml、0.6 ml、0.8 ml、1.0 ml、1.2 ml、1.5 ml分别置10 ml量瓶中，分别精密量取杂质A、B、C、D储备液各80 μl、120 μl、160 μl、200 μl、240 μl、300 μl置上述10 ml量瓶中，加30%乙腈稀释至刻度，摇匀，分别得到40%、60%、80%、100%、120%、150%的溶液。取上述溶液依法测定，记录色谱图。以Ex4c及杂质A、B、C、D的浓度C (mg?ml?1)为横坐标，以Ex4c及杂质A、

B、C、D峰面积为纵坐标进行线性回归，结果见表3。

由表3可知，该方法线性关系良好。

3.3.6. 精密度试验

1) 重复性分别取本品6份各约10 mg，精密称定，加各杂质A、B、C、D储备液各200 μl，置10

ml量瓶中，加30%乙腈稀释至刻度，作为供试品溶液，依法测定，记录色谱图。按面积归一化法，计算各个色谱图中Ex4c的纯度及杂质A、B、C、D百分含量，并计算其相对标准偏差，结果见表4。

2) 中间精密度实验员A、B于第二天分别同法配制6份供试品溶液，依法测定，记录色谱图。按

面积归一化法，计算各个色谱图中Ex4c的纯度及杂质A、B、C、D百分含量，并计算其相对标准偏差，试验结果见表4。

由表4可知，方法精密度良好。

3.3.7. 回收率试验

精密量取Ex4c储备液1.0 ml，置10 ml量瓶中，配置9份，分别精密量取杂质A、B、C、D储备液160 μl、200 μl、240 μl置上述容量瓶中，每个浓度配置3份，加30%乙腈稀释至刻度，作为供试品溶液。

精密量取Ex4c储备液1.0 ml，置10 ml量瓶中，分别精密量取杂质A、B、C、D储备液200 μl，加30%乙腈稀释至刻度，同法配置两份，作为对照溶液。精密称取Ex4c适量，加30%乙腈溶解并稀释制成1 mg?ml?1的溶液，作为样品测定溶液。

取上述各溶液依法测定，记录色谱图，计算各浓度项下的回收率，试验结果见表5。

由表5可知，本方法对杂质和Ex4c均具有良好的回收率。

3.3.8. 耐用性试验

分别通过改变柱温(±2℃)、流速(±0.02 ml?min?1)和更换色谱柱，考察供试品溶液中Ex4c及各杂质的变化情况，试验结果见表6。

结果表明：测定结果没有明显差异，峰形、分离度均符合要求，本方法的耐用性良好。

3.4. 样品测定

精密称取本品3批样品适量，分别加30%的乙腈溶解并稀释制成每1 ml含Ex4c 1 mg的溶液，作为供试品溶液。依法测定，有关物质按面积归一化法计算，结果见表7。

杨欣茹等Table 3. Results of linear equations test

表3. 线性关系试验结果

杂质(solvent)

回归方程

(regression equation)

高效液相色谱方法的验证

高效液相色谱方法的验证 ?方法验证的目的 ?方法验证的内容 ?方法验证的项目及测定方法

方法验证的目的目的：证明采用的方法适合相应检测的要求。方法验证是实验室针对特定方法的研究过程，通过设计方案，有步骤、系统地收集、处理实验数据，最终形成文件，以证明所用试验方法准确、灵敏、专属并重现。同一分析方法用于不同的检测项目会有不同的验证要求。

方法验证的内容 ?准确度 ?精密度 ?专属性 ?检测限 ?定量限 ?线性和范围 ?耐用性

准确度定义：方法测定结果与真实值或参考值的接近程度。一般用回收率%表示。 1. 主成分含量测定原料药：对照品或方法比对 2. 制剂、中药：标准加样回收杂质定量测定：加样回收（n 3 9）杂质对照品方法比对回收率 C-A %=′ B 100% 杂质与主成分的相对含量 A:试验供试品中被测成分的量（通常为含量测定量的50%） B: 试验供试品中加入的对照品的量（通常为±20%） C:试验测定值

精密度定义：在规定测试条件下，同一个均匀供试品，经多次取样测定所得结果之间的接近程度。一般用偏差，相对偏差和相对标准偏差 1. 重复性（n 9） 3 2. 中间精密度 3. 重复性测定：HPLC方法的精密度测试，应从样品制备开始，设计3个浓度，分别平行制备3份，以测定含量计算相对标准偏差；或同一样品平行制备6份供试品，分别进样，以峰面积计算相对标准偏差。同一份供试品连续进样6次，计算得到的相对标准偏差只能表征进样精密度，不能作为方法精密度。

专属性定义：在其它成分可能存在下，方法能正确测定出被测物的特性。 1. 鉴别反应 2. 含量测定杂质测定测定：限量检查空白制剂，模拟复方加速破坏试样测试 DAD峰纯度检查

高效液相色谱的发展及其应用

高效液相色谱的发展及其应用摘要：了解高效液相色谱[1]的发展历史，知道高效液相色谱的组成结构、操作原理以及方法等等。掌握它的分类方法，通过比较得出高效液相色谱分析方法的优点与缺点。明确高效液相色谱的应用，最终分析结果。关键词：高效液相色谱；发展历史；应用高效液相色谱是以液体为流动相，采用高压输液系统，将具有不同极性的单一溶剂或不同比例的混合溶剂、缓冲液等流动相泵入装有固定相的色谱柱，在柱内各成分被分离后，进入检测器进行检测，从而实现对试样的分析。 1、高效液相色谱的发展历史 1.1高效液相色谱的历史高效液相色谱作为色谱分析法的一个分支，是在二十世纪60年代末期，在经典液相色谱法和气相色谱法的基础上，发展起来的新型分离分析技术。1960年中后期，气相色谱理论和实践的发展，以及机械、光学、电子等技术上的进步，液相色谱开始活跃。到60年代末期把高压泵和化学键合固定相用于液相色谱就出现了高效液相色谱。 1.2高效液相色谱与其它色谱的比较[2] 1.2.1与经典液相色谱的比较经典液相色谱法使用粗粒多孔固定相，装填在大口径、长玻璃柱管内，流动相仅靠重力流经色谱柱，溶质在固定相的传质、扩散速度缓慢，柱入口压力低，柱效低，分析时间冗长。高效液相色谱法使用了全多孔微粒固定相，装填在小口径、短不锈钢柱内，流动相通过高压输液泵进入高柱压的色谱柱，溶质在固定相的传质，扩散速度大大加快，从而在短的分析时间内获得高柱效和高分离能力。 1.2.2与气相色谱法的比较高效液相色谱法与气相色谱法有许多相似之处。气相色谱法具有选择性高、分离效率高、灵敏度高，分析速度快的特点，但它仅适于分析蒸气压低、沸点低的样品，而不适用于分析高沸点有机物、高分子和热稳定性差的化合物以及生物活性物质，因而使其应用受到限制。在全部有机化合物中仅有20%的样品适用于气相色谱分析。高效液相色谱法却恰可弥补气相色谱法的不足之处，可对80%的有机化合物进行分离和分析。 2、高效液相色谱 2.1高效液相色谱的特点 2.1.1高效液相色谱的优点 1.分辨率高于其它色谱法，可选择固定相和流动相以达到最佳分离效果； 2.速度快，十几分钟到几十分钟可完成； 3.重复性高、样品不被破坏、易回收； 4.高效相色谱柱可反复使用； 5.自动化操作，分析精确度高；

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实验四高效液相色谱法测定有机化合物的含量 [目的要求] 1、了解仪器各部分的构造及功能。 2、掌握样品、流动相的处理，仪器维护等基本知识。 3、学会简单样品的分析操作过程。 [基本原理] 高效液相色谱仪液体作为流动相，并采用颗粒极细的高效固定相的主色谱分离技术，在基本理论方面与气相色谱没有显著不同，它们之间的重大差别在于作为流动相的液体与气体之间的性质差别。与气相色谱相比，高效液相色谱对样品的适用性强，不受分析对象挥发性和热稳定性的限制，可以弥补气相色谱法的不足。液相色谱根据固定向的性质可分为吸附色谱、键合相色谱、离子交换色谱和大小排阻色谱。其中反相键合相色谱应用最广，键合相色谱法是将类似于气相色谱中固定液的液体通过化学反应键合到硅胶表面，从而形成固定相。若采用极性键合相、非极性流动相，则称为正相色谱；采用非极性键合相，极性流动相，则称为反相色谱。这种分离的保留值大小，主要决定于组分分子与键合固定液分子间作用力的大小。反相键合相色谱采用醇-水或腈-水体系作为流动相，纯水廉价易得，紫外吸收小，在纯水中添加各种物质可改变流动相选择性。使用最广泛的反相键合相是十八烷基键合相，即让十八烷基（C18H37―）键合到硅胶表面，这也就是我们通常所说的碳十八柱。 [仪器试剂] 高效液相色谱仪（包括储液器、高压泵、自动进样器、色谱柱、柱温箱、检测器、工作站）、过滤装置待测样品（浓度约100 ppm）、甲醇、二次水 [实验步骤] 1、仪器使用前的准备工作（1）样品与流动相的处理配好的溶液需要用0.45 μm的一次性过滤膜过滤。纯有机相或含一定比便例有机相的就要用有机系的滤膜，水相或缓冲盐的就要用水系滤膜。水、甲醇等过滤后即可使用；水放置一天以上需重新过滤或换新鲜的水。含稳定剂的流动相需经过特殊处理，或使用色谱纯的流动相。（2）更换泵头里清洗瓶中的清洗液流动相不同，清洗液也不同，如果流动相为甲醇-水体系，可以用50%的甲醇；如果流动相含有电解质，通常用95%去离子水甚至高纯水。如果仪器经常使用建议每周更换两次，如果仪器很少使用则每次使用前必须更换。（3）更换托盘里洗针瓶中的洗液洗液一般为：50%的甲醇。

高效液相色谱法的应用

高效液相色谱法在药物分析中的应用与进展摘要：主要介绍了高效液相色谱法在药物鉴别、药物杂质检查、药物含量测定等方面具体应用以及展望了高效液相色谱法在药物分析中的应用前景。关键词：高效液相色谱法；HPLC；药物分析；联用技术 Abstract:Mainly introduced the high performance liquid chromatography in drug discrimination, drug impurity test, determination of the content and concrete application and the prospect of the high performance liquid chromatography in pharmaceutical analysis application prospect. Keywords: high performance liquid chromatography，HPLC ,pharmaceutical analysis，hyphenated techniques 引言：高效液相色谱法（High Performance Liquid Chromatography \ HPLC）又称“高压液相色谱”、“高速液相色谱”、“高分离度液相色谱”、“近代柱色谱”等。高效液相色谱是色谱法的一个重要分支，以液体为流动相，采用高压输液系统，将具有不同极性的单一溶剂或不同比例的混合溶剂、缓冲液等流动相泵入装有固定相的色谱柱，在柱内各成分被分离后，进入检测器进行检测，从而实现对试样的分析。该方法已成为化学、医学、工业、农学、商检和法检等学科领域中重要的分离分析技术。HPLC在国内和国外的药物分析领域的应用范围很广，发展速度也很快，尤其在我国，近十几年来HPLC方法越来越受到重视。HPLC 在药物的分析中的应用主要是鉴别、有关物质的检查、有效成分及含量的测定[1]；本文对高效液相色谱法（HPLC）技术在药物分析中的应用进行概述并展望其应用前景。 1 在药物分析中的应用 1.1 在药物鉴别中的应用在HPLC 法中，药物组分的保留时间与其结构和性质有着直接的关系，不同的药物由于结构和性质的差异在色谱图上的出峰顺序不同，是定性的重要参数，

高效液相色谱法的标准操作规程

高效液相色谱法的标准操作规程 1 定义及概述： 1.1 高效液相色谱法是一种现代液体色谱法，其基本方法是将具不同极性的单一溶剂或不同比例的混合溶液作为流动相，用高压输液泵将流动相注入装有填充剂的色谱柱，注入的供试品被流动相带入柱内进行分离后，各成分先后进入检测器，用记录仪或数据处理装置记录色谱图或进行数据处理，得到测定结果。由于应用各种性质的微粒填料和加压的液体流动相，本法具有分离性能高、分析速度快的特点。 1.2 高效液相色谱法适用于能在特定填充剂的色谱柱上进行分离的药品的分析测定，特别是多组分药品的测定、杂质检查和大分子物质的测定。有的药品需要在色谱分离前或后经过衍生化反应，方能进行分离或检测。常用的色谱柱填充剂有：硅胶，用于正相色谱；化学键合固定相，根据键合的基团不同可用于反相或正相色谱，其中最常用的是十八烷基硅烷（又称ODS）键合硅胶，可用于反相色谱或离子交换色谱；凝胶或玻璃微球等填充剂是有一定孔径的大孔填料，用于排阻色谱。 1.3 高效液相色谱仪基本由泵、进样器、色谱柱、检测器和色谱数据处理组成。检测器最常用的为可变波长紫外检测器或紫外—可见检测器。色谱信息的收集和处理常用积分仪或数据工作站进行。梯度洗脱，可用两台泵或单台泵加比例阀进行程控实现。 2 高效液相色谱仪的使用要求： 2.1 按国家技术监督局国家计量检定规程汇编中“实验室液相色谱仪检定规程”的规定作定期检定，应符合规定。 2.2 仪器各部件应能正常工作，管路为无渗漏连结，流路中无堵塞或漏液，在设定的检测器灵敏度条件下，色谱基线噪音和漂移应能满足分析要求。 2.3 具体仪器在使用前应详细参阅各操作说明书。

高效液相色谱法测定氨基酸

脑蛋白水解物溶液氨基酸含量分析方法研究方案 1、仪器与试药 1.1 仪器 1525型高效液相色谱仪（美国Waters公司）；Waters1525型泵，Waters2487型检测器，Waters5CH 型柱温箱，WatersBREEZE数据处理软件，水浴恒温器（精度±0.1℃），旋涡器，微量移液器，衍生专用管；CP225D型分析天平（德国）；4umNora-Pak TM C18（3.9mm×150mm，5μm）色谱柱（美国） 1.2 药品与试剂 16种氨基酸（门冬氨酸、丝氨酸、谷氨酸、甘氨酸、组氨酸、精氨酸、苏氨酸、丙氨酸、脯氨酸、缬氨酸、甲硫氨酸、赖氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸、色氨酸）由中国药品生物制品检定所提供。脑蛋白水解物注射液，云南盟生药业有限公司生产，规格10ml/支。批号：2013、2013、2013. 乙腈（HPLC级）；EDTA（分析纯）；磷酸（分析纯）；二乙胺（分析纯）；三水合乙酸钠（分析纯）。2、方法与结果 2.1色谱条件流动相A为AccQTag醋酸—磷酸盐缓冲液；由AccQTagEluent A浓缩制备AccQTag洗脱液,用前稀释10倍（或按以下方法配制：称19.04g三水合乙酸钠，加1000ml纯化水，搅拌，溶解，用50%H3PO4将pH调至5.2，加入1ml 1mg/ml的EDTA溶液，加入2.37ml二乙胺，用50%H3PO4滴定至pH4.95，用水溶性过滤器过滤，超声，脱气，备用。）；流动相B为60% HPLC级乙腈，按梯度表梯度洗脱；流速1.0ml/min；检测波长为254nm；进样量5μl；柱温38℃。

时间 (min) 流速 (ml/min) % A % B 曲线起始 1.0 100 0 * 0.5 1.0 98 2 6 15.0 1.0 93 7 6 19.0 1.0 90 10 6 32.0 1.0 65 35 6 33.0 1.0 65 35 6 34.0 1.0 0 100 6 37.0 1.0 0 100 6 38.0 1.0 100 0 6 42.0 1.0 100 0 6 2.2对照品溶液、供试品溶液的制备分别精密称取16种氨基酸标准品，用纯化水配制成浓度如下表所示的混合溶液。名称浓度（mg/ml）名称浓度（mg/ml）名称浓度（mg/ml）门冬氨酸 4.80 苏氨酸 1.20 异亮氨酸 1.10 丝氨酸 2.60 丙氨酸 2.50 亮氨酸 2.70 谷氨酸 6.20 脯氨酸 2.00 苯丙氨酸 1.20 甘氨酸 2.40 缬氨酸 1.60 色氨酸0.40 组氨酸0.90 甲硫氨酸 1.00 精氨酸 1.20 赖氨酸 3.45 取上述溶液0.1ml，加纯化水0.9ml，旋涡器混匀，作为对照品溶液；取脑蛋白水解物注射液，加水稀释成含总氮为1mg/ml的溶液，取0.1ml，加纯化水0.9ml,旋涡器混匀，作为供试品溶液。衍生剂配制将水浴锅设置55℃，加热，待温度稳定, 取AccQFluor衍生剂2A，轻轻弹击,确保AccQFluor 衍生剂2A粉末全落在瓶底，吸取AccQFluor衍生稀释剂2B 1ml并放掉，清洗移液器管，再吸取AccQFluor 衍生稀释剂2B 1ml，加入AccQFluor衍生剂2A的瓶中，振荡10秒钟，在恒温水浴锅中溶解，保持10分钟。于干燥器中室温保存一周,于干燥器中4℃保存二周。 2.3测定方法分别取20ul对照品溶液和供试品溶液加入衍生专用管底部，加入60uLAccQFluor硼酸

高效液相色谱分析原理及流程

高效液相色谱分析原理及流程高效液相色谱以经典的液相色谱为基础，是以高压下的液体为流动相的色谱过程。通常所说的柱层析、薄层层析或纸层析就是经典的液相色谱。所用的固定相为大于100um的吸附剂(硅胶、氧化铝等)。这种传统的液相色谱所用的固定相粒度大，传质扩散慢，因而柱效低，分离能力差，只能进行简单混合物的分离。而高效液相所用的固定相粒度小(5um-10um)、传质快、柱效高。高效液相色谱法(HPLC)是20世纪60年代后期发展起来的一种分析方法。近年来，在保健食品功效成分、营养强化剂、维生素类、蛋白质的分离测定等应用广泛。世界上约有80%的有机化合物可以用HPLC来分析测定。高效液相色谱分析原理 (一)高效液相色谱分析的流程由泵将储液瓶中的溶剂吸入色谱系统，然后输出，经流量与压力测量之后，导入进样器。被测物由进样器注入，并随流动相通过色谱柱，在柱上进行分离后进入检测器，检测信号由数据处理设备采集与处理，并记录色谱图。废液流入废液瓶。遇到复杂的混合物分离(极性范围比较宽)还可用梯度控制器作梯度洗脱。这和气相色谱的程序升温类似，不同的是气相色谱改变温度，而HPLC改变的是流动相极性，使样品各组分在最佳条件下得以分离。 (二)高效液相色谱的分离过程同其他色谱过程一样，HPLC也是溶质在固定相和流动相之间进行的一种连续多次交换过程。它借溶质在两相间分配系数、亲和力、吸附力或分子大小不同而引起的排阻作用的差别使不同溶质得以分离。开始样品加在柱头上，假设样品中含有3个组分，A、B和C，随流动相一起进入色谱柱，开始在固定相和流动相之间进行分配。分配系数小的组分A不易被固定相阻留，较早地流出色谱柱。分配系数大的组分C 在固定相上滞留时间长，较晚流出色谱柱。组分B的分配系数介于A，C之间，第二个流出色谱柱。若一个含有多个组分的混合物进入系统，则混合物中各组分按其在两相间分配系数的不同先后流出色谱柱，达到分离之目的。不同组分在色谱过程中的分离情况，首先取决于各组分在两相间的分配系数、吸附能力、亲和力等是否有差异，这是热力学平衡问题，也是分离的首要条件。其次，当不同组分在色谱柱中运动时，谱带随柱长展宽，分离情况与两相之间的扩散系数、固定相粒度的大小、柱的填充情况以及流动相的流速等

超高效液相色谱仪技术参数

超高效液相色谱仪技术参数原装进口 1. 工作条件 1.1 电源：220V，50Hz 1.2 操作环境 15?C-28?C 1.3 湿度：20-80% 2.技术参数 *2.1 二元高压泵结构：四压力传感器，数控直线驱动色谱双泵。四个压力传感器能够准确的监控泵系统的压力，并对泵做出相应调整，保证流量精度的重复性和稳定性。（需在投标文件中提供泵结构示意图予以证明并加盖仪器制造商公章，并标明四压力传感器示意图位置和真实位置）。 2.1.1 泵类型：数控直线驱动色谱双泵 2.1.2 泵输出压力：≥20000 psi *2.1.3 泵驱动马达：≥4 2.1.4 柱塞杆与马达联接方式：刚性直连 *2.1.5 泵压力传感器数量：≥4 2.1.6 1-4路溶剂任意混合 2.1.7可配内置溶剂选择阀，扩展到9路溶剂 #2.1.8 真空脱气:六通道在线真空脱气机 #2.1.9 流量：最小流量范围≥0.0100，最大流量范围≤2.000mL/min，以0.001mL/min 为增量 *2.1.10 最大操作压力：≥17,800psi（须提供厂家英文官方原版指标及应用证明文件，并加盖仪器制造商公章。 #2.1.11 梯度模式：线性、步进、凹线、凸线四种类型 2.1.12 柱塞清洗：自动，可编程 2.1.13 流量精度：+/-0.02min SD,（全流速范围内）,不随反压变化 2.1.14 流速准确度：±1.0% 2.1.15 梯度准确度：± 0.5%，不随反压变化 2.1.16 梯度精度：±0.15%RSD，不随反压变化

#2.1.17缓冲盐浓度和pH值调节：自动配置缓冲盐浓度和自动调节pH值2.1.17.1配置方式:自动比例混合 2.1.17.2计算方式:梯度曲线 2.1.17.3 pH精度: ±0.01 2.2 自动进样器系统 2.2.1密封在线针进样 2.2.2 耐压: 18,000psi 2.2.3 进样模式：任意体积直接注射进样 2.2.4 样品瓶数：≥90 位 2.2.5 进样精度：<0.3%RSD #2.2.6 样品交叉污染度：<0.001% 2.2.7 进样体积：0.1-50μL，以 0.1μL 为增量 2.2.8 进样线性度：>0.999 2.2.9 自动进样循环时间：<30 秒 2.3 柱温箱及色谱柱 2.3.1 温度范围：室温以上 5℃-90℃，增量：0.1℃ 2.3.2加热方式:电加热 2.3.3 预热方式：主动式 2.3.4 色谱柱颗粒度：≤1.7 um 2.3.5 色谱柱与柱温箱上带有使用信息记录装置 2.4紫外/可见光检测器 *2.4.1波长范围：190～700nm 2.4.2波长准确度：±1nm 2.4.3测量范围：0.0001～4.0000AUFS 2.4.4基线噪音：6.0×10-6 AU, 2.4.5基线漂移: ≤5.0x10-4AU/hr/℃ 2.4.6线性范围：2.5AU 2.4.7吸收范围：0.0001 to 4.0000 AUFS 2.4.8光源：氘灯，寿命2000小时

高效液相色谱法测定饮料中的咖啡因(含问题分析)

实验二高效液相色谱法测定饮料中的咖啡因一、目的要求 1、学习高效液相色谱仪的操作。 2、了解高效液相色谱法测定咖啡因的基本原理。 3、掌握高效液相色谱法进行定性及定量分析的基本方法。二、基本原理咖啡因又称咖啡碱，是由茶叶或咖啡中提取而得的一种生物碱，它属黄嘌呤衍生物，化学名称为1,3,7-三甲基黄嘌呤。咖啡因能兴奋大脑皮层，使人精神兴奋。咖啡中含咖啡因约为1.2~1.8%，茶叶中约含2.0~4.7%。可乐饮料、APC 药片等中均含咖啡因。其分子式为C 8H 10O 2N 4，结构式为： N N CH 3 H 3C O O N N CH 3 定量测定咖啡因的传统分析方法是采用萃取分光光度法。用反相高效液相色谱法将饮料中的咖啡因与其它组分（如：单宁酸、咖啡酸、蔗糖等）分离后，将已配制的浓度不同的咖啡因标准溶液进入色谱系统。如流动相流速和泵的压力在整个实验过程中是恒定的，测定它们在色谱图上的保留时间t R 和峰面积A 后，可直接用t R 定性，用峰面积A 作为定量测定的参数，采用工作曲线法（即外标法）测定饮料中的咖啡因含量。三、仪器和试剂 1、Agilent 1100高效液相色谱仪。 2、色谱柱：Kromasil C18，5μ 150×4.6mm 。 3、流动相：30%甲醇（色谱纯）+70%高纯水；流动相进入色谱系统前，用超声波发生器脱气10min 。 4、咖啡因标准贮备溶液：将咖啡因在110℃下烘干1h 。准确称取0.1000g 咖啡因，用二次蒸馏水溶解，定量转移至100mL 容量瓶中，并稀释至刻度。标样浓度1000μg·mL -1。 5、测饮料试液：可乐，茶叶，速溶咖啡。

高效液相色谱(HPLC)法测定邻苯二甲酸酯

高效液相色谱（HPLC ）法测定邻苯二甲酸酯一、实验目的： 1. 了解高效液相色谱仪原理； 2. 学习高效液相色谱仪的基本操作方法； 3. 利用高效液相色谱仪测定邻苯二甲酸酯、邻苯二乙酸酯、邻苯二丁酸酯的峰图和含量。二、实验原理： ① 高效液相色谱法（High Performance Liquid Chromatography \ HPLC ）是色谱法的一个重要分支，以液体为流动相，采用高压输液系统，将具有不同极性的单一溶剂或不同比例的混合溶剂、缓冲液等流动相泵入装有固定相的色谱柱，在柱内各成分被分离后，进入检测器进行检测，从而实现对试样的分析。高效液相色谱法有“四高一广”的特点：高压、高速、高效、高灵敏度和应用范围广。该方法已成为化学、医学、工业、农学、商检和法检等学科领域中重要的分离分析技术。在高效液相色谱中，若采用非极性固定相，如十八烷基键合相，极性流动相，即构成反相色谱分离系统。反之，则称为正相色谱分离系统。反相色谱系统所使用的流动相成本较低，应用也更为广泛。定量分析时，为便于准确测量，要求定量峰与其他峰或内标峰之间有较好的分离度。分离度（R ）的计算公式为： R ＝ 2[t (R2)-t (R1)] /1.7*(W 1＋W 2) //式中 t (R2)为相邻两峰中后一峰的保留时间；t (R1)为相邻两峰中前一峰的保留时间； W 1 及W 2为此相邻两峰的半峰宽。除另外有规定外，分离度应大于1.5。 ② 本实验对象为邻苯二甲酸酯，又称酞酸酯，缩写PAE ，常被用作塑料增塑剂。它被普遍应用于玩具、食品包装材料、医用血袋和胶管、乙烯地板和壁纸、清洁剂、润滑油、个人护理用品，如指甲油、头发喷雾剂、香皂和洗发液等数百种产品中。但研究表明，邻苯二甲酸酯在人体和动物体内发挥着类似雌性激素的作用，是一类内分泌干扰物。同时也有一定的致癌作用。如果要检测不同条件对谱图分离的影响，可按表1配制几种物质的混合溶液，在不同条件下进行HPLC 分离检测。三.仪器与试剂 1、仪器 Agilent 1100高效液相色谱仪，50ul 微量注射器。 2、试剂甲醇（色谱专用），高纯水，样品。出峰次序样品组成 1 邻苯二甲酸二甲酯（DMP ） 2 邻苯二甲酸二乙酯(DEP) 3 邻苯二甲酸二丁酯(DBP)

高效液相色谱在生物制药中的应用

高效液相色谱在生物制药中的应用高效液相色谱法是近35年发展起来的一项高效、快速的分离分析技术，是现代分离测试的重要手段[1]。高效液相色谱法已经被广泛用在各种领域，它是以经典的液相色谱为基础，引入气相色谱的理论与实验方法，将流动相改为高压输送，并采用高效固定相及在线检测等手段，发展而成的分析、分离方法。以其灵敏度高、选择性好，可分析微量组成甚至痕量样品等特点，成为医药分析领域发展最快、应用最广的现代分析技术之一。于此同时，高效液相色谱法成为环境污染物检测技术及化工产品质量检验中的标准方法。鉴于其简便、快速、灵敏、准确的特点，目前，在医药、卫生、食品、环保等各个领域已得到广泛应用。随着色谱技术的不断发展，在世界许多科学领域中，色谱法已成为世界许多科学领域中普及的一种分离分析手段，色谱仪也呈多样化、高精化、自动化、联用技术化等方向发展。高效液相色谱仪具有柱效高、分析速度快、流动相和被测组分的体积流量小等特点，广泛应用于临床工作[2]。 1.高效液相色谱的介绍高效液相色谱仪一般都具备贮液器、高压泵、梯度洗提装置（用双泵）、进样器、色谱柱、检测器、恒温器、记录仪等主要部件。高效液相色谱法有以下五个特点：①高压：流动相为液体，流经色谱柱受到的阻力比较大，为了能够快速的通过柱子，必须对流动相加很高的高压。②高效：分离效能高。可选择固定相和流动相以达到最佳分离效果，比工业精馏塔和气相色谱的分离效能高出许多倍。③高灵敏度：紫外检测器可达0.01ng，进样量在uL数量级。④应用范围广：百分之七十以上的有机化合物可用高效液相色谱分析，特别是强极性、热稳定性差、高沸点、大分子化合物的分离分析，显示出优势。⑤分析速度快、载液流速快：分析所需时间一般小于1小时，和传统经典液体色谱法相比速度快得多。高效液相色谱有5种类型： 1、吸附色谱（Adsorption Chromatography） 2、分配色谱（Partition Chromatography） 3、离子色谱（Ion Chromatography） 4、体积排阻色谱（Size Exclusion Chromatography）

通则0512高效液相色谱法

高效液相色谱法：系采用高压输液泵将规定的流动相泵入装有填充剂的色谱柱，对供试品进行分离测定的色谱方法。注入的供试品，由流动相带入色谱柱内，各组分在柱内被分离，并进入检测器检测，由积分仪或数据处理系统记录和处理色谱信号。 1.对仪器的一般要求和色谱条件高效液相色谱仪由高压输液泵、进样器、色谱柱、检测器、积分仪或数据处理系统组成。色谱柱内径一般为3.9～4.6mm，填充剂粒径为3～10μm。超高液相色谱仪：是适应小粒径（约2μm）填充剂的耐超高压、小进样量、低死体积、高灵敏度检测的高效液相色谱仪。（1）色谱柱反相色谱柱：以键和非极性基团的载体为填充剂填充而成的色谱柱。常见的载体有硅胶、聚合物复合硅胶和聚合物等；常用的填充剂优十八烷基硅烷键合硅胶、辛基硅烷键合硅胶和苯基键合硅胶等。正相色谱柱：用硅胶填充剂，或键合极性基团的硅胶填充而成的色谱柱。常见的填充剂有硅胶、氨基键合硅胶和氰基键合硅胶等。氨基键合硅胶和氰基键合硅胶也可用作反向色谱。离子交换色谱柱：用离子交换填充剂填充而成的色谱柱。有阳离子交换色谱柱和阴离子交换色谱柱。手性分离色谱柱：用手性填充剂填充而成的色谱柱。

色谱柱的内径和长度，填充剂的形状、粒径与粒径分布、孔径、表面积、键合基团的表面覆盖度、载体表面基团残留量，填充的致密与均匀程度等均影响色谱柱的性能，应根据被分离物质的性质来选择合适的色谱柱。温度会影响分离效果，品种正文中未指明色谱柱温度时系指室温，应注意室温变化的影响。为改善分离效果可适当提高色谱柱的温度，但一般不宜超过60℃。残余硅羟基未封闭的硅胶色谱柱，流动相的pH值一般应在2～8之间。残余硅羟基已封闭的硅胶、聚合物复合硅胶或聚合物色谱柱可耐受更广泛pH值的流动相，适合于pH值小于2或大于8的流动相。（2）检测器最常用的检测器为紫外-可见分光检测器，包括二极管阵列检测器，其他常见的检测器有荧光检测器、蒸发光散射检测器、示差折光检测器、电化学检测器和质谱检测器等。紫外-可见分光检测器、荧光检测器、电化学检测器为选择性检测器，其响应值不仅与被测物质的量有关，还与其结构有关；蒸发光散射检测器和示差折光检测器为通用型检测器，对所有物质均有响应，结构相似的物质在蒸发光散射检测器的响应值几乎仅与被测物质的量有关。紫外-可见分光检测器、荧光检测器、电化学检测器和示差折光检测器的响应值与被测物质的量在一定范围内呈线性关系，但蒸发光散射检测器的响应值与被测物质的量通常呈指数关系，一般需经对数转换。不同的检测器，对流动相的要求不同。紫外-可见分光检测器所用流动相应符合紫外－可见分光光度法（通则0401）项下对溶剂的要求；采用低波长检测时，还应考虑有机溶剂的截止使用波长，并选用色谱级有机溶剂。蒸发光散射检测器和质谱检测器不得使用含不挥发性盐的流动相。（3）流动相

高效液相色谱法的分类及原理

高效液相色谱法的分类及其分离原理高效液相色谱法分为：液-固色谱法、液-液色谱法、离子交换色谱法、凝胶色谱法。 1.液-固色谱法（液-固吸附色谱法）固定相是固体吸附剂，它是根据物质在固定相上的吸附作用不同来进行分配的。 ①液-固色谱法的作用机制吸附剂：一些多孔的固体颗粒物质，其表面常存在分散的吸附中心点。流动相中的溶质分子X（液相）被流动相S带入色谱柱后，在随载液流动的过程中，发生如下交换反应： X（液相）+nS（吸附）<==>X（吸附）+nS（液相）其作用机制是溶质分子X（液相）和溶剂分子S（液相）对吸附剂活性表面的竞争吸附。吸附反应的平衡常数K为： K值较小：溶剂分子吸附力很强，被吸附的溶质分子很少，先流出色谱柱。 K值较大：表示该组分分子的吸附能力较强，后流出色谱柱。发生在吸附剂表面上的吸附-解吸平衡，就是液-固色谱分离的基础。 ②液-固色谱法的吸附剂和流动相常用的液-固色谱吸附剂：薄膜型硅胶、全多孔型硅胶、薄膜型氧化铝、全多孔型氧化铝、分子筛、聚酰胺等。一般规律：对于固定相而言，非极性分子与极性吸附剂（如硅胶、氧化铜）之间的作用力很弱，分配比k较小，保留时间较短；但极性分子与极性吸附剂之间的作用力很强，分配比k大，保留时间长。对流动相的基本要求：试样要能够溶于流动相中流动相粘度较小流动相不能影响试样的检测常用的流动相：甲醇、乙醚、苯、乙腈、乙酸乙酯、吡啶等。 ③液-固色谱法的应用常用于分离极性不同的化合物、含有不同类型或不；数量官能团的有机化合物，以及有机化合物的不同的异构体；但液-固色谱法不宜用于分离同系物，因为液-固色谱对不同相对分子质量的同系物选择性不高。 2.液-液色谱法（液-液分配色谱法）将液体固定液涂渍在担体上作为固定相。 ①液-液色谱法的作用机制溶质在两相间进行分配时，在固定液中溶解度较小的组分较难进入固定液，在色谱柱中向前迁移速度较快；在固定液中溶解度较大的组分容易进入固定液，在色谱柱中向前迁移速度较慢，从而达到分离的目的。液-液色谱法与液-液萃取法的基本原理相同，均服从分配定律：K=C固/C液 K值大的组分，保留时间长，后流出色谱柱。 ②正相色谱和反相色谱正相分配色谱用极性物质作固定相，非极性溶剂（如苯、正己烷等）作流动相。反相分配色谱用非极性物质作固定相，极性溶剂（如水、甲醇、己腈等）作流动相。

高效液相色谱测定法标准操作规程

标准操作规程 STANDARD OPERATION PROCEDURE 1 目的：建立高效液相色谱测定法操作规程，以使检验操作规化。 2 适用围：适用于高效液相色谱测定法检验操作全过程。 3 责任：QC人员对本SOP实施负责。 4容高效液相色谱法系采用高压输液泵将规定的流动相泵入装有填充剂的色谱柱，对供试品进行分离测定的色谱方法。注入的供试品，由流动相带入色谱柱，各组分在柱被分离，并进入检测器检测，由积分仪或数据处理系统记录和处理色谱信号。 4.1. 对仪器的一般要求和色谱条件高效液相色谱仪由高压输液泵、进样器、色谱柱、检测器、积分仪或数据处理系统组成。色谱柱径一般为3.9~4.6mm，填充剂粒径为3~10μ m。超高效液相色谱仪是适应小粒径（约2μm）填充剂的耐超高压、小进样量、低死体积、高灵敏度检测的高效液相色谱仪。 4.1.1. 色谱柱反相色谱柱：以键合非极性基团的载体为填充剂填充而成的色谱柱。常见的载体有硅胶、聚合物复合硅胶和聚合物等；常用的填充剂有十八烷基硅烷键合硅胶、辛基硅烷键合硅胶和苯基键合硅胶等。正相色谱柱：用硅胶填充剂，或键合极性基团的硅胶填充而成的色谱柱。常用的填充剂有硅胶、氨基键合硅胶和氰基键合硅胶等。氨基键合硅胶和氰基键合硅胶也可用作反相色谱。离子交换色谱柱：用离子交换填充剂填充而成的色谱柱。有阳离子交换色谱柱和阴离子交换色谱柱。手性分离色谱柱：用手性填充剂填充而成的色谱柱。色谱柱的径与长度，填充剂的形状、粒径与粒径分布、孔径、表面积、键合基团的表面覆盖度、载体表面基团残留量，填充的致密与均匀程度等均影响色谱柱的性能，应根据被分离物质的性质来选择合适的色谱柱。温度会影响分离效果，品种正文中未指明色谱柱温度时系指室温，应注意室温变化的影响。为改善分离效果可适当提高色谱柱的温度，但一般不宜超过60℃。残余硅羟基未封闭的硅胶色谱柱，流动相pH值一般应在2? 8 之间。残余硅羟基已封闭的硅胶、聚合物复合硅胶或聚合物色谱柱可耐受更广泛pH值的流动相，适合于pH 值小于2 或大于8 的流动相。

色谱分析(中国药科大学)超高效液相色谱(UPLC)

超高效液相色谱(UPLC) 超高效液相色谱技术（ultra performance liquid chcromatography，简称UPLC）是一种综合了小颗粒填料、非常低系统体积(死体积)及快速检测手段等全新的检测技术。在全面提升HPLC的速度、灵敏度及分离度的同时，保留其原有的实用性及原理。基于小颗粒技术的UPLC，并非普通HPLC系统改进而成。它不但需要耐压、稳定的小颗粒填料（可达1.7μm），而且需要耐压的色谱系统(>15,000psi)、最低交叉污染的快速进样器、快速检测器及优化的系统体积等诸多方面的保障，以充分发挥小颗粒技术优势。这就需要对系统所有硬件和软件的进行全面创新。世界第一个商品化UPLC产品是Waters ACQUITY UPLC TM超高效液相色谱系统，它于2004年3月投入市场。图1：填料技术的沿革 1．小颗粒填料改善分离的理论与科学基础液相色谱30年的发展史是颗粒技术的发展史。颗粒大小的改变直接影响到柱效，从而对分离结果产生直接影响。由上图可知：随着颗粒度的不断降低，色谱分

离度不断提高。事实上，上述规律的理论基础是著名的Van Deemeter方程。Van Deemeter方程是色谱科学家预测颗粒度变化而引起的色谱变化的根本依据。Van Deemeter曲线（见图2）预测最佳柱效与相应的流动相流速。由Van Deemeter方程得知：随着颗粒度减小，相应的理论塔板高度（HETP）也下降，得到的柱效会更高。还应该注意到1.7 μm颗粒的HETP最小值区域扩大了（见图2），这表明可以在比大颗粒更宽的流量范围内得到最高的柱效，结果可以不损失高分离度的同时来适当提高流动相的流速（分析速度）。小颗粒填料为色谱分离带来如此的高柱效和速度优势，使得利用小颗粒技术成为色谱科学家梦寐以求的目标。然而HPLC系统的设计，一直难于发挥出最小颗粒的优点。小颗粒技术的运用，不但要求仪器在超出目前限度（6000 psi/ 400 bar）的压力下工作，同时要求仪器系统的死体积要更小，以便不影响梯度性能，而且还要检测器能高速检测出峰宽只有几秒的色谱峰。在利用杂化颗粒技术合成出耐压的新一代小颗粒色谱填料之后，UPLC超高效液相色谱系统的设计，充分利用了小颗粒填料的所有优点，弥补传统HPLC系统的不足。

高效液相色谱测定法标准操作规程

标准操作规程 1目的：建立高效液相色谱测定法操作规程，以使检验操作规化。 2适用围：适用于高效液相色谱测定法检验操作全过程。 3责任：QC人员对本SOP实施负责。 4容高效液相色谱法系采用高压输液泵将规定的流动相泵入装有填充剂的色谱柱，对供试品进行分离测定的色谱方法。注入的供试品，由流动相带入色谱柱，各组分在柱被分离，并进入检测器检测，由积分仪或数据处理系统记录和处理色谱信号。 4.1.对仪器的一般要求和色谱条件高效液相色谱仪由高压输液泵、进样器、色谱柱、检测器、积分仪或数据处理系统组成。色谱柱径一般为3.9~4.6mm，填充剂粒径为3~10μm。超高效液相色谱仪是适应小粒径（约2μm）填充剂的耐超高压、小进样量、低死体积、高灵敏度检测的高效液相色谱仪。 4.1.1.色谱柱反相色谱柱：以键合非极性基团的载体为填充剂填充而成的色谱柱。常见的载体有硅胶、聚合物复合硅胶和聚合物等；常用的填充剂有十八烷基硅烷键合硅胶、辛基硅烷键合硅胶和苯基键合硅胶等。正相色谱柱：用硅胶填充剂，或键合极性基团的硅胶填充而成的色谱柱。常用的填充剂有硅胶、氨基键合硅胶和氰基键合硅胶等。氨基键合硅胶和氰基键合硅胶也可用作反相色谱。离子交换色谱柱：用离子交换填充剂填充而成的色谱柱。有阳离子交换色谱柱和阴离子交换色谱柱。手性分离色谱柱：用手性填充剂填充而成的色谱柱。色谱柱的径与长度，填充剂的形状、粒径与粒径分布、孔径、表面积、键合基团的表面覆盖度、载体表面基团残留量，填充的致密与均匀程度等均影响色谱柱的性能，应根据被分

离物质的性质来选择合适的色谱柱。温度会影响分离效果，品种正文中未指明色谱柱温度时系指室温，应注意室温变化的影响。为改善分离效果可适当提高色谱柱的温度，但一般不宜超过60℃。残余硅羟基未封闭的硅胶色谱柱，流动相pH值一般应在 2?8之间。残余硅羟基已封闭的硅胶、聚合物复合硅胶或聚合物色谱柱可耐受更广泛pH值的流动相，适合于pH 值小于2或大于8 的流动相。 4.1.2.检测器最常用的检测器为紫外-可见分光检测器，包括二极管阵列检测器，其他常见的检测器有荧光检测器、蒸发光散射检测器、示差折光检测器、电化学检测器和质谱检测器等。紫外-可见分光检测器、荧光检测器、电化学检测器为选择性检测器，其响应值不仅与被测物质的量有关，还与其结构有关；蒸发光散射检测器和示差折光检测器为通用检测器，对所有物质均有响应。结构相似的物质在蒸发光散射检测器的响应值几乎仅与被测物质的量有关。紫外-可见分光检测器、荧光检测器、电化学检测器和示差折光检测器的响应值与被测物质的量在一定围呈线性关系，但蒸发光散射检测器的响应值与被测物质的量通常呈指数关系，一般需经对数转换。不同的检测器，对流动相的要求不同。紫外-可见分光检测器所用流动相应符合紫外-可见分光光度法（通则0401）项下对溶剂的要求；采用低波长检测时，还应考虑有机溶剂的截止使用波长，并选用色谱级有机溶剂。蒸发光散射检测器和质谱检测器不得使用含不挥发性盐的流动相。 4.1.3.流动相反相色谱系统的流动相常用甲醇-水系统和乙腈-水系统，用紫外末端波长检测时，宜选用乙腈-水系统。流动相中应尽可能不用缓冲盐，如需用时，应尽可能使用低浓度缓冲盐。用十八烷基硅烷键合硅胶色谱柱时，流动相中有机溶剂一般不低于5％，否则易导致柱效下降、色谱系统不稳定。正相色谱系统的流动相常用两种或两种以上的有机溶剂，如二氯甲烷和正己烷等。品种正文项下规定的条件除填充剂种类、流动相组分、检测器类型不得改变外，其余如色谱柱径与长度、填充剂粒径、流动相流速、流动相组分比例、柱温、进样量、检测器灵敏度等，均可适当改变，以达到系统适用性试验的要求。调整流动相组分比例时，当小比例组分的百分比例X小于等于33%时，允许改变围为0.7X?1.3X；当X大于33%时，允许改变围为X—10%?X+10% 。

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