泥鳅肉酶解物对羟自由基的清除作用
泥鳅肉酶解物对羟自由基的清除作用
姚东瑞1，王淑军1，李圆圆1，盘赛昆1，杨 帆1,2
(1.淮海工学院食品工程学院，江苏 连云港 222005；2.大连海洋大学食品工程学院，辽宁 大连 116000)摘 要：为了探讨深度开发泥鳅蛋白制备功能性肽的可能性，采用比色法研究泥鳅肉酶解物对Fenton 体系产生的羟自由基的清除效果，从复合风味蛋白酶、复合蛋白酶、胰蛋白酶、胃蛋白酶、菠萝蛋白酶5种酶中，筛选出菠萝蛋白酶作为酶解泥鳅肉制备具有清除羟自由基活性酶解物的适宜水解酶。用响应面分析法(RSM)对该酶的酶解条件进行优化，并采用Sephadex G-15凝胶层析测定最佳酶解条件下制得的酶解液中活性肽的相对分子质量分布。结果表明，菠萝蛋白酶的最佳酶解条件为：固液比1:4、加酶量0.2%、pH6.47、温度54.48℃、酶解时间59.97min ，酶解物对羟自由基的清除率为99.03 %，IC 50值为0.57mg/mL 。酶解液中活性肽的相对分子质量范围为1129～2344。关键词：泥鳅肉；酶解物；羟自由基
Optimization of Enzymatic Hydrolysis of Loach Muscle for Production of Antioxidant Peptides and
Measurement of Their Molecular Weights
YAO Dong-rui 1，WANG Shu-jun 1，LI Yuan-yuan 1，PAN Sai-kun 1，YANG Fan 1,2
(1. School of Food Engineering, Huaihai Institute of Technology, Lianyungang 222005, China ；
2. Food Engineering College, Dalian Ocean University, Dalian 116000, China)
Abstract ：In order to obtain bioactive peptides having better ability to scavenge hydroxyl free radicals generated in Fenton system,the muscle of loach (Misgurnus anguillicaudatus ) was hydrolyzed separately with flavourzyme, protamex, trypsin and pepsin and bromelain, and bromelain was the selected protease for the hydrolysis of loach muscle. The subsequent investigations involved optimization of the hydrolysis of loach muscle by response surface methodology for achieving maximum hydroxyl free radical scavenging rate and Sephadex G-15 gel column chromatographic determination of relative molecular mass distribution of the hydrolysate obtained under optimized hydrolysis conditions. The optimal conditions for bromelain-catalyzed hydrolysis of loach muscle were determined as follows: solid/liquid ratio, 1:4; enzyme dose, 0.2%; pH, 6.47; hydrolysis temperature, 54.48 ℃; and hydrolysis duration, 59.97 ℃. The hydrolysate obtained under these conditions displayed a free radical scavenging rate of 99.03%and an IC 50 value of 0.57 mg/mL, and contained peptides having a relative molecular mass varying from 1129 to 2344.Key words ：loach (Misgurnus anguillicaudatus )；enzymatic hydrolysis ；hydroxyl free radical
中图分类号：Q514 文献标识码：A 文章编号：1002-6630(2010)21-0029-06
收稿日期：2010-06-23
基金项目：科技部科技人员服务企业行动项目(2009GJC10044)；江苏省农业科技自主创新基金项目(CX09-627)； 连云港市科技基础设施建设计划项目(CK0935)
作者简介：姚东瑞(1966—)，男，教授，博士，研究方向为水产品加工及渔业经济。E-mail ：yaodr@https://www.sodocs.net/doc/034069964.html,
泥鳅(Misgurnus anguillicaudatus )是滋补佳品，素有“水中人参”的美誉。其肉质细嫩，营养价值较高，含有多种对人体有益的生物活性物质如蛋白质、多不饱和脂肪酸、赖氨酸等必需氨基酸、类胡萝卜素、尼克酸等维生素以及锌、硒等微量元素[1]。它们具有提高机体免疫活性的作用，对于人类防病治病、强身健体、延年益寿大有裨益，因此研究泥鳅肉中的活性成分具有实际应用价值。近10多年来，国内外对泥鳅中生物活性成分如凝集素[2]、泥鳅素(misgurin)[3]、超氧化物歧化酶[4]、泥鳅多糖[5]、牛磺酸[5]和透明质酸[6]的研究
报道较多，但对泥鳅肉酶解物对羟自由基(?OH)清除作用的研究尚未见报道。
20世纪50年代中期Harman 首先提出衰老自由基学说，该学说认为自由基攻击生命大分子造成组织损伤，是引起机体衰老的根本原因，也是诱发肿瘤的恶性疾病的重大原因[7]，其中?OH 是一种氧化能力很强的自由基，是目前所知活性氧中对生物体毒性最强、危害最大的一种自由基[8]。
生物活性肽易被人体消化吸收，同时具有抗氧化、抗疲劳、调节激素和降血压等功能。抗氧化多肽是生
物活性肽的一种，它具有通过减少氧自由基和羟自由基从而达到抗衰老的功能，因此含有生物活性肽的各种保健食品的开发具有广阔的市场前景。本实验采用Fenton 体系测定泥鳅肉酶解物对?OH的清除作用，旨在为利用泥鳅肉蛋白制备抗氧化活性肽提供指导。
1材料与方法
1.1材料与试剂
鲜活泥鳅购于连云港敦尚镇泥鳅养殖基地，经淮海工学院水产养殖系程汉良教授鉴定为泥鳅(Mis gurn us anguillicaudatus)，去头、尾和血并洗净，置于－40℃冰箱中冷冻备用。
复合蛋白酶(42300U/g)、复合风味蛋白酶(31800 U/g)诺维信(沈阳)公司；菠萝蛋白酶(43600U/g)、胰蛋白酶(41000U/g)、胃蛋白酶(28000U/g) 广州市齐云生物技术有限公司；α-脱氧核糖(2-Deoxy-D-ribose)、硫代巴比妥酸(TBA) 生工生物工程(上海)有限公司。
1.2仪器与设备
BS323S型电子天平北京赛多利斯仪器系统有限公司；DKZ-3型电热恒温振荡水槽上海一恒科技有限公司；日立CR22G高速冷冻离心机日本Hitach公司；SynergyTM HT型多功能酶标仪美国Bio-Tek公司；BioLogic DuoFlowTM层析系统美国Bio-Rad公司；PHS-3C型pH计上海精宏实验设备有限公司。
1.3方法
1.3.1酶解工艺流程
鲜活泥鳅→预处理→冷冻备用→解冻→加水搅打均匀→酶解→灭酶(沸水浴，10min)→冷却→10000r/min离心20min→收集上清液
1.3.2酶活力测定
采用Fo l i n-酚法，以酪蛋白为底物，参照S B/T 10317—1999《蛋白酶活力测定法》[9]进行测定。
1.3.3水解度测定
C N－C NO
DH/%=—————×100
C
式中：C N为水解液中游离氨基氮的含量/(g/100mL)；
C N0为鱼糜液水解前游离氨基氮的含量/(g/100mL)；C为鱼糜液中蛋白氮的含量/(g/100mL)。
游离氨基氮采用甲醛电位滴定法测定[10]，蛋白氮采用微量凯氏定氮法测定[11]。
1.3.4对羟自由基清除作用实验
参考文献[12-13]测定泥鳅肉酶解物对Fenton体系产生的羟自由基清除率。IC50定义为清除50%羟自由基时的多肽质量浓度(mg/mL)，用SPSS13.0 统计软件的概率单位法(probit)计算。多肽含量测定采用Lowry法[14]。
1.3.5酶的筛选
取泥鳅肉10g，加水30mL，以0.29%加酶量(m酶/m泥)分别加入菠萝蛋白酶(p H7.0，50℃)、复合蛋白酶(p H7.0，50℃)、胰蛋白酶(pH8.0，55℃)、复合风味蛋白酶(pH7.0，50℃)和胃蛋白酶(pH2.0，37℃)，再分别在上述酶的适宜pH值和温度下进行酶解实验，以IC50及水解度为指标考察0～240min内(间隔30min)供试酶酶解液对羟自由基的清除效果及水解进程。
1.3.6泥鳅肉酶解物的相对分子质量分布测定
酶解物相对分子质量分布的测定采用凝胶层析法[15]。2结果与分析
2.1蛋白酶的筛选
如图1所示，随着时间延长，不同蛋白酶作用下的水解度逐渐增加，但增加趋势变缓和。图2显示，未经酶解的泥鳅肉匀浆具有一定清除羟自由基的能力，其清除率达45.7%，IC50为2.32mg/mL。除了胰蛋白酶外，供试的4种酶酶解物对羟自由基的清除能力均较未经酶解的匀浆有显著提高，但不同蛋白酶酶解物的清除作用存在一定差异，没有一定的规律性，并且水解度和清除率之间没有相关性，因此酶的选择及工艺条件的优化在制备功能肽时是非常必要的。菠萝蛋白酶和胃蛋图2 不同蛋白酶酶解物对清除羟自由基的影响
Fig.2 Change in IC50 of loach muscle hydrolysate during hydrolysis
with five proteases
1
/
I
C
5
/
(
m
L
/
m
g
)
酶解时间/min
0306090120150180210240
1.2
1.0
0.8
0.6
0.4
0.2
0.0
复合蛋白酶
复合风味蛋白酶
菠萝蛋白酶
胃蛋白酶
胰蛋白酶
图1 5种供试酶对泥鳅肉的水解进程
Fig.1 Hydrolysis courses of loach muscle with five proteases D
H
/
%
酶解时间/min
0306090120150180210240
35
30
25
20
15
10
5
菠萝蛋白酶
胃蛋白酶
胰蛋白酶
复合蛋白酶
复合风味蛋白酶
白酶酶解物对羟自由基清除活性较高，但菠萝蛋白酶能在较短的时间内即可达到较好的效果，而胃蛋白酶达到相当的效果则需要较长的水解时间，因此选用菠萝蛋白酶用于下一阶段的研究。2.2单因素试验
2.2.1
固液比对酶解物清除羟自由基的影响
选取固液比1:3、1:4、1:5、1:6，调节pH7.0，加酶量为0.29%，在50℃下酶解60min ，测定酶解液水解度及其对羟自由基的清除率，结果如图3所示。
从图3可知，在固液比为1:4时，水解度及酶解物对羟自由基的清除率同时达到最高，随着固液比的增大，底物浓度变小，水解度及清除率均呈下降趋势，因此，固液比为1:4是比较适宜的。2.2.2
加酶量对酶解物清除羟自由基的影响
固液比1:4，加酶量为0.1%、0.2%、0.3%、0.4%、0.5%，其他条件同2.2.1节，测定酶解液水解度及其对羟自由基的清除率，结果如图4所示。
从图4可以看出，底物浓度保持不变，加酶量为0.2%时，酶解物对羟自由基的清除率最高，之后随着酶使用量的增加，清除率呈现下降趋势，并逐渐保持平稳，D H 最大时清除率并非最大。2.2.3
pH 值对酶解物清除羟自由基的影响
固液比1:4，调节p H 值为6.0、6.5、7.0、7.5、
8.0，其他条件同2.2.1节，测定酶解液水解度及其对羟自由基的清除率，结果如图5所示。
由图5可见，在p H6.5时，酶解物对羟自由基的清除能力最强，当pH 值超过6.5时，酶解物对羟自由基的清除能力明显下降，而水解度在p H 7.0时达到最大，这说明在相同的作用时间下，酶活力最强时水解得到的肽不一定具有活性肽的结构。2.2.4
温度对酶解物清除羟自由基的影响
固液比1:4，分别选取酶解温度45、50、55、60、65℃，其他条件同2.2.1节，测定酶解液水解度及其对羟自由基的清除率，结果如图6所示。
由图6可见，酶解物对羟自由基的清除率随温度升高逐渐增大，在温度为50℃时达到最高值，因此选择最适酶解温度为50℃，继续提高温度，清除率下降较快。这是因为高于酶作用的温度范围后，酶的性质受到影响，从而影响酶解物对羟自由基的清除作用。2.2.5
酶解时间对清除羟自由基的影响
固液比1:4，分别选取酶解时间30、45、60、75、90min ，其他条件同2.2.1节，测定酶解液水解度及其对羟自由基的清除率，结果如图7所示。
由图7可知，酶解时间为60mi n 时，酶解物显示出最强的羟自由基清除作用。随着时间延长，虽然水解度有所提高，但酶解物清除自由基的能力却明显下降。单因素试验结果显示，水解度与酶解物清除自由基的能力之间并没有显著的一致性规律。这可能是因为酶解物对羟自由的基清除作用主要取决于肽链中暴露的氨基酸侧链基团的性质和肽的氨基酸序列，而与水解程度无直接相关性[16]。图3 固液比对清除羟自由基的影响
Fig.3 Effect of solid/liquid ratio on hydroxyl free radical scavenging
rate of loach muscle hydrolysate
90888684828078清除率
清除率/%
固液比
1:3
1:4
1:5
1:6
DH
2520151050
DH/%
图6 酶解温度对清除羟自由基的影响
Fig.6 Effect of hydrolysis temperature on hydroxyl free radical
scavenging rate of loach muscle hydrolysate
80757065605550清除率
清除率/%
温度/℃
45
50
5560
65
DH
2520151050
DH/%图4 加酶量对清除羟自由基的影响
Fig.4 Effect of enzyme dose on hydroxyl free radical scavenging rate
of loach muscle hydrolysate
9088868482807876清除率
清除率/%
加酶量/%
0.1
0.2
0.30.4
0.5
DH
30252015105
DH/%
图5 pH 值对清除羟自由基的影响
Fig.5 Effect of pH on hydroxyl free radical scavenging rate of loach
muscle hydrolysate
95908580757065清除率
清除率/%
pH
6.0
6.5
7.07.58.0
DH
2520151050
DH/%
2.3优化分析试验
2.3.1
响应面分析方案及结果
据单因素试验结果，通过SPSS V13.0软件分析作单因素方差分析，结果表明温度、时间、p H 值三个因
素对清除率有显著影响。利用Design-Expert 6.0.10.Trial 软件，根据中心组合试验设计原理，设计三因素三水平共20个试验的响应面分析试验，泥鳅肉酶解物清除羟自由基试验设计方案与试验结果见表1。
试验号因素
清除率/%温度/℃时间/min
pH 15060 6.595.0325575696.08
34545785.3745060 6.598.8855060 6.598.8765060 6.598.44750607.3484.9285860 6.598.2495545699.24105035 6.594.18115060 5.6688.27125060 6.597.47134575685.72145545793.90154575789.38164260 6.592.09175060 6.598.34185085 6.595.71194545686.8320
55
75
7
85.19
表1 响应面试验设计与结果
Table 1 Response surface design arrangement and experimental results 变异来源平方和自由度均方F 值P 值显著性模型496.04862.0113.050.0001显著
A 102.711102.7121.620.0007
B 3.001 3.000.630.4439
C 28.31128.31 5.960.0328A 224.35124.35 5.130.0448B 227.36127.36 5.760.0353C
2
270.191270.1956.86＜0.0001AB 27.27127.27 5.740.0355AC 42.46142.468.940.0123残差52.2711 4.75失拟项41.496 6.91 3.21
0.1110
不显著
纯误差10.795 2.16
总变异
548.31
19
表2 响应面试验结果分析表
Table 2 Analysis of variance for fitted regression model
注：B C 项是不显著项，数据未列出。
对表1试验数据进行多元线性回归拟合，对模型进行方差分析及显著性检验，采用手动优化的方法对设计进行优化，去掉对结果影响不显著的项，结果见表2。
从表2可以看出，模型及失拟项的P 值分别为0.0001和0.1110，表明该模型拟合良好。其中温度和pH 值对响应值有显著的交互作用，温度和时间的交互作用次之。
2.3.2羟自由基清除率的响应面分析
图7 酶解时间对清除羟自由基的影响
Fig.7 Effect of hydrolysis duration on hydroxyl free radical scaveng-ing rate of loach muscle hydrolysate
9796959493929190898887
清除率
清除率/%
时间/min
30
45
6075
90
DH
2520151050
DH/%
由图8可见，当pH 值和酶解时间不变时，随着酶解温度的升高，自由基清除率升高，增幅比较显著，增加到一定程度后，变化不太明显；当pH 值和酶解温度不变时，自由基清除率随着酶解时间的增加而升高，当时间增加到一定程度时，自由基清除率基本上趋于平稳。由图9可见，当pH 值和酶解时间不变时，随着酶解温度的升高，自由基清除率升高，增幅比较显著，增加到一定程度后，基本上趋于平稳；当酶解时间和酶解温度不变时，自由基清除率随着p H 值的升高而升高，且在pH 值比较低时增幅比较显著，随着pH 值进一步提高，清除率逐渐下降。
图8 时间、温度交互作用对清除率影响的等高线图和响应曲面图Fig.8 Response surface and contour plots revealing the interactive effects of hydrolysis temperature and duration on hydroxyl free radical
scavenging rate of loach muscle hydrolysate
100.1497.2794.4091.5388.66
75.067.560.052.545.045.047.550.052.555.0时间/m i n 温
度
/℃羟自由基清除率/%
75.067.560.052.545.0
97.23时间/m i n
温度/℃
45.0
47.5
50.052.555.0
98.77
95.7094.1692.636
2.3.3最佳酶解工艺验证
经软件优化后得到酶解的最佳条件为：酶解温度54.48℃、酶解时间59.97min 、pH6.47、固液比1:4、加酶量0.2%，清除率预测值为99.52%。在该条件下重复3次实验，测得的羟自由基清除率均值为(99.03±0.24)%，通过SPSS V13.0软件做t 检验，置信区间为97.52%～99.57%，与预测值无显著差异，说明模型与实际相符，具有实际指导意义。酶解物的水解度为24.6%，IC 50为0.57mg/mL ，说明优化后的酶解条件可有效提高功能肽的制备效率。2.4酶解物的相对分子质量分布
2.4.1
标准曲线
测定Sephadex G-15凝胶柱的V 0为17.95mL ，V t 为
39.94mL ，由各标准物的保留时间计算出相应的V e ，进而计算出有效分配系数K av ，制作标准曲线，得标准曲线回归方程为y =－1.2895x +4.3499，R 2=0.9978。2.4.2
酶解物的相对分子质量分布及清除率的测定
3结 论
3.1通过对酶解进程及羟自由基清除能力研究发现，水解度与清除能力之间没有相关性，酶法制备功能肽的关键可能在于选择适合的酶及酶解条件的优化。
3.2菠萝蛋白酶作为酶解泥鳅肉制备具有清除羟自由基活性肽的水解酶要优于复合风味蛋白酶、复合蛋白酶、胰蛋白酶和胃蛋白酶。
3.3响应面分析法优化酶解工艺条件是可行的，优化得到的最佳酶解条件为：加酶量0.2%、温度5
4.48℃、时间59.97min 、pH 6.47、固液比1:4，酶解物对羟自由基的清除率为99.03%，IC 50为0.57mg/mL 。酶解液中活性肽的相对分子质量范围为1129～2344。
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图11 各分离组分的相对分子质量和对羟自由基的清除率Fig.11 Comparisons on relative molecular mass and hydroxyl free radical scavenging rate of various separated fractions of loach muscle
hydrolysate obtained under optimized hydrolysis conditions
25002000150010005000
相对分子质量
峰号
1
2
34
相对分子质量1/IC 50
5.04.54.03.53.02.52.01.5 1.00.50.0
1/IC 50/(mL/mg)
图10 泥鳅肉酶解液Sephadex G-15层析图
Fig.10 Sephadex G-15 gel chromatographic fractionation of loach muscle hydrolysate obtained under optimized hydrolysis conditions
0.70.60.50.40.30.20.10.0－0.1
A U
时间/min
60
120
－44.69
－66.56
－90.77
－115.73
7.006.756.506.25
6.00
p H
温度/℃
45.0
47.5
50.052.5
55.0
98.77
697.23
95.7094.1692.63
92.63
图9 pH 值、温度交互作用对清除率影响的等高线图和响应曲面图Fig.9 Response surface and contour plots revealing the interactive effects of hydrolysis temperature and pH on hydroxyl free radical
scavenging rate of loach muscle hydrolysate
6.75 6.256.0045.04
7.550.0
52.555.0p H 温
度/℃
羟自由基清除率/% 6.50由图10、11可见，具有较高羟自由基清除率的酶解物主要为第1洗脱峰和第2洗脱峰。峰1相对分子质量为2344，IC 50为0.36mg/mL ；第2峰的相对分子质量
为1129，IC 50为0.21mg/mL ，因此泥鳅肉酶解物抗氧化活性肽是相对分子质量范围在1129～2344的活性肽，经Sephadex G-15层析分离后的组分较酶解物对羟自由基的清除能力有很大提高(IC 50下降)。
羟基自由基清除注意事项
一般而言，对于Fenton试剂与有机化合物氧化能力的影响因素大致上可分为： A.亚铁离子浓度。 B.过氧化氢浓度。 C.溶液于反应时的反应温度。 D.溶液中的pH值。 以下将对此四项变因做详细的探讨： A.亚铁离子浓度的影响 在Fenton试剂的反应中，亚铁离子主要是扮演着催化过氧化氢的角色。因此，若溶液中没有亚铁离子当触媒，则其溶液可能就没有氢氧自由基的生成。所以，大致上分解反应会随亚铁离子的浓度增加而加快，亚铁添加量会影响脱色效率，亚铁剂量愈高效果愈佳，此原因为增加亚铁剂量将使氧化反应更加完全并且可产生混凝机制而进行脱色(26)。但亚铁离子本身会与有机物形成竞争，亚铁离子浓度过高会增加氢氧自由基的消耗，反而造成处理效果的下降，反应式如下： Fe2+ + ·OH Fe3+ + OH- 故当浓度到达某一定值时，则其分解速率便不会在随着亚铁离子浓度的增加而持续加快，且亚铁离子浓度和生成物的比值也将可能会影响生成物的分布。一般而言，亚铁离子浓度皆维持在亚铁离子与其反应物之浓度比值为1：10-50(wt/wt)。 此外，亚铁在Fenton程序中除了扮演催化过氧化氢的角色外，亦具有混凝的功能，因此过量的铁离子加入将会造成过度的混凝，降低Fenton程序处理的效果，其可能的反应如下所示: B.过氧化氢浓度的影响 反应过程中，过氧化氢的浓度会直接影响氧化有机物的效果。一般而言，随着过氧化氢添加量的增加，有机物的氧化效果亦将随之提升，并且过氧化氢的添加浓度不同，则分解反应生成的产物将会有所差异。大致而言，在过氧化氢浓度越高的情况下，则其氧化反应产物，将会更趋近于最终产物。但是，当溶液中的过氧化氢浓度过高时，反而会使过氧化氢与有机物竞争氢氧自由基，而造成反应速率的结果可能不如预期一般增加。此外，当Fenton试剂系统中过氧化氢浓度远高于亚铁离子浓度时，Fenton法所产生的氢氧自由基会与过氧化氢反应产生perhydroxyl radical (HO2．)及一系列反应，且三价铁离子会与HO2．进行氧化还原反应生成superoxide radical anion (O2．)，造成过氧化氢消耗量的增加，过量的过氧化氢加药量并不必然增加氢氧自由基的浓度，氢氧自由基达到稳定浓度所需反应时间随加药量增加而增加(27)。因此，若以连续之方式加入低浓度之过氧化氢，减少因为过氧化氢初始浓度过高所导致的抑制效应，亦可得到较好的氧化效果。 C.温度的影响 根据Arrhennius' Law：k=k0exp(-Ea/RT)可得知温度的改变会影响活化能及反应速率常数，进而影响反应速率。 对于Fenton试剂反应而言，一般若选用的反应温度条件是在小于20℃以下时，其对有机物的氧化速率将会随温度升高而加快。但是，倘若将其反应的温度升高至40-50℃时，其Fenton反应将会可能因为温度过高，进而使过氧化氢自行分解成水与氧(2H2O2 → 2H2O + O2 )，造成Fenton试剂对氧化有机物之反应速率减慢。 因此，当过氧化氢浓度超过10-20 g/L时，在其经济与安全的考量下，应谨慎选择适当的温度。在一般商业应用上，通常皆将其反应的温度设定在20-40℃之间。 D. pH值的影响 于Fenton试剂反应中，其反应溶液之pH值对Fenton法之影响，关系到铁离子错合效应、铁
超氧自由基清除能力测定法-操作图解
超氧自由基（·O2-）的清除能力测定法（连苯三酚自氧 化法） （适用于：SOD及各种抗氧化剂） 操作图解 具体方法 1 溶液配制 1.1 Tris溶液（0.1mol/L）：1.21 gTris（三羟甲基氨基甲烷，M.W. 121.1）+100 mL蒸馏水。 1.2 HCl溶液（0.1mol/L）：取0.1 mL浓盐酸，加蒸馏水稀释到6 mL。 1.3 Tris-HCl缓冲液（0.05mol/L，pH7.4，含1mmol/L Na2EDTA） 40 mL0.1 mol/L Tris溶液+ x mL0.1 mol/L HCl溶液+15.2 mg Na2EDTA，混合，稀释到80 mL。用pH 计测量，pH应为7.4。用棕色瓶保存在冰箱内(最多保存三天) 。（以上为一个样品的用量）用前稍热至室温，再测pH值，符合要求即可。 1.4 60 mmol/L连苯三酚溶液（溶于1 mmol/L盐酸中） 取0.1mol/L HCl溶液（见1.2项）20μL，用蒸馏水稀释到2 mL，得1 mmol/L盐酸溶液（用pH计测量，pH＝2.5-3.0）。再往里加连苯三酚14.6 mg (M。W.126.1 )，即得。（当天有效,以上为1个样品的用量）。 2 测试液 2.1连苯三酚溶液：取2950μL Tris-HCl缓冲液加入到石英比色皿中，再加约50μL连苯三酚溶液，迅速混合(颠覆式)，开始计时,每隔30秒读数一次A值（325nm），至300秒（5min）时为止。（空白参比：Tris-HCl 缓冲液） ΔA＝A325nm,300s - A325nm,30s。由于ΔA值反映了生成·O2的初始浓度，所以，对于同一批实验而言，此时的ΔA值必须相等。此时的ΔA为ΔA0。 3.2 样品溶液：取xμL样品溶液加入到大石英比色皿中，再加（2950-x）μL Tris-HCl缓冲液，再加50μL 连苯三酚溶液，迅速混合(颠覆式)，开始计时,每隔30秒读数一次（A值，325nm），至300秒时为止。（空白参比：Tris-HCl缓冲液） ΔA＝A325nm,300s - A325nm,30s。此时的ΔA为ΔA样。 3 计算公式
DPPH自由基清除法
DPPH自由基清除法 李熙灿/Xican Li （广州中医药大学） [文献] Xican Li, Jing Lin, Yaoxiang Gao, Weijuang Han, Dongfeng Chen. Antioxidant activity and mechanism of Rhizoma Cimicifugae. Chemistry Central Journal. 2012; 6(1):140. [原理] DPPH（1,1-Diphenyl-2-picrylhydrazyl radical）即1,1-二苯基-2-苦基肼基自由基。分子中，由于存在多个吸电子的-NO2和苯环的大π键，所以，氮自由基能稳定存在。 N 2 2 当DPPH自由基被清除，其最大吸收波长519nm处的吸光度A值随之减小。DPPH这种稳定的自由基为清除自由基活性的检测提供了一个理想而又简单的药理模型。 [实验步骤] 1.1 DPPH测试液的配制 取DPPH 1mg溶于约20mL溶剂（乙醇、95乙醇或甲醇）中，超声5min，充分振摇，务使上下各部分均匀。取1mL 该DPPH溶液，在519nm处测A值，使A＝1.2-1.3之间最佳。该DPPH溶液最好避光保存，3.5小时内用完。 1.2 样品液的配制 样品用合适的溶剂溶解，为便于计算，可配成1mg/mL浓度。溶剂根据样品的极性进行选择，首选95乙醇或无水乙醇，如不溶可用DMSO。 1.3 预试 取DPPH溶液2mL，往其中加少量样品液，加样时，先少后多渐加，边加边混合，并观察溶液的褪色情况，当溶液颜色基本褪去时，记下样品的加样量。 此加样量即为样品的最大用量，在此最大用量的基础上，往前设置5个用量，使之成等差数列。 【如】在预试过程中，发现加样到200μL时，DPPH溶液颜色基本褪去，则100μL为该样品液的最大用量。其用量梯度宜设为40、80、120 、160、200μL。 1.4测量 A0值的测量：取DPPH溶液2 mL加入到小试管（或玻璃瓶）中，加95乙醇（或无水乙醇）1mL，充分混合，测A值（519nm），此A值为A0（A0多在0.7-0.9之间）。 A值的测量：取DPPH溶液2mL加入到小试管（或玻璃瓶）中，加样品液xμL （x是根据1.3 预试结果确定样品液的用量），再加（1000 -x）μL 95乙醇（或无水乙醇），混合，静置30分钟后，测A值（519nm）。如：某样品的用量梯度为40、80、120 、160、200μL，则加样表如下： 表1 加样表 1.5 正式测量
羟自由基清除率检测试剂盒(Fenton比色法)
茶多酚(TP)检测试剂盒(酒石酸铁微板法) 简介： 茶多酚(Tea Polyphenols，TP)是茶叶中多酚类物质的总称，包括黄烷醇类、花色苷类、黄酮类、黄酮醇类和酚酸类等，是一类儿茶素为主体的黄酮化合物，儿茶素占60~80%，具有C6-C3-C6碳骨架结构，是一种重要的天然抗氧化物质，能够清除自由基。类物质茶多酚又称茶鞣或茶单宁，是形成茶叶色香味的主要成份之一，也是茶叶中有保健功能的主要成份之一。研究表明，茶多酚等活性物质具解毒和抗辐射作用，能有效地阻止放射性物质侵入骨髓，并可使锶90和钴60迅速排出体外。 Leagene 茶多酚(TP)检测试剂盒(酒石酸铁微板法)检测原理是以酒石酸铁为底物，利用茶多酚与酒石酸铁反应，生成稳定化合物，以酶标仪测定吸光度，在一定范围内吸光度与颜色深浅的变化成正比，与标准曲线比较，进而计算茶多酚含量。该试剂盒主要用于测定植物组织、血清等样品中茶多酚含量，尤其适用于测定茶叶中茶多酚含量。该试剂盒仅用于科研领域，不宜用于临床诊断或其他用途。 组成： 自备材料： 1、蒸馏水 2、研钵 3、离心管或试管 4、水浴锅或电炉 5、200目细胞筛或滤纸 6、离心机 7、96孔板 8、酶标仪 操作步骤(仅供参考)： 1、配制茶多酚标准：取干净离心管或试管和茶多酚标准(1mg/ml)，按下表进行操作，依 编号 名称 TO1201100T Storage 试剂(A):茶多酚标准(1mg/ml)1ml 4℃避光试剂(B):TP Assay buffer 2×500ml 4℃试剂(C):TP 显色液5ml 4℃避光使用说明书 1份
次稀释。 加入物(μl)12345 茶多酚标准(1mg/ml)48121620 TP Assay buffer196192188184180 相当于茶多酚含量(μg/ml)20406080100 2、准备样品： ①植物样品：取植物组织，研磨成粉末。煮沸TP Assay buffer，将粉末完全加入TP Assay buffer中，沸水浴，用细胞筛或滤纸过滤。滤渣再继续置于新的煮沸TP Assay buffer中，沸水浴，用200目细胞筛或滤纸过滤，合并两次滤液。离心，取上清液，即为茶多酚提取液。4℃避光保存，用于茶多酚的检测。 ②血浆、血清和尿液样品：血浆、血清按照常规方法制备后可以直接用于本试剂盒的测定，4℃避光保存，用于茶多酚的检测。 ③细胞或组织样品：取恰当细胞或组织裂解液，如有必要用TP Assay buffer进行适当匀浆，离心15min，取上清液，即为茶多酚提取液。4℃避光保存，用于茶多酚的检测。 ④高浓度样品：如果样品中含有较浓度的茶多酚，可以使用TP Assay buffer进行恰当的稀释。 3、TP加样：取96孔板，按照下表设置空白孔、对照孔、测定孔，溶液应按照顺序依次加 入，并注意避免产生气泡。如果样品中的TP浓度过高，可以减少样品用量或适当稀释后再进行测定。样品的检测最好能设置2平行孔，求平均值。 加入物(μl)空白孔标准孔测定孔 TP Assay buffer200150150 系列茶多酚标准(1-5号)－50－ 待测样品－－50 TP显色液505050 4、TP测定：以空白调零，以酶标仪测定540nm处标准孔、测定孔的吸光度。 计算： 以系列茶多酚标准浓度(1-5号)(20、40、60、80、100μg/ml)为横坐标，以对应的吸光度为纵坐标，绘制标准曲线，求得回归方程。以测定孔吸光度代入回归方程求得提取液中TP含量。 组织样本TP含量(μg/g)=(C×V T)/(W×V S) 式中：C=根据标准曲线求得提取液中茶多酚含量(μg/ml) V T=提取液的总体积(ml)
线粒体自由基与衰老之间的关系
线粒体自由基与衰老之间的关系 一、线粒体简介 动物的线粒体DNA（mtDNA）是裸露环形双螺旋。两条链一条是重链，一条是轻链。除mtDNA外，线粒体还拥有自身转录RNA体系。线粒体是半自主性细胞器，其遗传物质可自我复制，能编码13种多肽，并在线粒体核糖体上合成。 二、衰老 衰老是一种复杂的病理生理现象, 衰老机理的研究目前已 从整体水平、器官水平、细胞水平发展到分子水平。近年来大量研究表明, 衰老的发展过程与线粒体( mitochondrion, MT ) 功能异常密 切相关, 目前自由基被视为引发衰老的一个重要因素。 三、线粒体与衰老 线粒体是直接利用氧气制造能量的部位，90%以上吸入体内的氧气被线粒体消耗掉。任何事物都有其两面性，氧 是个“双刃剑”，一方面生物体利用氧分子制造能量，另一 方面氧分子在被利用的过程中会产生极活泼的中间体（活 性氧自由基）伤害生物体造成氧毒性。生物体就是在不断 地与氧毒性进行斗争中求得生存和发展的，氧毒性的存在 是生物体衰老的最原初的原因。线粒体利用氧分子的同时 也不断受到氧毒性的伤害，线粒体损伤超过一定限度，细 胞就会衰老死亡。
1.线粒体自由甚的产生 自由基是只带有未配对电子的粒子, 化学性质极为活跃, 易对机体产生迅速而强烈的损伤, 主要包括ROS和活性氮基因(RNS)。 氧自由基主要来源于线粒体呼吸链反应, 这里可产生活细胞内90%以上的自由基。正常情况下电子通过呼吸链传递给氧生成, 如果线粒体功能下降, 会使氧不能被有效利用, 导致大量电子漏出, 直接对氧进行单电子还原, 生成氧气离子。氧气离子又可被位于线粒体基质的超氧化物歧化酶（Mn一SOD）歧化成氧气和双氧水, 因此电子漏是细胞内的恒定来源, 电子漏出增加, ROS产生增加。 2.线粒体权自由基随年龄增长而增加的机制 线粒体内随年龄增长不断积聚有三方面的原因一方面由于线粒体电子传递链的活性下降, 电子漏和质子漏不断增加;另一方面与年龄相关的线粒体的突变可降低其编码的呼吸链成分的功能, 为电子漏出提供条件, 导致氧自由基产生增加;第三, 线粒体内抗氧化酶活性不断下降,自由基清除减少亦是重要原因之一。 3.线粒体权自由甚在细胞衰老中的作用 氧化应激是细胞衰老的重要原因之一, 而ROS参与各种氧化反应如脂质过氧化和蛋白质拨基化等, 造成生物大分子的结构改变和功能丧失, 甚至引起基因突变、DNA复制停止等, 从
自由基清除剂
自由基清除剂 以下几种食物是很好的自由基清除剂，你不妨试一试： 一、茶：茶中的有效成分茶多酚是一种抗氧化剂物质，凡经常饮茶的地区，其居民患癌症的几率较低。由此可见，茶多酚能消除自由基防止癌症的发生。 二、葡萄：葡萄中含有大量多酚类物质，其中最重要的是原花青素(0PC)——此物质具有抗自由基、保护心脑血管、调节血脂、预防高血压、抗肿瘤等多种作用。原花青素主要存在于葡萄籽和皮中，吃葡萄时，可以将籽与肉嚼碎同食。 三、苹果：苹果在所有的水果中是口碑最好的，而且适合不同年龄、不同体格的人。研究发现，常喝苹果汁会降低心脏病的患病率。这是因为苹果汁中的抗氧化剂有利于心脏的健康运转。 四、番茄：番茄含有番茄红素，一种抗氧化剂物质。食物的生熟很重要。如果食用的番茄是生的，它们的总抗氧化剂潜能大约为80。如果将番茄煮熟或装入罐中，它们的总抗氧化剂潜能就会增长5-6倍。五、菠菜：其含有大量β-胡萝卜素和铁，还有大量的α-硫辛酸，能提供给人体丰富的营养。菠菜中的大量抗氧化剂，既能激活大脑功能，又可增强青春活力，有助于防大脑的老化和老年痴呆。 六、山楂：所含有的黄酮类物质和维生素C、胡萝卜素等能阻断并减少自由基的生成，增强机体的免疫力，还有防衰老、抗癌的作用。 七、胡萝卜：胡萝卜不仅能够增强人体免疫力，有抗癌作用，它更含有丰富的胡萝卜素，胡萝卜素可以清除致人衰老的单线态氧和自由
基，减缓人体衰老的过程，防止皮肤老化。 八、黄豆：含有异黄酮和黄豆皂甙，是一种天然抗氧化剂，同时具有弱雌性激素作用。常喝豆浆可以明显减弱妇女更年期症状，而且还有防癌和预防老年痴呆症的作用。对女性有很好的美容养颜的功效。 九、大蒜：大蒜中的大蒜素有较强的抗自由基能力。大蒜切开在空气中被氧化需要15分钟以上。
清除自由基能力的研究概况
清除自由基能力的研究概况 陶涛 （西南林业大学林学院农学（药用植物）昆明 650224） 摘要：自由基及其诱导的氧化反应是导致生物衰老和某些疾病如癌症、糖尿病、一心血管疾病等的重要因素。乳酸茵作为一种高效、低毒的生物源天然抗氧化荆，正逐步受到食品、制药、化工等领域的广泛关注。就目前国内外常用的乳酸茵抗氧化活性的筛选方法、乳酸茵抗氧化机理的国内外研究进展及未来的发展趋势作一综述。 关键词：自由基；乳酸茵；抗氧化． Study on the scavenging ability of lactic acid bacteria on free radical bstract：Free radical and its inducing oxiditative reaction may CaUSe biological doat and certain diseases such as Cancers，diabetes and the cat- diovascular．The lactic acid baaeria as one ofbiological SOUrCeS oxidation inhibitor is becoming more and more popular in the fields offood．，drug manufacture and chemical industry．This article mainly reviews the screening methods for antioxidative of lactic add bacteria among domestic and foreign countries，the advance of the research progress in lactic add bacteria antioxidative and r∞earch trends in future． 引言 氧化过程可以提供能量．对大多数生物体来说，是维持生命必不可少的一个能量转化过程。但过多的氧化过程会对生物大分子引起损伤．氧化损伤主要是由于自由基和过氧化产物作用于人体而产生的。 自由基(free radicals)27．．称游离基．为人体氧化代谢过程中形成含有一个不成对电子的原子或原子团。人体的自由基主要包括超氧阴离子自由基(o2)、
自由基
自由基 自由基是指能够独立存在的，含有一个或多个未成对电子的分子或分子的一部分。由于自由基中含有未成对电子，具有配对的倾向。因此大多数自由基都很活泼，具有高度的化学活性。自由基的配对反应过程，又会形成新的自由基。在正常情况下，人体内的自由基是处于不断产生与清除的动态平衡之中。自由基是机体有效的防御系统，如不能维持一定水平的自由基则会对机体的生命活动带来不利影响。但自由基产生过多或清除过慢，它通过攻击生命大分子物质及各种细胞，会造成机体在分子水平、细胞水平及组织器官水平的各种损伤，加速机体的衰老进程并诱发各种疾病。 自由基过量产生的原因 1、人体非正常代谢产物 2、有毒化学品接触 3、毒品、吸烟、酗酒 4、长时间的日晒 5、长期生活在富氧/缺氧环境 6、环境污染因素 7、过量运动 8、疾病 9、不健康的饮食习惯（营养过剩以及脂肪摄入过量）10、辐射污染11、心理因素 自由基对生命大分子的损害 ★由于自由基高度的活泼性与极强的氧化反应能力，能通过氧化作用来攻击其所遇到的任何分子，使机体内大分子物质产生过氧化变性，交联或断裂，从而引起细胞结构和功能的破坏，导致机体组织损害和器官退行性变化。 ★自由基作用于核酸类物质会引起一系列的化学变化，诸如氨基或羟基的脱除、碱基与核糖连接键的断裂、核糖的氧化和磷酸酯键的断裂等。 在体内以水分为介质环境中通过电离辐射诱导自由基的研究表明，大剂量辐射可直接使DNA断裂，小剂量辐射可使DNA主链断裂。 ★自由基对蛋白质的损害 自由基可直接作用于蛋白质，也可通过脂类过氧化产物间接与蛋白质产生破坏作用。 ★自由基对糖类的损害 自由基通过氧化性降解使多糖断裂，如影响脑脊液中的多糖，从而影响大脑的正常功能。自由基使核糖、脱氧核糖形成脱氢自由基，导致DNA主链断裂或碱基破坏，还可使细胞膜寡糖链中糖分子羟基氧化生成不饱和的羰基或聚合成双聚物，从而破坏细胞膜上的多糖结构，影响细胞免疫功能的发挥。 ★自由基对脂质的损害 脂质中的多不饱和脂肪酸由于含有多个双键而化学性质活泼，最易受自由基的破坏发生氧化反应。磷脂是构成生物膜的重要部分，因富含多不饱和的脂肪酸故极易受自由基所破坏。这将严重影响膜的各种生理功能，自由基对生物膜组织的破坏很严重，会引起细胞功能的极大紊乱。 自由基与疾病 (一)自由基与衰老 从古至今，依据对衰老机理的不同理解，人们提出各种各样的衰老学说多达300余种。自由基学说就是其中之一。反映出衰老本质的部分机理。 英国Harman于1956年率先提出自由基与机体衰老和疾病有关，接着在1957年发表了第一篇研究报告，阐述用含0.5％－1％自由基清除剂的的饲料喂养小鼠可延长寿命。由于自由基学说能比较清楚地解释机体衰老过程中出现的种种症状，如老年斑、皱纹及免疫力下降等，因此倍受关注，已为人们所普遍接受。自由基衰老理论的中心内容认为，衰老来自机体正常代谢过程中产生自由基随机而破坏性的作用结果，由自由基引起机体衰老的主要机制可以概括为以下三个方面。
自由基清除剂
第五章自由基清除剂 本章要点 1.自由基理论的产生机理及来源 2.自由基对机体活动的影响 3.自由基清除剂的基本概念 随着生命科学的飞速发展，英国人Harman于1956年提出了自由基学说。该学说认为，自由基攻击生命大分子造成组织细胞损伤，是引起机体衰老的根本原因，也是诱发肿瘤等恶性疾病的重要起因，其中的观点被越来越多的实验所证明。 自由基（Free radical）是人体生命活动中各种生化反应的中间代谢产物，具有高度的化学活性，是机体有效的防御系统，若不能维持一定水平则会影响机体的生命活动。但自由基产生过多而不能及时地清除，它就会攻击机体内的生命大分子物质及各种细胞器，造成机体在分子水平、细胞水平及组织器官水平的各种损伤，加速机体的衰老进程并诱发各种疾病。 近年来，国内外对自由基及自由基清除剂的研究十分活跃，在各类食品科学、生命科学及医学书籍上都有许多关于自由基及其清除剂的研究报道，自由基清除剂作为功能性食品的重要原料成分之一，通过人们日常消费的食品来调节人体内自由基的平衡，已受到食品营养学家的广泛重视。 第一节自由基理论 一、自由基的产生机理及来源 自由基又叫游离基，它是由单质或化合物的均裂（Homdytic Fission）而产生的带有未成对电子的原子或基团。它的单电子有强烈的配对倾向，倾向于以各种方式与其他原子基团结合，形成更稳定的结构，因而自由基非常活泼，成为许多反应的活性中间体。 人体内的自由基分为氧自由基和非氧自由基。氧自由基占主导地位，大约占自由基总量的95%。氧自由基包括超氧阴离子（O2－·）、过氧化氢分子（H2O2）、羟自由基（OH·）、氢过氧基（HO2－·）、烷过氧基（ROO·）、烷氧基（RO·）、氮氧自由基（NO·）、过氧亚硝酸盐（ONOO－）、氢过氧化物（ROOH）和单线态氧（1O2）等，它们又统称为活性氧（reactive oxygen species，ROS），都是人体内最为重要的自由基。非氧自由基主要有氢自由基（H·）和有机自由基（R·）等。 （一）自由基的产生 人体细胞在正常的代谢过程中，或者受到外界条件的刺激（如高压氧、高能辐射、抗癌剂、抗菌剂、杀虫剂、麻醉剂等药物，香烟烟雾和光化学空气污染物等作用），都会刺激机体产生活性氧自由基。 人体内酶催化反应是活性氧自由基产生的重要途径。人体细胞内的黄嘌呤氧化酶、髓过氧化物酶和NADPH氧化酶等在进行酶促催化反应时，会诱导产生大量的自由基中间产物。除酶促反应外，生物体内的非酶氧化还原反应，如核黄素、氢醌、亚铁血红素和铁硫蛋白等单电子氧化反应也会产生自由基。外界环境，如电离辐射和光分解等也能刺激机体产生自由基反应，如分子中的共价键均裂后即形成自由基。 自由基反应包含3个阶段，即引发、增长和终止阶段。反应之初，引发阶段占主导地位，反应体系中的新生自由基形成许多链的开端，反应物浓度高。引发后的扩展阶段为反应的主体，若起始有几个引发自
DPPH抗氧化能力测定
DPPH.法测定绿原酸清除自由基能力 2.1 待测液的制备 将绿原酸(纯度56%)、维生素C 和没食子酸分别配制成体积分数为0.1mg/mL 的无水乙醇溶液。 2.1.1 绿原酸母液的配制 称取 9.0 mg 绿原酸，定容到50ml ，即可得到绿原酸的母液0.1mg/mL 。然后，再将所配制的母液按照要求稀释成不同浓度的溶液。 分别为 mg/ml; mg/ml; mg/ml; mg/ml; mg/ml; mg/ml; mg/ml 。 2.1.2 Vc 母液的配制 称取 mg VC ，定容到100ml ，即可得到VC 的母液。然后，再将所配制的母液按照要求稀释成不同浓度的溶液。 分别为 mg/ml; mg/ml; mg/ml; mg/ml; mg/ml; mg/ml; mg/ml 。 2.1.3 没食子酸母液的配制 称取 mg 没食子酸，定容到100ml ，即可得到没食子酸的母液。然后，再将所配制的母液按照要求稀释成不同浓度的溶液。 分别为 mg/ml; mg/ml; mg/ml; mg/ml; mg/ml; mg/ml 。 2.1.4 DPPH 母液的配制 称取 mg DPPH ，用无水乙醇定容到100ml ，即可得到DPPH 的母液。然后，再将所配制的母液按照要求稀释成至一定浓度的溶液。C DPPH = mg/ml 。（建议用0.025mg/mL ） 2.2 DPPH.溶液的可见光谱 以无水乙醇为对照，在分光光度计上对DPPH.溶液进行在440～600nm 下扫描。A max = nm 2.3 抗氧化活性测定 DPPH.是一种稳定的自由基，它的乙醇溶液呈紫色，在可见光区最大吸收峰为 nm 。当DPPH.溶液中加入自由基清除剂时，溶液颜色变浅，517nm 处的吸光度变小，而吸光度变小的程度与自由基被清除的程度呈线性关系。因此，可用来检测自由基的清除情况，从而评价某物质的抗氧化能力，其能力用清除率(Scavenging Rate,SR)来表示，清除率越大，抗氧化能力越强 [4.5]。 具体实验步骤及方法： 精确吸取的DPPH.溶液2mL 与2ml 无水乙醇混合均匀后，以相对应的溶剂(4mL 无水乙醇)为对照，用分光光度计测定上述溶液在 nm 处的吸光度值(A 0)。 A 0= 2.3.1 绿原酸样品溶液的抗氧化能力测定 精确吸取上述不同浓度的绿原酸溶液2mL ，分别与浓度 mg/ml 的DPPH.溶液2mL 混合，摇匀后放置30min 。以相对应的溶剂(无水乙醇)为对照调零，用分光光度计分别测定上述溶液在 nm 处的吸光度值(A i )，分别测得A i 值。 A 1 ；A 2 ；A 3 ；A 4 ；A 5 ；A 6 ；A 7 。 精确吸取上述不同浓度的绿原酸溶液2mL ，分别与2mL 无水乙醇混合均匀后，以无水乙醇为对照，用分光光度计分别测定各混合液在波长 nm 处的吸光度值(A j )，分别测得A j 值。 A 1 ；A 2 ；A 3 ；A 4 ；A 5 ；A 6 ；A 7 。 将以上数据代入下列公式计算其清除率。 清除率SR(％)=%100A A A 10j i ???? ? ?? -- 其中， A i ：为2mL 绿原酸、维生素C 和没食子酸与 2mL 的DPPH.溶液混合后在波长 nm 处的吸光度值； A j ：为2mL 绿原酸、维生素C 和没食子酸分别与2mL 无水乙醇溶剂混合后在波长 nm 处的光值； A 0：2mLDPPH.溶液与2mL 无水乙醇溶剂混合后在波长 nm 处的吸光度值。
衰老与疾病的根源
衰老与疾病的根源 一、自由基—早已被锁定的罪魁祸首 早在20世纪40年代，科学家就发现生物体存在自由基信号。1956年美国人哈曼提出衰老自由基机理，认为自由基是衰老与疾病的元凶，被广泛接受。1969年美国人McCord 和Fridovich发现了SOD，证实活性氧自由基存在于生物体。1998年美国人菲希戈特、穆拉德、伊格纳罗三个人因发现氮氧自由基一起获得诺贝尔奖，更加扩大认识了各种不同自由基对机体的伤害。迄今历经数十年研究，人们已经证实，人类备受衰老和疾病折磨的真正原因是自由基对人体的侵害。它是危害人类健康的天然杀手。冠心病、心绞痛、心肌梗塞、脑血栓、脑溢血、高血压、高血脂、糖尿病、癌变、失眠便秘、关节疼痛、四肢麻木……这些常见的慢性疾病都是由于自由基造成的。 美国医学博士Harman于1956年率先提出自由基与机体衰老和疾病有关；接着在1957年发表了第一篇研究报告，阐述用含0.5%～1%自由基清除剂的饲料喂养小鼠可延长寿命。由于自由基学说能比较清楚地解释机体衰老过程中出现的种种症状，如老年斑、皱纹及免疫力下降等，因此倍受关注，20年后即1976年被西方主流医学所普遍接受。 自由基衰老理论的中心容认为，衰老来自机体遭受自由基侵害而发生的破坏性结果。 权威的疾病理论认为：体自由基对细胞成分，尤其是对血管血液的有害进攻是人体衰老和多种疾病的根本原因，而所有这一切都是自由基对人体细胞的一个慢性氧化的过程。所以要对抗自由基，就要找到一个强效的抗氧化剂，从源头上扼制疾病的发生。 二、过氧化给人类带来的损伤和疾病 氧在人体必不可少，然而过多的氧却会对人体造成不可挽回的损伤，引起多种慢性疾病，甚至产生急性氧中毒导致生命危险。这就是我们平常所说的过氧化损伤。 过量的氧能导致疾病？听起来不可思议，但事实就是如此。氧的化学特性很活泼，也很危险，在正常的生物化学反应中，氧会变得很不稳定，能够“氧化”邻近的分子，使得物质发生性质的改变，比如：切开的苹果会很短时间就出现棕褐色，铁会生锈等等。在人体，过度的氧化会引起细胞损伤，从而导致癌症、发炎、动脉损伤以及衰老。氧化对生物体的损害主要表现为自由基的链式反应受到破坏，导致生物膜结构功能发生改变；蛋白质对氧化也是很敏感的，尤其是其中的含硫氨基酸；DNA分子中的碱基和戊糖都是易氧化的位置，氧化可导致DNA断裂、碱基降解和与蛋白质交联，使得遗传物质发生变异或导致细胞死亡。 过氧化是诱发多种慢性疾病的重要原因。比如肿瘤，糖尿病及其并发症、血管硬化、心脑血管疾病、肾病、辐射损伤、免疫性疾病等等，都与其密切相关。
氧自由基与氧自由基清除剂依达拉奉
氧自由基与氧自由基清除剂依达拉奉 山东大学齐鲁医院麻醉科（250012）于金贵 一、氧自由基 （一）自由基的概念 自由基（free radical，FR）是指外层轨道上有未配对电子的原子、原子团、分子或离子的总称。因其含有未配对的电子，故化学性质非常活泼，极易与其生成部位的其他物质发生反应，而这种反应的最大特点是以连锁反应的形式进行。氧原子上有未配对电子的自由基称为氧自由基。人体吸入的分子氧，在正常状态下绝大多数（98%）都连接4个电子，它们最终与H+结合，代谢还原为H2O。但有极少数氧（1~2%）在代谢过程中被夺去或接受一个电子而形成活性氧，即氧自由基。 （二）氧自由基的生理作用 氧自由基在生理上是必需的物质，如合成ATP 和前列腺素、中性粒细胞杀灭细菌、酸性粒细胞杀灭寄生虫等过程都必须有氧自由基参与。氧自由基在体内的生成与清除保持动态平衡，且在体内存在时间甚短。由于其化学性极强，反应剧烈，过量产生会对机体造成极大危害。 （三）氧自由基的种类及其作用
1. 超氧化物阴离子：氧自由基连锁反应的启动者，使生物膜、激素和脂肪酸过氧化。 2. 羟自由基（OH∙）：作用最强的自由基，可破坏氨基酸、蛋白质、核酸和糖类。 3. 过氧化氢（H2O2）：过渡型氧化剂，主要使巯基氧化，可氧化不饱和脂肪酸。 4. 单线态分子氧（1O2）：氧分子的激发状态，亲电子性强，在光作用下可由O2直接产生，对细胞有杀伤作用。 5. 其他含氧的自由基如脂质过氧化物（ROOH）：易于分解再产生自由基，腐化脂肪，破坏DNA，可与蛋白质交联使之形成变性交聚物。 （四）机体抗氧化机制 机制一：直接提供电子，以确保氧自由基还原；机制二：增强抗氧化酶的活性，以有效地消除或抵御氧自由基的破坏作用如酶类抗氧化剂超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化氢酶（CAT）、谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-PX）；非酶类抗氧化剂如维生素E、维生素C、辅酶Q、还原型谷胱甘肽（GSH）、葡萄糖、含硫氨基酸和不饱和脂肪酸等。 SOD多存在于细胞的线粒体内，作用是将氧自由基歧化，将其一半转变成H2O，另一半转变成O2，从而清除氧自由基。CAT是血红蛋白酶类之一，作用是分解H2O2，并将其清除之。
DPPH和ABTS、PTIO自由基清除实验-操作图解-李熙灿-Xican-Li
DPPH?和ABTS+?自由基清除实验（含PTIO?自由基清除实验)：详细说明与疑难解答 李熙灿（广州中医药大学中药学院, 2019.7） （以下内容系来源于实验经验及三个参考文献[1]Li, X., Comparative Study of 1,1-Diphenyl-2-picryl-hydrazyl Radical (DPPH?) Scavenging Capacity of the Antioxidant Xanthones Family. Chemistryselect, 2018. 3,13081-13086. [2]Li, X.; Ouyang, X.; Cai, R.; Chen, D. 3’,8”-Dimerization Enhances the Antioxidant Capacity of Flavonoids: Evid ence from Acacetin and Isoginkgetin. 2019, Molecules. 24, 2039. [3]Li, X.C., 2-Phenyl-4,4,5,5-tetramethylimidazoline-1-oxyl 3-Oxid e (PTIO?) Radical Scavenging: A New and Simpl e Antioxidant Assay In Vitro. J. Agric. Food Chem., 2017. 65,6288-6297 【概述】DPPH?、ABTS+?、PTIO?自由基三者，都是常用的自由基。概述如下表： 1
紫色墨绿色蓝紫色 2
3
如何清除体内自由基
如何清除体内自由基 消除体内自由基，应该要了解自由基的来源，从外界到身体内部的代谢一起中和性的描叙不要单方面的讲叙体内各种酶与自由基之间的关系 人体内的自由基有两个来源：其一是来自环境，如环境污染、食品污染、过度的紫外线照射和各种辐射、杀虫剂、室内外废气、吸烟、二手烟、酗酒、工作压力、生活不规律等等，都会直接导致人体内产生过多的自由基（活性氧）；食品添加剂、食用脂肪和熏炸烤肉、某些抗癌药物、安眠药、抗生素、有机物腐烂物、塑料用品制造过程、油漆干燥挥发、石棉粉尘、空气污染、化学致癌物、大气中的臭氧等也都能诱发人体内产生自由基。 其二是来自体内，人体内组织细胞的新陈代谢也会产生自由基，这是人体代谢过程的正常产物，十分活跃又极不稳定，它们会附着于健康细胞之上，再慢慢瓦解健康细胞，而被破坏的细胞则又再转而侵害更多健康的细胞，如此恶性循环从而导致人体的衰老和疾病的发生。另外，组织器官损伤后的缺血一段时间后又突然恢复供血(即重灌流)，如心肌梗塞、脑血栓、外伤、外科手术后，自由基会大量生成。正常人体有一套清除自由基的系统，但这个系统的力量会因人的年龄增长及体质改变而减弱，致使自由基的负面效应大大增强，引起多种疾病发病率的提高。活性氧自由基对人体的损害实际上是一种氧化过程。因此，要降低自由基的损害，就要从抗氧化做起。 听说过抗氧化剂吗？它对人体的健康可是有着密切的关系。既然自由基不仅存在于人体内，也来自于人体外，那么，降低自由基危害的途径也有两条：一是，利用内源性自由基清除系统清除体内多余自由基；二是发掘外源性抗氧化剂——自由基清除剂，阻断自由基对人体的入侵。 大量研究已经证实，人体内本身就具有清除多余自由基的能力，这主要是靠内源性自由基清除系统，它包括超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化氢酶、谷胱甘肽过氧化物酶等一些酶和维生素C、维生素E、还原型谷胱甘肽、β-胡萝卜素和硒等一些抗氧化剂。酶类物质可以使体内的活性氧自由基变为活性较低的物质，从而削弱它们对肌体的攻击力。酶的防御作用仅限于细胞内，而抗氧化剂有些作用于细胞膜，有些则是在细胞外就可起到防御作用。这些物质就深藏于我们体内，只要保持它们的量和活力它们就会发挥清除多余自由基的能力，使我们体内的自由基保持平衡。 要降低自由基对人体的危害，除了依靠体内自由基清除系统外，还要寻找和发掘外源性自由基清除剂，利用这些物质作为替身，让它们在自由基进入人体之前就先与自由基结合，以阻断外界是自由基的攻击，使人体免受伤害。在自然界中，可以作用于自由基的抗氧化剂范围很广，种类极多。目前，国内外已陆续发现许多有价值的天然抗氧化剂。如β－胡萝卜素（维生素A）、维生素C、维生素E、番茄红素、辅酶q10、等等。此外，我国很多中草药植物中的有效成分都是天然抗氧化剂，例如，银杏黄酮、甘草黄酮等，另外还有巴西菇、灰树花、茯苓、黄芪、丹参、银杏、枸杞、灵芝、人参......。 吃什么可以减少体内自由基 在正常的生命过程中，自由基为维持生命所必需。体内自由基不断产生，也不断地被清除，两者 处于动态平衡之中，使之维持在一个正常的生理水平上。自由基在生物体内具有参与吞噬病原体，参 与前列腺素和凝血酶原的合成、解毒，参与体内部分生化反应和胶原蛋白的合成，调节细胞增殖与分化，参与机体免疫和环核苷酸的生物合成，以及生殖和胚胎发育等重要的生理功能。但是当自由基过 量时，自由基在机体内损伤蛋白质、核酸和生物膜，导致细胞凋亡，并参与许多疾病的发病过程。 由基清除剂即抗氧化剂清除机体自由基，保护机体免受氧化损害中起重要作用。因此，近年来对 自由基清除剂的研究备受关注。多吃点抗氧化剂食物有利于减少体内多余自由基。 方法/步骤 1.全面复方自由基清除剂：葡茶多酚胶囊。适当吃葡茶多酚可以全面清除体内多余自由
简述抗氧化和延缓衰老的区别
简述抗氧化和延缓衰老的区别在卫生部原来批准的保健功能中没有“抗氧化”，只有“延缓衰老”，在颁布新标准后，很多人以为“抗氧化”就是“延缓衰老”，而实际上，“延缓衰老”只是“抗氧化”的主要作用之一。 由于化学制剂的大量使用、汽车尾气和工业生产废气的增加等，令环境污染日趋严重，自由基与日俱增;而人们每天处于电视屏幕、电脑屏幕、复印机、手机等现代化工具的大量辐射中，射线可加速细胞的氧化，使自由基在体内乱窜，加速老化。除此之外，吸烟、酗酒、运动过度、压力过大、食用过多的加工食品，过度摄取油脂等也会诱导过多自由基产生。这些骤然增加的自由基超过了生命所能正常保持平衡的标准，令人体应接不暇，皮肤可能出现皱纹、斑点等老化现象，而内脏器官与血管也会因过度氧化而产生老化与功能衰退，这是引起心脑血管疾病、高血压、糖尿病等退化性疾病的主要因素。 不要以为“抗氧化”就是“延缓衰老”，而实际上，“延缓衰老”只是“抗氧化”的主要作用之一。抗氧化物的定义为“任何以低浓度存在就能有效抑制自由基的氧化反应的物质”，其作用机理可以是直接作用在自由基，或是间接消耗容易生成自由基的物质，防止发生进一步反应。人体在不可避免地产生自由基的同时，也在自然产生着抵抗自由基的抗氧化物质，以抵消自由基对人体细胞的氧化攻击。研究证明，人体的抗氧化系统是一个可与免疫系统相比拟的、具有完
善和复杂的功能的系统，机体抗氧化的能力越强，就越健康，生命也越长。 我们都知道，人体每天都需要能量的补充，吃的食物在体内经消化代谢，氧化产生能量。在这一过程中会产生自由基，它对酶蛋白活性有破坏作用，进而加速细胞的衰老。 人体自身有抗氧化能力，这种能力来源于一种酶，这种酶可以对自由基进行分解， 医学界把它称没为人体的‘清道夫‘。但是，随着年龄的增长，人体内的酶活性下降，最后体内的抗氧化能力就无力清除那些不断积蓄下来的自由基。 清除自由基目前最好的方法就是用抗氧化及帮助人体提高抗氧化能力，通过提高人体抗氧化能力来降低体内自由基的积蓄。 目前，抗衰老医学，普遍使用抗氧化剂类药物，来提高人体抗氧化能力来减少体内自由基的积蓄。 自由基与衰老及治疗。自由基学说认为;人之所以会出现身体机能衰退，除要使体内积蓄的自由基过多。这不仅干扰了人体内其他正常细胞的代谢功能，自由基自身还能引发一系列的连锁反应。自由基是机体代谢过程中不断产生的毒性物质，并由于这种自由基的连锁反
清除自由基研究方法汇总
电子自旋共振法（ESR）、高效液相色谱法、化学发光法、比色法、分光光度法 自由基清除剂也称为抗氧化剂，可清除体内多余的自由基，减轻它们对机体的损伤。目前常用超氧阴离子自由基体系（O2-·）、羟基自由基体系（·OH）、二苯代苦味酰基自由基体系（DPPH·）对某抗氧化剂的体外清除自由基能力进行了研究。 其中ESR法和气相色谱法、HPLC 法对自由基的检测灵敏度高，但对设备要求较高，操作复杂，无法在一般实验室普及。而其中的分光光度法、化学发光法、荧光分析法等不需要昂贵的仪器，易于被一般实验室所采用，但测定过程中的干扰因素较多，容易对测定的准确性和灵敏度造成影响。分光光度法最常用。 原理部分： 1.DPPH·法测试机理 DPPH·（二苯代苦味脐基自由基）的甲醇溶液呈深紫色，可见光区最大吸收峰为492nm。当自由基清除剂加入到DPPH·溶液中时，DPPH·的单电子被配对而使其颜色变浅，在最大吸收波长处的吸光度减少，而且颜色变浅的程度与配电子数成化学计量关系，因此，可通过吸光度减弱的程度来评价自由基被消除的情况。 2. 羟基自由基（·OH） 1）邻二氮菲法[70]
实验原理：邻二氮菲可与Fe2+形成络合物，此络合物在510nm 处有最大吸收峰，是一常用的氧化还原指示剂，其颜色变化可敏锐地反映溶液氧化还原状态的改变。H2O2/ Fe2+体系可通过Fenton 反应产生羟自由基，邻二氮菲－Fe2+水溶液被羟自由基氧化为邻二氮菲－Fe3+后，其510nm 最大吸收峰消失。如果反应体系中同时存在羟自由基清除剂，则Fenton 反应产生的羟自由基将被此清除剂全部或部分清除，邻二氮菲－Fe2+络合物受到的破坏将会随之减少。根据这一原理，可建立以A510变化反映自由基清除剂对羟自由基清除作用的比色测定法。 2）水杨酸法[71] 实验原理：羟自由基易攻击芳环化合物产生羟基化合物，因此可用水杨酸捕集Fenton 反应体系中的·OH，生成的2,3－二羟基苯甲酸用乙醚萃取，用钨酸钠和亚硝酸钠显色，然后用分光光度计测定其在510nm 处的吸光值，此吸光值可反映体系中的羟自由基浓度。 3）甲基紫-Fe2+-H2O2反应体系 测定原理：在Fenton反应的基础上加入甲基紫作显色剂，反应式如下： Fe2++H2O2→Fe3++OH-+·OH 甲基紫在酸性溶液中呈现紫色[9],在578nm 处有强吸收。反应产生的·OH 具有高的反应活性，容易进攻高电子云密度点，会与甲基紫中具有高电子云密度的-C=C-基团发生亲电加成反应，使甲基紫褪色。通过测定甲基紫在578nm 处吸光度值的变化可间接测定出·OH 的生成量。当有清除自由基的物质存在时，会阻断甲基紫与·OH 的反应，从而使得甲基紫的颜色有所加重，因此可利用抗氧化剂加入前后溶液吸光度值的变化来评价物质的抗氧化性强弱。