高效液相色谱仪使用注意事项-2016

岛津液相色谱仪使用注意事项

1.流动相必须用HPLC级的试剂，使用前过滤除去其中的颗粒性杂质和其他物质(使用0.45um或更细的膜过滤)。

2.流动相过滤后要用超声波脱气，脱气后应该恢复到室温后使用。

3.不能用纯乙腈作为流动相，这样会使单向阀粘住而导致泵不进液。

4.使用缓冲溶液时，做完样品后应立即用去离子水冲洗管路及柱子一小时，然后用甲醇(或甲醇水溶液)冲洗40分钟以上，以充分洗去离子。对于柱塞杆外部，做完样品后也必须用去离子水冲洗20ml以上。

5.长时间不用仪器，应该将柱子取下用堵头封好保存，注意不能用纯水保存柱子，而应该用有机相(如甲醇等)，因为纯水易长霉。

6.每次做完样品后应该用溶解样品的溶剂清洗进样器。

7.C18柱绝对不能进蛋白样品，血样、生物样品。

8.堵塞导致压力太大，按预柱→混合器中的过滤器→管路过滤器→单向阀检查并清洗。清洗方法；①以异丙醇作溶剂冲洗：②放在异丙醇中间用超声波清洗；⑧用10％稀硝酸清洗。

9.气泡会致使压力不稳，重现性差，所以在使用过程中要尽量避免产生气泡。

10.如果进液管内不进液体时，要使用注射器吸液：通常在输液前要进行流动相的清洗。

11.要注意柱子的pH值范围，不得注射强酸强碱的样品，特别是碱性样品。

12.更换流动相时应该先将吸滤头部分放入烧杯中边振动边靖洗，然后插入新的流动相中。更换无互溶性的流动相时要用异丙醇过渡一下。

液相色谱柱使用经验谈

色谱柱在使用前，最好进行柱的性能测试，并将结果保存起来，作为今后评价柱性能变化的参考。但要注意：柱性能可能由于所使用的样品、流动相、柱温等条件的差异而有所不同；另外，在做柱性能测试时是按照色谱柱出厂报告中的条件进行(出厂测试所使用的条件是最佳条件)，只有这样，测得的结果才有可比性。

1、样品的前处理：

a、最好使用流动相溶解样品。

b、使用预处理柱除去样品中的强极性或与柱填料产生不可逆吸附的杂质。

c、使用0.45μm的过滤膜过滤除去微粒杂质。

流动相的配制

液相色谱是样品组分在柱填料与流动相之间质量交换而达到分离的目的，因此要求流动相具备以下的特点：

a、流动相对样品具有一定的溶解能力，保证样品组分不会沉淀在柱中(或长时间保留在柱中)。

b、流动相具有一定惰性，与样品不产生化学反应(特殊情况除外)。

c、流动相的黏度要尽量小，以便在使用较长的分析柱时能得到好的分离效果；同时降低柱压降，延长液体泵的使用寿命(可运用提高温度的方法降低流动相的黏度)。

d、流动相的物化性质要与使用的检测器相适应。如使用UV检测器，最好使用对紫外吸收较低的溶剂配制。

e、流动相沸点不要太低，否则容易产生气泡，导致实验无法进行。

f、在流动相配制好后，一定要进行脱气。除去溶解在流动相中的微量气体既有利于检测，还可以防止流动相中的微量氧与样品发生作用。

3、流动相流速的选择：因柱效是柱中流动相线性流速的函数，使用不同的流速可得到不同的柱效。对于一根特定的色谱柱，要追求最佳柱效，最好使用最佳流速。对内径为4.6mm的色谱柱，流速一般选择1ml／min，对于内径为4.0mm 柱，流速0.8ml／min为佳。当选用最佳流速时，分析时间可能延长。可采用改变流动相的洗涤强度的方法以缩短分析时间(如使用反相柱时，可适当增加甲醇或乙腈的含量)。注意：

a．由于甲醇廉价，对于反相柱推荐使用甲醇体系(必须使用乙腈的场合除外)。

b．对于正相柱推荐使用沸程为30-60℃的石油醚或提纯后的己烷作流动相，没有提纯的己烷不得使用。用水最好使用超纯水(电阻率大于18兆欧)，去离子水及双蒸水中含有酚类杂质，有可能影响分析结果。

c．含水流动相最好在临实验前配制，尤其是夏天使用缓冲溶液作为流动相不要过夜。最好加入叠氮化钠，防止细菌生长。

d．流动相要求使用0.45 μm滤膜过滤，除去微粒杂质。

e．使用HPLC级溶剂配制流动相，使用合适的流动相可延长色谱柱的使用寿命，提高柱性能

常见故障的断定及解决方法

诊状可能的原因及解决方法

(一)保留时间变化

1.柱温变化柱恒温，必要时需配置恒温箱

2.等度与梯度间未能充分平衡至少用10倍柱体积的流动相平衡柱

3.缓冲液容量不够用》25mmol/L的缓冲液

4.柱污染每天冲洗柱

5.柱内条件变化稳定进样条件,调节流动相

6.柱快达到寿命采用保护柱

(二)保留时间缩短

1.流速增加检查泵,重新设定流速

2.样品超载降低样品量

3.键合相流失流动相pH值保持在3~7.5，检查柱的方向

4.流动相组成变化防止流动相蒸发或沉淀

5.温度增加柱恒温

(三)保留时间延长

1.流速下降管路泄漏,更换泵密封圈,排除泵内气泡

2.硅胶柱上活性点变化用流动相改性剂,如加三乙胺,或采用碱质钝化柱

3.键合相流失同前(二)3

4.流动相组成变化同前(二)4

5.温度降低同前(二)5

(四) 出现肩峰或分叉

1.样品体积过大用流动相配样,总的样品体积小于第一峰的15%

2.样品溶剂过强采用较弱的样品溶剂

3.柱塌陷或形成短路通道更换色谱柱,采用较弱腐蚀性条件

4.柱内烧结不锈钢失效更换烧结不锈钢,加在线过滤器,过滤样品

5.进样器损坏更换进样器转子

(五)鬼峰

1.进样阀残余峰每次用后用强溶剂清洗阀,改进阀和样品的清洗

2.样品中未知物处理样品

3.柱未平衡重新平衡柱,用流动相作样品溶剂 (尤其是离子对色谱)

4.三氟乙酸(TFA)氧化(肽谱) 每天新配,用抗氧化剂

5.水污染(反相) 通过变化平衡时间检查水质量，用HPLC级的水

(六) 基线噪声

1.气泡(尖锐峰) 流动相脱气,加柱后背压

2.污染(随机噪声) 清洗柱,净化样品,用HPLC级试剂

3.检测器灯连续噪声更换氘灯

4.电干扰(偶然噪声) 采用稳压电源,检查干扰的来源(如水浴等)

5.检测器中有气泡流动相脱气,加柱后背压

(七)峰拖尾

1.柱超载降低样品量,增加柱直径采用较高容量的固定相

2.峰干扰清洁样品,调整流动相

3.硅羟基作用加三乙胺,用碱质钝化柱，增加缓冲液或盐的浓度，降低流动相pH值，钝化样品

4.同前(四)4 同前(四)4

5.同前(四)3 5.同前(四)3

6.死体积或柱外体积过大连接点降至最低,对所有连接点作合适调整,尽可能采用细内径的连接管

7.柱效下降用较低腐蚀条件,更换柱,采用保护柱

(八)峰展宽

1.进样体积过大同(四)1

2.在进样阀中造成峰扩展进样前后排出气泡以降低扩散

3.数据系统采样速率太慢设定速率应是每峰大于10点

4.检测器时间常数过大设定时间常数为感兴趣第一峰半宽的10%

5.流动相粘度过高增加柱温,采用低粘度流动相

6.检测池体积过大用小体积池,卸下热交换器

7.保留时间过长等度洗脱时增加溶剂含量也可用梯度洗脱

8.柱外体积过大将连接管径和连接管长度降至最小

9.样品过载进小浓度小体积样品

液相色谱仪使用操作规程

液相色谱仪使用操作规程总流程：

超纯水冲洗柱——流动相分离样品——超纯水冲洗柱——纯乙睛保存柱

1．电源准备

打开稳压器电源开关，须待电压指示至 220V 后，才能开启其他有关设备。2． HP1100 高效液相色谱仪的准备

试剂：三氟乙酸

乙腈(Fisher 公司产品色谱纯)

超纯水(Millipore 超纯水)

冰乙酸

溶液配置：贮液瓶与流动相的准备

A 液 0.1%三氟乙酸（三氟乙酸 1ml，超纯水 999ml）室温保存

B 液 60%乙腈（乙腈 600ml，超纯水 400ml）室温保存

样品液 0.01%乙酸（冰乙酸0.01ml，超纯水 100ml）室温保存

泵头冲洗液：精滤后超纯水或者是 1%色谱纯甲醇室温保存

注：贮液瓶应用超纯水清洗干净，备用。

流动相溶剂用洁净硼砂漏斗精滤除去微小颗粒。

操作者必须清楚并注明 A、B 贮液瓶盛装为何种溶剂。

冲洗泵头：用注射管于软塑料管末端抽吸至有水流出，调节流速开关控制流速为20-30drop/min.。

①流动相管道排气

如果管道中气泡较多，可通过弹击管道，排除气泡，并逆时针旋转脱气泵活塞使其松动，用注射管于流动相出口的塑料管末端抽吸至管道内气泡排除完全。操作时，我们通常已经打开了脱气机（气泡严重影响分离效果，所以观察管道中液体是否有气泡非常重要。）

②开机

③进入 HP1100 操作系统

a.双击 WIN-95 操作界面中左下角 Instrument 1 online 图标，进入HP1100 工作站软件操作界面。单击工作站操作界面上方 Run control 菜单，在下拉菜单中找到 Sample Info 子菜单，单击。在 Sample Info 信息框内定义操作者、样品前缀及编号、保存路径等参数。在保存路径项下，将可定义子目录分别输入操作者拼音缩写，以方便检索时互不干扰。

b.等待工作站操作界面中泵、柱温箱、检测器各指示图标由灰色转变为绿色后，单击泵、检测器各图标可从其各自弹出的菜单中设定流动相各溶剂比例、流速等。

（1）流速通常为 1ml/min。检测波长通常为 280，或者 254nm。

（2） A 液设置为 100%，运行 15-30 分钟（目的是色谱柱的预平衡），观察基线走势，基线应为直线，通过单击“Balance”键可将基线调至零点。待基线平稳后可进样。

（3）调整 A 液为 0，B 液为 100%再运行 60 分钟（此时乙腈实际浓度为 60%）

（4）在 A 液冲洗同时进行进样环的冲洗：用 500μl 的针样注射器，在 load 状态，注入超纯水 500μl。（反复三次，若是 20μl 进样环，则加入 20μl 以上，多余的水可废液管流出。通常同一样品上样 30 次后应冲洗进样环，如果不同样品，最好，每次上样前均进行冲洗。）

（5）吸取一定量可直接进样的样品溶液（上样液最好用滤器滤过），将进样阀逆时针旋至Load 档，将进样针从进样孔处水平推入，按进样器活塞将样品溶液注射入进样环后，立即将进样阀顺时针方向旋至 Inject 档，与此同时，数据开始自动收集。

（6）此时样品分析已经完成。在 HP1100 主操作界面的检测器图标，关闭检测器，然后关闭色谱仪主机检测器开关（目的是延长检测器寿命）。将 B 通道调为 0，A 通道调为 100%，即 A 液冲洗色谱柱约 10-30min。用 A 液续冲洗色谱柱约 10-30m（目的是冲出柱内残留的杂质）

（7） A 通道换为 C 通道（100%乙腈）续冲洗色柱约 10-30min。（目的主要为保护柱）

④数据记录的终止与保存

电脑将自动收集并保存数据，终止运行后，将自动弹出数据框，或者可通过 DATA ANALYSIS菜单，调出资料。

3．图谱处理

4．关机

1） HP1100 的关闭

在 HP1100 的主操作界面上分别单击关闭泵、检测器图标，或通过菜单关闭。然后，单击HP1100 的主操作界面右上方“X”，退出 Instrument 1 online 程序，返回至 WIN-95 操作界面。单击左下角“Start”菜单，单击“Shut down”,等待关机，待出现“Restart”提示后，按电脑主机电源键，关闭电脑主机及显示器。将所有使用仪器用布盖好。关闭排气扇、空调与稳压器开关。

2）清洁卫生

实验完毕后，打扫仪器室桌面与地面清洁，保持桌面整洁。

3）仪器使用记录

记录当天的仪器使用情况于指定记录本上，包括仪器使用起止时间与出现问题的解决方案，并签上操作者的名字.

液相色谱仪使用及维护方法

液相色谱仪使用时要非常注意。

使用卡套柱时，两端的卡套应时刻连接在柱芯上。不管您是平衡色谱柱或是清洗，任何时候都不能将卡套取下来，否则会造成填料的流失。

液相色谱柱使用注意：

卡套柱的安装（加预柱）

1．将卡套架套入柱芯

2．将两片夹套片嵌入柱芯的凹槽，使夹套高于柱芯（见下图）

3．将已套到柱芯上的卡套架向上推，直至高过夹套片

4．将"子弹头"预柱放入卡套片内

5．将卡套帽和卡套架旋在一起，然后用手拧紧

6．然后依同样的顺序连接好柱子的另一端

平衡色谱柱

反相色谱柱在经过出厂测试后是保存在乙腈/水中的。请一定确保您所使用的流动相和乙腈/水互溶。由于色谱柱在储存或运输过程中可能会干掉，因此在用流动相分析样品之前，应使用10－20倍柱体积的甲醇或乙腈平衡色谱柱；如果您所使用的流动相中含有缓冲盐，应注意用纯水"过渡"。

硅胶柱或极性色谱柱在经过出厂测试后是保存在正庚烷中的。如果该色谱柱需要使用含水的流动相，请在使用流动相之前用乙醇或异丙醇平衡

如何平衡色谱柱？

平衡过程中，将流速缓慢地提高用流动相平衡色谱柱直到获得稳定的基线（缓冲盐或离子对试剂度如果较低，则需要较长的时间来平衡）

色谱柱的再生

进行色谱柱再生时，应使用一个廉价的泵，我们建议最好不使用您的高效液相色谱仪上的泵。

注意：

在对NH2改性的色谱柱进行再生时，由于NH2可能成铵根离子的形式存在，因此应该在水洗后用0.1M的氨水冲洗，然后再用水冲洗至碱溶液完全流出。如果简单的有机溶剂/水的处理不能够完全洗去硅胶表面吸附的杂质，用0.05M稀硫酸冲洗非常有效。

色谱柱的维护

1．使用预柱保护分析柱（硅胶在极性流动相/离子性流动相中有一定的溶解度）

2．大多数反相色谱柱的pH稳定范围是2－7.5，尽量不超过该色谱柱的pH范围

3．避免流动相组成及极性的剧烈变化

4．流动相使用前必须经脱气和过滤处理

5．如果使用极性或离子性的缓冲溶液作流动相，应在实验完毕柱子冲洗干净，并保存于甲醇/乙腈中

6．压力升高是需要更换预柱的信号

液相色谱的常用术语

1、色谱曲线chromatogram）：在色谱法中，当样品加入后，样品中各组分随着流动相的不断向前移动而在两相间反复进行溶解、挥发，或吸附、解吸的过程。如果各组分在固定相中的分配系数（表示溶解或吸附的能力）不同，就有可能达到分离。

分配系数小的组分滞留在固定相中的时间短，在柱内移动的速度快，先流出柱子；分配系数大的组分滞留在固定相中的时间长，在柱内移动的速度慢，后流出柱子；分离后的各组分经检测器转换成电信号而记录下来，得到一条信号随时间变化的曲线，称为色谱流出曲线或“色谱峰”，理想的色谱流出曲线应该是正态分布曲线。

2、（色谱）峰（chromatographic peak）：色谱柱流出组分通过检测器系统时所产生的响应信号的微分曲线。

3、峰底（peak base）：峰的起点与终点之间的连接的直线。

4、峰高（h ，peak height）：色谱峰最大值点到峰底的距离。

5、峰宽（W ，peak width）：在峰两侧拐点处所作切线与峰底相交两点的距离。

6、半高峰宽（W h/2 ，peak withd at half height）：通过峰高的中点作平行于峰底的直线，此直线与峰两侧相交两点之间的距离（图1 中的HJ）。

7、峰面积（A ，peak area）：峰与峰底之间的面积（图1中的CHEJDC）。

8、拖尾峰（tailing peak）：后沿较前沿平缓的不对称的峰。

9、前伸峰（leading peak）：前沿较后沿平缓的不对称的峰。（又叫伸舌峰、前延峰）

10、假峰（ghost peak）：除组分正常产生的色谱峰外，由于仪器条件的变化等原因而在谱图上出现的色谱峰，即并非由试样所产生的峰。这种色谱峰并不代表具体某一组分，容易给定性、定量带来误差。（又叫鬼峰）

11、畸峰（distrorted peak）：形状不对称的色谱峰，前伸峰、拖尾峰都属于这类。

12、反峰（negative peak）：也称倒峰、负峰，即出峰的方向与通常的方向相反的色谱峰。

柱的使用和维护注意事项(推荐)

色谱柱的正确使用和维护十分重要，稍有不慎就会降低柱效、缩短使用寿命甚至损坏。在色谱操作过程中，需要注意下列问题，以维护色谱柱。

①避免压力和温度的急剧变化及任何机械震动。温度的突然变化或者使色谱柱从高处掉下都会影响柱内的填充状况；柱压的突然升高或降低也会冲动柱内填料，因此在调节流速时应该缓慢进行，在阀进样时阀的转动不能过缓（如前所述）。

②.应逐渐改变溶剂的组成，特别是反相色谱中，不应直接从有机溶剂改变为全

部是水，反之亦然。

③一般说来色谱柱不能反冲，只有生产者指明该柱可以反冲时，才可以反冲除去留在柱头的杂质。否则反冲会迅速降低柱效。

④选择使用适宜的流动相（尤其是pH），以避免固定相被破坏。有时可以在进样器前面连接一预柱，分析柱是键合硅胶时，预柱为硅胶，可使流动相在进入分析柱之前预先被硅胶"饱和"，避免分析柱中的硅胶基质被溶解。

⑥经常用强溶剂冲洗色谱柱，清除保留在柱内的杂质。在进行清洗时，对流路系统中流动相的置换应以相混溶的溶剂逐渐过渡，每种流动相的体积应是柱体积的20倍左右，即常规分析需要50~75ml。

下面列举一些色谱柱的清洗溶剂及顺序，作为参考：硅胶柱以正已烷（或庚烷）、二氯甲烷和甲醇依次冲洗，然后再以相反顺序依次冲洗，所有溶剂都必须严格脱水。甲醇能洗去残留的强极性杂质，已烷使硅胶表面重新活化。反相柱以水、甲醇、乙腈、一氯甲烷（或氯仿）依次冲洗，再以相反顺序依次冲洗。如果下一步分析用的流动相不含缓冲液，那么可以省略最后用水冲洗这一步。一氯甲烷能洗去残留的非极性杂质，在甲醇（乙腈）冲洗时重复注射100~200μl四氢呋喃数次有助于除去强疏水性杂质。四氢呋喃与乙腈或甲醇的混合溶液能除去类脂。有时也注射二甲亚砜数次。此外，用乙腈、丙酮和三氟醋酸（0.1%）梯度洗脱能除去蛋白质污染。阳离子交换柱可用稀酸缓冲液冲洗，阴离子交换柱可用稀碱缓冲液冲洗，除去交换性能强的盐，然后用水、甲醇、二氯甲烷（除去吸附在固定相表面的有机物）、甲醇、水依次冲洗。

⑦保存色谱柱时应将柱内充满乙腈或甲醇，柱接头要拧紧，防止溶剂挥发干燥。绝对禁止将缓冲溶液留在柱内静置过夜或更长时间。

⑧色谱柱使用过程中，如果压力升高，一种可能是烧结滤片被堵塞，这时应更换滤片或将其取出进行清洗；另一种可能是大分子进入柱内，使柱头被污染；如果柱效降低或色谱峰变形，则可能柱头出现塌陷，死体积增大。在后两种情况发生时，小心拧开柱接头，用洁净小钢勺将柱头填料取出1~2mm高度（注意把被污染填料取净）再把柱内填料整平。然后用适当溶剂湿润的固定相（与柱内相同）填满色谱柱，压平，再拧紧柱接头。这样处理后柱效能得到改善，但是很难恢复到新柱的水平。柱子失效通常是柱端部分，在分析柱前装一根与分析柱相同固定相的短柱（5~30mm），可以起到保护、延长柱寿命的作用。采用保护柱会损失一定的柱效，这是值得的。通常色谱柱寿命在正确使用时可达2年以上。以硅胶为基质的填料，只能在pH2~9范围内使用。柱子使用一段时间后，可能有一些吸附作用强的物质保留于柱顶，特别是一些有色物质更易看清被吸着在柱顶的填料上。新的色谱柱在使用一段时间后柱顶填料可能塌陷，使柱效下降，这时也可补加填料使柱效恢复。每次工作完后，最好用洗脱能力强的洗脱液冲洗，例如ODS 柱宜用甲醇冲洗至基线平衡。当采用盐缓冲溶液作流动相时，使用完后应用无盐流动相冲洗。含卤族元素（氟、氯、溴）的化合物可能会腐蚀不锈钢管道，不宜长期与之接触。装在HPLC仪上柱子如不经常使用，应每隔4~5天开机冲洗15分钟。

岛津液相操作规程

一、开机操作规程

1. 开机

按Power键，按以下顺序依次开启HPLC系统各设备的电源：总电源→泵→柱温箱

2. 脱气

将吸滤头分别放入流动相中，旋转排液阀至180度，启动键板上的Purge 键，排液1~2min；再按一次Purge键停止冲洗操作，关紧排液阀。

3. 设定参数

按Func键依次设定仪器参数：流速（或压力）、压力最大限、压力最小限。当屏幕显示区闪烁时，提示可以输入数值，按Enter键确认。

在A泵面板上，按Conc键，根据流动相比例，设置B泵比例。

4. 启动流速

先按CE键显示初始屏幕，然后按一下Func键，屏幕显示区闪烁，提示可以输入数值，按Enter键确认。以0.2ml/min的梯度逐步升至所需流速（一般为1.0ml/min）。按Enter键之前，按CE键可以删除新设定的数值。

5. 准备进样

平衡10min后，开启检测器、计算机以及信号收集器。

待基线平衡后（约15~30min），进样，即可进行等度洗脱。

6. 梯度洗脱

先按照上述方法，设定好0时刻流动相比例，然后按edit键编辑梯度程序，然后按Enter键，按照以下流程进行设定。

6.1 如有要删除的程序步骤，就按Enter键查找需要删除的程序，然后按del

键即可。

6.2切记：最后设定好程序，按CE键返回原始状态，升至需要流速，等基线平

衡后（约15~30min），进样，立即按run键，启动梯度程序。

7. 清洗

首先关闭检测器，然后按照参数方法，降低流速，换用流动相，具体内容见注意事项。

8. 关闭HPLC系统各设备所有电源，且倾倒废液。

二、注意事项

1.！特别注意：一定打开排液阀，再按Purge键，否则很容易把色谱柱冲塌

陷。

2.如果流动相中含有酸，用10％的甲醇（乙腈）水溶液冲洗系统40~60min，然

后再用100%甲醇冲洗系统10min，保证所有管路都在100%甲醇溶液中。

3.如果流动相中含有离子对或缓冲盐，用10％的甲醇（乙腈）水溶液冲洗系统

60~90min，然后再用100%甲醇冲洗系统10min，保证所有管路都在100%甲醇溶液中。

4.如果管路长时间不用，请用100%甲醇把管路冲洗干净，以免管路发霉、长

菌、腐败。

5.经常将2个管路相互使用不同的流动相。

6.！特别注意：在做样品制备时，一定记住要将检测器中，入口的阻尼管更换

为二通。

7. 如果仪器可以连续使用，不必关机，如果超过4h以上，就可以考虑关机，

节约氘灯寿命。

三、液相维护

1．管路过滤器的检查及清洗，吸滤头及在线过滤器先用异丙醇超声5~15min，然后用甲醇超声5~15min，随后用双蒸水超声5~15min，再用甲醇清洗超声5~15min，安装。

2．液相的清洗，一般使用4周以后，将系统在没有连接色谱柱的条件下，依次用甲醇、异丙醇、甲醇、50%甲醇、甲醇各冲洗1h。

安捷伦高效液相色谱仪的规范操作

安捷伦高效液相色谱仪的规范操作 1. 目的：明确安捷伦高效液相色谱仪的规范操作，确保数据的准确性。 2. 范围：适用于安捷伦高效液相色谱仪。 3. 职责：检验人员对此负责。 4.操作规程： 系统组成 本系统由1个溶剂二元输送泵（分主/A泵和副/B泵）、手动进样阀、柱温箱、检测器、化学工作站和电脑等组成。 准备 4.2.1使用前应根据待检样品的检验方法准备所需的流动相，用合适的μm滤膜过滤，超声脱气20min。 4.2.2 根据待检样品的需要更换合适的色谱柱（柱进出口位置应与流动相流向一致）和定量环。 4.2.3 配制样品和标准溶液（也可在平衡系统时配制），用合适的μm滤膜过滤。 4.2.4 检查仪器各部件的电源线、数据线和输液管道是否连接正常 将待测样品按要求前处理，准备HPLC 所需流动相，检查线路是否连接完好，废液瓶是否够用等。 开机： 4.3.1 打开计算机,进入中文Windows XP画面,并运行CAG Bootp Server程序。4.3.2 打开1200 LC 各模块电源。 4.3.3 待各模块自检完成后，双击[Instrument 1 Online]图标，化学工作站自动与1200LC 通讯，进入的工作站画面如下所示。 4.3.4 从[视图]菜单中选择[方法和运行控制]画面, 点击[视图]菜单中的[显示顶部工具栏]，[ 显示状态工具栏]，[系统视图],[样品视图]，使其命令前有[√]标志，来调用所需的界面。 4.3.5 把流动相放入溶剂瓶中。

4.3.6 打开冲洗阀。 4.3.7 点击[泵]图标，点击[设置泵…]选项，进入泵编辑画面。 4.3.8 设流速：5ml/min，点击[确定]。 4.3.9 点击[泵] 图标，点击[控制…]选项，选中[启动]，点击[确定] ，则系统开始冲洗，直到管线内（由溶剂瓶到泵入口）无气泡为止,切换通道继续冲洗，直到所有要用通道无气泡为止。 4.3.10 点击[泵] 图标，点击[控制…]选项，选中[关闭]，点击[确定]关泵，关闭冲洗阀。 4.3.11 点击[泵]图标，点击[设置泵…选项]，设流速：min。 4.3.12 点击泵下面的瓶图标，如下图所示（以单元泵为例），输入溶剂的实际体积和瓶体积。也可输入停泵的体积，点击[确定]。 数据采集方法编辑 4.4.1开始编辑完整方法：从[方法]菜单中选择[编辑完整方法…] 项，如下图所示选中除[数据分析]外的三项，点击[确定]，进入下一画面。 4.4.2方法信息 4.4.2.1在[方法注释]中加入方法的信息（如：测试方法）。 4.4.2.2 点击[确定]，进入下一画面。 4.4.3 泵参数设定 4.4.3.1 在[流速]处输入流量,如1ml/min，在[溶剂B]处输入,(A=100-B) ,也可[插入]一行[时间表] ,编辑梯度。在[压力限]处输入柱子的最大耐高压，以保护柱子。 4.4.3.2 点击[确定]，进入下一画面。 4.4.4 柱温箱参数设定 4.4.4.1 在[温度]下面的空白方框内输入所需温度,如：40度。并选中它,点击[更多>>] 键,如图所示,选中[与左侧相同]，使柱温箱的温度左右一致。 4.4.4.2 点击[确定]，进入下一画面。 4.4.5 检测器参数设定：检测波长：一般选择最大吸收处的波长。样品带宽：一般选择最大吸收值一半处的整个宽度。参比波长：一般选择在靠近样品信号的无吸收或低吸收区 域。参比带宽：至少要与样品信号的带宽相等，许多情况下用100nm作为缺省

高效液相色谱仪使用注意事项[1]全解

岛津液相色谱仪使用注意事项 1.流动相必须用HPLC级的试剂，使用前过滤除去其中的颗粒性杂质和其他物质(使用0.45um或更细的膜过滤)。 2.流动相过滤后要用超声波脱气，脱气后应该恢复到室温后使用。 3.不能用纯乙腈作为流动相，这样会使单向阀粘住而导致泵不进液。 4.使用缓冲溶液时，做完样品后应立即用去离子水冲洗管路及柱子一小时，然后用甲醇(或甲醇水溶液)冲洗40分钟以上，以充分洗去离子。对于柱塞杆外部，做完样品后也必须用去离子水冲洗20ml以上。 5.长时间不用仪器，应该将柱子取下用堵头封好保存，注意不能用纯水保存柱子，而应该用有机相(如甲醇等)，因为纯水易长霉。 6.每次做完样品后应该用溶解样品的溶剂清洗进样器。 7.C18柱绝对不能进蛋白样品，血样、生物样品。 8.堵塞导致压力太大，按预柱→混合器中的过滤器→管路过滤器→单向阀检查并清洗。清洗方法；①以异丙醇作溶剂冲洗：②放在异丙醇中间用超声波清洗；⑧用10％稀硝酸清洗。 9.气泡会致使压力不稳，重现性差，所以在使用过程中要尽量避免产生气泡。 10.如果进液管内不进液体时，要使用注射器吸液：通常在输液前要进行流动相的清洗。 11.要注意柱子的pH值范围，不得注射强酸强碱的样品，特别是碱性样品。 12.更换流动相时应该先将吸滤头部分放入烧杯中边振动边靖洗，然后插入新的流动相中。更换无互溶性的流动相时要用异丙醇过渡一下。 液相色谱柱使用经验谈 色谱柱在使用前，最好进行柱的性能测试，并将结果保存起来，作为今后评价柱性能变化的参考。但要注意：柱性能可能由于所使用的样品、流动相、柱温等条件的差异而有所不同；另外，在做柱性能测试时是按照色谱柱出厂报告中的条件进行(出厂测试所使用的条件是最佳条件)，只有这样，测得的结果才有可比性。 1、样品的前处理： a、最好使用流动相溶解样品。 b、使用预处理柱除去样品中的强极性或与柱填料产生不可逆吸附的杂质。 c、使用0.45μm的过滤膜过滤除去微粒杂质。 流动相的配制 液相色谱是样品组分在柱填料与流动相之间质量交换而达到分离的目的，因此要求流动相具备以下的特点： a、流动相对样品具有一定的溶解能力，保证样品组分不会沉淀在柱中(或长时间保留在柱中)。 b、流动相具有一定惰性，与样品不产生化学反应(特殊情况除外)。

液相色谱仪结构及原理

液相色谱仪结构及原理 高效液相色谱法是在经典色谱法的基础上，引用了气相色谱的理论，在技术上，流动相改为高压输送（最高输送压力可达 4.9′107Pa）;色谱柱是以特殊的方法用小粒径的填料填充而成，从而使柱效大大高于经典液相色谱（每米塔板数可达几万或几十万）；同时柱后连有高灵敏度的检测器，可对流出物进行连续检测。 一、特点： 1．高压：液相色谱法以液体为流动相（称为载液），液体流经色谱柱，受到阻力较大，为了迅速地通过色谱柱，必须对载液施加高压。一般可达150～350×105Pa。 2. 高速：流动相在柱内的流速较经典色谱快得多，一般可达1～10ml/min。高效液相色谱法所需的分析时间较之经典液相色谱法少得多，一般少于1h 。 3. 高效：近来研究出许多新型固定相，使分离效率大大提高。 4.高灵敏度：高效液相色谱已广泛采用高灵敏度的检测器，进一步提高了分析的灵敏度。如荧光检测器灵敏度可达10-11g。另外，用样量小，一般几个微升。 5.适应范围宽：气相色谱法与高效液相色谱法的比较：气相色谱法虽具有分离能力好，灵敏度高，分析速度快，操作方便等优点，但是受技术条件的限制，沸点太高的物质或热稳定性差的物质都难于应用气相色谱法进行分析。而高效液相色谱法，只要求试样能制成溶液，而不需要气化，因此不受试样挥发性的限制。对于高沸点、热稳定性差、相对分子量大（大于400 以上）的有机物（这些物质几乎占有机物总数的75% ～80% ）原则上都可应用高效液相色谱法来进行分离、分析。据统计，在已知化合物中，能用气相色谱分析的约占20%，而能用液相色谱分析的约占70～80%。 二、性质及原理：高效液相色谱按其固定相的性质可分为高效凝胶色谱、疏水性高效液相色谱、反相高效液相色谱、高效离子交换液相色谱、高效亲和液相色谱以及高效聚焦液相色谱等类型。用不同类型的高效液相色谱分离或分析各种化合物的原理基本上与相对应的普通液相层析的原理相似。其不同之处是高效液相色谱灵敏、快速、分辨率高、重复性好，且须在色谱仪中进行。 高效液相色谱法的主要类型及其分离原理 根据分离机制的不同，高效液相色谱法可分为下述几种主要类型： 1 ．液—液分配色谱法(Liquid-liquid Partition Chromatography)及化学键合相色谱(Chemically Bonded Phase Chromatography) 流动相和固定相都是液体。流动相与固定相之间应互不相溶（极性不同，避免固定液流失），有一个明显的分界面。当试样进入色谱柱，溶质在两相间进行分配。LLPC与GPC有相似之处，即分离的顺序取决于K，K大的组分保留值大；但也有不同之处，GPC中，流动相对K影响不大，LLPC流动相对K影响较大。a. 正相液—液分配色谱法(Normal Phase liquid Chromatography): 流动相的极性小于固定液的极性。 b. 反相液—液分配色谱法(Reverse Phase liquid Chromatography): 流动相的极性大于固定液的极性。 c. 液—液分配色谱法的缺点：尽管流动相与固定相的极性要求完全不同，但固定液在流动相中仍有微量溶解；流动相通过色谱柱时的机械冲击力，会造成固定液流失。上世纪70年代末发展的化学键合固定相（见后），可克服上述缺点。现在应用很广泛（70~80%）。 2 ．液—固色谱法 流动相为液体，固定相为吸附剂（如硅胶、氧化铝等）。这是根据物质吸附作用的不同来进行分离的。其作用机制是：当试样进入色谱柱时，溶质分子(X) 和溶剂分子(S)对吸附剂表面活性中心发生竞争吸附（未进样时，所有的吸附剂活性中心吸附的是S），可表示如下：

高效液相色谱仪HPCL使用中常见故障及解决方法

高效液相色谱仪HPCL使用中常见故障及解决方法 1 高效液相色谱仪系统 液相色谱仪主要由贮液瓶、泵、进样器、柱子、柱温箱、检测器、数据处理系统组成。对于整个系统而言，柱子、泵和检测器是核心部件同时也是易出问题的主要部位。 2 常见问题及解决方法 高效液相作为一种高精密仪器，如果在使用过程中不按照正确操作的话，就容易导致一些问题。其中最常见的就是柱压问题、漂移问题、峰型异常问题。 2.1 柱压问题柱压问题是使用高效液相色谱过程中需要密切注意的地方，柱压的稳定与色谱图峰形的好坏、柱效、分离效果及保留时间等密切相关。所谓柱压稳定并不是指压力值稳定于一个恒定值而是指压力波动范围在50PSI（ 3.3 Bar）之间（在使用梯度洗脱时，柱压平稳缓慢的变化是允许的）。压力过高、过低都属于柱压问题。 2.1.1 压力过高这是高效液相在使用中最常见的问题，指的是压力突然升高，一般都是由于流路中有堵塞的原因。此时，我们应该分段进行检查。 (1).首先断开真空泵的入口处，此时PEEK管里充满液体，使PEEK管低于溶剂瓶，看液体是否自由滴下，如果液体不滴或缓慢滴下，则是溶剂过滤头堵塞。处理方法：用30%的硝酸浸泡半个小时，在用超纯水冲洗干净。如果液体自由滴下，溶剂过滤头正常，在检查；

(2).打开Purge阀，使流动相不经过柱子，如果压力没有明显下降，则是过滤白头堵塞。处理方法：将过滤白头取出，用10%的异丙醇超声半个小时。如果压力降至100PSI (6.7 Bar)以下，过滤白头正常，在检查； (3).把色谱柱出口端取下，如果压力不下降，则是柱子堵塞。处理方法：如果是缓冲盐堵塞，则用95%的水冲至压力正常。如果是一些强保留的物质导致堵塞，则要用比现在流动相更强的流动相冲至压力正常。假如按上面的方法长时间冲洗压力都不下降，则可考虑将柱子的进出口反过来接在仪器上，用流动相冲洗柱子。这时，如果柱压仍不下降，只有换柱子入口筛板，但一旦操作不甚，很容易造成柱效下降，所以尽量少用。 2.1.1 压力过低压力过低的现象一般是由于系统泄漏，处理方法：寻找各个接口处，特别是色谱柱两端的接口，把泄漏的地方旋紧即可。当然还有一个原因就是泵里进了空气，但此时表现的往往是压力不稳，忽高忽低，更严重一点会导致泵无法吸上液体。处理方法：打开Purge阀，用3~5ml/min的流速冲洗，如果不行，则要用专用针筒在排空阀处借住外力将气泡吸出。 2.2．漂移问题主要包括基线漂移和保留时间漂移。 2.2.1基线漂移一般说来，机器刚起动时，基线容易漂移，大概要半个小时的平衡时间，如果你用了缓冲溶液或缓冲盐，还有就是在低波长下（220nm）平衡时间相对会比较长，但如果你在实验过程中发现基线漂移，则你要考虑下面的原因：

高效液相色谱仪操作步骤

高效液相色谱仪操作步骤： 1)．过滤流动相，根据需要选择不同的滤膜(0.45um)。 2)．对抽滤后的流动相进行超声脱气10-20分钟。 3)．打开HPLC工作站（包括计算机软件和色谱仪），连接好流动相管道，连接检测系统。 4)．进入HPLC控制界面主菜单，点击manual，进入手动菜单。 5)．有一段时间没用，或者换了新的流动相，需要先冲洗泵和进样阀。冲洗泵，直接在泵的出水口，用针头抽取。冲洗进样阀，需要在manual菜单下，先点击purge，再点击start，冲洗时速度不要超过10 ml/min。 6)．调节流量，初次使用新的流动相，可以先试一下压力，流速越大，压力越大，一般不要超过2000。点击injure，选用合适的流速，点击on，走基线，观察基线的情况。 7)．设计走样方法。点击file，选取select users and methods，可以选取现有的各种走样方法。若需建立一个新的方法，点击new method。选取需要的配件，包括进样阀，泵，检测器等，根据需要而不同。选完后，点击protocol。一个完整的走样方法需要包括：a.进样前的稳流，一般2-5分钟；b.基线归零；c.进样阀的loading-inject转换；d.走样时间，随不同的样品而不同。 8)．进样和进样后操作。选定走样方法，点击start。进样，所有的样品均需过滤。方法走完后，点击postrun，可记录数据和做标记等。全部样品走完后，再用上面的方法走一段基线，洗掉剩余物。 9)．关机时，先关计算机，再关液相色谱。 10)．填写登记本，由负责人签字。 注意事项： 1)．流动相均需色谱纯度，水用20M的去离子水。脱气后的流动相要小心振动尽量不引起气泡。 2)．柱子是非常脆弱的，第一次做的方法，先不要让液体过柱子。 3)．所有过柱子的液体均需严格的过滤。

高效液相色谱仪的结构

四、高效液相色谱仪的结构 高效液相色谱仪由高压输液系统、进样系统、分离系统、检测系统、记录系统等五大部分组成（图3-1-2）。分析前，选择适当的色谱柱和流动相，开泵，冲洗柱子，待柱子达到平衡而且基线平直后，用微量注射器把样品注入进样口，流动相把试样带入色谱柱进行分离，分离后的组分依次流入检测器的流通池，最后和洗脱液一起排入流出物收集器。当有样品组分流过流通池时，检测器把组分浓度转变成电信号，经过放大，用记录器记录下来就得到色谱图。色谱图是定性、定量和评价柱效高低的依据。 图3-1-2 高效液相色谱仪的结构示意图 1.高压输液系统 高压输液系统由溶剂贮存器、高压泵、梯度洗脱装置和压力表等组成。 (1) 溶剂贮存器。溶剂贮存器一般由玻璃、不锈钢或氟塑料制成，容量为1～2L，用来贮存足够数量、符合要求的流动相。 (2) 高压输液泵。高压输液泵（图3-1-3）是高效液相色谱仪中关键部件之一，其功能是将溶剂贮存器中的流动相以高压形式连续不断地送入液路系统，使样品在色谱柱中完成分离过程。 由于液相色谱仪所用色谱柱径较细，所填固定相粒度很小，因此，对流动相的阻力较大，为了使流动相能较快地流过色谱柱，就需要高压泵注入流动相。对泵的要求：输出压力高、流量范围大、流量恒定、无脉动，流量精度和重复性为0.5%左右。此外，还应耐腐蚀，密封性好。高压输液泵，按其性质可分为恒压泵和恒流泵两大类。恒流泵是能给出恒定流量的泵，其流量与流动相粘度和柱渗透无关。恒压泵是保持输出压力恒定，而流量随外界阻力变化而变化，如果系统阻力不发生变化，恒压泵就能提供恒定的流量。

图3-1-3 恒流柱塞泵 (3) 梯度洗脱装置。梯度洗脱就是在分离过程中使两种或两种以上不同极性的溶剂按一定程序连续改变它们之间的比例，从而使流动相的强度、极性、pH值或离子强度相应地变化，达到提高分离效果，缩短分析时间的目的。梯度洗脱装置分为两类： 一类是外梯度装置（又称低压梯度），流动相在常温常压下混合，用高压泵压至柱系统，仅需一台泵即可。 另一类是内梯度装置（又称高压梯度），将两种溶剂分别用泵增压后，按电器部件设置的程序，注入梯度混合室混合，再输至柱系统。 梯度洗脱的实质是通过不断地变化流动相的强度，来调整混合样品中各组分的k值，使所有谱带都以最佳平均k值通过色谱柱。它在液相色谱中所起的作用相当于气相色谱中的程序升温，所不同的是，在梯度洗脱中溶质k值的变化是通过溶质的极性、pH值和离子强度来实现的，而不是借改变温度（温度程序）来达到。 2.进样系统 进样系统包括进样口、注射器和进样阀等，它的作用是把分析试样有效地送入色谱柱上进行分离。六通进样阀是最理想的进样器，其结构如图3-1-4。 图3-1-4 六通进样阀装置 3.分离系统 分离系统包括色谱柱、恒温器和连接管等部件。色谱柱一般用内部抛光的不锈钢制成，如图3-1-5。其内径为2 ~ 6mm，柱长为10 ~50cm，柱形多为直形，内部充满微粒固定相，柱温一般为室温或接近室温。 图3-1-5 常见色谱柱外形

心电监护仪的使用方法及注意事项

心电监护仪的使用方法及 注意事项 It was last revised on January 2, 2021

心电监护仪的使用方法及注意事项 ?监护仪以其准确性高、方便、实用日益受到医护人员及其患者、亲属的喜爱、依赖。日常应用中注意正确操作，细微方面的保养、使用、爱护，会给医护人员带来吏多的方便，为提高医疗护理质量给予很好的帮助。 一、心电监护仪的厂家型号不同使用方法也不同，步骤大致为： 1、接电源开机 2、接心电监护，通常使用模拟肢导（红黄蓝黑即右上肢、左上肢、左下肢、右下肢）也可根据病人情况选择心导连，在各接头上都标有相应的英文字母。 3、接血氧探头，注意红色发光面和指甲紧贴 4、接袖带，调整测血压时间 二、使用心电监护时的注意事项： 1. 取出心电导联线，将导联线的插头凸面对准主机前面板上的“心电”插孔的凹槽，插入即可 2．心电导联线带有5个电极头的另一端与被测人体进行连接，正确连接的步骤：a．将人体的5个具体位置用电极片上的砂片擦试，然后用75\%的乙醇进行测量部位表面清洁，目的清除人体皮肤上的角质层和汗渍，防止电极片接触不良。

b．将心电导联线的电极头与5个电极片上电极扣扣好。 c．乙醇挥发干净后，将5个电极片贴到清洁后的具体位置上使其接触可靠，不致脱落。 d．将导联线上的衣襟夹夹在病床固定好。并叮嘱病人和医护人员不要扯拉电极线和导联线。 3、请务必连接好地线，这将对波形的正常显示起到非常重要的作用。 三、心电监护仪的使用时连接地线的注意事项： 地线连接时应把带有铜片套的一端，接在主机后面板的接地端子上。（方法是旋开接地端子旋钮帽，把铜片套套上，然后旋紧钮帽）。地线另一端带有夹子，请夹在建筑设施的公共接地端（自来水管、暖气片上等与大地直接相通的地方）。切不可随随便便地把地线夹在与接地无关的病床或其他金属上，那样如同没有连接地线。如果不接地线或地线连接不好可能会造成心电波形干扰较大，同时可能对仪器操作人的人身安全带来伤害。 四、心电监护仪使用中易忽略的问题●血压监测中易忽略的方面1.袖带应多备，数量充足，型号齐全且消毒备用。做到专人专用。即使仪器不足，相邻床位之间共用一台监护仪，袖带也需固定应用，测量时更换袖带接头部分即可。可有效避免交叉感染，且防止由此给患者及其亲属造成的心理上的不适。2. 连续监测的患者，必须做到每班放松1-2次。病情允许时，最好间隔6-8h更换监测部位一次。防止连续监测同一部位，给患者

高效液相色谱法习题答案

第二十章高效液相色谱法 思考题和习题 1．简述高效液相色谱法和气相色谱法的主要异同点。 相同点：均为高效、高速、高选择性的色谱方法，兼具分离和分析功能，均可以在线检测不同点： 分析对象及范围流动相的选择操作条件 GC 能气化、热稳定性好、且沸 点较低的样品，占有机物的20% 流动相为有限的几种“惰 性”气体，只起运载作用，对 组分作用小 加温常压操作 HPLC 溶解后能制成溶液的样品， 高沸点、高分子量、难气化、离 子型的稳定或不稳定化合物，占 有机物的80% 流动相为液体或各种液 体的混合。它除了起运载作用 外，还可通过溶剂来控制和改 进分离。 室温、高压下进行 2．何谓化学键合相常用的化学键合相有哪几种类型分别用于哪些液相色谱法中 采用化学反应的方法将固定液键合在载体表面上，所形成的填料称为化学键合相。优点是使用过程不流失，化学性能稳定，热稳定性好，适于作梯度淋洗。 目前常用的Si-O-Si-C型键合相，按极性分为非极性，中等极性与极性三类。①非极性键合相：常见如ODS键合相，既有分配又有吸附作用，用途非常广泛，用于分析非极性或弱极性化合物；②中等圾性键合相：常见的有醚基键合相，这种键合相可作正相或反相色谱的固定相，视流动相的极性而定：③极性键合相：常用氨基、氰基键合相，用作正相色谱的固定相，氨基键合相还是分离糖类最常用的固定相。 3．什么叫正相色谱什么叫反相色谱各适用于分离哪些化合物 正相色谱法：流动相极性小于固定相极性的色谱法。用于分离溶于有机溶剂的极性及中等极性的分子型物质，用于含有不同官能团物质的分离。 反相色谱法：流动相极性大于固定相极性的色谱法。用于分离非极性至中等极性的分子型化合物。4．简述反相键合相色谱法的分离机制。 典型的反相键合色谱法是用非极性固定相和极性流动相组成的色谱体系。固定相，常用十八烷基（ODS或C18）键合相；流动相常用甲醇-水或乙腈-水。非典型反相色谱系统，用弱极性或中等极性的键合相和极性大于固定相的流动相组成。 反相键合相表面具有非极性烷基官能团，及未被取代的硅醇基。硅醇基具有吸附性能，剩余硅醇基的多寡，视覆盖率而定。对于反相色谱的分离机制目前，保留机制还没有一致的看法，大致有两种观点，一种认为属于分配色谱，另一种认为属于吸附色谱。分配色谱的作用机制是假设混合溶剂（水十有机溶剂）中极性弱的有机溶剂吸附于非极性烷基配合基表面，组分分子在流动相中与被非极性烷基配合基所吸附的液相中进行分配。吸附色谱的作用机制可用疏溶剂理论来解释。这种理论把非极性的烷基键合相，看作是在硅胶表面上覆盖了一层键合的十八烷基的"分子毛"，这种"分子毛'有强的疏水特性。当用水与有机溶剂所组成的极性溶剂为流动相来分离有机化合物时，一方面，非极性组分分子或组分分子的非极性部分，由于疏溶剂作用，将会从水中被＂挤＂出来，与固定相上的疏水烷基之间产生缔合作用，其结果使组分分子在固定相得到保留。另一方面，被分离物的极性部分受到极性流动相的作用，使它离开固定相，减小保留值，此即解缔过程，显然，这两种作用力之差，决定了分子在色谱中的保留行为。一般说来，固定相上的烷基配合基或被分离分子中非极性部分的表面积越大，或者流动相表面张力及介电常数越大，则缔合作用越强，分配比k'也越大，保留值越大。不难理解，在反相键合相色谱中，极性大的组分先流出，极性小的组分后流出。 5．离子色谱法、反相离子对色谱法与离子抑制色谱法的原理及应用范围有何区别

高效液相色谱仪的综述

题目：高效液相色谱仪的综述 院 部 生命科学院 学科门类 生物仪器分析 专 业 生物技术一班 学 号 1111431017 姓 名 王伟康 指导教师 陈金武 2014年6月15日 装 订 线

摘要 目前，高效液相色谱(HPLC)法由于对复杂样品中的分析物具有极高的分离效率而成为最有效的分离方法。将具有高灵敏度的化学发光分析法和具有高分离效率的高效液相色谱分离法相结合已引起了国内外分析化学家的极大兴趣。本文简单概述了高效液相色谱化学发光的特点、发展史、检测原理、化学发光反应体系以及发展前景。 关键词：高效液相色谱仪发展历史原理应用 ABSTRACT At present, high performance liquid chromatography (HPLC) and become the most effective method for separating the separation efficiency of the analysis method of complex samples with high. Luminescence analysis method and high performance liquid with high separation efficiency of chemical with high sensitivity of chromatographic separation method has aroused great interest of chemists at home and abroad. This paper briefly introduces the characteristics, chemiluminescence HPLC detection principle, development history, chemiluminescence reaction system and the development prospects. Key words:High performance liquid chromatography；Development history；Principle；Application

Waters_2695_型高效液相色谱仪操作方法

Waters 2695 型高效液相色谱仪操作方法 1 仪器组成及开机 1.1 仪器组成本仪器由Waters 2695 分离单元、2996型二极管阵列检测器、2420蒸发光散射检测器、色谱管理工作站和打印机组成。 2695 分离单元包括四元梯度洗脱的溶剂输送系统，四通道在线真空脱气机（或氦气脱气机），可容纳120 个样品瓶的自动进样系统，柱温箱，内置的柱塞杆密封垫清洗系统，溶剂瓶托盘，液晶显示器，键盘用户界面及软盘驱动器。 1.2 开机依次接通2695 分离单元、检测器、计算机和打印机的电源。接通2695 分离单元后，约20s 仪器开始自检，约1min 后，显示主屏幕，此时继续各部件的初始化，待主屏幕上方标题区出现“Idle ”时，仪器进入待命状态。 2 溶剂管理系统的准备 2.1 流动相脱气确认所有溶剂管路都充满溶剂，按【Menu/Status 】，进入“Status （1 ）”屏幕，光标选“Degasser ”，按【Enter 】，显示选项屏幕，光标下移选“Continuous ”，按【Enter 】。 2.2 启动溶剂管理系统 2.2.1 干启动，当溶剂的管路是干的或是需要更换溶剂时，在“Status （1 ）”屏幕下，按【Direct Function 】，光标选“Dry Prime ”，按【Enter 】，显示“Dry Prime ”屏幕，按欲启动的溶剂管路的屏幕键，如【OpenA 】，光标选“Duration ”，按数字键输入5min ，按【Continue 】，待限定时间结束后，重复操作，使实验所需的各溶剂管路均启动、排气并充满流动相。 2.2.2 湿启动在“Status （1 ）”屏幕下，光标选“Compomtion ”中欲使用的流动相，输入10 0％，按【Direct Function 】，光标选“Wet Prime ”，按【Enter 】，显示“Wet Prime ”屏幕，输入7.5Ml/min 和6min ，按【OK 】，待限定时间结束后，对每种流动相重复操作。 2.2.3 平衡真空脱气机在“Status （1 ）”屏幕下，光标选“Composition ”，输入流动相的组成，按【Enter 】再用光标选“Degasser ”中的“Normal ”，按【Enter 】，按【Direct Function 】，光标选“Wet Prime ”，输入0.000mL/min 和10min. ，按【OK 】。待限定时间结束后，按【Abort Prime 】。 3 样品管理系统的准备 3.1 冲洗自动进样器在“Status （1 ）”屏幕下，光标选“Composition ”，输入流动相的组成。按【Direct Function 】，光标选“PurgeInjector ”，按【Enter 】，显示“Purge Injector ”屏幕，输入“Sample Loop Volumes 6.0 ”，光标下移“Compression Check ”，按任意数字键，按【OK 】。 3.2 冲洗进样针在主屏幕下，按【Diag 】，显示“Diagnositcs ”屏幕，按【Prime Ndl Wash 】，显示“Prime Needle Wash ”屏幕，按【Start 】，30s 内应见溶剂从废液排放口流出。按【Close】、【Exit 】。 3.3 冲洗柱塞杆密封垫在主屏幕下，按【Diag 】，显示“Diagnosities ”屏幕，按Prime Seal Wash ，显示“Prime Seal Wash ”屏幕，按【Start 】，待排放口有水流出，按【Halt 】、【Close】、【Exit 】。 3.4 装入样品与转盘将样品瓶插到样品盘合适的位置，打开样品仓门，显示“Door is Open ”屏幕，装入样品盘，按【Next 】，直至所有样品盘装毕，关仓门。 4 编辑分析方法及执行样品分析表 在主屏幕下，按【Develop Methods 】，显示“Methods ”屏幕。 4.1 编辑分析方法 4.1.1 建立新的分离方法在“Method ”屏幕下，按【New 】、【Separation Methods 】，输入方法名，按【Enter 】，显示分离方法屏幕，该屏幕共有6 页，通过按【Next 】或【Prev 】切换。如需设定梯度，在第（ 1 ）页按【Gradient 】，输入后按【Exit 】；如需设定色谱柱的温度，在第（ 4 ）页输入后按【Exit 】；在第（6 ）页设定检测器的种类，光标选“Absorbance Detector ”，按【Enter 】，光标选“48 6﹨2487 ”，按Abs （1 ）图标，设定检测波长，按【OK 】、【Exit 】、【Save 】。 4.1.2 编辑已建立的分离方法在“Methods ”屏幕下，光标选欲编辑﹨修改的分离方法的图标，按【Edit 】，编辑\ 改各种分析参数，按【Exit 】、【Save 】。 4.2 编辑执行样品分析表 4.2.1 建立新的样品组在“Methods ”屏幕下，按【New 】、【Sample Set 】，输入样品组名，按【Enter 】，显示方法组屏幕，在样品组表中输入待分析样品的信息。在“Vial ”中输入样品放置的位

液相色谱仪的工作原理

液相色谱仪的工作原理 高效液相色谱法是在经典色谱法的基础上，引用了气相色谱的理论，在技术上，流动相改为高压输送（最高输送压力可达4.9107Pa）;色谱柱是以特殊的方法用小粒径的填料填充而成，从而使柱效大大高于经典液相色谱（每米塔板数可达几万或几十万）；同时柱后连有高 高效液相色谱法是在经典色谱法的基础上，引用了气相色谱的理论，在技术上，流动相改为高压输送（最高输送压力可达4.9′107Pa）;色谱柱是以特殊的方法用小粒径的填料填充而成，从而使柱效大大高于经典液相色谱（每米塔板数可达几万或几十万）；同时柱后连有高灵敏度的检测器，可对流出物进行连续检测。特点 1．高压：液相色谱法以液体为流动相（称为载液），液体流经色谱柱，受到阻力较大，为了迅速地通过色谱柱，必须对载液施加高压。一般可达150～ 350×105Pa。 2. 高速：流动相在柱内的流速较经典色谱快得多，一般可达1～10ml/min。高效液相色谱法所需的分析时间较之经典液相色谱法少得多，一般少于 1h 。 3. 高效：近来研究出许多新型固定相，使分离效率大大提高。 4.高灵敏度：高效液相色谱已广泛采用高灵敏度的检测器，进一步提高了分析的灵敏度。如荧光检测器灵敏度可达10-11g。另外，用样量小，一般几个微升。 5.适应范围宽：气相色谱法与高效液相色谱法的比较：气相色谱法虽具有分离能力好，灵敏度高，分析速度快，操作方便等优点，但是受技术条件的限制，沸点太高的物质或热稳定性差的物质都难于应用气相色谱法进行分析。而高效液相色谱法，只要求试样能制成溶液，而不需要气化，因此不受试样挥发性的限制。对于高沸点、热稳定性差、相对分子量大（大于 400 以上）的有机物（这些物质几乎占有机物总数的 75% ～ 80% ）原则上都可应用高效液相色谱法来进行分离、分析。据统计，在已知化合物中，能用气相色谱分析的约占20%，而能用液相色谱分析的约占70～80%。 高效液相色谱按其固定相的性质可分为高效凝胶色谱、疏水性高效液相色谱、反相高效液相色谱、高效离子交换液相色谱、高效亲和液相色谱以及高效聚焦液相色谱等类型。用不同类型的高效液相色谱分离或分析各种化合物的原理基本上与相对应的普通液相层析的原理相似。其不同之处是高效液相色谱灵敏、快速、分辨率高、重复性好，且须在色谱仪中进行。 高效液相色谱法的主要类型及其分离原理 根据分离机制的不同，高效液相色谱法可分为下述几种主要类型： 1 ．液—液分配色谱法(Liquid-liquid Partition Chromatography)及化学键合相色谱(Chemically Bonded Phase Chromatography)

气相色谱仪由哪几部分组成

气相色谱仪由哪几部分 组成 Company Document number：WTUT-WT88Y-W8BBGB-BWYTT-19998

1、气相色谱仪由哪几部分组成 答：基本包括六个基本单元：气源系统、进样系统、柱系统、检测系统、数据采集及处理系统、温控系统。 2、在环已烯成分检测的实验中，我们所使用的气相色谱仪的固定相和流动相分别是什么？ 答：固定相为：PEG毛细管柱。流动相为：氮气 3、在环已烯成分检测的实验中，我们所使用的液相色谱仪的检测器是什么检测器 答：为氢火焰离子化检测器。 4、气相色谱仪的适用范围是什么 答：气相色谱仪可以应用于分析气体试样，也可分析易挥发或可转化为易挥发的液体和固体。如：环境检测，食品检测，有机化合物的质量检测等范围。 5、高效液相色谱仪由哪几部分组成 答：主要包括：高压泵、进样阀、色谱柱、检测器、数据采集和处理系统等部分。 6、在反相高效液相色谱法分离芳香烃化合物的实验中，我们所使用的液相色谱仪的固定相和流动相分别是什么 答：固定相为：十八烷烃；流动相为：80%甲醇和20%水的混合溶液。 7、在反相高效液相色谱法分离芳香烃化合物的实验中，我们所使用的液相色谱仪的检测器是什么检测器 答：紫外吸收检测器。 8、什么叫反向高效液相色谱仪，什么叫正向液相色谱仪

答：固定相的极性小于流动相的极性叫做反向高效液相色谱仪；固定相的极性大于流动相的极性叫做正向高效液相色谱仪。 9、液相色谱仪的适用范围是什么 答：只要被分析物在流动相溶剂中有一定的溶解度，便可以分析。特别适合于那些沸点高、极性强、热稳定性差的化合物。如：环境检测，食品检测，有机化合物的含量检测等范围。 10、色谱仪进行定性分析和定量分析的依据分别为什么 答：定性分析的依据为：各检测物的保留时间；定量分析的依据为：峰面积与浓度成正比。 实验操作部分： 1、该实验中气相色谱仪的操作步骤是什么 打开氮气阀门——打开主机电源——设置温度(气化室150℃、色谱柱室75℃、检测器180℃)——打开空压机开关——打开氢气阀门——点火——待基线稳定后——进样——分析结束后读取数据。 2、在反相高效液相色谱法分离芳香烃化合物的实验中的操作步骤是什么 答：流动相的配制（超声脱气过滤）；开机预热30分钟；进样（以微量注射器吸取适量试样并排气泡——将微量注射器插入六通阀——旋转六通阀——注入试样——旋转六通阀——拔出微量注射器）；在计算机上读取数据——关机（先关泵后关电源）。

多参数监护仪维护和使用注意事项

多参数监护仪维护和使用注意事项 1ECG附件的维护和使用注意事项 清洁： 用沾有清水的棉球或软布擦拭，晾干后再使用。 消毒： 用棉球或软布沾适量的消毒剂，擦拭传感器。 消毒后，用沾有清水的软布，擦拭残留在传感器上的消毒剂。 推荐的消毒剂有：70％酒精、70％异丙醇，2％戊二醛溶液。 灭菌： 不能使用高压或热蒸气的方法灭菌。 可采用环氧乙烷（EQ）进行杀菌。 注意事项： 不要将附件浸泡在水或消毒液中。 不要弄湿电缆的针脚。 在擦洗过程中要小心，以免损坏附件。 在经过清洁、消毒、杀菌后的附件，使用之前要先检查附件是否正常和完好。 2SPO2附件的维护和使用注意事项 清洁： 将传感器从患者和监护仪上取下后，用含70％酒精的棉球或软纱布擦拭传感器，然后用干布擦干。这种方法也可以用来清洁发光和接收部分。 电缆应用3％的双氧水或7％异丙醇或其他试剂清洁。传感器的连接部分不能沾上这些试剂。

注意事项： 不要将电缆浸在任何液体中。不要用蒸气喷射对电缆进行消毒。 为了避免交叉感染，一次性传感器只能给一个患者使用。 周围高强度的光源，如外科手术灯（尤其是一些用氙气为发光源的外科手术灯），胆红素灯、荧光灯，红外线加热灯或者阳光直射等，会影响SPO2传感器的性能。为了避免周围光源对传感器的影响，确保传感器正常使用，需要的话可以用不透明的物质遮住传感器。 3NIBP附件的维护和使用注意事项不要挤压袖带上的橡皮管。 不要让水或清洁液流入监护仪前端的联接器插座，以防损坏仪器。 当清洁监护仪时，只擦拭联接器插座的外周，而不要擦拭它的内部。 当可重复使用的袖带没有和监护仪连接或正在清洗时，总是要将盖帽安放在橡胶管上面。这样可防止因不小心而使液体入橡胶管并被吸入模块中。 重复使用的血压袖带的维护： 袖带可以通过常规的在热气烘箱内进行的高压灭菌，气体或放射消毒法进行消毒，或者是浸入去污溶液内灭菌。但要记住在采用此法时要取走橡胶袋。袖带不能干洗。袖带可以机器洗也可以手洗，手洗可以延长使用的寿命。在清洗前，取出橡胶袋。洗净后等袖带干透，再重新把橡胶袋装入。 要将橡胶袋重新装入袖带，先把橡胶袋放在袖带的头端，这样橡胶管就和袖带长端的大开口排成一行，现在将橡胶袋纵向卷起并插入袖带的大开口，握住皮管和袖带，抖动整个袖带一直到橡胶袋到位为止。把皮管引入袖带里，经过小孔内衬下穿出来。

(完整word版)高效液相色谱仪使用说明

高效液相色谱仪使用说明 1. 型号：LC-10AT 产地日本岛津。 2. 用途： 高效液相色谱法只要求样品能制成溶液, 不受样品挥发性的限制,流动相可选择的范围宽,固定相的种类繁多,因而可以分离热不稳定和非挥发性的、离解的和非离解的以及各种分子量范围的物质。 与试样预处理技术相配合，HPL C 所达到的高分辨率和高灵敏度，使分离和同时测定性质上十分相近的物质成为可能，能够分离复杂相体中的微量成分。随着固定相的发展, 有可能在充分保持生化物质活性的条件下完成其分离。由于HPL C具有高分辨率、高灵敏度、速度快、色谱柱可反复利用, 流出组分易收集等优点,因而被广泛应用到生物化学、食品分析、医药研究、环境分析、无机分析等各种领域。高效液相色谱仪与结构仪器的联用是一个重要的发展方向。 3. 测定原理 高效液相色谱仪的系统由储液器、泵、进样器、色谱柱、检测器、记录仪等几部分组成。储液器中的流动相被高压泵打入系统，样品溶液经进样器进入流动相,被流动相载入色谱柱(固定相) 内, 由于样品溶液中的各组分在两相中具有不同的分配系数, 在两相中作相对运动时, 经过反复多次的吸附- 解吸的分配过程, 各组分在移动速度上产生较大的差别, 被分离成单个组分依次从柱内流出, 通过检测器时, 样品浓度被转换成电信号传送到记录仪，数据以图谱形式打印出来。 4. 使用方法 4.1 系统组成：本系统由1个LC-10ATvp溶剂输送泵、Rheodyne 7725i手动进样阀、SPD-10Avp紫外-可见检测器、色谱数据工作站和电脑等组成，另外还包括打印机、不间断电源等辅助设备。 4.2 准备 4.2.1 准备所需的流动相，用合适的0.45μm滤膜过滤，超声波脱气20min。 4.2.2 根据待检样品的需要更换合适的洗脱柱（注意方向）和定量环。 4.2.3 配制样品和标准溶液（也可在平衡系统时配制），用合适的0.45μm滤膜过滤。 3.2.4 检查仪器各部件的电源线、数据线和输液管道是否连接正常，特别注意输液管道内是否有气泡。 4.3 开机：接通电源，依次开启不间断电源、溶剂输送泵、先将机器预热半小时，这时的流动相用85％甲醇溶液（已脱气），而且要时刻注意输液管道内是否有气泡，如有气泡要进行排气。预热半小时后，开启检测器，待检测器自检结束后，打开打印机、电脑显示器、主机，最后打开色谱工作站。 4.4 各种参数设定 4.4.1 波长设定：在检测器显示初始屏幕时，按[func]键，用数字键输入所需波长值，按[Enter]键确认。按[CE]键退出到初始屏幕。 4.4.2 流速设定：在输送泵显示初始屏幕时，按[func]键，用数字键输入所需的流速（柱在线时流速一般不超过1ml/min），按[Enter]键确认。按[CE]键退出。 4.5 更换流动相并排气泡 4.5.1 将输送管道的吸滤器放入装有准备好的流动相的储液瓶（已排气）中； 4.5.2 逆时针转动泵的排液阀180度，打开排液阀； 4.5.3 按泵的[purge]键，pump指示灯亮，泵大约以2ml/min的流速冲洗，3min（可设定）后自动停止；

监护仪的使用注意事项

监护仪的使用注意事项 1 心电图监护中应注意的问题 1．1 屏幕报警显示导联线脱落(没有波形) 应检查是否存在电极脱落、导联线与电极连接脱落、干线与导联线脱落、干线与主机端口脱落等情况。 1．2 心电图波形出现干扰 应排除是否是患者肌肉移动或颤动等干扰造成高频噪音，或周围电磁波干扰等引起。手机、传呼机、对讲机等无线通讯设备对监护仪也有不同程度的干扰，要求这些东西应远离监护仪。患者在使用电热毯时，对监护仪也有很大的干扰［3］。 1．3 高低限报警 应分析、观察是否是患者病情变化，或心率高于或低于报警高、低限引起，或者是否是由于设置不当引起。 2 心率监护中应注意的问题 2．1 有心电图未显示心率 可能是心电信号过高或过低，观察困难，无法显示正常心率等原因引起。 2．2 心率报警 如果患者病情平稳，心率又在报警范围内，但心率报警不止，此时应注意监护仪的心率设置，心率来源是ECG还是脉搏，有针对性调节心率报警界限。 3 呼吸监护中应注意的问题 3．1 呼吸参数异常显示 应检查电极放置是否妥当。监护呼吸不需另加电极，但电极安放很重要，部分患者由于病情影响信号弱，呼吸浅表，计数不准确，此时最好把呼吸电极置于右腋中线内侧和胸廓左侧呼吸时活动最大的区域以获取最佳呼吸波。与此同时密切观察患者病情变化，注意患者有无窒息、缺氧、呼吸不规则等，及时采取措施以缓解患者呼吸窘迫症状。 3．2 高、低限报警值设置不当 呼吸参数在正常范围却呼吸报警，此时应重新设置报警界限参数。

4 血氧饱和度监护中应注意的问题 4．1 屏幕上无氧饱和度和脉率值 可能为血氧探头未连接或损坏，应检查血氧探头。分析是否患者移动过度，使氧饱和度参数找不到一个脉搏形式。同时密切观察患者病情，使患者保持不动或将传感器移动到活动少的肢体，或者用自己的手指进行测试对比，如果是探头的问题及时更换。 4．2 氧饱和度显示传感器脱落 传感器如在位且性能良好，应注意连接是否正常，有无液体溅进传感器接头处，检查方法：用干布清洁，待干或吹干一段时间后恢复正常可证实。 4．3 高、低限报警 检查报警界限设置，重新调整。 5 无创血压监护应注意的问题 5．1 无创血压泵超时 认真检查袖带管路连接处是否漏气，如无漏气则重新放置袖带于正确位置。 5．2 只有泵充气无血压值 检查监护仪使用的模式是成人模式还是儿童模式。成人使用儿童模式或儿童使用成人模式都会受到影响。 5．3 无创血压计测量结果与病情不符 应分析患者被测肢体与患者心脏是否在同一水平线上，侧睡时被测肢体在身体上方、下方均可对测量结果有一定的影响。另外使用不同的袖带也有可能使血压测量值产生偏差。 6 使用监护仪时应注意以下几点 监护仪突然不工作或显示器不亮，遇到此类情况首先检查电源有无接好或电源线插口有无松动。其次检查内置电池有无全部耗尽；安放电极时先擦去皮肤上的油渍汗迹，以确保获取最佳的信号；心率报警上限设定在监护中是很重要的，不要把上限设的太高或太低，避免引起错觉，影响观察病情；为使测量数据的准确，测量无创血压所选用的袖带不能过大或过小、过松或过紧、袖带放置的位置要正确、测量期间尽量使患者肢体不移动；使用无创血压监护患者时，如果监测时间间隔较短(15 min/1次)，则应注意袖带与肢体的摩擦，防止皮肤擦伤，必要时经常更换肢体测量；血氧探头不能与血压袖带放在同一手臂上，安放探头的手指必须清洁干燥，以免测量精度受影响，手指甲上涂有指甲油，也会影响测量精度；清洗监护仪和传感器之前关掉电源并断开交流电源，用清水或稀释后的清洁剂，清洗时注意防止液体进入机壳；心电监护仪应每6个月～12个月请专业维修人员进行全性能检查［4］；附件整理时不要折叠线条，应环行缠绕，避免折断。