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pcDNA3.1 HisA哺乳动物表达载体说明

pcDNA3.1 HisA哺乳动物表达载体说明
pcDNA3.1 HisA哺乳动物表达载体说明

pcDNA3.1/His A

编号 载体名称

北京华越洋生物VECT6147 pcDNA3.1/His A

pcDNA3.1/HisA载体基本信息

载体名称: pcDNA3.1/His A , pcDNA3.1/HisA

质粒类型: 哺乳动物细胞表达载体

启动子: CMV

表达水平: 高

克隆方法: 多克隆位点,限制性内切酶

载体大小: 5514 bp

5' 测序引物: pcDNA3.1-F:CTAGAGAACCCACTGCTTAC

3' 测序引物: pcDNA3.1-R (BGH-R):TAGAAGGCACAGTCGAGG 载体标签: N-His, N-EK

载体抗性: Ampicillin 氨苄

筛选标记: Neomycin (G418)

备注:

稳定性: 瞬表达Transient

组成型: 组成型Constitutive

病毒/非病毒: 非病毒

pcDNA3.1/HisA载体质粒图谱和多克隆位点信息

pcDNA3.1/HisA载体简介

pcDNA3.1/His A, B, and C are 5.5 kb vectors derived from pcDNA3.1 and designed for high-level expression and purification of recombinant proteins in mammalian hosts. The vectors are supplied in three reading frames to facilitate in frame cloning with a polyhistidine metal-binding tag. The human cytomegalovirus (CMV) immediate-early promoter provides high-level expression in a wide range of mammalian cells. In addition, the vector replicates episomally in cell lines that are latently infected with SV40 or that express the SV40 large T antigen (e.g. COS7). High-level stable and non-replicative transient expression can be carried out in most mammalian cells. The control plasmid, pcDNA3.1/His lacZ, is the pcDNA3.1/His B vector with a 3.2 kb fragment containing the β-galactosidase gene cloned in frame with the N-terminal peptide. pcDNA3.1/His lacZ is included for use as a positive control for transfection, expression, and purification in the cell line of choice.

pcDNA3.1/HisA载体序列

ORIGIN

1 GACGGATCGG GAGATCTCCC GATCCCCTAT GGTGCACTCT CAGTACAATC TGCTCTGATG 61 CCGCATAGTT AAGCCAGTAT CTGCTCCCTG CTTGTGTGTT GGAGGTCGCT GAGTAGTGCG 121 CGAGCAAAAT TTAAGCTACA ACAAGGCAAG GCTTGACCGA CAATTGCATG AAGAATCTGC 181 TTAGGGTTAG GCGTTTTGCG CTGCTTCGCG ATGTACGGGC CAGATATACG CGTTGACATT 241 GATTATTGAC TAGTTATTAA TAGTAATCAA TTACGGGGTC ATTAGTTCAT AGCCCATATA 301 TGGAGTTCCG CGTTACATAA CTTACGGTAA ATGGCCCGCC TGGCTGACCG CCCAACGACC 361 CCCGCCCATT GACGTCAATA ATGACGTATG TTCCCATAGT AACGCCAATA GGGACTTTCC 421 ATTGACGTCA ATGGGTGGAG TATTTACGGT AAACTGCCCA CTTGGCAGTA CATCAAGTGT

481 ATCATATGCC AAGTACGCCC CCTATTGACG TCAATGACGG TAAATGGCCC GCCTGGCATT 541 ATGCCCAGTA CATGACCTTA TGGGACTTTC CTACTTGGCA GTACATCTAC GTATTAGTCA 601 TCGCTATTAC CATGGTGATG CGGTTTTGGC AGTACATCAA TGGGCGTGGA TAGCGGTTTG 661 ACTCACGGGG ATTTCCAAGT CTCCACCCCA TTGACGTCAA TGGGAGTTTG TTTTGGCACC 721 AAAATCAACG GGACTTTCCA AAATGTCGTA ACAACTCCGC CCCATTGACG CAAATGGGCG 781 GTAGGCGTGT ACGGTGGGAG GTCTATATAA GCAGAGCTCT CTGGCTAACT AGAGAACCCA 841 CTGCTTACTG GCTTATCGAA ATTAATACGA CTCACTATAG GGAGACCCAA GCTGGCTAGC 901 GTTTAAACTT AAGCTTACCA TGGGGGGTTC TCATCATCAT CATCATCATG GTATGGCTAG 961 CATGACTGGT GGACAGCAAA TGGGTCGGGA TCTGTACGAC GATGACGATA AGGTACCTAG 1021 GATCCAGTGT GGTGGAATTC TGCAGATATC CAGCACAGTG GCGGCCGCTC GAGTCTAGAG 1081 GGCCCGTTTA AACCCGCTGA TCAGCCTCGA CTGTGCCTTC TAGTTGCCAG CCATCTGTTG 1141 TTTGCCCCTC CCCCGTGCCT TCCTTGACCC TGGAAGGTGC CACTCCCACT GTCCTTTCCT 1201 AATAAAATGA GGAAATTGCA TCGCATTGTC TGAGTAGGTG TCATTCTATT CTGGGGGGTG 1261 GGGTGGGGCA GGACAGCAAG GGGGAGGATT GGGAAGACAA TAGCAGGCAT GCTGGGGATG 1321 CGGTGGGCTC TATGGCTTCT GAGGCGGAAA GAACCAGCTG GGGCTCTAGG GGGTATCCCC 1381 ACGCGCCCTG TAGCGGCGCA TTAAGCGCGG CGGGTGTGGT GGTTACGCGC AGCGTGACCG 1441 CTACACTTGC CAGCGCCCTA GCGCCCGCTC CTTTCGCTTT CTTCCCTTCC TTTCTCGCCA 1501 CGTTCGCCGG CTTTCCCCGT CAAGCTCTAA ATCGGGGGCT CCCTTTAGGG TTCCGATTTA 1561 GTGCTTTACG GCACCTCGAC CCCAAAAAAC TTGATTAGGG TGATGGTTCA CGTAGTGGGC 1621 CATCGCCCTG ATAGACGGTT TTTCGCCCTT TGACGTTGGA GTCCACGTTC TTTAATAGTG 1681 GACTCTTGTT CCAAACTGGA ACAACACTCA ACCCTATCTC GGTCTATTCT TTTGATTTAT 1741 AAGGGATTTT GCCGATTTCG GCCTATTGGT TAAAAAATGA GCTGATTTAA CAAAAATTTA 1801 ACGCGAATTA ATTCTGTGGA ATGTGTGTCA GTTAGGGTGT GGAAAGTCCC CAGGCTCCCC 1861 AGCAGGCAGA AGTATGCAAA GCATGCATCT CAATTAGTCA GCAACCAGGT GTGGAAAGTC 1921 CCCAGGCTCC CCAGCAGGCA GAAGTATGCA AAGCATGCAT CTCAATTAGT CAGCAACCAT 1981 AGTCCCGCCC CTAACTCCGC CCATCCCGCC CCTAACTCCG CCCAGTTCCG CCCATTCTCC 2041 GCCCCATGGC TGACTAATTT TTTTTATTTA TGCAGAGGCC GAGGCCGCCT CTGCCTCTGA 2101 GCTATTCCAG AAGTAGTGAG GAGGCTTTTT TGGAGGCCTA GGCTTTTGCA AAAAGCTCCC 2161 GGGAGCTTGT ATATCCATTT TCGGATCTGA TCAAGAGACA GGATGAGGAT CGTTTCGCAT 2221 GATTGAACAA GATGGATTGC ACGCAGGTTC TCCGGCCGCT TGGGTGGAGA GGCTATTCGG 2281 CTATGACTGG GCACAACAGA CAATCGGCTG CTCTGATGCC GCCGTGTTCC GGCTGTCAGC 2341 GCAGGGGCGC CCGGTTCTTT TTGTCAAGAC CGACCTGTCC GGTGCCCTGA ATGAACTGCA 2401 GGACGAGGCA GCGCGGCTAT CGTGGCTGGC CACGACGGGC GTTCCTTGCG CAGCTGTGCT 2461 CGACGTTGTC ACTGAAGCGG GAAGGGACTG GCTGCTATTG GGCGAAGTGC CGGGGCAGGA 2521 TCTCCTGTCA TCTCACCTTG CTCCTGCCGA GAAAGTATCC ATCATGGCTG ATGCAATGCG 2581 GCGGCTGCAT ACGCTTGATC CGGCTACCTG CCCATTCGAC CACCAAGCGA AACATCGCAT 2641 CGAGCGAGCA CGTACTCGGA TGGAAGCCGG TCTTGTCGAT CAGGATGATC TGGACGAAGA 2701 GCATCAGGGG CTCGCGCCAG CCGAACTGTT CGCCAGGCTC AAGGCGCGCA TGCCCGACGG 2761 CGAGGATCTC GTCGTGACCC ATGGCGATGC CTGCTTGCCG AATATCATGG TGGAAAATGG 2821 CCGCTTTTCT GGATTCATCG ACTGTGGCCG GCTGGGTGTG GCGGACCGCT ATCAGGACAT 2881 AGCGTTGGCT ACCCGTGATA TTGCTGAAGA GCTTGGCGGC GAATGGGCTG ACCGCTTCCT 2941 CGTGCTTTAC GGTATCGCCG CTCCCGATTC GCAGCGCATC GCCTTCTATC GCCTTCTTGA 3001 CGAGTTCTTC TGAGCGGGAC TCTGGGGTTC GAAATGACCG ACCAAGCGAC GCCCAACCTG 3061 CCATCACGAG ATTTCGATTC CACCGCCGCC TTCTATGAAA GGTTGGGCTT CGGAATCGTT

3121 TTCCGGGACG CCGGCTGGAT GATCCTCCAG CGCGGGGATC TCATGCTGGA GTTCTTCGCC 3181 CACCCCAACT TGTTTATTGC AGCTTATAAT GGTTACAAAT AAAGCAATAG CATCACAAAT 3241 TTCACAAATA AAGCATTTTT TTCACTGCAT TCTAGTTGTG GTTTGTCCAA ACTCATCAAT 3301 GTATCTTATC ATGTCTGTAT ACCGTCGACC TCTAGCTAGA GCTTGGCGTA ATCATGGTCA 3361 TAGCTGTTTC CTGTGTGAAA TTGTTATCCG CTCACAATTC CACACAACAT ACGAGCCGGA 3421 AGCATAAAGT GTAAAGCCTG GGGTGCCTAA TGAGTGAGCT AACTCACATT AATTGCGTTG 3481 CGCTCACTGC CCGCTTTCCA GTCGGGAAAC CTGTCGTGCC AGCTGCATTA ATGAATCGGC 3541 CAACGCGCGG GGAGAGGCGG TTTGCGTATT GGGCGCTCTT CCGCTTCCTC GCTCACTGAC 3601 TCGCTGCGCT CGGTCGTTCG GCTGCGGCGA GCGGTATCAG CTCACTCAAA GGCGGTAATA 3661 CGGTTATCCA CAGAATCAGG GGATAACGCA GGAAAGAACA TGTGAGCAAA AGGCCAGCAA 3721 AAGGCCAGGA ACCGTAAAAA GGCCGCGTTG CTGGCGTTTT TCCATAGGCT CCGCCCCCCT 3781 GACGAGCATC ACAAAAATCG ACGCTCAAGT CAGAGGTGGC GAAACCCGAC AGGACTATAA 3841 AGATACCAGG CGTTTCCCCC TGGAAGCTCC CTCGTGCGCT CTCCTGTTCC GACCCTGCCG 3901 CTTACCGGAT ACCTGTCCGC CTTTCTCCCT TCGGGAAGCG TGGCGCTTTC TCATAGCTCA 3961 CGCTGTAGGT ATCTCAGTTC GGTGTAGGTC GTTCGCTCCA AGCTGGGCTG TGTGCACGAA 4021 CCCCCCGTTC AGCCCGACCG CTGCGCCTTA TCCGGTAACT ATCGTCTTGA GTCCAACCCG 4081 GTAAGACACG ACTTATCGCC ACTGGCAGCA GCCACTGGTA ACAGGATTAG CAGAGCGAGG 4141 TATGTAGGCG GTGCTACAGA GTTCTTGAAG TGGTGGCCTA ACTACGGCTA CACTAGAAGA 4201 ACAGTATTTG GTATCTGCGC TCTGCTGAAG CCAGTTACCT TCGGAAAAAG AGTTGGTAGC 4261 TCTTGATCCG GCAAACAAAC CACCGCTGGT AGCGGTGGTT TTTTTGTTTG CAAGCAGCAG 4321 ATTACGCGCA GAAAAAAAGG ATCTCAAGAA GATCCTTTGA TCTTTTCTAC GGGGTCTGAC 4381 GCTCAGTGGA ACGAAAACTC ACGTTAAGGG ATTTTGGTCA TGAGATTATC AAAAAGGATC 4441 TTCACCTAGA TCCTTTTAAA TTAAAAATGA AGTTTTAAAT CAATCTAAAG TATATATGAG 4501 TAAACTTGGT CTGACAGTTA CCAATGCTTA ATCAGTGAGG CACCTATCTC AGCGATCTGT 4561 CTATTTCGTT CATCCATAGT TGCCTGACTC CCCGTCGTGT AGATAACTAC GATACGGGAG 4621 GGCTTACCAT CTGGCCCCAG TGCTGCAATG ATACCGCGAG ACCCACGCTC ACCGGCTCCA 4681 GATTTATCAG CAATAAACCA GCCAGCCGGA AGGGCCGAGC GCAGAAGTGG TCCTGCAACT 4741 TTATCCGCCT CCATCCAGTC TATTAATTGT TGCCGGGAAG CTAGAGTAAG TAGTTCGCCA 4801 GTTAATAGTT TGCGCAACGT TGTTGCCATT GCTACAGGCA TCGTGGTGTC ACGCTCGTCG 4861 TTTGGTATGG CTTCATTCAG CTCCGGTTCC CAACGATCAA GGCGAGTTAC ATGATCCCCC 4921 ATGTTGTGCA AAAAAGCGGT TAGCTCCTTC GGTCCTCCGA TCGTTGTCAG AAGTAAGTTG 4981 GCCGCAGTGT TATCACTCAT GGTTATGGCA GCACTGCATA ATTCTCTTAC TGTCATGCCA 5041 TCCGTAAGAT GCTTTTCTGT GACTGGTGAG TACTCAACCA AGTCATTCTG AGAATAGTGT 5101 ATGCGGCGAC CGAGTTGCTC TTGCCCGGCG TCAATACGGG ATAATACCGC GCCACATAGC 5161 AGAACTTTAA AAGTGCTCAT CATTGGAAAA CGTTCTTCGG GGCGAAAACT CTCAAGGATC 5221 TTACCGCTGT TGAGATCCAG TTCGATGTAA CCCACTCGTG CACCCAACTG ATCTTCAGCA 5281 TCTTTTACTT TCACCAGCGT TTCTGGGTGA GCAAAAACAG GAAGGCAAAA TGCCGCAAAA 5341 AAGGGAATAA GGGCGACACG GAAATGTTGA ATACTCATAC TCTTCCTTTT TCAATATTAT 5401 TGAAGCATTT ATCAGGGTTA TTGTCTCATG AGCGGATACA TATTTGAATG TATTTAGAAA 5461 AATAAACAAA TAGGGGTTCC GCGCACATTT CCCCGAAAAG TGCCACCTGA CGTC

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其他哺乳动物表达载体:

pCHO1.0 pBApo-CMV-Pur pOPRSVI

pcDNA3.1/His C pcDNA5/FRT/V5-His-TOPO pREP4

pcDNA3.1/His B pcDNA5/FRT/TO-TOPO pDual-GC

pcDNA3.1/His A pcDNA5/TO pBK-RSV

pIRESpuro3 pcDNA5/FRT/TO pBK-CMV

pIRES2-EGFP pcDNA5/FRT pBI-CMV4

pTT5 pFLAG-CMV2 pcDNA4/TO/Myc-His/LacZ pNFkB-DD-tdTomato pcDNA3.1/CT-GFP-TOPO pOPI3CAT

pBI-CMV5 pcDNA3.1/NT-GFP-TOPO pGene/V5-His B pSEAP2-Basic pOptiVEC-TOPO pSwitch

pSEAP2-Control pCMV-MEKK1 pCMVLacI

pBI-CMV3 pCMV-MEK1 pVgRxR

pBI-CMV2 pCMV-PKA pIND

pBI-CMV1 pcDNA6.2/nTC-Tag-DEST pTRE3G-Luc

pNFκB-MetLuc2-Reporter pcDNA6.2/cTC-Tag-DEST pTRE3G

pCRE-MetLuc2-Reporter pcDNA3.2/V5/GW/D-TOPO pTRE2-hygro

pAcGFP1-Actin pcDNA6.2/V5/GW/D-TOPO pTRE-Tight

pAcGFP1-N In-Fusion Ready pcDNA6.2/nGeneBLAzer-GW/D-TOPO pTK-hyg

pAcGFP1-C3 pcDNA6.2/C-YFP-DEST pTet-On

pAcGFP1-C pcDNA6.2/cGeneBLAzer-DEST pTet-Off

pAcGFP1-p53 pcDNA6/V5-His A pTet on advanced pAcGFP1-Mito pcDNA6/V5-His B pRevTRE

pAcGFP1-Mem pcDNA6/V5-His C pRevTet-On

pAcGFP1-Lam pcDNA6/myc-His C pRevTet-Off

pAcGFP1-Golgi pcDNA6/myc-His A pCMV-Tet3G

pAcGFP1-F pcDNA6/myc-His B pTRE2

pAcGFP1-Hyg-C1 pcDNA6.2/nGeneBLAzer-DEST pBD-NF-κB

pAsRed2-N1 pcDNA4/HisMax-TOPO pCMV-AD

ptdTomato-N1 pcDNA6.2/nLumio-DEST pCMV-BD

pCMV-tdTomato pcDNA6.2/cLumio-DEST pBIND-Id Control

pCRE-DD-tdTomato pcDNA4/myc-His C pBIND

pCMV-DsRed-Express2 pcDNA4/HisMax C pG5 luciferase

pEF1α-tdTomato pcDNA4/HisMax A pACT-MyoD

pCRE-hrGFP c-Flag pcDNA3 pACT

ptdTomato-C1 pcDNA4/HisMax B pCMV-SPORT6 pAsRed2-C1 pcDNA4/myc-His B pGL4.13

pGL3-Promoter pcDNA4/myc-His A pGL4.19

pGL3 basic pcDNA4/His C pGL4.26

pAcGFP1-C2 pcDNA4/His B pGL4.20

pAcGFP1-C1 pcDNA4/His A pGL4.29

pAcGFP1-N3 pcDNA6/TR pGL4.30

pAcGFP1-N2 pcDNA4/TO/Myc-His A pGL4.27

pAcGFP1-N1 pcDNA4/TO pGL4.75

pAcGFP1-C In-Fusion Ready pcDNA4/TO/Myc-His B pGL4.10

pCRE-DD-AmCyan1 pcDNA4/TO/Myc-His C pGRN145

pNFkB-DD-AmCyan1 pcDNA3.3-TOPO pSecTag2 A pDsRed2-Bid pBudCE4.1 pEBVHis B pDsRED2-Mito pFLAG-CMV-4 pEBVHis A

pDD-AmCyan1 Reporter pFLAG-CMV-3 pCMV-Tag 3C pAmCyan1-N1 pFLAG-CMV-2 pCMV-Tag 3A pAmCyan1-C1 pFLAG-CMV-5a pCMV-Tag 3B

pEF1α-IRES-DsRed-Express2 p3XFLAG-CMV-9 pCMV-Tag 5C

pEF1α-DsRed-Monomer-N1 p3xFLAG-CMV-10 pCMV-Tag 5A pDsRED-Monomer-N1 p3XFLAG-CMV-8 pCMV-Tag 4A pDsRed-Express-N1 p3XFLAG-CMV-7.1 pCMV-Tag 5B

p3XFLAG-CMV-7 pDsRed-Monomer-N In-Fusion Ready pCMV-Tag 4B pDsRed-Express-C1 p3XFLAG-CMV-13 pCMV-Tag 2C pIRES2-ZsGreen1 p3XFLAG-CMV-14 pCMV-Tag 2B pDsRed-Express2-C1 plRES2-ZsGreen1 pCMV-Tag 2A pDsRed-Express2-N1 pBApo-EF1α-pur pCMV-LacZ

pEF1α-DsRed-Express2 pBApo-EF1α-neo pCMV-Myc

pIRES2-DsRed-Express pBApo-CMV pEF1α-IRES-AcGFP1 pIRES2-DsRed-Express2 pBApo-CMV-neo pEF1α-IRES-ZsGreen1 pIRES-hrGFP-1a pIRES-EGFP pEF1α-AcGFP1-N1 pIRESneo2 pIRESneo3 pIRES2-DsRed2 pIRESneo pDsRed-Monomer pIRES2-AcGFP1 pIREShyg3 pIRES

八体外哺乳动物细胞染色体畸变试验

九、体外哺乳动物细胞染色体畸变试验 In Vitro Mammalian Cells Chromosome Aberration Test 1 范围 本规范规定了体外哺乳动物细胞染色体畸变试验的基本原则、要求和方法。 本规范适用于检测化妆品原料及其产品的致突变性。 2 规范性引用文件 OECD Guidelines for Testing of Chemicals ( No.473, July 1997) 3试验目的 本试验是用于检测培养的哺乳动物细胞染色体畸变,以评价受试物致突变的可能性。 4 定义 染色体型畸变(Chromosome-type aberration):染色体结构损伤,表现为在两个染色单体相同位点均出现断裂或断裂重组的改变。 染色单体型畸变(Chromatid-type aberration):染色体结构损伤,表现为染色单体断裂或染色单体断裂重组的损伤。 染色体数目改变(Numerical aberration):所用细胞株的正常染色体数目的变化。 结构畸变(Structural aberration):在细胞分裂的中期相阶段,用显微镜检出的染色体结构改变,表现为缺失、断片、互换等。 有丝分裂指数(Mitotic index):中期相细胞数与所观察的细胞总数之比值;是一项反映细胞增殖程度的指标。 5 试验基本原则 在加入和不加入代谢活化系统的条件下,使培养的哺乳动物细胞暴露于受试物中。用中期分裂相阻断剂(如秋水仙素或秋水仙胺)处理,使细胞停止在中期分裂相,随后收获细胞,制片,染色,分析染色体畸变。 6 试验方法 6.1 试剂和受试物制备 6.1.1 阳性对照物:可根据受试物的性质和结构选择适宜的阳性对照物,阳性对照物应是已知的断裂剂,能引起可检出的、并可重复的阳性结果。当外源性活化系统不存在时,可使用甲磺酸甲酯(methyl methanesulphonate (MMS))、甲磺酸乙酯(ethyl methanesulphonate(EMS))、乙基亚硝基脲(ethyl nitrosourea)、丝裂霉素C(mitomycin C)、4-硝基喹啉-N-氧化物(4-nitroquinoline-N-oxide)。当外源性活化系统存在时,可使用苯并(a)芘[benzo(a)pyrene]、环磷酰胺(cyclophosphamide)。 6.1.2 阴性对照物:应设阴性对照,即仅含和受试物组相同的溶剂,不含受试物,其它处理和受试物组完全相同。此外,如未能证实所选溶剂不具有致突变性,溶剂对照与本实验室空白对照背景资料有明显差异,还应设空白对照。 6.1.3 受试物 6.1.3.1 受试物的配制:固体受试物需溶解或悬浮于溶剂中,用前稀释至适合浓度;液体受试物可以直接加入试验系统和/或用前稀释至适合浓度。受试物应在使用前新鲜配制,否则就必

型循环流化床蒸汽锅炉使用说明书教学提纲

YG-130/9.8-M型循环流化床蒸汽锅炉 使用说明书 (阳泉专用) 图号:55300-0-0 编号:55300S Y S 编制: 校对: 审核: 标审: 审定: 济南锅炉集团有限公司 二00四年十月

目录 一、概述 二、锅炉机组启动应具备的条件 三、锅炉机组启动前的检查与准备 四、锅炉机组启动方法与步骤 五、整定安全阀 六、锅炉机组的运行 (一)水、汽监测与调整 (二)锅炉受热面的吹灰 (三)锅炉的排污 (四)燃烧调整 七、锅炉的压火与热启动 八、锅炉机组的正常停止 (一)停炉前的准备工作 (二)锅炉的停炉 九、故障处理 十、停炉后的冷态再启动 十一、启动中的组织与分工 十二、压火注意事项

一、概述 该循环流化床锅炉,是济南锅炉集团有限公司开发的一种高效、低污染的新型锅炉。 本说明书着重论述的是锅炉首次启动的条件、步骤、方法。 锅炉安装完毕后的首次启动是对各设备各系统设计、安装的一次全面检查,通过试运,暴露和消除设备的缺陷和问题,为机组投产做好准备,通过启动如烘炉、煮炉、吹管等,使运行人员通过操作设备,熟悉系统,积累经验,检验各种联锁保护、自动系统投入率,同时也是对循环流化床系统、燃烧系统、上煤除灰、除渣、辅机等的一次运行考核。在整定安全阀等工作结束后,转入七十二小时试运。 二、锅炉机组启动应具备的条件 1、试运的现场条件 (1)场地基本平整,消防、交通及人行道路畅通。厂房各层地面起码应做好粗地面,最好使用正式地面,试运现场应有明显标志和分界,危险区应有围栏和警告标志。 (2)试运区的施工脚手架全部拆除,现场清扫干净,保证运行安全操作。 (3)试运区的梯子、步道、栏杆、护板应按设计安装完毕,正式投入使用。 (4)新扩建部分的排水沟道畅通、沟道及孔洞盖板齐全。 (5)试运范围的工业、消防及生活用水系统应能够投入正常使用,并备有足够的消防器材。 (6)试运现场具有充足的正式照明。事故照明应能在故障时及时自动投入。 (7)各运行岗位都应有正式的通讯装置。根据试运要求增设临时岗位,并应有可靠的通讯联络设施。 (8)严冬季节,应对有关阀门和管道采取必要的防冻措施,以防冻裂。 2、下列系统中的设备、管道、阀门等安装完毕,保温完成。 (1)锅炉范围内管道、汽水系统、疏放水、放汽系统、加药系统、辅用蒸汽系统、排污系统。

#130t_h高温高压流化床说明书

目录 一、锅炉基本特性 (1) 1、主要工作参数 (1) 2、设计燃料 (2) 3、安装和运行条件 (3) 4、锅炉基本尺寸 (3) 二、锅炉结构简述 (4) 1. 炉膛水冷壁 (4) 2. 高效蜗壳式汽冷旋风分离器 (5) 3. 锅筒及锅筒内部设备 (6) 4. 燃烧设备 (7) 5. 过热器系统及其调温装置 (9) 6. 省煤器 (10) 7. 空气预热器 (10) 8. 锅炉范围内管道 (11) 9. 吹灰装置 (11) 10. 密封装置 (11) 11. 炉墙 (12) 12. 构架 (12) 13.膨胀系统 (13) 14.锅炉水压试验 (13) 15. 锅炉过程监控 (13) 三、性能说明 (15) 一、锅炉基本特性 1、主要工作参数 额定蒸发量 130 t/h 额定蒸汽温度 540 ℃

额定蒸汽压力(表压) 9.81 MPa 给水温度 215 ℃ 锅炉排烟温度~142 ℃ 排污率≤2 % 空气预热器进风温度 20 ℃ 锅炉计算热效率≥88.58 % 锅炉保证热效率≥85 % 燃料消耗量 25.6 t/h 一次热风温度 202 ℃ 二次热风温度202 ℃ 一、二次风量比 55:45 循环倍率 25 ~ 30 脱硫效率(钙硫摩尔比为2.5时)≥ 80 % 2、设计燃料 (1)煤质分析资料: 的 入 炉 粒 度 要 求: =2mm,详见附图。粒度范围0~10mm,50%切割粒径d 50 (2)点火及助燃用油 锅炉点火用油:0#轻柴油

(3)脱硫剂特性 石灰石作为脱硫剂,外购成品石灰粉,粒度0-1mm,详见附图;其成分: CaCO 3:92%,MgCO 3 :3.5%,酸不溶物+R 2 O 3 :4.5%。 3、安装和运行条件 地震烈度抗震设防烈度为7度 海拔高度: 347.5m 锅炉给水满足GB/T12145-1999《火力发电机组及蒸汽动力设备水汽质量》标准。 4、锅炉基本尺寸 炉膛宽度(两侧水冷壁中心线间距离) 7010mm 炉膛深度(前后水冷壁中心线间距离) 4530mm 炉膛顶棚管标高 34500mm 锅筒中心线标高 37700mm 锅炉最高点标高 43000mm 运转层标高 8000mm 操作层标高 5200mm 锅炉宽度(两侧柱间中心距离) 9400mm 锅炉深度(柱Z 1与柱Z 4 之间距离) 19900mm

用于生产生物制品的建库哺乳动物细胞基质的制备_鉴定和检测.

8Duan D,Yue Y,Yan Z,et al.A new dual-vector approach to enh ance r ecom binant adeno-as sociated virus-mediated gene exp ress ion thr ou gh in termolecular cis activation.Nat M ed, 2000,6:595-598. 9Gao GP,Lu F,S anm iguel JC,et al.Rep/Cap gene amplification an high-yield pr odu ction of AAV in an A549cell line exp ress ing Rep/Cap.M ol T her,2002,5(5Pt1:644-649. 10Collaco RF,Cao X,T rem pe JP.A helper virus-free pack aging sys tem for r ecom binant adeno-as sociated virus vectors.Gene, 1999,238:397-405. 11鲁晓春,李小鹰,马鑫,等.腺相关病毒载体对心肌细胞感染和外源基因表达的作用.中国临床康复,2003,7:4056-4057. 12Hoshijima M,Ikeda Y,Iw an aga Y,et al.Chr on ic s uppression of heart-failure progression by a pseudo ph os phorylated mutan t of phos pholamban via in vivo card iac rAAV gene delivery.Nat M ed,2002,8:864-871. 13Bartlett J S,W ilcher R,Samulski RJ.Infectiou s en try pathw ay of adeno-ass ociated vir us and adeno-ass ociated virus vectors.J Virol,2000,74:2777-2785. 14黄志军,袁洪,曾钧发,等.重组腺相关病毒载体介导人血管内皮生长因子165 基因对缺血心肌血管新生的影响.中国动脉硬化杂志,2004,12:627-631.15S ugiyam a A,Hottori S,Tanaka S,et al.Defective aden oass ociated viral-m ediated trans fection of insulin gene by direct injection into liver parenchym a decreases b lood glucose of d iabetic mice.Horm M etab Res,1997,29:599-603. 16Yang Z,Chen M,Wu R,et al.Su ppres sion of autoimmune diabetes by viral IL- 10gene transfer.J Immunol,2002,168: 6479-6485. 17S hklyaev S,As lanidi G,T ennan t M,et al.Sus tained p eriph eral expression of trans gene adiponectin offs ets the development of diet-induced obesity in rats.Proc Natl Acad S ci USA,2003, 25:14217-14222.

ZDFR流化床热风炉使用说明书

ZDFR流化床热风炉使用说明书 2004-06-10点击: 1539 一、准备工作: 1、准备好司炉工具:钩、耙、锹、铲、推车等。 2、准备好点火用材料: ●木柴100公斤左右,直径<100mm,长度500mm左右。 ●优质碎烟煤100-200公斤,筛选1-6mm粒径为宜。 ●木炭,废油或废棉纱适量。 ●黄砂或炉渣(沸渣)0.5m3,炉渣粒径<10mm。 3、逐台检查配套设备:风机、提升机、破碎机及圆盘喂料机等运行情况是否正常。 4、检查控制柜连线及各仪表、传感器情况是否正常。 5、检查布风板上风帽通风孔是否通畅,将炉床清理干净。 6、在炉床上面铺上厚150mm左右的干粗黄砂,打开风机让炉料沸腾后逐渐减小风量至黄砂成鼓泡状,观察床料是否腾跃均匀;然后停风机观察床料是否平坦。

二、点火: 1、在炉床上加铺厚度250mm左右的过筛干粗黄砂,并同时加入占其总量8-10%,粒度<10mm的优质煤。若用干煤渣做床料,则视渣的含煤量多少适当减少加入的煤量。然后开启风机使床料混合均匀、平整。 2、视炉型大小加入适量木柴,以预热炉膛和加热底料,底料上有足够火炭层后,再把未烧透的木柴钩出,将赤红火炭层扒平。 3、开动风机,瞬间将风压升至3500Pa后突然关闭风门,使火炭、砂、煤三者混合均匀,再徐徐开启风门,使炉料均匀蠕动,并不断搅拌均化,扒出焦块,待全部炉料燃烧成桔黄色后,加大风门开度,使之沸腾燃烧。 ★要点:加热床料到灼热! 三、运行: 流化床炉的炉温变化是非常快的,很短时间就可能造成熄火或结焦,因此司炉人员必须密切监视仪表及炉膛燃烧情况,注意调整风量、风压、给煤量以让沸腾炉膛保持在一定温度范围内正常燃烧,并利用增减风、煤量来控制温度及供热大小。 1、送风量:

哺乳动物细胞悬浮驯化方法研究进展

龙源期刊网 https://www.sodocs.net/doc/f915959810.html, 哺乳动物细胞悬浮驯化方法研究进展 作者:陆陈晨谭树华 来源:《科学与财富》2018年第13期 摘要:哺乳动物细胞表达系统是药用蛋白的主要表达方式,传统的贴壁细胞培养有诸多不利,本文介绍常用的贴壁细胞悬浮驯化的方法,通过将贴壁细胞驯化成悬浮细胞,提高哺乳动物细胞表达水平,降低生产成本。 关键词:哺乳动物细胞;驯化;无血清培养 重组蛋白表达是研究蛋白质功能与结构、药物筛选以及后续应用的关键环节,常规的蛋白表达系统有原核表达和真核表达两大类。现代医药工业的快速发展需要重组蛋白拥有接近天然蛋白分子的复杂结构、理化性质和生物功能,特别是糖蛋白及抗体类药物。这就要求表达的重组蛋白需要正确的翻译后修饰、组装和折叠,这是原核表达系统所欠缺的[1-2]。真核表达系统包括酵母表达系统、昆虫杆状病毒表达系统和哺乳动物细胞表达系统,其中以哺乳动物细胞表达系统较为常用。 1 贴壁细胞表达外源蛋白的缺点 传统细胞培养或表达外源重组蛋白采用贴壁细胞进行表达,这种表达方式虽然操作简便,但细胞密度和表达量较低,并且培养时需要加入血清,亦具很多缺点[3]: 1.1 血清组分复杂,含有多种杂蛋白不利于目的蛋白纯化; 1.2 血清批间差异较大,不同批次的血清浓度不稳定,影响工艺的连贯性; 1.3 血清中可能携带有未充分灭活的动物病毒或支原体,有细胞污染和传染人类的风险。 2 细胞无血清悬浮培养的优势 细胞无血清悬浮培养由于具有培养基的化学成分限定、批间产品质量稳定、简化下游生产、生理环境易于控制等优点,在重组蛋白表达、单克隆抗体制备和疫苗生产等中应用广泛。 3 贴壁细胞驯化成悬浮细胞的方法 3.1 分子生物学手段改造 贴壁细胞驯化成悬浮细胞通常有两种方法,一种是通过分子生物学手段,改造贴壁细胞。Noelle-Anne Sunstrom, Sugiyono 等人通过将编码胰岛素样生长因子 I(IGF-I)和转铁蛋白的基因稳定整合到CHO-K1细胞系的基因组中,使用 lac 操纵子/阻遏子系统调控 IGF-I 基因的表

pGL3-Promoter哺乳动物表达载体说明

pGL3-Promoter 编号 载体名称 北京华越洋生物VECT6010 pGL3--‐Promoter pGL3--‐Promoter载体基本信息 载体名称: pGL3-promoter, pGL3promoter 质粒类型: 荧光素酶报告系统载体 高拷贝/低拷贝: 高拷贝 启动子: SV40 克隆方法: 多克隆位点,限制性内切酶 载体大小: 5010bp 5' 测序引物及序列: RV primer3:CTAGCAAAATAGGCTGTCCC 3' 测序引物及序列: GLprimer2: CTTTATGTTTTTGGCGTCTTCCA 载体标签: -- 载体抗性: 氨苄 筛选标记: -- 备注: 用于快速定量评估影响哺乳动物细胞特定基因表达的因子及其影响能力。 稳定性: 稳定 组成型: 非组成型 病毒/非病毒: 非病毒 pGL3--‐Promoter载体质粒图谱和多克隆位点信息

pGL3--‐Promoter载体序列 ORIGIN 1 GGTACCGAGC TCTTACGCGT GCTAGCCCGG GCTCGAGATC TGCGATCTGC ATCTCAATTA 61 GTCAGCAACC ATAGTCCCGC CCCTAACTCC GCCCATCCCG CCCCTAACTC CGCCCAGTTC 121 CGCCCATTCT CCGCCCCATC GCTGACTAAT TTTTTTTATT TATGCAGAGG CCGAGGCCGC 181 CTCGGCCTCT GAGCTATTCC AGAAGTAGTG AGGAGGCTTT TTTGGAGGCC TAGGCTTTTG

110吨流化床锅炉设计说明书

太原锅炉集团有限公司设计文件锅炉设计说明 书 目录 前言 (1) 1.锅炉概述 (1) 2.锅炉基本特性 (2) 2.1. 主要工作参数 (2) 2.2. 设计燃料 (2) 2.3. 锅炉基本尺寸 (3) 3.锅炉主要部件结构简述 (4) 3.1锅筒 (4) 3.2 水冷系统 (5) 3.3 过热器系统及汽温调节 (6) 3.4 省煤器 (6) 3.5 空气预热器 (7) 3.6燃烧设备 (7) 3.7 分离回料系统 (8) 3.8 锅炉范围内管道 (9) 3.9 构架 (10) 3.10 炉墙 (10) 3.11 膨胀设计 (10) 3.12 防磨设计 (11) 3.13 密封设计 (11) 3.14水容积表 (12) 4.锅炉设计、制造、检验、安装执行规范 (12) 5.特别说明 (12)

太原锅炉集团有限公司设计文件锅炉设计说明书 前言 循环流化床燃烧是一种新型的高效、低污染的清洁燃煤技术,其主要特点是锅炉炉膛内含有大量的物料,在燃烧过程中大量的物料被烟气携带到炉膛上部,经过布置在炉膛出口的分离器,将物料与烟气分开,并经过非机械式回送阀将物料回送至床内,多次循环燃烧。由于物料浓度高,具有很大的热容量和良好的物料混合,一般每公斤烟气可携带若干公斤的物料,这些循环物料带来了高传热系数,使锅炉热负荷调节范围广,对燃料的适应性强。 循环流化床锅炉具有燃料适应性广、环保性能优异、负荷调节范围广、灰渣易于综合利用等优点,因此在世界范围内得到了迅速发展。随着环保要求日益严格,普遍认为,循环流化床锅炉是目前最实用和可行的高效低污染燃煤设备之一。在循环流化床燃烧技术快速发展的今天,我们对循环流化床锅炉的磨损、耐火材料、辅机系统三大问题进行研究解决后,使CFB锅炉的可用率得到很大提高。 太原锅炉集团与清华大学通过多年的密切合作,深入分析了常规循环流化床锅炉面临的问题和挑战,提出了低能耗循环流化床锅炉设计理论和方法,形成了第二代节能型循环流化床锅炉全套设计导则,在此基础上同时完成了第二代节能型循环流化床锅炉的产品结构设计。使第二代循环流化床锅炉产品具有供电煤耗低、厂用电率低、锅炉可用率高的技术优势,其技术关键在于分离器效率提高后,循环物料中的细灰份额增加,适当减少床存量低床压运行依然可以保证锅炉正常运行。床存量降低后,二次风区域物料浓度降低,二次风穿透扰动效果增强,炉膛上部气固混合效果得以改进,提高了锅炉燃烧效率,降低了锅炉机组的供电煤耗;床存量降低后,物料流化需要的动力减小,锅炉一、二次风机的压头降低,风机电耗下降,从而降低锅炉机组的厂用电率;床存量降低后,炉膛下部物料浓度大幅度减小,从而可以减轻炉膛下部浓相区特别是防磨层与膜式壁交界处的磨损,提高锅炉机组的可用率。 本循环流化床锅炉运用了经过实践检验过的第二代节能型循环流化床锅炉全套设计导则进行设计。在燃用设计煤种时,锅炉能够在定压时50~100%额定负荷范围内过热器出口蒸汽保持额定参数;在燃用设计煤种或校核煤种时,在30~100%额定负荷范围内锅炉能够稳定燃烧。 1.锅炉概述 本锅炉为高温高压,单锅筒横置式,单炉膛,自然循环,全悬吊结构,全钢架π型布置。锅炉采用室外布置,运转层设置在8m标高。 锅炉主要由炉膛、绝热旋风分离器、自平衡回料阀和尾部对流烟道组成。炉膛采用膜式水冷壁,锅炉中部是绝热旋风分离器,尾部竖井烟道布置两级四组对流过热器,过热器下方布置三组光管省煤器及一、二次风各三组空气预热器。 在燃烧系统中,给煤机将煤送入落煤管进入炉膛,锅炉燃烧所需空气分别由一、二次风机提供。 1

pAcGFP1-N1哺乳动物表达载体说明

pAcGFP1-N1 编号 载体名称 北京华越洋生物VECT6107 pAcGFP1--‐N1 pAcGFP1--‐N1载体基本信息 载体名称: pAcGFP1-N1 质粒类型: 哺乳动物细胞表达载体;荧光报告载体高拷贝/低拷贝: 高拷贝 克隆方法: 限制性内切酶,多克隆位点 启动子: CMV IE 载体大小: 4726 bp 5' 测序引物及序列: -- 3' 测序引物及序列: -- 载体标签: AcGFP1 (C-端) 载体抗性: 卡那霉素 筛选标记: 新霉素(Neomycin) 克隆菌株: DH5α, HB101 宿主细胞(系): 常规细胞系(293、CV-1、CHO等) 备注: 哺乳动物载体pAcGFP1-N1组成型表达C端AcGFP融合蛋白;AcGFP1与GFP相比,密码子经过了优化,更适合在哺乳动物细胞中高水平表达,同时也增强了亮度。 稳定性: 稳表达或瞬表达 组成型/诱导型: 组成型 病毒/非病毒: 非病毒 pAcGFP1--‐N1载体质粒图谱和多克隆位点信息

pAcGFP1-N1载体描述 pAcGFP1-N1 encodes a green fluorescent protein (GFP) from Aequorea coerulescens (excitation maximum = 475 nm; emission maximum = 505 nm). The coding sequence of the AcGFP1 gene contains silent base changes, which correspond to human codon-usage preferences (1). The MCS in pAcGFP1-N1 is between the immediate early promoter of CMV (PCMV IE) and the AcGFP1 coding sequences. Genes cloned into the MCS will be expressed as fusions to the N-terminus of AcGFP1 if they are in the same reading frame as AcGFP1 and there are no intervening stop codons. SV40 polyadenylation signals downstream of the AcGFP1 gene direct proper processing of the 3' end of the AcGFP1 mRNA. The vector backbone also contains an SV40 origin for replication in mammalian cells expressing the SV40 T antigen. A neomycin-resistance cassette (Neor), consisting of the SV40 early promoter, the neomycin/kanamycin resistance gene of Tn5, and polyadenylation signals from the Herpes simplex virus thymidine kinase (HSV TK) gene, allows stably transfected eukaryotic cells to be selected using G418. A bacterial promoter upstream of the gene expresses kanamycin resistance in E. coli. The pAcGFP1-N1 backbone also provides a pUC origin of replication for propagation in E. coli and an f1 origin for single-stranded DNA production. Fusions to the N terminus of AcGFP1 retain the fluorescent properties of the native protein allowing the localization of the fusion protein in vivo . The target gene should be cloned into pAcGFP1-N1 so that it is in frame with the AcGFP1 coding sequences, with no intervening in-frame stop codons. The inserted gene should include the initiating ATG codon. The recombinant AcGFP1 vector can be transfected into mammalian cells using any standard transfection method. If required, stable transformants can be selected using G418 (2). pAcGFP1-N1 can also be used simply to express AcGFP1 in a cell line of interest (e.g., as a transfection marker). Propagation in E. coli Suitable host strains: DH5α, HB101 and other general purpose strains. Single-stranded DNA production requires a host containing an F plasmid such as JM101 or XL1-Blue. Selectable marker: plasmid confers resistance to kanamycin (30 μg/ml) to E. coli hosts. E. coli replication origin: pUC Copy number: ≈500 Plasmid incompatibility group: pMB1/ColE1

循环流化床锅炉使用说明书

一、概述 该循环床锅炉是新开发的一种高效低污染的新型锅炉。 锅炉安装完毕后的首次起动是对各设备各系统设计、安装的一次全面检查,通过试运,暴露和消除设备的缺陷和问题,为机组投产做好准备,启动前应根据有关规程和设备技术文件制定符合设计、设备特点的启动试运调整方案及措施,有计划、按步骤进行。通过启动和如烘炉、煮炉、吹管等,使运行人员通过操作设备,熟悉系统,积累经验,检验各种联锁保护,自动系统投入率,同时也是对循环流化床系统、燃烧系统、上煤除灰除渣、辅机等的一次运行考核,在整定安全阀等工作结束后,转入七十二小时试运。 二、锅炉机组启动前应具备的条件 1.试运现场的条件 ⑴场地基本平整,消防交通及人行道路畅通。厂房各层地面起码应做好粗地面,最好使用正式地面,试运现场应有明显标志和分界,危险区应有围栏和警告标志。 ⑵试运区的施工脚手架应全部拆除,现场清扫干净,保证运行安全操作。 ⑶试运区的梯子、步道、栏杆、护板应按设计安装完毕,正式投入使用。 ⑷新扩建部分的排水沟道畅通,沟道及洞盖板齐全。 ⑸试运范围的工业、消防及生活用水系统应投入正常使用,并备有足够的消防器材。 ⑹试运现场具有充足的正式照明。事故照明应能在故障时及时自动投入。 ⑺各运行岗位都有正式的通风装置。根据试运要求增设的临时岗位、并应有可靠的通风联络设施。 ⑻严冬季节,应对有关阀门和管道采取必要的防冻措施,以防冻裂。 2.下列系统中的设备、管道、阀门等安装完毕,保温完成。 锅炉范围内管道、汽水系统、疏放水、放汽系统、加药系统、辅用蒸汽系统、排污系统。 3.下列设备经调试合格 ⑴一、二次风机,引风机经调试结束并符合点火要求。 ⑵热工测量,控制和保护系统的调试已符合点火要求。 4.漏风试验

哺乳动物细胞冷冻保存

哺乳动物细胞冷冻保存 主要目的: (1)保存种子细胞,以便随时取用。这是保存细胞的最主要目的。 (2)减少细胞被微生物污染的危险性。 (3)减少细胞之间交叉污染的危险性。 (4)减少细胞因传代培养而引起的遗传变异和形态改变。 (5)避免有限细胞系出现衰老或恶性转化。 (6)降低人力和物力。 冷冻保存要点: (1)冷冻过程要缓慢。需要冷冻保存的细胞先在4℃冰箱中放置30-60 分钟;然后转入-20℃,放置30 分钟;然后再转入-80℃放置16-18 小时(或过夜);最后放入液氮中长期保存。有条件的地方,可用程控降温仪,按每分钟-1 到-3℃速度降温,一直到-80℃以下,然后直接放入液氮中长期保存。 (2)冻存细胞必须处在对数生长期,活力大于90%,无微生物污染。 (3)细胞浓度控制在:1×107-5×107/ml。 (4)使用高浓度血清或蛋白保护剂。一般情况下,用于冷冻保存完全细胞生长培养液中血清浓度大于20%。 (5)使用合适的细胞冷冻保护剂,以保护细胞在冷冻过程中免受冰晶破坏。目前,最常用的冷冻保护剂是DMSO(二甲基亚砜),使用终浓度为5-10%。但是,有些细胞系不能用DMSO 作为冷冻保护剂,如人白血病细胞系HL-60。因为,DMSO 能诱导HL-60 细胞分化。在这种情况下,可选用其它冷冻保护剂,如甘油(glycele),羟乙基淀粉等。 特别注意: (1)细胞在冷冻过程中在-20℃冰箱内放置时间不可超过1 小时,以防止冰晶过大而破坏细胞。也可跳过-20℃这一步骤直接放入-80℃冰箱中,但这样做细胞存活率要低一些。 (2)DMSO 稀释时会释放大量热量。因此,DMSO 不能直接加到细胞液中,必须事先配制。 (3)DMSO 必须是细胞培养级别的。新买的DMSO 本身处于无菌状态,第一次开瓶后应立即少量分装于无菌试管或瓶中,4℃保存。避免反复冻融造成DMSO 裂解产生有害物质。并可减少污染机会。如要过滤DMSO,必须选用耐DMSO 的尼龙滤膜。细胞冷冻保存液主要成分:冷冻保护剂,基础培养液,血清或蛋白。 常用细胞冷冻保存液: (1)10%DMSO +完全细胞生长培养液(20%血清+基础培养液) (2)10%甘油+完全细胞生长培养液(20%血清+基础培养液)悬浮细胞冷冻保存操作程序(液氮保存法): (1)取对数生长期细胞培养物,离心200-400g 5 分钟。用粘附(贴壁)细胞冷冻保存操作程序(液氮保存法): (1)冷冻保存细胞的解冻与复苏要点:(1)快速解冻。冻存细胞从液氮中取出后,应立即放入37℃水浴中,轻轻摇动冷冻管,使其在1 分钟内全部融化(不要超过3 分钟)。 (2)解冻操作过程动作要轻。由于冷冻保存过的细胞变得非常脆弱,不仅解冻速度要快,而且动作要轻。一般情况下,解冻后的细胞可直接接种到含完全生长培养液的细胞培养瓶中直接进行培养(1ml 冻存细胞液加入到25-30ml 新鲜完全培养液中),24 小时后再用新鲜完全培养 DMSO。如果,细胞对冷冻保护剂特别敏感,那么,解冻后的细胞应先通过离心去除冷冻保护剂,然后再接种到含完全生长培养液的培养瓶中。 特别注意:

哺乳动物细胞蛋白表达FAQ

哺乳动物细胞蛋白表达FAQ 1、什么是质粒超螺旋,超螺旋对提高表达量有什么帮助?答:闭环DNA(closed circular DNA)没有断口的双链环状DNA,亦称为超螺旋DNA ,超螺旋比例90%以上是比较理想的真核表达质粒,较低的超螺旋比例会降低表达量近50%以上。 2、CHO细胞与293细胞有什么区别? 答:CHO细胞即中国仓鼠卵巢细胞,是目前表达外源蛋白最多最成功的细胞之一。该细胞属于成纤维细胞,是一种非分泌型细胞,自身很少分泌内源蛋白,因此有利于目的蛋白的纯化分离;相较于其他细胞类型,CHO细胞是治疗性蛋白生产的主要宿主细胞的原因如下:(1)能在化学成分限定和无血清悬浮培养中稳定生长, (2)该细胞基因组信息明确,在人类致病病毒应答方面表现出合理的安全性, (3)能够表达与人相似的翻译后修饰。 此外,CHO细胞表达系统的最重要优势之一是能够容易的得到基因改造的细胞。然而,因为糖基化模式与人类不完全相同,导致CHO细胞产生的重组蛋白在某些时候仍然表现出免疫原性。 HEK293细胞是真核蛋白表达常用的细胞之一,它具有以下优势:更快的生长速度,更高的生长密度、转染效率高,表达后修饰更接近人体蛋白的结构,可能会有潜在的人病毒污染。

3、常用的哺乳动物细胞蛋白表达系统是什么?原理是什 么? 答:我们常用的系统是2936e细胞配套PTT5(pAZ5)载体 HEK2936E 是在细胞的基因组中整合了EBV病毒的 nuclear antigen 1 (EBNA1), 该蛋白可以保证含有EBV病毒复制原点(EBV ori)的质粒在HEK293E 细胞株中复制,提高质粒的拷贝数,进而提高克隆在此种质粒上的外源基因的表达水平。该系统比常规的293F细胞表达量要高。 4、导致哺乳动物细胞蛋白表达低或者不表达的原因有哪些?哪类蛋白不容易表达? 答:基因是否优化,有的蛋白稀有密码子较多,需要对应表达细胞进 行优化密码子。 蛋白本身就比较难做,比如细胞因子类的,衣壳蛋白类的,膜蛋白。质粒质量:内毒素水平、有无蛋白和核酸污染、超螺旋比例、无盐苯酚等试剂 分子量较大或者太小:大于150KD表达会有一定的难度,小于5KD也会有难度。 有的表达量不低,但是纯化得率低(可溶性差,不挂住,不稳定,易降解) 难表达蛋白:细胞因子、激素、抗菌肽、衣壳蛋白、膜蛋白

哺乳动物细胞表达系统

哺乳动物细胞表达系统 按照宿主细胞的类型,可将基因表达系统大致分为原核、酵母、植物、昆虫和哺乳动物细胞表达系统。与其它系统相比,哺乳动物细胞表达系统的优势在于能够指导蛋白质的正确折叠,提供复杂的N型糖基化和准确的O型糖基化等多种翻译后加工功能,因而表达产物在分子结构、理化特性和生物学功能方面最接近于天然的高等生物蛋白质分子。从最开始以裸露DNA直接转染哺乳动物细胞至今的30余年间,哺乳动物细胞表达系统不仅已成为多种基因工程药物的生产平台,在新基因的发现、蛋白质的结构和功能研究中亦起了极为重要的作用。本文主要从表达系统及其两个组成部分——表达载体和宿主细胞等方面,简要介绍哺乳动物细胞表达系统和相关的研究进展。 研究现状 ①部分蛋白在哺乳动物细胞中的表达已从实验室研究迈向生产或中试生产阶段。 ②已有许多重要的蛋白及糖蛋白利用哺乳动物细胞系统表达和大量制备、生产。如人组织型血纤蛋白酶原激活因子、凝血因子Ⅷ、干扰素、乙肝表面抗原、红血球生成激素、人生长激素、人抗凝血素Ⅲ,集落刺激因子等。有些产品已投入临床应用或试用。 ③虽然经过多年努力,哺乳动物细胞表达系统的表达水平有大幅度增高,但从整个水平上看仍偏低,一般处在杂交瘤细胞单克隆抗体蛋白产率的下限,即1-30μg/l08细胞/24小时。有人认为其限速步骤可嚣是在工程细胞中(对于重组蛋白来讲,常是异源的),重组蛋白的分泌效率较低。 1 表达载体 1.1 表达栽体的类型 哺乳动物细胞表达外源重组蛋白可利用质粒转染和病毒载体的感染。利用质粒转染获得稳定的转染细胞需几周甚至几个月时间,而利用病毒表达系统则可快速感染细胞,在几天内使外源基因整合到病毒载体中,尤其适用于从大量表达产物中检测出目的蛋白。 根据进入宿主细胞的方式,可将表达载体分为病毒载体与质粒载体。病毒载体是以病毒颗粒的方式,通过病毒包膜蛋白与宿主细胞膜的相互作用使外源基因进入到细胞内。常用的病毒载体有腺病毒、腺相关病毒、逆转录病毒、semliki森林病毒(sFv)载体等。另外,杆状病毒载体应用于哺乳动物细胞的表达在近几年颇受重视,这是因为它与其它病毒载体相比有特有优势,如可通过昆虫细胞大量制备病毒颗粒;可感染多种哺乳动物细胞,但在细胞内无复制能力,生物安全度高;可插入高达38 kb的外源基因等。 质粒载体则是借助于物理或化学的作用导人细胞内。依据质粒在宿主细胞内是否具有自我复制能力,可将质粒载体分为整合型和附加体型载体两类。整合型载体无复制能力,需整合于宿主细胞染色体内方能稳定存在,如SV40病毒载体、反转录病毒载体和游离型如痘苗病毒、腺病毒载体。利用Sindbis virus(SV)、Scmliki Forest virus(sFV) 和痘苗病毒载体感染哺乳动物细胞表达的蛋白在结构与功能上与天然哺乳动物来源的蛋白更相似。Liljestrom等利用SFV病毒载体感染哺乳动物细胞获得的外源蛋白占细胞总蛋白的;而附加体型载体则是在细胞内以染色体外可自我复制的附加体形式存在。整合型载体一般是随机整合入染色体,其外源基因的表达受插入位点的影响,同时还可能会改变宿主细胞的生长特性。相比之下,附加体型载体不存在这方面的问题,但载体DNA在复制中容易发生突变或重排。 附加体型载体在胞内的复制需要两种病毒成分:病毒DNA的复制起始点(ori)及复制相关蛋白。根据病毒成分的来源不同,附加体型表达载体主要分为4大类,表2对这几类附加体载体进行了简要的概括。 载体的选择取决于外源基因的导人方式和其调控元件是否有利于转录和翻译。真核

流化床单元操作手册

文档编号:TSS_FLUID.DOC 流化床反应器单元仿真培训系统 操作说明书 北京东方仿真软件技术有限公司 二〇〇六年十月

目录 一、工艺流程说明 (3) 1、工艺说明 (3) 2、反应机理 (3) 3、设备一览 (4) 4、参数说明 (4) 二、装置的操作规程 (4) 1、冷态开车规程 (4) 2、正常操作规程 (6) 3、停车操作规程 (6) 4、仪表一览表 (8) 三、事故设置一览表 (9) 四、仿真界面 (10) 附:思考题 (12)

一、工艺流程说明 1、工艺说明 该流化床反应器取材于HIMONT工艺本体聚合装置,用于生产高抗冲击共聚物。具有剩余活性的干均聚物(聚丙烯),在压差作用下自闪蒸罐D-301流到该气相共聚反应器R-401。 在气体分析仪的控制下,氢气被加到乙烯进料管道中,以改进聚合物的本征粘度,满足加工需要。 聚合物从顶部进入流化床反应器,落在流化床的床层上。流化气体(反应单体)通过一个特殊设计的栅板进入反应器。由反应器底部出口管路上的控制阀来维持聚合物的料位。聚合物料位决定了停留时间,从而决定了聚合反应的程度,为了避免过度聚合的鳞片状产物堆积在反应器壁上,反应器内配置一转速较慢的刮刀,以使反应器壁保持干净。 栅板下部夹带的聚合物细末,用一台小型旋风分离器S401除去,并送到下游的袋式过滤器中。 所有末反应的单体循环返回到流化压缩机的吸入口。 来自乙烯汽提塔顶部的回收气相与气相反应器出口的循环单体汇合,而补充的氢气,乙烯和丙烯加入到压缩机排出口。 循环气体用工业色谱仪进行分析,调节氢气和丙烯的补充量。 然后调节补充的丙烯进料量以保证反应器的进料气体满足工艺要求的组成。 用脱盐水作为冷却介质,用一台立式列管式换热器将聚合反应热撤出。该热交换器位于循环气体压缩机之前。 共聚物的反应压力约为1.4Mpa(表),70℃,注意,该系统压力位于闪蒸罐压力和袋式过滤器压力之间,从而在整个聚合物管路中形成一定压力梯度,以避免容器间物料的返混并使聚合物向前流动。 2、反应机理 乙烯,丙烯以及反应混合气在一定的温度70度,一定的压力1.35Mpa下,通过具有剩余活性的干均聚物(聚丙烯)的引发,在流化床反应器里进行反应,同时加入氢气以改善共聚物的本征粘度,生成高抗冲击共聚物。 主要原料:乙烯,丙烯,具有剩余活性的干均聚物(聚丙烯),氢气。 主产物:高抗冲击共聚物(具有乙烯和丙烯单体的共聚物)。 副产物:无。 反应方程式: n C2H4 + n C3H6———→[C2H4—C3H6]n。

哺乳动物细胞培养生产流感疫苗

哺乳动物细胞培养生产流感疫苗 摘要 动物细胞培养是模拟体内生理环境使分离的动物细胞在体外生存、增殖的一门技术。动物细胞培养是现代生物制药的重要技术之一,不仅可以通过直接培养动物细胞制备相关药用产品,而且还可以将动物细胞作为宿主细胞表达生产原核细胞所不能生产的药用物质。对于许多人用和兽用的重要蛋白质药物和疫苗,尤其是那些相对分子质量较大、结构较复杂或糖基化的蛋白质来说,动物细胞培养是首选的生产方式。 传统的流感疫苗生产多采用鸡胚培养,但该生产过程易受微生物污染、内毒素残余量高、对流感大流行应急能力差,因此基于哺乳动物细胞培养的病毒疫苗工业的发展变得尤为重要。本文重点是MDCK细胞生产流感疫苗的研究以及临床应用现状。 研究背景 动物细胞培养是在动物组织培养基础上发展起来的,起源于19世纪的某些胚胎学技术,奠基人是美国生物学家哈里森(Harrison)。1907年,哈里森采用盖玻片覆盖凹窝玻璃悬滴培养法将蛙胚的神经组织培养在淋巴液中,使细胞存活了几周时间,并观察到细胞突起的生长过程,开创了动物组织培养的先河。法国学者卡雷尔(Carrel)设计的卡氏培养瓶1923年用于培养鸡胚的心肌组织取得成功,极大地推动了动物细胞培养技术的建立。 流行性感冒(以下简称流感)是由流感病毒引起的急性呼吸道传染病,其临床特征是全身不适症状比一般感冒厉害,能引起心肌炎、肺炎和支气管炎等多种并发症,而且可以侵犯所有的年龄层。由于流感病毒具有高度传染性,能在短期迅速蔓延,造成不同程度的流行,甚至世界范围内的大流行。20世纪,甲型流感病毒曾引起过4次全球流行,1918-1919年的西班牙流感(H1N1),历时18个月,导致二千万至四千万人死亡,是历史上最严重的一次流感暴发。进入21世纪,禽流感成为危害世界养禽业发展的重要因素。2004年至今,由甲型H5N1流感病毒引起的禽流感病毒肆虐全球多个国家和地区,并且由染病禽类传染到人,累计造成250多人死亡。世界卫生组织数据显示,每年有5%~15%的人会感染季节性流感,重症病例达三百万至五百万。 抗病毒药物常用作抵抗流感的应急药物。目前,获准用于流感病毒感染治疗的四种药物:金刚胺和金刚乙胺通过干扰病毒颗粒M2蛋白离子通道功能间接抑制病毒复制;扎那米韦和奥赛米韦是神经氨酸酶抑制剂,可以阻止病毒从细胞膜上正常释放。这些药物可以有效抑制流感病毒,但因其可能对人体产生不良反应及可能诱导耐药等缺点,面对大范围长时间的流感大流行,药物往往也无能为力。

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