小RNA与蛋白质的相互作用

小ＲＮＡ与蛋白质的相互作用

刘默芳＊，王恩多

（中国科学院上海生命科学研究院生物化学与细胞生物学研究所，分子生物学国家重点实验室，上海２０００３１）

摘　要：小分子调控ＲＮＡ，包括ｓｉＲＮＡ　（ｓｍａｌｌ　ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ　ＲＮＡ）、ｍｉＲＮＡ　（ｍｉｃｒｏＲＮＡ）和ｐｉＲＮＡ　（ｐｉｗｉ

ｉｎｔｅｒａｃｔｉｎｇ　ＲＮＡ）、ｈｓＲＮＡ　（ｈｅｔｅｒｏｃｈｒｏｍａｔｉｎ　ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ　ｓｍａｌｌ　ＲＮＡ）等，是当前生命科学研究的前沿热点。越来越多的证据表明，这些小分子ＲＮＡ存在于几乎所有较高等的真核生物细胞中，对生物体具有非常重要的调控功能。它们通过各种序列特异性的ＲＮＡ基因沉默作用，包括ＲＮＡ干扰　（ＲＮＡｉ）、翻译抑制、异染色质形成等，调控诸如生长发育、应激反应、沉默转座子等各种各样的细胞进程。随着对这些小分子调控ＲＮＡ的发现，一些ＲＮａｓｅ　ＩＩＩ酶家族成员、Ａｒｇｏｎａｕｔｅ蛋白质家族成员及ＲＮＡ结合蛋白质等先后被鉴定为小ＲＮＡ的胞内蛋白质合作者，参与小ＲＮＡ的加工成熟和在细胞内行使功能。本综述简介一些ＲＮＡ沉默作用途径中重要组分的结构和功能的研究进展。

关键词：小分子调控ＲＮＡ；ＲＮＡ基因沉默；Ｄｒｏｓｈａ；Ｄｉｃｅｒ；Ａｒｇｏｎａｕｔｅ；Ｐｉｗｉ；小ＲＮＡ结合蛋白中图分类号：Ｑ５２２；Ｑ５１ 文献标识码：Ａ

Small RNAs and proteins in RNA silencing pathways

LIU Mo-fang*, W ANG En-duo

(State Key Laboratory of Molecular Biology, Institute of Biochemistry and Cell Biology, Shanghai Institutes for

Biological Sciences, Chinese Academy of Sciences, Shanghai 200031, China)

Ａｂｓｔｒａｃｔ：　Ｓｍａｌｌ　ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ　ＲＮＡｓ，　ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ　ｓｉＲＮＡ　（ｓｈｏｒｔ　ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ　ＲＮＡ），　ｍｉＲＮＡ　（ｍｉｃｒｏＲＮＡ），　ｐｉＲＮＡ　（ｐｉｗｉｉｎｔｅｒａｃｔｉｎｇ　ＲＮＡ），　ａｎｄ　ｈｓＲＮＡ　（ｈｅｔｅｒｏｃｈｒｏｍａｔｉｎ　ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ　ｓｍａｌｌ　ＲＮＡ），　ｈａｖｅ　ｂｅｅｎ　ｔｈｅ　ｈｏｔ　ｆｒｏｎｔｉｅｒ　ｏｆ　ｌｉｆｅｓｃｉｅｎｃｅｓ　ｉｎ　ｔｈｅ　ｐａｓｔ　ｆｅｗ　ｙｅａｒｓ，　ａｎｄ　ｉｔ　ｉｓ　ｂｅｃｏｍｉｎｇ　ｍｏｒｅ　ａｎｄ　ｍｏｒｅ　ａｐｐａｒｅｎｔ　ｔｈａｔ　ｔｈｅｓｅ　ｓｍａｌｌ　ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ　ｈａｖｅ　ｋｅｙｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ　ｆｕｎｃｔｉｏｎｓ．　Ｓｍａｌｌ　ＲＮＡｓ　ｔｒｉｇｇｅｒ　ｖａｒｉｏｕｓ　ｆｏｒｍｓ　ｏｆ　ｓｅｑｕｅｎｃｅ　ｓｐｅｃｉｆｉｃ　ｇｅｎｅ　ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ，　ｃｏｍｍｏｎｌｙ　ｒｅｆｅｒｒｅｄｔｏ　ａｓ　ＲＮＡ　ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ，　ｓｕｃｈ　ａｓ　ＲＮＡ　ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ　（ＲＮＡｉ），　ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ　ｒｅｐｒｅｓｓｉｏｎ，　ａｎｄ　ｈｅｔｅｒｏｃｈｒｏｍａｔｉｎ　ｆｏｒｍａｔｉｏｎｉｎ　ａｌｌ　ｈｉｇｈｅｒ　ｅｕｋａｒｙｏｔｅｓ　ａｎｄ　ｐｌａｙ　ｉｍｐｏｒｔａｎｔ　ｒｏｌｅｓ　ｉｎ　ｃｅｌｌｕｌａｒ　ｐｒｏｃｅｓｓｅｓ　ａｓ　ｄｉｖｅｒｓｅ　ａｓ　ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，　ｓｔｒｅｓｓｒｅｓｐｏｎｓｅ，　ｏｒ　ｔｒａｎｓｐｏｓｏｎ　ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ．　Ｓｏｏｎ　ａｆｔｅｒ　ｔｈｅ　ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ　ｏｆ　ｓｍａｌｌ　ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ　ＲＮＡｓ，　ｍｅｍｂｅｒｓ　ｏｆ　ｔｈｅ　ＲＮａｓｅＩＩＩ　ｆａｍｉｌｙ　ａｎｄ　Ａｒｇｏｎａｕｔｅ　ｐｒｏｔｅｉｎ　ｆａｍｉｌｙ，　ｓｏｍｅ　ＲＮＡ　ｂｉｎｄｉｎｇ　ｐｒｏｔｅｉｎｓ，　ａｎｄ　ｅｔｃ．，　ｗｅｒｅ　ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｄ　ａｓ　ｔｈｅｉｒ　ｍａｊｏｒｃｅｌｌｕｌａｒ　ｐｒｏｔｅｉｎ　ｉｎｔｅｒａｃｔｏｒｓ　ａｎｄ　ｉｎｖｏｌｖｅｄ　ｉｎ　ｔｈｅ　ｂｉｏｇｅｎｅｓｉｓ　ａｎｄ　ｖａｒｉｏｕｓ　ｃｅｌｌｕｌａｒ　ｆｕｎｃｔｉｏｎｓ　ｏｆ　ｓｍａｌｌ　ＲＮＡｓ．　Ｔｈｉｓｒｅｖｉｅｗ　ｓｕｍｍａｒｉｅｓ　ｔｈｅ　ｕｎｄｅｒｓｔａｎｄｉｎｇ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ　ａｎｄ　ｆｕｎｃｔｉｏｎｓ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｉｍｐｏｒｔａｎｔ　ｃｏｍｐｏｎｅｎｔｓ　ｉｎ　ｓｍａｌｌＲＮＡ－ｉｎｄｕｃｅｄ　ｇｅｎｅ－ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ　ｐａｔｈｗａｙｓ．

Ｋｅｙ　ｗｏｒｄｓ：　ｓｍａｌｌ　ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ　ＲＮＡ；　ＲＮＡ　ｇｅｎｅ　ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ；　Ｄｒｏｓｈａ；　Ｄｉｃｅｒ；　Ａｒｇｏｎａｕｔｅ；　Ｐｉｗｉ；　ｓｍａｌｌ　ＲＮＡ　ｂｉｎｄｉｎｇｐｒｏｔｅｉｎ

文章编号　：１００４－０３７４（２００８）０２－０１７８－０５

收稿日期：２００７－１２－０４；修回日期：２００８－０１－１１基金项目：“９７３”项目（２００５ＣＢ７２４６０３）；中国科学院创新重要方向项目（ＫＳＣＸ１－ＹＷ－Ｒ－６４）；上海市科委浦江人才计划资助项目（０６ＰＪ１４１０５）＊通讯作者：Ｅ－ｍａｉｌ：　ｍｆｌｉｕ＠ｓｉｂｓ．ａｃ．ｃｎ

在真核生物中，小分子非编码ＲＮＡ引发一系列序列特异性的基因表达负调控作用，包括ＲＮＡ干扰（ＲＮＡｉ）、翻译抑制和异染色质形成等，这一现象被称为ＲＮＡ基因沉默作用［１－３］。ＲＮＡ沉默作用的发挥离不开参与小ＲＮＡ生成和作用的一系列蛋白质因

179第２期刘默芳，等：小ＲＮＡ与蛋白质的相互作用

子。在过去的几年中，通过对这些小ＲＮＡ相互作用蛋白质的结构和功能的研究，对小ＲＮＡ生成和作用的分子机制、生物学功能等方面的研究都取得了诸多突破性的进展。

１　ｓｉＲＮＡ／ｍｉＲＮＡ作用途径中的蛋白质因子

ｓｉＲＮＡ和ｍｉＲＮＡ是最早被发现和认识的小分子调控ＲＮＡ。它们有许多共同之处，如：大小都约为２２　ｎｔ；都经过ＲＮａｓｅ　ＩＩＩ家族酶加工成熟；都是在转录后水平负调控基因表达；作用途径共享多种蛋白质因子。两者主要的区别在于起源上：ｍｉＲＮＡ是内源性的，从编码ｍｉＲＮＡ的基因转录长链初始ｍｉＲＮＡ　（ｐｒｉ－ｍｉＲＮＡ），分别在核内和胞浆经两步加工形成；ｓｉＲＮＡ则是从内源或外源的ｄｓＲＮＡ前体中生成，在胞浆内加工成熟，不需要Ｄｒｏｓｈａ等细胞核内因子参与。此外，ｓｉＲＮＡ引发ｍＲＮＡ的降解，而动物ｍｉＲＮＡ主要抑制ｍＲＮＡ的翻译。１．１　Ｄｒｏｓｈａ及其辅助蛋白质　Ｄｒｏｓｈａ负责ｐｒｉ－ｍｉＲＮＡ核内加工，属于ＲＮａｓｅ　ＩＩＩ家族第ＩＩ亚家族中的一种酶，其特征是Ｃ－端有２个ＲＩＩＩ结构域和１个ｄｓＲＮＡ结合结构域（ｄｏｕｂｌｅ　ｓｔｒａｎｄｓ　ＲＮＡ　ｂｉｎｄｉｎｇｄｏｍａｉｎ，ｄｓＲＢＤ），Ｎ－端带有一长肽段［４］。人Ｄｒｏｓｈａ含有１３７４个氨基酸残基，Ｎ－端有２个可能参与蛋白质－蛋白质相互作用的结构域，分别是脯氨酸富集区和丝氨酸－精氨酸富集结构域，后者在参与ＲＮＡ代谢和剪接的蛋白质因子中普遍存在［５，６］。除了加工ｐｒｉ－ｍｉＲＮＡ外，人Ｄｒｏｓｈａ与Ｅ．ｃｏｌｉ　ＲＮａｓｅ　ＩＩＩ相似，也参与加工高级结构化的ｒＲＮＡ前体［５］。

在哺乳动物中仅有Ｄｒｏｓｈａ不能将长ｐｒｉ－ｍｉＲＮＡ加工成７０　ｎｔ左右的前体ｍｉＲＮＡ　（ｐｒｅ－ｍｉＲＮＡ）形式，还必需有ｄｓＲＮＡ结合蛋白ＤＧＣＲ８参与才能进行该反应，　ＤＧＣＲ８在ＤｉＧｅｏｒｇｅ综合征（一种致命性先天病症，其特征是无胸腺、甲状旁腺功能减退和心脏缺陷）中缺失，其果蝇同源物被称为Ｐａｓｈａ［７，８］。此外，还有多种ＲＮＡ结合蛋白，包括ＲＮＡ解旋酶、ｄｓＲＮＡ结合蛋白、Ｅｗｉｎｇ肉瘤家族蛋白及一些核蛋白等，可能参与调节ｐｒｉ－ｍｉＲＮＡ的核内加工［７］。生成的ｐｒｅ－ｍｉＲＮＡ由核膜上的Ｅｘｐｏｒｔｉｎ－５转运蛋白，转运到胞浆中，进一步被Ｄｉｃｅｒ酶加工［９］。Ｅｘｐｏｒｔｉｎ－５同时还介导ｔＲＮＡ、腺病毒ＶＡ１等非编码ＲＮＡ的核输出［１０］。

１．２　Ｄｉｃｅｒ及其辅助蛋白质　ｓｉＲＮＡ／ｍｉＲＮＡ的成熟是ＲＮａｓｅ　ＩＩＩ家族第ＩＩＩ亚家族酶——Ｄｉｃｅｒ加工完成［１１］。哺乳动物Ｄｉｃｅｒ是一个相对分子质量约２００　０００的多结构域蛋白质［１２，１３］，通常含有６个结构域，它们是：１个ＲＮＡ解旋酶——ＤＥＸＨ盒子、１个含结合ｄｓＲＮＡ折叠的ＤＵＦ２８３、１个结合ｄｓＲＮＡ末端的ＰＡＺ、２个ＲＩＩＩ和１个ｄｓＲＮＡ结合结构域。ＰＡＺ结构域同时存在于构成ＲＮＡ沉默复合物的Ａｒｇｏｎａｕｔｅ（Ａｇｏ）蛋白质家族中，事实上，ＰＡＺ就取名于３个主要的Ａｇｏ蛋白质，即Ｐｉｗｉ、Ａｇｏ和Ｚｗｉｌｌｅ［１２］。贾第虫Ｄｉｃｅｒ仅有１个ＰＡＺ、２个ＲＩＩＩ结构域［１３］，比哺乳动物Ｄｉｃｅｒ要小得多，但在体外却有正常的裁剪活性。对贾第虫Ｄｉｃｅｒ晶体结构的研究揭示了Ｄｉｃｅｒ制造确定长度小ＲＮＡ的机制：Ｄｉｃｅｒ的晶体结构外形象短柄斧，２个ＲＩＩＩ结构域构成刃部，ＰＡＺ结构域构成柄端，之间通过长α螺旋相连，相距约６５?，相当于２５ｎｔ　ＲＮＡ的长度［１３］。

大多数脊椎动物、尾索动物和蠕虫类动物都只有１个Ｄｉｃｅｒ，而昆虫、真菌和植物往往有多个Ｄｉｃｅｒ同系物［１４］。例如，果蝇中有２个Ｄｉｃｅｒ：Ｄｃｒ－１和Ｄｃｒ－２，分别负责ｍｉＲＮＡ和ｓｉＲＮＡ的生成［１５］。除了加工生成小ＲＮＡ外，Ｄｉｃｅｒ在ＲＮＡ沉默复合物的装配中也发挥作用，双链ｓｉＲＮＡ不能在去掉Ｄｉｃｅｒ的人细胞系中引发ＲＮＡｉ［１６］，证据表明，人Ｄｉｃｅｒ与已知的８个人Ａｇｏ家族蛋白都有直接的相互作用［１４］。

一些ｄｓＲＮＡ结合蛋白与Ｄｉｃｅｒ偶联，促进ｍｉＲＮＡ的加工或沉默复合物的装配。Ｌｏｑｓ是果蝇Ｄｃｒ－１生成ｍｉＲＮＡ的辅助蛋白质因子［１７，１８］。重组Ｄｃｒ－１能够独立将ｐｒｅ－ｍｉＲＮＡ加工成ｍｉＲＮＡ，但Ｌｏｑｓ能大大提高Ｄｃｒ－１对ｄｓＲＮＡ的亲和力［１７］。另一个ｄｓＲＮＡ结合蛋白Ｒ２Ｄ２，与果蝇Ｄｃｒ－２相互作用，促进ｓｉＲＮＡ装配到Ａｇｏ２［１９］。Ｄｃｒ－２与Ｒ２Ｄ２组成的异源二聚体能够根据双链ｓｉＲＮＡ末端的热稳定性选择向导链［２０］。ＴＲＢＰ是Ｌｏｑｓ的人源同系物，它同时与Ｄｉｃｅｒ和Ａｇｏ２相互作用，不仅影响ｍｉＲＮＡ的加工，而且与Ｄｉｃｅｒ一起构成沉默复合物的装配平台［２１］。另一个人源Ｌｏｑｓ－ＰＡＣＴ，类似于ＴＲＢＰ，虽然不是ｐｒｅ－ｍｉＲＮＡ加工必需的，但强烈地影响胞内成熟ｍｉＲＮＡ的积累和ｓｉＲＮＡ引发ＲＮＡｉ的效率［２２，２３］。１．３　ｓｉＲＮＡ／ｍｉＲＮＡ沉默复合物中的蛋白质因子　ｓｉＲＮＡ和ｍｉＲＮＡ都是通过ＲＮＡ诱导沉默复合物（ＲＮＡ－ｉｎｄｕｃｅｄ　ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ　ｃｏｍｐｌｅｘ，ＲＩＳＣ）负调控基因表达［２４］。它们通过碱基配对，引导ＲＩＳＣ结合到靶ｍＲＮＡ上，ｓｉＲＮＡ指导ＲＩＳＣ执行定点裁剪，引发靶ｍＲＮＡ的降解，而大多数动物ｍｉＲＮＡ不直接导致靶ｍＲＮＡ的剪切，主要是抑制翻译，或者介导ｍＲＮＡ的衰变，如ｍＲＮＡ　３'去腺苷化、５'脱帽，间接影响ｍＲＮＡ的稳定性［２５］。

ＲＩＳＣ是一个由多种蛋白质组成的大分子复合物，其核心成分是Ａｇｏ家族蛋白质，最小的ＲＩＳＣ仅有Ａｇｏ２一个蛋白质成分［２６］。Ａｇｏ蛋白质种类繁多，共同点是都有１个ＰＡＺ结构域、１个具有潜在

180生命科学第２０卷

ＲＮａｓｅＨ核酸内切酶活性的ＰＩＷＩ结构域［２４，２７］。大多数真核生物都有多种Ａｇｏ家族成员，不同的Ａｇｏ通常具有不同的功能［２，２４，２７，２８］。例如，果蝇有５个不同的Ａｇｏ家族成员：Ａｇｏ１、Ａｇｏ２、Ａｕｂ、Ｐｉｗｉ和Ａｇｏ３；Ａｇｏ１与ｍｉＲＮＡ偶联，而Ａｇｏ２与ｓｉＲＮＡ偶联，Ａｇｏ１和Ａｇｏ２组成Ａｇｏ亚家族　［２９，３０］；　Ａｕｂ、Ｐｉｗｉ和Ａｇｏ３属于Ａｇｏ家族的ＰＩＷＩ亚家族，与ｐｉＲＮＡ偶联。

ＲＩＳＣ还含有其他一些蛋白质组分，包括Ｖａｓａ内含子基因蛋白质（ＶＩＧ）、脆弱Ｘ蛋白的果蝇同源物（ＤｍＦＸＲ）、Ｔｕｄｏｒ－ＳＮ、潜在的ＲＮＡ解旋酶Ｄｍｐ６８及Ｇｅｍｉｎ３等［３１］。这些蛋白质成分不是ＲＩＳＣ核酸酶活性必需的，可能具有其他作用，如ＲＩＳＣ周转、ＲＩＳＣ亚细胞定位等，它们在ＲＮＡｉ机器中的准确功能还有待于进一步的研究。此外，Ａｇｏ的两个辅助蛋白：ＭＯＶ１０和含有ＲＮＡ识别模块ＲＲＭ的蛋白ＴＮＲＣ６Ｂ／ＫＩＡＡ１０９３，它们与Ａｇｏ蛋白共定位于参与ｍＲＮＡ降解的胞浆Ｐ小体，介导ｍｉＲＮＡ诱导的ｍＲＮＡ衰变［３１］。

２　ｐｉＲＮＡ作用途径中的蛋白质因子

最近在生殖系细胞中发现了一类新的小ＲＮＡ，因它们特异性地与Ａｇｏ家族的ＰＩＷＩ亚家族蛋白质相互作用，被命名为ｐｉｗｉ－ＲＮＡ，简称ｐｉＲＮＡ［３２－３６］。ｐｉＲＮＡ与ｓｉＲＮＡ／ｍｉＲＮＡ有许多不同之处：（１）　ｐｉＲＮＡ与ＰＩＷＩ亚家族蛋白质相互作用，而ｓｉＲＮＡ／ｍｉＲＮＡ与Ａｇｏ亚家族蛋白质相互作用；（２）　ｓｉＲＮＡ／ｍｉＲＮＡ的生物合成必需ＲＮａｓｅ　ＩＩＩ家族酶，而ｐｉＲＮＡ的生物合成可能需要ＰＩＷＩ亚家族蛋白质［３７－３９］；　（３）　ｐｉＲＮＡ长度为２４－３１ｎｔ，稍长于２２　ｎｔ的ｍｉＲＮＡ／ｓｉＲＮＡ；（４）ｐｉＲＮＡ有超过５００００种，而ｍｉＲＮＡ只有数百种；（５）　大多数ｐｉＲＮＡ序列起源于基因组上２０－９０　ｋｂ长度的ＤＮＡ链，每条ＤＮＡ链可能代表一个长的ｐｉＲＮＡ前体，常见ＤＮＡ双链被双向不重叠的转录，生成２个ｐｉＲＮＡ长链前体，而ｓｉＲＮＡ和ｍｉＲＮＡ分别从双链和短发夹结构ＲＮＡ前体衍生［４０－４４］；　（６）　除了基因沉默的负调控效应外，部分ｐｉＲＮＡ可能还有正调控效应，如增加ｍＲＮＡ的稳定性和翻译［４２］。

２．１　ＰＩＷＩ亚家族蛋白质与ｐｉＲＮＡ的生成　ｐｉＲＮＡ是怎样生成的？证据表明，ｐｉＲＮＡ的生成与Ｄｉｃｅｒ无关［３４］。它们可能是由某种核酸内切酶从长的单链ＲＮＡ前体加工生成。推测果蝇的Ｐｉｗｉ、Ａｕｂ和Ａｇｏ３可能就是这样的核酸内切酶，因为它们具有剪切ＲＮＡ的活性［３７－３９］。

从转座子衍生的ｐｉＲＮＡ可能通过一种“乒乓”机制生成［３８，３９］。比较果蝇的Ａｇｏ３－ｐｉＲＮＡ、Ａｕｂ－ｐｉＲＮＡ和Ｐｉｗｉ－ｐｉＲＮＡ序列发现：Ａｕｂ－ｐｉＲＮＡ和Ｐｉｗｉ－ｐｉＲＮＡ主要来自转座子ＤＮＡ反义链，而Ａｇｏ３－ｐｉＲＮＡ主要来自正义链；许多Ａｇｏ３－ｐｉＲＮＡ　５＇端的１０　ｎｔ序列与Ａｕｂ－或Ｐｉｗｉ－ｐｉＲＮＡ的５＇端１０　ｎｔ序列正好互补配对，Ａｕｂ－ｐｉＲＮＡ和Ｐｉｗｉ－ｐｉＲＮＡ的５＇末端碱基偏爱Ｕ，而Ａｇｏ３－ｐｉＲＮＡ的第１０位碱基偏爱Ａ。由此推测，ＰＩＷＩ亚家族蛋白质可能也有类似Ａｇｏ２的ＲＮａｓｅＨ活性，受向导ｐｉＲＮＡ的指导，在对应于ｐｉＲＮＡ　５＇的第１０和１１位核苷酸剪切靶ＲＮＡ链，产生一个新ｐｉＲＮＡ的５＇端序列，也就是，Ａｇｏ３－ｐｉＲＮＡ复合物切割靶ＲＮＡ产生Ａｕｂ－ｐｉＲＮＡ和Ｐｉｗｉ－ｐｉＲＮＡ的５＇端，而Ａｕｂ－ｐｉＲＮＡ或Ｐｉｗｉ－ｐｉＲＮＡ复合物切割靶ＲＮＡ产生Ａｇｏ３－ｐｉＲＮＡ的５＇端。这个过程不仅连续制造新的ｐｉＲＮＡ，还不断破坏从自在基因转录的靶ＲＮＡ。哺乳动物和鱼的ｐｉＲＮＡ可能也通过类似的机制生成［４１，４３］。

此外，不同于动物的ｍｉＲＮＡ和ｓｉＲＮＡ，ｐｉＲＮＡ的３＇末端抗ＮａＩＯ

４

／β－消除处理，表明其核糖２＇－羟基被甲基化修饰［３２，３８，４３－４５］。最近，从果蝇中鉴定了一个负责ｐｉＲＮＡ　３＇末端甲基化修饰的甲基化酶——Ｐｉｍｅｔ，与从拟南芥获得的植物ｍｉＲＮＡ　３＇末端甲基化酶ＨＥＮ１同源［４６］。目前还不清楚这种修饰的意义，推测可能对ｐｉＲＮＡ的稳定性及功能至关重要。２．２　ｐｉＲＮＡ的生物学功能　ｐｉＲＮＡ的生物学功能是什么？目前对这个问题还知之甚少，但它们的表达特异性、基因组分布特性为预测其生物学功能提供了重要线索。ｐｉＲＮＡ在生殖系细胞中特异表达，大部分ｐｉＲＮＡ序列分布于基因组的特定位点，如１７％－２０％的哺乳动物ｐｉＲＮＡ起源于基因组的重复区，包括转座子和逆转座子，提示ｐｉＲＮＡ可能通过沉默基因组内源的自在性遗传元件（ｓｅｌｆｉｓｈ　ｇｅｎｅｔｉｃｅｌｅｍｅｎｔｓ），如逆转录病毒和重复性序列等，保证生殖系细胞基因组的稳定性，在配子形成（精子和卵子发生）过程中发挥作用［３２－３５，４０］。事实上，已发现果蝇的一种转座因子——吉普赛因子（ｇｙｐｓｙ）ｐｉＲＮＡ下调吉普赛因子内源逆转录病毒的正义链转录本，专一性地在生殖系细胞中防止自在性ＤＮＡ的有害表达［４７］。

ｐｉＲＮＡ偶联蛋白质的已知功能也是预测其功能的重要线索。Ｐｉｗｉ和Ａｕｂ是表观遗传学调控因子，参与异染色质形成［４８］；Ｐｉｗｉ与ＰｃＧ　（Ｐｏｌｙｃｏｍｂ　ｇｒｏｕｐ）蛋白质共结合于基因组ＰｃＧ应答元件上，调控ＰｃＧ靶染色质的核内组织，协助ＰｃＧ沉默同源异型基因［４９］。在果蝇雄性生殖细胞系中，Ｐｉｗｉ防止逆转座子转位［５０］。而Ｐｉｗｉ的鼠同源物Ｍｉｗｉ，可增加靶ｍＲＮＡ的稳定性，可能对翻译有促进作用［４２］。协同于这些蛋白质的功能，ｐｉＲＮＡ可能参与表观遗传学调控、基因转位抑制、转录后调控等。

181第２期刘默芳，等：小ＲＮＡ与蛋白质的相互作用

总之，ｐｉＲＮＡ的发现揭示了生殖系细胞中一类新层面的基因表达调控，对其生成及作用机制、生物学功能的研究将加深我们对精子和卵子形成过程的了解。

３　小ＲＮＡ与异染色质的形成

小ＲＮＡ对着丝粒异染色质的形成和维持至关重要［５１］。在裂殖酵母、植物和果蝇的细胞核内都发现了一种类似ｍｉＲＮＡ的小分子ＲＮＡ，它们与异染色质的形成密切相关，被命名为异染色质相关小ＲＮＡ（ｈｅｔｅｒｏｃｈｒｏｍａｔｉｎ　ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ　ｓｍａｌｌ　ＲＮＡｓ，ｈｓＲＮＡ）［５２］。它们通过ＲＮＡ诱导基因转录起始沉默复合物（ＲＮＡ－ｉｎｄｕｃｅｄ　ｉｎｉｔｉａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ　ｇｅｎｅ　ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ，ＲＩＴＳ），参与组蛋白甲基化修饰，促成异染色质形成，在转录水平关闭基因表达。ＲＩＴＳ复合物由Ａｇｏ１、染色质结构域蛋白Ｃｈｐ１及Ｔａｓ３等蛋白质组成，Ｔａｓ３结合活性基因ｕｒａ４＋转录的ＲＮＡ，沉默ｕｒａ４＋表达，起始异染色质形成　［５２，５３］。

在裂殖酵母中建立了ＲＩＴＳ作用模型［２７，５２－５５］：ｈｓＲＮＡ指导ＲＩＴＳ复合物将依赖ＲＮＡ的ＲＮＡ聚合酶（ＲｄＲＰ）招募到新转录的ＲＮＡ上，将其转化成ｄｓＲＮＡ。裂殖酵母的Ｄｉｃｅｒ——Ｄｃｒ１，与ＲｄＲＰ复合物发生直接偶联，将新生成的ｄｓＲＮＡ裁剪为与转录位点互补的小ＲＮＡ［５６］。这些新生成的小ＲＮＡ装配到ＲＩＴＳ中，引发新转录ＲＮＡ的降解，同时指导沉默因子Ｒｉｋ１招募组蛋白甲基转移酶Ｃｌｒ４到染色体的特定位点，接着Ｃｌｒ４促使Ｈ３（ｈｉｓｔｏｎｅ－３）的Ｋ９甲基化，这一修饰为克罗莫结构域蛋白质，如Ｓｗｉ６、Ｃｈｐ１和Ｃｈｐ２　（ＨＰ１相关蛋白）等创造结合位点，招募更多其他蛋白质，从而启动异染色质形成，使基因沉默进一步扩大。

在异染色质重复区，位于启动子下游的基因被沉默的效率要高于位于上游的基因，说明转录促进沉默作用［５４，５５］。在裂殖酵母中，ＲＮＡｉ通路为异染色质型沉默插入着丝粒重复区的转基因所必需。证据表明，在着丝粒重复区位点插入的转基因，从中转录生成的ＲＮＡ可直接被ＲＮＡｉ加工成ｓｉＲＮＡ，进而参与转基因的异染色质沉默［５７］。

４　展望

具有调控功能的小ＲＮＡ通过转录后水平、转录水平、表观遗传学水平和异染色质形成等方式调控基因组的表达，参与多种细胞过程，对个体生长发育、繁殖和遗传起至关重要的作用。通过对小ＲＮＡ及其相互作用蛋白质的研究，使我们对这类新调控子的生成和作用机制、生物学功能等都有了一定的认识，但对一些新发现的小ＲＮＡ，如ｐｉＲＮＡ，还需要进一步研究其生成及作用模式，如：哪些蛋白质参与ｐｉＲＮＡ　３＇端形成？新生成的ｐｉＲＮＡ是如何装载到ＰＩＷＩ蛋白中的？此外，尚需鉴定包括ｍｉＲＮＡ和ｐｉＲＮＡ在内的大部分小ＲＮＡ的生物学功能。另外，调控小ＲＮＡ的表达表现出高度的时空性，对模式生物的一些特定发育、生理或病理状态的研究，是否还会发现新类型的小ＲＮＡ？通过生化和分子生物学进一步研究将逐渐解决这些问题。

［参　考　文　献］

［１］Ｔｏｍａｒｉ　Ｙ，　Ｚａｍｏｒｅ　ＰＤ．　Ｐｅｒｓｐｅｃｔｉｖｅ：　ｍａｃｈｉｎｅｓ　ｆｏｒ　ＲＮＡｉ．Ｇｅｎｅｓ　Ｄｅｖ，　２００５，　１９（５）：　５１７－２９

［２］Ｐｅｔｅｒｓ　Ｌ，　Ｍｅｉｓｔｅｒ　Ｇ．　Ａｒｇｏｎａｕｔｅ　ｐｒｏｔｅｉｎｓ：　ｍｅｄｉａｔｏｒｓ　ｏｆ　ＲＮＡｓｉｌｅｎｃｉｎｇ．　Ｍｏｌ　Ｃｅｌｌ，　２００７，　２６（５）：　６１１－２３

［３］Ｋｌｏｏｓｔｅｒｍａｎ　ＷＰ，　Ｐｌａｓｔｅｒｋ　ＲＨ．　Ｔｈｅ　ｄｉｖｅｒｓｅ　ｆｕｎｃｔｉｏｎｓ　ｏｆｍｉｃｒｏＲＮＡｓ　ｉｎ　ａｎｉｍａｌ　ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ　ａｎｄ　ｄｉｓｅａｓｅ．　Ｄｅｖ　Ｃｅｌｌ，２００６，　１１（４）：　４４１－５０

［４］Ｆｉｌｉｐｐｏｖ　Ｖ，　Ｓｏｌｏｖｙｅｖ　Ｖ，　Ｆｉｌｉｐｐｏｖａ　Ｍ，　ｅｔ　ａｌ．　Ａ　ｎｏｖｅｌ　ｔｙｐｅ　ｏｆＲＮａｓｅ　ＩＩＩ　ｆａｍｉｌｙ　ｐｒｏｔｅｉｎｓ　ｉｎ　ｅｕｋａｒｙｏｔｅｓ．　Ｇｅｎｅ，　２０００，　２４５（１）：　２１３－２１

［５］Ｌｅｅ　Ｙ，　Ａｈｎ　Ｃ，　Ｈａｎ　ＪＪ，　ｅｔ　ａｌ．　Ｔｈｅ　ｎｕｃｌｅａｒ　ＲＮａｓｅ　ＩＩＩ　Ｄｒｏｓｈａｉｎｉｔｉａｔｅｓ　ｍｉｃｒｏＲＮＡ　ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ．　Ｎａｔｕｒｅ，　２００３，　４２５（６９５６）：４１５－１９

［６］Ｂｌｅｎｃｏｗｅ　ＢＪ，　Ｂｏｗｍａｎ　ＪＡ，　ＭｃＣｒａｃｋｅｎ　Ｓ，　ｅｔ　ａｌ．　ＳＲ－ｒｅｌａｔｅｄｐｒｏｔｅｉｎｓ　ａｎｄ　ｔｈｅ　ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ　ｏｆ　ｍｅｓｓｅｎｇｅｒ　ＲＮＡ　ｐｒｅｃｕｒｓｏｒｓ．Ｂｉｏｃｈｅｍ　Ｃｅｌｌ　Ｂｉｏｌ，　１９９９，　７７（４）：　２７７－９１

［７］Ｇｒｅｇｏｒｙ　ＲＩ，　Ｙａｎ　Ｋ，　Ａｍｕｔｈａｎ　Ｇ，　ｅｔ　ａｌ．　Ｔｈｅ　ｍｉｃｒｏｐｒｏｃｅｓｓｏｒｃｏｍｐｌｅｘ　ｍｅｄｉａｔｅｓ　ｔｈｅ　ｇｅｎｅｓｉｓ　ｏｆ　ｍｉｃｒｏＲＮＡｓ．　Ｎａｔｕｒｅ，　２００４，４３２（７０１４）：　２３５－４０

［８］Ｙｅｏｍ　ＫＨ，　Ｌｅｅ　Ｙ，　Ｈａｎ　ＪＪ，　ｅｔ　ａｌ．　Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ　ｏｆ　ＤＧＣＲ８／Ｐａｓｈａ，　ｔｈｅ　ｅｓｓｅｎｔｉａｌ　ｃｏｆａｃｔｏｒ　ｆｏｒ　Ｄｒｏｓｈａ　ｉｎ　ｐｒｉｍａｒｙ　ｍｉＲＮＡｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ．　Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ，　２００６，　３４（１６）：　４６２２－９［９］Ｙｉ　Ｒ，　Ｑｉｎ　Ｙ，　Ｍａｃａｒａ　ＩＧ，　ｅｔ　ａｌ．　Ｅｘｐｏｒｔｉｎ－５　ｍｅｄｉａｔｅｓ　ｔｈｅ　ｎｕｃｌｅａｒｅｘｐｏｒｔ　ｏｆ　ｐｒｅ－ｍｉｃｒｏＲＮＡｓ　ａｎｄ　ｓｈｏｒｔ　ｈａｉｒｐｉｎ　ＲＮＡｓ．　ＧｅｎｅｓＤｅｖ，　２００３，　１７（２４）：　３０１１－６

［１０］Ｃａｌａｄｏ　Ａ，　Ｔｒｅｉｃｈｅｌ　Ｎ，　Ｍｕｌｌｅｒ　ＥＣ，　ｅｔ　ａｌ．　Ｅｘｐｏｒｔｉｎ－５－ｍｅｄｉａｔｅｄｎｕｃｌｅａｒ　ｅｘｐｏｒｔ　ｏｆ　ｅｕｋａｒｙｏｔｉｃ　ｅｌｏｎｇａｔｉｏｎ　ｆａｃｔｏｒ　１Ａ　ａｎｄ　ｔＲＮＡ．ＥＭＢＯ　Ｊ，　２００２，　２１（２２）：　６２１６－２４

［１１］Ｋｅｔｔｉｎｇ　ＲＦ，　Ｆｉｓｃｈｅｒ　ＳＥ，　Ｂｅｒｎｓｔｅｉｎ　Ｅ，　ｅｔ　ａｌ．　Ｄｉｃｅｒ　ｆｕｎｃｔｉｏｎｓ　ｉｎＲＮＡ　ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ　ａｎｄ　ｉｎ　ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ　ｏｆ　ｓｍａｌｌ　ＲＮＡ　ｉｎｖｏｌｖｅｄ　ｉｎｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ　ｔｉｍｉｎｇ　ｉｎ　Ｃ．　ｅｌｅｇａｎｓ．　Ｇｅｎｅｓ　Ｄｅｖ，　２００１，　１５（２０）：　２６５４－９

［１２］Ｂｅｒｎｓｔｅｉｎ　Ｅ，　Ｃａｕｄｙ　ＡＡ，　Ｈａｍｍｏｎｄ　ＳＭ．　Ｒｏｌｅ　ｆｏｒ　ａ　ｂｉｄｅｎｔａｔｅｒｉｂｏｎｕｃｌｅａｓｅ　ｉｎ　ｔｈｅ　ｉｎｉｔｉａｔｉｏｎ　ｓｔｅｐ　ｏｆ　ＲＮＡ　ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ．Ｎａｔｕｒｅ，　２００１，　４０９（６８１８）：　３６３－６

［１３］Ｍａｃｒａｅ　ＩＪ，　Ｚｈｏｕ　Ｋ，　Ｌｉ　Ｆ，　ｅｔ　ａｌ．　Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ　ｂａｓｉｓ　ｆｏｒ　ｄｏｕｂｌｅ－ｓｔｒａｎｄｅｄ　ＲＮＡ　ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ　ｂｙ　Ｄｉｃｅｒ．　Ｓｃｉｅｎｃｅ，　２００６，　３１１（５７５８）：　１９５－８

［１４］Ｓａｓａｋｉ　Ｔ，　Ｓｈｉｍｉｚｕ　Ｎ．　Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎａｒｙ　ｃｏｎｓｅｒｖａｔｉｏｎ　ｏｆ　ａ　ｕｎｉｑｕｅａｍｉｎｏ　ａｃｉｄ　ｓｅｑｕｅｎｃｅ　ｉｎ　ｈｕｍａｎ　ＤＩＣＥＲ　ｐｒｏｔｅｉｎ　ｅｓｓｅｎｔｉａｌ　ｆｏｒｂｉｎｄｉｎｇ　ｔｏ　Ａｒｇｏｎａｕｔｅ　ｆａｍｉｌｙ　ｐｒｏｔｅｉｎｓ．　Ｇｅｎｅ，　２００７，　３９６（２）：３１２－２０

［１５］Ｌｅｅ　ＹＳ，　Ｎａｋａｈａｒａ　Ｋ，　Ｐｈａｍ　ＪＷ，　ｅｔ　ａｌ．　Ｄｉｓｔｉｎｃｔ　ｒｏｌｅｓ　ｆｏｒＤｒｏｓｏｐｈｉｌａ　Ｄｉｃｅｒ－１　ａｎｄ　Ｄｉｃｅｒ－２　ｉｎ　ｔｈｅ　ｓｉＲＮＡ／ｍｉＲＮＡ　ｓｉｌｅｎｃ－ｉｎｇ　ｐａｔｈｗａｙｓ．　Ｃｅｌｌ，　２００４，　１１７（１）：　６９－８１

［１６］Ｄｏｉ　Ｎ，　Ｚｅｎｎｏ　Ｓ，　Ｕｅｄａ　Ｒ，　ｅｔ　ａｌ．　Ｓｈｏｒｔ－ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ－ＲＮＡ－ｍｅ－ｄｉａｔｅｄ　ｇｅｎｅ　ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ　ｉｎ　ｍａｍｍａｌｉａｎ　ｃｅｌｌｓ　ｒｅｑｕｉｒｅｓ　ｄｉｃｅｒ　ａｎｄｅＩＦ２Ｃ　ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ　ｉｎｉｔｉａｔｉｏｎ　ｆａｃｔｏｒｓ．　Ｃｕｒｒ　Ｂｉｏｌ，　２００３，　１３（１）：４１－６

［１７］Ｊｉａｎｇ　Ｆ，　Ｙｅ　ＸＣ，　Ｌｉｕ　Ｘ，　ｅｔ　ａｌ．　Ｄｉｃｅｒ－１　ａｎｄ　Ｒ３Ｄ１－Ｌ　ｃａｔａｌｙｚｅ

182生命科学第２０卷

ｍｉｃｒｏＲＮＡ　ｍａｔｕｒａｔｉｏｎ　ｉｎ　Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ．　Ｇｅｎｅｓ　Ｄｅｖ，　２００５，　１９（１４）：　１６７４－９

［１８］Ｆｏｒｓｔｅｍａｎｎ　Ｋ，　Ｔｏｍａｒｉ　Ｙ，　Ｄｕ　Ｔ，　ｅｔ　ａｌ．　Ｎｏｒｍａｌ　ｍｉｃｒｏＲＮＡｍａｔｕｒａｔｉｏｎ　ａｎｄ　ｇｅｒｍ－ｌｉｎｅ　ｓｔｅｍ　ｃｅｌｌ　ｍａｉｎｔｅｎａｎｃｅ　ｒｅｑｕｉｒｅｓＬｏｑｕａｃｉｏｕｓ，　ａ　ｄｏｕｂｌｅ－ｓｔｒａｎｄｅｄ　ＲＮＡ－ｂｉｎｄｉｎｇ　ｄｏｍａｉｎ　ｐｒｏｔｅｉｎ．ＰＬｏＳ　Ｂｉｏｌ，　２００５，　３（７）：　ｅ２３６

［１９］Ｌｉｕ　Ｑ，　Ｒａｎｄ　ＴＡ，　Ｋａｌｉｄａｓ　Ｓ，　ｅｔ　ａｌ．　Ｒ２Ｄ２，　ａ　ｂｒｉｄｇｅ　ｂｅｔｗｅｅｎｔｈｅ　ｉｎｉｔｉａｔｉｏｎ　ａｎｄ　ｅｆｆｅｃｔｏｒ　ｓｔｅｐｓ　ｏｆ　ｔｈｅ　Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ　ＲＮＡｉｐａｔｈｗａｙ．　Ｓｃｉｅｎｃｅ，　２００３，　３０１（５６４１）：　１９２１－５

［２０］Ｔｏｍａｒｉ　Ｙ，　Ｍａｔｒａｎｇａ　Ｃ，　Ｈａｌｅｙ　Ｂ，　ｅｔ　ａｌ．　Ａ　ｐｒｏｔｅｉｎ　ｓｅｎｓｏｒ　ｆｏｒｓｉＲＮＡ　ａｓｙｍｍｅｔｒｙ．　Ｓｃｉｅｎｃｅ，　２００４，　３０６（５７００）：　１３７７－８０［２１］Ｃｈｅｎｄｒｉｍａｄａ　ＴＰ，　Ｇｒｅｇｏｒｙ　ＲＩ，　Ｋｕｍａｒａｓｗａｍｙ　Ｅ，　ｅｔ　ａｌ．　ＴＲＢＰｒｅｃｒｕｉｔｓ　ｔｈｅ　Ｄｉｃｅｒ　ｃｏｍｐｌｅｘ　ｔｏ　Ａｇｏ２　ｆｏｒ　ｍｉｃｒｏＲＮＡ　ｐｒｏｃｅｓｓ－ｉｎｇ　ａｎｄ　ｇｅｎｅ　ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ．　Ｎａｔｕｒｅ，　２００５，　４３６（７０５１）：　７４０－４［２２］Ｌｅｅ　Ｙ，　Ｈｕｒ　Ｉ，　Ｐａｒｋ　ＳＹ，　ｅｔ　ａｌ．　Ｔｈｅ　ｒｏｌｅ　ｏｆ　ＰＡＣＴ　ｉｎ　ｔｈｅ　ＲＮＡｓｉｌｅｎｃｉｎｇ　ｐａｔｈｗａｙ．　ＥＭＢＯ　Ｊ，　２００６，　２５（３）：　５２２－３２

［２３］Ｋｏｋ　ＫＨ，　Ｎｇ　ＭＨ，　Ｃｈｉｎｇ　ＹＰ，　ｅｔ　ａｌ．　Ｈｕｍａｎ　ＴＲＢＰ　ａｎｄ　ＰＡＣＴｄｉｒｅｃｔｌｙ　ｉｎｔｅｒａｃｔ　ｗｉｔｈ　ｅａｃｈ　ｏｔｈｅｒ　ａｎｄ　ａｓｓｏｃｉａｔｅ　ｗｉｔｈ　ｄｉｃｅｒ　ｔｏｆａｃｉｌｉｔａｔｅ　ｔｈｅ　ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ　ｏｆ　ｓｍａｌｌ　ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ　ＲＮＡ．　Ｊ　ＢｉｏｌＣｈｅｍ，　２００７，　２８２（２４）：　１７６４９－５７

［２４］刘默芳，　蒋　帅，　王恩多．　ＲＮＡｉ机器．　生物化学与生物物理进展，　２００７，　３４（１０）：　１０１２－７

［２５］Ｖａｌｅｎｃｉａ－Ｓａｎｃｈｅｚ　ＭＡ，　Ｌｉｕ　Ｊ，　Ｈａｎｎｏｎ　ＧＪ，　ｅｔ　ａｌ．　Ｃｏｎｔｒｏｌ　ｏｆｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ　ａｎｄ　ｍＲＮＡ　ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ　ｂｙ　ｍｉＲＮＡｓ　ａｎｄ　ｓｉＲＮＡｓ．Ｇｅｎｅｓ　Ｄｅｖ，　２００６，　２０（５）：　５１５－２４

［２６］Ｃａｒｍｅｌｌ　ＭＡ，　Ｘｕａｎ　Ｚ，　Ｚｈａｎｇ　ＭＱ，　ｅｔ　ａｌ．　Ｔｈｅ　Ａｒｇｏｎａｕｔｅｆａｍｉｌｙ：　ｔｅｎｔａｃｌｅｓ　ｔｈａｔ　ｒｅａｃｈ　ｉｎｔｏ　ＲＮＡｉ，　ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌｃｏｎｔｒｏｌ，　ｓｔｅｍ　ｃｅｌｌ　ｍａｉｎｔｅｎａｎｃｅ，　ａｎｄ　ｔｕｍｏｒｉｇｅｎｅｓｉｓ．　ＧｅｎｅｓＤｅｖ，　２００２，　１６（２１）：　２７３３－４２

［２７］Ｔｏｌｉａ　ＮＨ，　Ｊｏｓｈｕａ－Ｔｏｒ　Ｌ．　Ｓｌｉｃｅｒ　ａｎｄ　ｔｈｅ　Ａｒｇｏｎａｕｔｅｓ．　ＮａｔＣｈｅｍ　Ｂｉｏｌ，　２００７，　３（１）：　３６－４３

［２８］Ｏｋａｍｕｒａ　Ｋ，　Ｉｓｈｉｚｕｋａ　Ａ，　Ｓｉｏｍｉ　Ｈ，　ｅｔ　ａｌ．　Ｄｉｓｔｉｎｃｔ　ｒｏｌｅｓ　ｆｏｒＡｒｇｏｎａｕｔｅ　ｐｒｏｔｅｉｎｓ　ｉｎ　ｓｍａｌｌ　ＲＮＡ－ｄｉｒｅｃｔｅｄ　ＲＮＡ　ｃｌｅａｖａｇｅｐａｔｈｗａｙｓ．　Ｇｅｎｅｓ　Ｄｅｖ，　２００４，　１８（１４）：　１６５５－６６

［２９］Ｐａｒｋｅｒ　ＪＳ，　Ｂａｒｆｏｒｄ　Ｄ．　Ａｒｇｏｎａｕｔｅ：　Ａ　ｓｃａｆｆｏｌｄ　ｆｏｒ　ｔｈｅ　ｆｕｎｃｔｉｏｎｏｆ　ｓｈｏｒｔ　ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ　ＲＮＡｓ．　Ｔｒｅｎｄｓ　Ｂｉｏｃｈｅｍ　Ｓｃｉ，　２００６，　３１（１１）：　６２２－３０

［３０］Ｗｉｌｌｉａｍｓ　ＲＷ，　Ｒｕｂｉｎ　ＧＭ．　ＡＲＧＯＮＡＵＴＥ１　ｉｓ　ｒｅｑｕｉｒｅｄ　ｆｏｒｅｆｆｉｃｉｅｎｔ　ＲＮＡ　ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ　ｉｎ　Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ　ｅｍｂｒｙｏｓ．　ＰｒｏｃＮａｔｌ　Ａｃａｄ　Ｓｃｉ　ＵＳＡ，　２００２，　９９（１０）：　６８８９－９４

［３１］Ｍｅｉｓｔｅｒ　Ｇ，　Ｌａｎｄｔｈａｌｅｒ　Ｍ，　Ｐｅｔｅｒｓ　Ｌ，　ｅｔ　ａｌ．　Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ　ｏｆｎｏｖｅｌ　ａｒｇｏｎａｕｔｅ　－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ　ｐｒｏｔｅｉｎｓ．　Ｃｕｒｒ　Ｂｉｏｌ，　２００５，　１５（２３）：　２１４９－５５

［３２］Ｖａｇｉｎ　ＶＶ，　Ｓｉｇｏｖａ　Ａ，　Ｌｉ　Ｃ，　ｅｔ　ａｌ．　Ａ　ｄｉｓｔｉｎｃｔ　ｓｍａｌｌ　ＲＮＡ　ｐａｔｈ－ｗａｙ　ｓｉｌｅｎｃｅｓ　ｓｅｌｆｉｓｈ　ｇｅｎｅｔｉｃ　ｅｌｅｍｅｎｔｓ　ｉｎ　ｔｈｅ　ｇｅｒｍｌｉｎｅ．　Ｓｃｉｅｎｃｅ，２００６，　３１３（５７８５）：　３２０－４

［３３］Ｇｉｒａｒｄ　Ａ，　Ｓａｃｈｉｄａｎａｎｄａｍ　Ｒ，　Ｈａｎｎｏｎ　Ｇ　Ｊ，　ｅｔ　ａｌ．　Ａ　ｇｅｒｍｌｉｎｅ－ｓｐｅｃｉｆｉｃ　ｃｌａｓｓ　ｏｆ　ｓｍａｌｌ　ＲＮＡｓ　ｂｉｎｄｓ　ｍａｍｍａｌｉａｎ　Ｐｉｗｉ　ｐｒｏｔｅｉｎｓ．Ｎａｔｕｒｅ，　２００６，　４４２（７０９９）：　１９９－２０２

［３４］Ａｒａｖｉｎ　Ａ，　Ｇａｉｄａｔｚｉｓ　Ｄ，　Ｐｆｅｆｆｅｒ　Ｓ，　ｅｔ　ａｌ．　Ａ　ｎｏｖｅｌ　ｃｌａｓｓ　ｏｆ　ｓｍａｌｌＲＮＡｓ　ｂｉｎｄ　ｔｏ　ＭＩＬＩ　ｐｒｏｔｅｉｎ　ｉｎ　ｍｏｕｓｅ　ｔｅｓｔｅｓ．　Ｎａｔｕｒｅ，　２００６，４４２（７０９９）：　２０３－７

［３５］Ｌａｕ　ＮＣ，　Ｓｅｔｏ　ＡＧ，　Ｋｉｍ　Ｊ，　ｅｔ　ａｌ．　Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｔｈｅｐｉＲＮＡ　ｃｏｍｐｌｅｘ　ｆｒｏｍ　ｒａｔ　ｔｅｓｔｅｓ．　Ｓｃｉｅｎｃｅ，　２００６，　３１３（５７８５）：３６３－７

［３６］Ｌｉｎ　Ｈ．　ｐｉＲＮＡｓ　ｉｎ　ｔｈｅ　ｇｅｒｍ　ｌｉｎｅ．　Ｓｃｉｅｎｃｅ，　２００７，　３１６（５８２３）：　３９７［３７］Ｓａｉｔｏ　Ｋ，　Ｎｉｓｈｉｄａ　ＫＭ，　Ｍｏｒｉ　Ｔ，　ｅｔ　ａｌ．　Ｓｐｅｃｉｆｉｃ　ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ　ｏｆＰｉｗｉ　ｗｉｔｈ　ｒａｓｉＲＮＡｓ　ｄｅｒｉｖｅｄ　ｆｒｏｍ　ｒｅｔｒｏｔｒａｎｓｐｏｓｏｎ　ａｎｄ　ｈｅｔ－ｅｒｏｃｈｒｏｍａｔｉｃ　ｒｅｇｉｏｎｓ　ｉｎ　ｔｈｅ　Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ　ｇｅｎｏｍｅ．　Ｇｅｎｅｓ　Ｄｅｖ，２００６，　２０（１６）：　２２１４－２２

［３８］Ｇｕｎａｗａｒｄａｎｅ　ＬＳ，　Ｓａｉｔｏ　Ｋ，　Ｎｉｓｈｉｄａ　ＫＭ，　ｅｔ　ａｌ．　Ａ　ｓｌｉｃｅｒ－ｍｅｄｉ－ａｔｅｄ　ｍｅｃｈａｎｉｓｍ　ｆｏｒ　ｒｅｐｅａｔ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ　ｓｉＲＮＡ　５＇　ｅｎｄ　ｆｏｒｍａ－

ｔｉｏｎ　ｉｎ　Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ．　Ｓｃｉｅｎｃｅ，　２００７，　３１５（５８１８）：　１５８７－９０［３９］Ｂｒｅｎｎｅｃｋｅ　Ｊ，　Ａｒａｖｉｎ　ＡＡ，　Ｓｔａｒｋ　Ａ，　ｅｔ　ａｌ．　Ｄｉｓｃｒｅｔｅ　ｓｍａｌｌ　ＲＮＡ－ｇｅｎｅｒａｔｉｎｇ　ｌｏｃｉ　ａｓ　ｍａｓｔｅｒ　ｒｅｇｕｌａｔｏｒｓ　ｏｆ　ｔｒａｎｓｐｏｓｏｎ　ａｃｔｉｖｉｔｙ　ｉｎＤｒｏｓｏｐｈｉｌａ．　Ｃｅｌｌ，　２００７，　１２８（６）：　１０８９－１０３

［４０］Ｋｉｍ　ＶＮ．　Ｓｍａｌｌ　ＲＮＡｓ　ｊｕｓｔ　ｇｏｔ　ｂｉｇｇｅｒ：　Ｐｉｗｉ－ｉｎｔｅｒａｃｔｉｎｇ　ＲＮＡｓ（ｐｉＲＮＡｓ）　ｉｎ　ｍａｍｍａｌｉａｎ　ｔｅｓｔｅｓ．　Ｇｅｎｅｓ　Ｄｅｖ，　２００６，　２０（１５）：１９９３－７

［４１］Ａｒａｖｉｎ　ＡＡ，　Ｓａｃｈｉｄａｎａｎｄａｍ　Ｒ，　Ｇｉｒａｒｄ　Ａ，　ｅｔ　ａｌ．　Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎ－ｔａｌｌｙ　ｒｅｇｕｌａｔｅｄ　ｐｉＲＮＡ　ｃｌｕｓｔｅｒｓ　ｉｍｐｌｉｃａｔｅ　ＭＩＬＩ　ｉｎ　ｔｒａｎｓｐｏｓｏｎｃｏｎｔｒｏｌ．　Ｓｃｉｅｎｃｅ，　２００７，　３１６（５８２５）：　７４４－７

［４２］Ｇｒｉｖｎａ　ＳＴ，　Ｐｙｈｔｉｌａ　Ｂ，　Ｌｉｎ　Ｈ．　ＭＩＷＩ　ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ　ｗｉｔｈ　ｔｒａｎｓｌａ－ｔｉｏｎａｌ　ｍａｃｈｉｎｅｒｙ　ａｎｄ　ＰＩＷＩ－ｉｎｔｅｒａｃｔｉｎｇ　ＲＮＡｓ　（ｐｉＲＮＡｓ）　ｉｎｒｅｇｕｌａｔｉｎｇ　ｓｐｅｒｍａｔｏｇｅｎｅｓｉｓ．　Ｐｒｏｃ　Ｎａｔｌ　Ａｃａｄ　Ｓｃｉ　ＵＳＡ，　２００６，１０３（３６）：　１３４１５－２０

［４３］Ｈｏｕｗｉｎｇ　Ｓ，　Ｋａｍｍｉｎｇａ　ＬＭ，　Ｂｅｒｅｚｉｋｏｖ　Ｅ，　ｅｔ　ａｌ．　Ａ　ｒｏｌｅ　ｆｏｒＰｉｗｉ　ａｎｄ　ｐｉＲＮＡｓ　ｉｎ　ｇｅｒｍ　ｃｅｌｌ　ｍａｉｎｔｅｎａｎｃｅ　ａｎｄ　ｔｒａｎｓｐｏｓｏｎｓｉｌｅｎｃｉｎｇ　ｉｎ　Ｚｅｂｒａｆｉｓｈ．　Ｃｅｌｌ，　２００７，　１２９（１）：　６９－８２

［４４］Ｋｉｒｉｎｏ　Ｙ，　Ｍｏｕｒｅｌａｔｏｓ　Ｚ．　Ｍｏｕｓｅ　Ｐｉｗｉ－ｉｎｔｅｒａｃｔｉｎｇ　ＲＮＡｓ　ａｒｅ２＇－Ｏ－ｍｅｔｈｙｌａｔｅｄ　ａｔ　ｔｈｅｉｒ　３＇　ｔｅｒｍｉｎｉ．　Ｎａｔ　Ｓｔｒｕｃｔ　Ｍｏｌ　Ｂｉｏｌ，２００７，　１４（４）：　３４７－８

［４５］Ｏｈａｒａ　Ｔ，　Ｓａｋａｇｕｃｈｉ　Ｙ，　Ｓｕｚｕｋｉ　Ｔ，　ｅｔ　ａｌ．　Ｔｈｅ　３＇　ｔｅｒｍｉｎｉ　ｏｆｍｏｕｓｅ　Ｐｉｗｉ－ｉｎｔｅｒａｃｔｉｎｇ　ＲＮＡｓ　ａｒｅ　２＇－Ｏ－ｍｅｔｈｙｌａｔｅｄ．　ＮａｔＳｔｒｕｃｔ　Ｍｏｌ　Ｂｉｏｌ，　２００７，　１４（４）：　３４９－５０

［４６］Ｓａｉｔｏ　Ｋ，　Ｓａｋａｇｕｃｈｉ　Ｙ，　Ｓｕｚｕｋｉ　Ｔ，　ｅｔ　ａｌ．　Ｐｉｍｅｔ，　ｔｈｅ　Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａｈｏｍｏｌｏｇ　ｏｆ　ＨＥＮ１，　ｍｅｄｉａｔｅｓ　２＇－Ｏ－ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｐｉｗｉ－　ｉｎ－ｔｅｒａｃｔｉｎｇ　ＲＮＡｓ　ａｔ　ｔｈｅｉｒ　３＇　ｅｎｄｓ．　Ｇｅｎｅｓ　Ｄｅｖ，　２００７，　２１（１３）：１６０３－８

［４７］Ｐｅｌｉｓｓｏｎ　Ａ，　Ｓａｒｏｔ　Ｅ，　Ｐａｙｅｎ－Ｇｒｏｓｃｈｅｎｅ　Ｇ，　ｅｔ　ａｌ．　Ａ　ｎｏｖｅｌ　ｒｅ－ｐｅａｔ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ　ｓｍａｌｌ　ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ　ＲＮＡ－ｍｅｄｉａｔｅｄ　ｓｉｌｅｎｃｉｎｇｐａｔｈｗａｙ　ｄｏｗｎｒｅｇｕｌａｔｅｓ　ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｙ　ｓｅｎｓｅ　ｇｙｐｓｙ　ｔｒａｎ－ｓｃｒｉｐｔｓ　ｉｎ　ｓｏｍａｔｉｃ　ｃｅｌｌｓ　ｏｆ　ｔｈｅ　Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ　ｏｖａｒｙ．　Ｊ　Ｖｉｒｏｌ，２００７，　８１（４）：　１９５１－６０

［４８］Ｐａｌ－Ｂｈａｄｒａ　Ｍ，　Ｌｅｉｂｏｖｉｔｃｈ　ＢＡ，　Ｇａｎｄｃｈｉ　ＳＧ，　ｅｔ　ａｌ．　Ｈｅｔｅｒｏ－ｃｈｒｏｍａｔｉｃ　ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ　ａｎｄ　ＨＰ１　ｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ　ｉｎ　Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ　ａｒｅｄｅｐｅｎｄｅｎｔ　ｏｎ　ｔｈｅ　ＲＮＡｉ　ｍａｃｈｉｎｅｒｙ．　Ｓｃｉｅｎｃｅ，　２００４，　３０３（５６５８）：　６６９－７２

［４９］Ｇｒｉｍａｕｄ　Ｃ，　Ｂａｎｔｉｇｎｉｅｓ　Ｆ，　Ｐａｌ－Ｂｈａｄｒａ　Ｍ，　ｅｔ　ａｌ．　ＲＮＡｉ　ｃｏｍ－ｐｏｎｅｎｔｓ　ａｒｅ　ｒｅｑｕｉｒｅｄ　ｆｏｒ　ｎｕｃｌｅａｒ　ｃｌｕｓｔｅｒｉｎｇ　ｏｆ　Ｐｏｌｙｃｏｍｂ　ｇｒｏｕｐｒｅｓｐｏｎｓｅ　ｅｌｅｍｅｎｔｓ．　Ｃｅｌｌ，　２００６，　１２４（５）：　９５７－７１

［５０］Ｋａｌｍｙｋｏｖａ　ＡＩ，　Ｋｌｅｎｏｖ　ＭＳ，　Ｇｖｏｚｄｅｖ　ＶＡ．　Ａｒｇｏｎａｕｔｅ　ｐｒｏ－ｔｅｉｎ　ＰＩＷＩ　ｃｏｎｔｒｏｌｓ　ｍｏｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｒｅｔｒｏｔｒａｎｓｐｏｓｏｎｓ　ｉｎ　ｔｈｅＤｒｏｓｏｐｈｉｌａ　ｍａｌｅ　ｇｅｒｍｌｉｎｅ．　Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ，　２００５，　３３（６）：２０５２－９

［５１］Ｉｒｖｉｎｅ　ＤＶ，　Ｚａｒａｔｉｅｇｕｉ　Ｍ，　Ｔｏｌｉａ　ＮＨ，　ｅｔ　ａｌ．　Ａｒｇｏｎａｕｔｅ　ｓｌｉｃｉｎｇｉｓ　ｒｅｑｕｉｒｅｄ　ｆｏｒ　ｈｅｔｅｒｏｃｈｒｏｍａｔｉｃ　ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ　ａｎｄ　ｓｐｒｅａｄｉｎｇ．Ｓｃｉｅｎｃｅ，　２００６，　３１３（５７９０）：　１１３４－７

［５２］Ｖｅｒｄｅｌ　Ａ，　Ｊｉａ　Ｓ，　Ｓｕｇｉｙａｍａ　Ｔ，　ｅｔ　ａｌ．　ＲＮＡｉ－ｍｅｄｉａｔｅｄ　ｔａｒｇｅｔｉｎｇｏｆ　ｈｅｔｅｒｏｃｈｒｏｍａｔｉｎ　ｂｙ　ｔｈｅ　ＲＩＴＳ　ｃｏｍｐｌｅｘ．　Ｓｃｉｅｎｃｅ，　２００４，３０３（５６５８）：　６７２－６

［５３］Ｂühlｅｒ　Ｍ，　Ｖｅｒｄｅｌ　Ａ，　Ｍｏａｚｅｄ　Ｄ．　Ｔｅｔｈｅｒｉｎｇ　ＲＩＴＳ　ｔｏ　ａ　ｎａｓｃｅｎｔｔｒａｎｓｃｒｉｐｔ　ｉｎｉｔｉａｔｅｓ　ＲＮＡｉ－　ａｎｄ　ｈｅｔｅｒｏｃｈｒｏｍａｔｉｎ－ｄｅｐｅｎｄｅｎｔｇｅｎｅ　ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ．　Ｃｅｌｌ，　２００６，　１２５（５）：　８７３－８６

［５４］Ｇｒｅｗａｌ　ＳＩ，　Ｊｉａ　Ｓ．　Ｈｅｔｅｒｏｃｈｒｏｍａｔｉｎ　ｒｅｖｉｓｉｔｅｄ．　Ｎａｔ　Ｒｅｖ　Ｇｅｎｅｔ，２００７，　８（１）：　３５－４６

［５５］Ｂａｙｎｅ　ＥＨ，　Ｗｈｉｔｅ　ＳＡ，　Ａｌｌｓｈｉｒｅ　ＲＣ．　ＤｅｇｒＡＡＡｄｅｄ　ｉｎｔｏｓｉｌｅｎｃｅ．　Ｃｅｌｌ，　２００７，　１２９（４）：　６５１－３

［５６］Ｃｏｌｍｅｎａｒｅｓ　Ｓ，　Ｂｕｋｅｒ　ＳＭ，　Ｂｕｈｌｅｒ　Ｍ，　ｅｔ　ａｌ．　Ｃｏｕｐｌｉｎｇ　ｏｆｄｏｕｂｌｅ－ｓｔｒａｎｄｅｄ　ＲＮＡ　ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ　ａｎｄ　ｓｉＲＮＡ　ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ　ｉｎｆｉｓｓｉｏｎ　ｙｅａｓｔ　ＲＮＡｉ．　Ｍｏｌ　Ｃｅｌｌ，　２００７，　２７（３）：　４４９－６１

［５７］Ｂｕｈｌｅｒ　Ｍ，　Ｈａａｓ　Ｗ，　Ｇｙｇｉ　ＳＰ，　ｅｔ　ａｌ．　ＲＮＡｉ－ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ　ａｎｄ　－ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ　ＲＮＡ　ｔｕｒｎｏｖｅｒ　ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ　ｃｏｎｔｒｉｂｕｔｅ　ｔｏ　ｈｅｔ－ｅｒｏｃｈｒｏｍａｔｉｃ　ｇｅｎｅ　ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ．　Ｃｅｌｌ，　２００７，　１２９（４）：　７０７－２１

蛋白质相互作用的研究方法

举世瞩目的基因组计划使大量的新基因不断被发现，然而单纯的基组DNA序列尚不能解答许多生命问题。基因是相对静态的，而基因编码的产物－蛋白质则是动态的，具有时空性和调节性，是生物功能的主要体现者和执行者。蛋白质的表达水平、存在方式以及相互作用等直接与生物功能相关。 在所有生命活动中，蛋白质之间的相互作用是必不可少的，它是细胞进行一切代谢活动的基础。细胞接受外源或是内源的信号，通过其特有的信号途径，调节其基因的表达，以保持其生物学特性。在这个过程中，蛋白质占有很重要的地位，它可以调控，介导细胞的许多生物学活性。 虽然有一些蛋白质可以以单体的形式发挥作用，但是大部分的蛋白质都是和伴侣分子一起作用或是与其他蛋白质形成复合物来发挥作用的。因此，为了更好地理解细胞的生物学活性，必须很好地理解蛋白质单体和复合物的功能，这就会涉及到蛋白质相互作用的研究。在现代分子生物学中，蛋白质相互作用的研究占有非常重要的地位。因此，揭示蛋白质之间的相互作用关系、建立相互作用关系的网络图，已成为蛋白质组学研究中的热点。 一、生物物理学方法 1. 融合蛋白pull-down实验 融合蛋白pull-down技术基本原理是将一种蛋白质固定于某种基质上（如Sepharose），当细胞抽提液经过该基质时，可与该固定蛋白相互作用的配体蛋白被吸附，而没有被吸附的“杂质”则随洗脱液流出。 被吸附的蛋白可以通过改变洗脱液或洗脱条件而回收下来。为了更有效地利用pull-down技术，可以将待纯化地蛋白以融合蛋白地形式表达，即将“诱饵”蛋白与一种易于纯化地配体蛋白相融合。1988年Smith等利用谷胱甘肽－S－转移酶（glutathione-S-transferase ，GST）融合标签从细菌中一步纯化出GST融合蛋白。从此GST融合蛋白在蛋白质相互作用研究领域里得到了极大的推广。 GST融合蛋白在经过固定有GST（glutathione）的色谱柱时，就可以通过GST与GSH的相互作用而被吸附。当再有细胞抽提物过柱，就可以得到能够与“诱饵”蛋白相互作用的兴趣蛋白。一般来说，GST融合蛋白pull-down方法用于两个方面：一是鉴定能与已知融合蛋白相互作用的未知蛋白质；二是鉴定两个已知蛋白质之间是否存在相互作用。 该方法比较简便，避免了使用同位素等危险物质，在蛋白质相互作用研究中有很广泛的应用。类似的融合蛋白很多，如与葡萄球菌蛋白A融合的“诱饵”蛋白可以通过固定有IgG的色谱柱进行纯化；与寡聚组氨酸肽段融合的“诱饵”蛋白可以通过结合Ni2+的色谱柱进行纯化；与二氢叶酸还原酶融合的“诱饵”蛋白可以通过固定有氨甲喋呤的色谱柱进行纯化等等。 2. 亲和印迹 亲和印迹是将聚丙烯酰胺凝胶电泳分离后的蛋白样品转移到硝酸纤维素膜上，然后检测哪种蛋白能与标记了的“诱饵”蛋白发生作用。此方法所要考虑的是如何保持膜上蛋白的生物活性，如何得到纯化的“诱饵”蛋白等。 3. 免疫共沉淀

检测两种蛋白质之间相互作用

检测两种蛋白质之间相互作用得实验方法比较 1、生化方法 ●免疫共沉淀免疫共沉淀就是以抗体与抗原之间得专一性作用为基础得用于研究蛋白质相互作用得经典方法.改法得优点就是蛋白处于天然状态,蛋白得相互作用可以在天然状态下进行，可以避免认为影响;可以分离得到天然状态下相互作用得蛋白复合体。缺点:免疫共沉淀同样不能保证沉淀得蛋白复合物时候为直接相互作用得两种蛋白。另外灵敏度不如亲与色谱高。 ●Fａr—Ｗestｅrｎ 又叫做亲与印记。将PAGE胶上分离好得凡百样品转移到硝酸纤维膜上,然后检测哪种蛋白能与标记了同位素得诱饵蛋白发生作用，最后显影。缺点就是转膜前需要将蛋白复性。2?、等离子表面共振技术（Surfacｅｐｌasmoｎｒｅsoｎance)该技术就是将诱饵蛋白结合于葡聚糖表面,葡聚糖层固定于几十纳米厚得技术膜表面。当有蛋白质混合物经过时,如果有蛋白质同“诱饵”蛋白发生相互作用，那么两者得结合将使金属膜表面得折射率上升，从而导致共振角度得改变。而共振角度得改变与该处得蛋白质浓度成线性关系,由此可以检测蛋白质之间得相互作用。该技术不需要标记物与染料，安全灵敏快速,还可定量分析。缺点:需要专门得等离子表面共振检测仪器。 ３、双杂交技术原理基于真核细胞转录因子得结构特殊性,这些转录因子通常需要两个或以上相互独立得结构域组成．分别使结合

域与激活域同诱饵蛋白与猎物蛋白形成融合蛋白，在真核细胞中表达,如果两种蛋白可以发生相互作用,则可使结合域与激活域在空间上充分接近,从而激活报告基因．缺点：自身有转录功能得蛋白会造成假阳性.融合蛋白会影响蛋白得真实结构与功能。不利于核外蛋白研究,会导致假隐性. 5、荧光共振能量转移技术指两个荧光法色基团在足够近（〈100埃)时，它们之间可发生能量转移得现象。荧光共振能量转移技术可以研究分子内部对某些刺激发生得构象变化,也能研究分子间得相互作用。它可以在活体中检测,非常灵敏,分辩率高,能够检测大分子得构象变化,能够定性定量得检测相互作用得强度。缺点此项技术要求发色基团得距离小于100埃。另外设备昂贵,还需要融合ＧFP给蛋白标记。?此外还有交联技术(ｃrｏsｓ－ｌｉnＫing)，蛋白质探针技术,噬菌体展示技术(Pｈａgｅ dｉsｐｌaｙ）以及生物信息学得方法来检测蛋白质之间相互作用。 1，酵母双杂交 1-5 酵母双杂交系统就是将待研究得两种蛋白质得基因分别克隆到酵 体,从表达产物分析两种蛋白质相互作用得系统 酵母双杂交得原理就是,把报告基因HIS３与l a c Z 整合到酵母细胞基因组中,并受转录因子

研究蛋白质与蛋白质相互作用方法总结-实验步骤

研究蛋白质与蛋白质相互作用方法总结-实验步骤 蛋白质与蛋白质之间相互作用构成了细胞生化反应网络的一个主要组成部分，蛋白-蛋白互作网络与转录调控网络对调控细胞及其信号有重要意义。把原来spaces空间上的一篇蛋白质与蛋白质间相互作用研究方法转来，算是实验技巧分类目录的首篇。(另补充2：检测两种蛋白质之间相互作用的实验方法比较) 一、酵母双杂交系统 酵母双杂交系统是当前广泛用于蛋白质相互作用组学研究的一种重要方法。其原理是当靶蛋白和诱饵蛋白特异结合后，诱饵蛋白结合于报道基因的启动子，启动报道基因在酵母细胞内的表达，如果检测到报道基因的表达产物，则说明两者之间有相互作用，反之则两者之间没有相互作用。将这种技术微量化、阵列化后则可用于大规模蛋白质之间相互作用的研究。在实际工作中，人们根据需要发展了单杂交系统、三杂交系统和反向杂交系统等。Angermayr等设计了一个SOS蛋白介导的双杂交系统。可以研究膜蛋白的功能，丰富了酵母双杂交系统的功能。此外，酵母双杂交系统的作用也已扩展至对蛋白质的鉴定。 二、噬茵体展示技术 在编码噬菌体外壳蛋白基因上连接一单克隆抗体的DNA序列，当噬菌体生长时，表面就表达出相应的单抗，再将噬菌体过柱，柱上若含目的蛋白，就会与相应抗体特异性结合，这被称为噬菌体展示技术。此技术也主要用于研究蛋白质之间的相互作用，不仅有高通量及简便的特点，还具有直接得到基因、高选择性的筛选复杂混合物、在筛选过程中通过适当改变条件可以直接评价相互结合的特异性等优点。目前，用优化的噬菌体展示技术，已经展示了人和鼠的两种特殊细胞系的cDNA文库，并分离出了人上皮生长因子信号传导途径中的信号分子。 三、等离子共振技术 表面等离子共振技术(Surface Plasmon Resonance，SPR)已成为蛋白质相互作用研究中的新手段。它的原理是利用一种纳米级的薄膜吸附上“诱饵蛋白”，当待测蛋白与诱饵蛋白结合后，薄膜的共振性质会发生改变，通过检测便可知这两种蛋白的结合情况。SPR技术的优点是不需标记物或染料，反应过程可实时监控。测定快速且安全，还可用于检测蛋白一核酸及其它生物大分子之间的相互作用。

检测两种蛋白质之间相互作用

检测两种蛋白质之间相互作用的实验方法比较 1. 生化方法 ●免疫共沉淀免疫共沉淀是以抗体和抗原之间的专一性作用为基础的用于研究蛋白质相互作用的经典方法。改法的优点是蛋白处于天然状态，蛋白的相互作用可以在天然状态下进行，可以避免认为影响；可以分离得到天然状态下相互作用的蛋白复合体。缺点：免疫共沉淀同样不能保证沉淀的蛋白复合物时候为直接相互作用的两种蛋白。另外灵敏度不如亲和色谱高。 ●Far-Western 又叫做亲和印记。将PAGE胶上分离好的凡百样品转移到硝酸纤维膜上，然后检测哪种蛋白能与标记了同位素的诱饵蛋白发生作用，最后显影。缺点是转膜前需要将蛋白复性。 2. 等离子表面共振技术（Surface plasmon resonance）该技术是将诱饵蛋白结合于葡聚糖表面，葡聚糖层固定于几十纳米厚的技术膜表面。当有蛋白质混合物经过时，如果有蛋白质同“诱饵”蛋白发生相互作用，那么两者的结合将使金属膜表面的折射率上升，从而导致共振角度的改变。而共振角度的改变与该处的蛋白质浓度成线性关系，由此可以检测蛋白质之间的相互作用。该技术不需要标记物和染料，安全灵敏快速，还可定量分析。缺点：需要专门的等离子表面共振检测仪器。 3. 双杂交技术原理基于真核细胞转录因子的结构特殊性，这些转录因子通常需要两个或以上相互独立的结构域组成。分别使结合域和

激活域同诱饵蛋白和猎物蛋白形成融合蛋白，在真核细胞中表达，如果两种蛋白可以发生相互作用，则可使结合域和激活域在空间上充分接近，从而激活报告基因。缺点：自身有转录功能的蛋白会造成假阳性。融合蛋白会影响蛋白的真实结构和功能。不利于核外蛋白研究，会导致假隐性。

蛋白质相互作用

蛋白质相互作用的概述 一、为什么要研究蛋白质相互作用 二、蛋白质相互作用亲和力：K d=[A][B]/[AB] 三、蛋白质相互作用的应用 A、利用抗原和抗体的相互作用：Western blot，免疫共沉淀，染色质沉淀，抗体筛库 B、利用已知的相互作用建立tag：GST pull down，Biotin－Avidin结合， C、直接利用蛋白质的相互作用：蛋白质亲和层析，酵母双杂交，phage display，Bait蛋白质筛表达库，蛋白质组 四、相互作用的生物学意义：蛋白质间的相互作用是细胞生命活动的基础。 五、生物学功能的研究：获得功能或失去功能 I、一些常用蛋白质相互作用技术 ?Traditional co-purification (chromatography co-purification and co-sedimentation) ?Affinity chromatography：GST pull down，Epitope-tag ?(co-)Immunoprecipitation ?Western和Far-Western blot Surface Plasmon Resonance Two-Hybrid System Fluorescence Resonance Energy Transfer (FRET) （实验过程及原理，注意事项，优缺点） III、研究实例讨论 一、酵母双杂交系统 作用：发现新的相互作用蛋白质；鉴定和分析已有的蛋白质间的相互作用；确定蛋白质相互作用的功能基团 具体过程：见书本 优点：是酵母细胞的in vivo相互作用；只需要cDNA，简单；弱的相互作用也能检测到 缺点：都是融合蛋白，万一融合出新的相互作用；酵母的翻译后修饰不尽相同，尤其是蛋白质的调控性修饰；自身激活报告基因；基因库德要求比较高，单向1/3是in frame 蛋白质毒性；第三者Z插足介导的相互作用；假阳性 酵母双杂交系统是当前广泛用于蛋白质相互作用组学研究的一种重要方法。其原理是当靶蛋白和诱饵蛋白特异结合后，诱饵蛋白结合于报道基因的启动子，启动报道基因在酵母细胞内的表达，如果检测到报道基因的表达产物，则说明两者之间有相互作用，反之则两者之间没有相互作用。将这种技术微量化、阵列化后则可用于大规模蛋白质之间相互作用的研究。在实际工作中，人们根据需要发展了单杂

DNA-蛋白质相互作用的研究方法

DNA-蛋白质相互作用的研究方法2008-02-21 12:21一、凝胶阻滞试验 1.试验原理 又叫作DNA迁移率变动试验（DNA mobility shift assay），在凝胶电泳中，由于电场的作用，裸露的DNA朝正电极移动的距离与其分子量的对数成反比。如果此时DNA分子与某种蛋白质结合，那么，由于分子量增大，它在凝胶中的迁移作用便会受到阻滞，在特定电压和时间内朝正电极移动的距离也就相应缩短了。 2.主要步骤及内容 首先是用放射性同位素标记待检测的DNA片段(亦称探针DNA)，然后同细胞蛋白质提取物一道温育，于是便有可能形成DNA-蛋白质复合物。将它加样到非变性的聚丙烯酰胺凝胶中，在控制使蛋白质仍与DNA保持结合状态的条件下进行电泳分离。应用放射自显影技术显现具放射性标记的DNA条带位置。如果细胞蛋白质提取物中不存在可同放射性标记的探针DNA结合的蛋白质，那么所有放射性标记都将集中出现在凝胶的底部，反之，将会形成DNA-蛋白质复合物，由于凝胶阻滞的缘故，其特有的放射性标记的探针DNA条带就将滞后出现在较靠近凝胶顶部的位置。 凝胶阻滞试验不仅可以用来鉴定在特殊类型细胞的提取物中，是否存在着能够同某一特定DNA片段结合的蛋白质分子(比如特异的转录因子等)，而且还可以用来研究发生此种结合作用之精确的DNA序列的特异性。 其办法是在DNA-蛋白质结合反应体系中，加入超量的非标记的竞争DNA(competitor DNA)。如果它与同位素标记的探针DNA结合的是同一种蛋白质，那么由于竞争DNA与探针DNA 相比是极大超量的，这样绝大部分蛋白质都会被其竞争结合掉而使探针DNA仍处于自由的状态，所以在电泳凝胶的放射自显影图片上就不会出现阻滞的条带。相反地，如果反应中加入的竞争DNA并不能够同探针DNA竞争结合同一种蛋白质，于是探针DNA便仍然与特定蛋白质结合形成复合物，结果在电泳凝胶的放射自显影图片上就会呈现阻滞的条带。 在凝胶阻滞试验中使用竞争DNA，可以间接地阐明在体内发生的DNA与蛋白质之间的相互作用。例如，使用一种具有已知转录因子结合位点的竞争DNA，我们就可以判断通过特定的凝胶阻滞试验所检测到的蛋白质，是否就是属于此类转录因子，抑或是与之相关的其它因子。同样地，假如我们在竞争DNA上已知的转录因子结合位点处，事先引入一个或少数几个碱基突变，通过凝胶阻滞试验亦可有效地评估出这些突变对竞争DNA的性能及其与转录因子结合作用的影响。 二、DNaseI足迹试验(DNaseI footFIrinting assay) DNaseI足迹试验是一种测定DNA结合蛋白在DNA上的准确结合位点的技术。 首先是对包含一定顺式作用元件的双链DNA进行单链标记，然后用DNaseI水解单链标记的双链DNA，产生不同长度的片断，DNA结合蛋白与其特异序列结合处由于空间位阻，DNaseI对这部分DNA不能切割，即被DNaseI保护。DNaseI水解产物经尿素变性，PAGE 分离及放射性显影后，形成以相差一个核苷酸为梯度的一系列DNA条带，在此显影图中相

蛋白质相互作用的主要研究方法

蛋白质相互作用的主要研究方法 细胞接受外源或是内源的信号，通过其特有的信号途径，调节其基因的表达，以保持其生物学特性。在这个过程中，蛋白质占有很重要的地位，它可以调控, 介导细胞的许多生物学活性。虽然有一些蛋白质可以以单体的形式发挥作用，但是大部分的蛋白质都是和伴侣分子一起作用或是与其他蛋白质形成复合物来发挥作用的。因此，为了更好地理解细胞的生物学活性，必须很好地理解蛋白质单体和复合物的功能，这就会涉及到蛋白质相互作用的研究。在现代分子生物学中，蛋白质相互作用的研究占有非常重要的地位。 研究蛋白质相互作用时要根据不同的实验目的及条件选择不同的实施策略。研究已知蛋白间的相互作用人们关注的是蛋白间能否发生结合，实验本身更趋向于验证性，因此，应选择操作性强、可信度高、接近生理条件的技术方法，尽量减少实验本身带来的假阴性或假阳性。蛋白质相互作用方面的研究方法主要有免疫共沉淀、Far Western blotting、生物信息学、酵母双杂交系统、噬菌体展示、表面等离子共振、荧光能量转移等几种。 1 免疫共沉淀 免疫共沉淀（Co-Immunoprecipitation）是以抗体和抗原之间的专一性作用为基础的用于研究蛋白质相互作用的经典方法。是确定两种蛋白质在完整细胞内生理性相互作用的有效方法。其基本原理是:细胞裂解液中加入抗体，与抗原形成特异免疫复合物，经过洗脱，收集免疫复合物，然后进行SDS-PAGE及Western blotting分析。免疫共沉淀既可以用于检验已知的两个蛋白质在体内的相互作用，也可以找出未知的蛋白质相互作用，不管是两者的哪个，其原则都是一样的，都需要用特异性的抗体与其中的一种蛋白质结合，之后通过蛋白质A或蛋白质G琼脂糖微珠将复合物沉淀下来，然后用SDS-PAGE鉴定。免疫共沉淀中设置正确的对照非常重要，因为该方法可能出现假阳性的概率比较高，设置的对照包括：在对照组中使用对照抗体，以缺失目的蛋白的细胞系作为阴性对照等等。 在免疫共沉淀试验中要保证试验结果的真实性应注意以下几点：（1）确保共沉淀的蛋白是由所加入的抗体沉淀得到的，而并非外源非特异蛋白。单克隆抗体的使用有助于避免污染的产生。（2）要确保抗体的特异性。即在不表达抗原

蛋白相互作用-ThermoFisher

Thermo Scientific Pierce Th S i tifi Pi
蛋 蛋白相互作用的研究方法和实践 实
罗 莎 Rosa Luo Ph.D. Application Scientist Biosciences Division Thermo Fisher Scientific China

酵母蛋白质相互作用图谱
Thick blue lines represent literature-derived interactions from PreBIND+MIPS in the HMS-PCI dataset. Thin orange lines represent potential novel interactions. Courtesy MDS Proteomics
2

蛋白质相互作用技术
Genetic Two Hybrid Phage Display Mutational analysis M t ti l l i Biochemical Immunoprecipitation (IP) Co-Immunoprecipitation (C IP) C I i it ti (Co-IP) Pull-Down Assays Far Western FRET (Fluorescence Resonance Energy Transfer) Chemical Crosslinking Label-transfer FeBABE F BABE mapping i Fluorescent Immunofluorescence colocalization
3

蛋白质相互作用数据库和分析方法

蛋白质相互作用数据库和分析方法 1. 蛋白质相互作用的数据库 蛋白质相互作用数据库见下表所示： 数据库名 说明 网址 BIND 生物分子相互作用数据库 http://bind.ca/ DIP 蛋白质相互作用数据库 https://www.sodocs.net/doc/0417794390.html,/ IntAct 蛋白质相互作用数据库 https://www.sodocs.net/doc/0417794390.html,/intact/index.html InterDom 结构域相互作用数据库 https://www.sodocs.net/doc/0417794390.html,.sg/ MINT 生物分子相互作用数据库 http://mint.bio.uniroma2.it/mint/ STRING 蛋白质相互作用网络数据库 http://string.embl.de/ HPRD 人类蛋白质参考数据库 https://www.sodocs.net/doc/0417794390.html,/ HPID 人类蛋白质相互作用数据库 http://wilab.inha.ac.kr/hpid/ MPPI 脯乳动物相互作用数据库 http://fantom21.gsc.riken.go.jp/PPI/ biogrid 蛋白和遗传相互作用数据，主要来自于酵母、线虫、果蝇和人 https://www.sodocs.net/doc/0417794390.html,/ PDZbase 包含PDZ 结构域的蛋白质相互作用数据库 https://www.sodocs.net/doc/0417794390.html,/services/pdz/start Reactome 生物学通路的辅助知识库 https://www.sodocs.net/doc/0417794390.html,/ 2. 蛋白质相互作用的预测方法 蛋白质相互作用的预测方法很非常多，以下作了简单的介绍 1) 系统发生谱 这个方法基于如下假定：功能相关的(functionally related)基因，在一组完全测序的基因组中预期同时存在或不存在，这种存在或不存在的模式(pattern)被称作系统发育谱；如果两个基因，它们的序列没有同源性，但它们的系统发育谱一致或相似．可以推断它们在功能上是相关的。

蛋白质相互作用研究方法及其应用

?技术与方法? 生物技术通报 B I O TECHNOLO G Y BULL ET I N 2006年增刊 蛋白质相互作用研究方法及其应用 王海波　安学丽　张艳贞　王爱丽　李巧云　晏月明 (首都师范大学生命科学学院,北京　100037) 摘　要:　过去10年来,蛋白质组学得到迅速发展,蛋白质间的相互作用作为蛋白质组学的重要内容,更是成为国内外竞相研究的重点,研究方法的快速发展为蛋白质间相互作用的研究奠定了坚实基础。着重就经典的噬菌体展示、酵母双杂交以及新近发展起来的串联亲和纯化、荧光共振能量转移技术和表面等离子共振等蛋白质相互作用研究方法的原理及应用作一综述并展望其发展前景。 关键词:　P DT Y2H T AP FPET SPR Approaches and Appli cati ons of Protei n 2Protei n I nteracti on Studi es W ang Haibo An Xueli Zhang Yanzhen W ang A ili L i Q iaoyun Yan Yue m ing (College of L ife Science,Capital N or m al U niversity,B eijing 100037) Ab s tra c t:　W ith the fulfill of HGP (Hu man genom ic p r oject ),the study t op r otein is s p ring up.Pr otein -p r otein in 2 teracti on is one of i m portant subjects of Pr oteom ic,it is i m p licated in every cellular p r ocesses .Now many methods have de 2vel oped t o identify and characterize p r otein 2p r otein interacti ons .The main content of this paper is describe both classical and es pecially recent methods t o study p r otein 2p r otein interacti ons such as Yeast t w o 2hybrid syste m (Y2H ),Tande m affinity pur 2ificati on (T AP ),Fluorescence res onance energy transfer (FRET )and Surface p las mon res onance (SPR ),fr om the p rinci p le t o p r ocess of these technol ogies,s ome ne w achieve ment obtained by these methods als o intr oduced . Key wo rd s:　P DT Y2H T AP FPET SPR 作者简介:王海波,硕士研究生,首都师范大学生命科学学院608实验室 通讯作者:晏月明,Tel:010*********;E 2mail:yany m2004@https://www.sodocs.net/doc/0417794390.html, 随着生命现象的研究逐渐由获取基因序列信息转向研究基因功能,一门新的学科———蛋白质组学应运而生。蛋白质组是一个在空间和时间上动态变化的整体,其功能往往是通过蛋白质之间或与核酸之间相互作用而表现出来的,这种相互作用存在于机体每个细胞的生命活动过程中,相互交叉形成网络,构成细胞中一系列重要生理活动的基础。因此,对于蛋白质相互作用的研究就成为蛋白质组学中最主要研究内容之一,迄今已发展了包括经典的噬菌体展示技术、酵母双杂交系统以及新近发展并广泛应用的串联亲和纯化和荧光共振能量转移技术、表面等离子共振技术等多种有效的研究蛋白质间相互作用的高通量分析方法,为蛋白质组学的发展奠定了坚实的基础。 1　噬菌体展示技术(P DT ) 大肠杆菌丝状噬菌体包括f1、fd 和M13,它们只感染含F 因子的大肠杆菌。1985年,美国M iss ouri 大学S m ith 博士等人 [1] 将R I 核酸内切酶基因片段 连接到丝状噬菌体fd 编码次要外壳蛋白的基因Ⅲ中,成功地得到了在外壳蛋白中融合表达了酶分子的噬菌体颗粒。后经验证,该噬菌体能被Eco R Ⅰ核酸内切酶抗体有效中和,说明展示在噬菌体外壳表面的酶分子具有与天然酶分子相同或极其相近的构象和活性,这一试验的成功标志着噬菌体展示技术(Phage dis p lay techniques,P DT )的诞生。 噬菌体展示技术是在噬菌体展示肽库建立之后才开始广泛应用到蛋白质相互作用研究的。1990年Scott 等人 [2] 利用噬菌体展示技术构建了随机多

蛋白质-蛋白质相互作用

蛋白质-蛋白质相互作用 蛋白质与蛋白质之间相互作用构成了细胞生化反应网络的一个主要组成部分，蛋白-蛋白互作网络与转录调控网络对调控细胞及其信号有重要意义。把原来spaces空间上的一篇蛋白质与蛋白质间相互作用研究方法转来，算是实验技巧分类目录的首篇。(另补充2：检测两种蛋白质之 间相互作用的实验方法比较) 一、酵母双杂交系统 酵母双杂交系统是当前广泛用于蛋白质相互作用组学研究的一种重要方法。其原理是当靶蛋白和诱饵蛋白特异结合后，诱饵蛋白结合于报道基因的启动子，启动报道基因在酵母细胞内的表达，如果检测到报道基因的表达产物，则说明两者之间有相互作用，反之则两者之间没有相互作用。将这种技术微量化、阵列化后则可用于大规模蛋白质之间相互作用的研究。在实际工作中，人们根据需要发展了单杂交系统、三杂交系统和反向杂交系统等。Angermayr等设计了一个SOS蛋白介导的双杂交系统。可以研究膜蛋白的功能，丰富了酵母双杂交系统的功能。此外，酵母双杂 交系统的作用也已扩展至对蛋白质的鉴定。 二、噬茵体展示技术 在编码噬菌体外壳蛋白基因上连接一单克隆抗体的DNA序列，当噬菌体生长时，表面就表达出相应的单抗，再将噬菌体过柱，柱上若含目的蛋白，就会与相应抗体特异性结合，这被称为噬菌体展示技术。此技术也主要用于研究蛋白质之间的相互作用，不仅有高通量及简便的特点，还具有直接得到基因、高选择性的筛选复杂混合物、在筛选过程中通过适当改变条件可以直接评价相互结合的特异性等优点。目前，用优化的噬菌体展示技术，已经展示了人和鼠的两种特殊细胞系的cDNA文库，并分离出了人上皮生长因子信号传导途径中的信号分子。 三、等离子共振技术 表面等离子共振技术(Surface Plasmon Resonance，SPR)已成为蛋白质相互作用研究中的新手段。它的原理是利用一种纳米级的薄膜吸附上“诱饵蛋白”，当待测蛋白与诱饵蛋白结合后，薄膜的共振性质会发生改变，通过检测便可知这两种蛋白的结合情况。SPR技术的优点是不需标记物或染料，反应过程可实时监控。测定快速且安全，还可用于检测蛋白一核酸及其它生物大分子之间 的相互作用。 四、荧光能量转移技术

检测蛋白相互作用的方法

检测蛋白之间相互作用的方法 酵母双杂交技术 实验目的 体外检测蛋白质与蛋白质之间相互作用。用于验证两个已知蛋白的相互作用，或者筛选与已知蛋白相互作用的未知蛋白。 原理 酵母双杂交系统的建立得力于对真核细胞调控转录起始过程的认识。研究发现，许多真核生物的转录激活因子都是由两个可以分开的、功能上相互独立的结构域(domain)组成的。例如，酵母的转录激活因子GAL4，在N端有一个由147个氨基酸组成的DNA结合域(DNA binding domain BD)，C端有一个由113个氨基酸组成的转录激活域(transcription activation domain AD).GAL4分子的DNA结合域可以和上游激活序列(upstream activating sequence，UAS)结合，而转录激活域则能激活UAS下游的基因进行转录。但是，单独的DNA结合域不能激活基因转录，单独的转录激活域也不能激活UAS的下游基因，它们之间只有通过某种方式结合在一起才具有完整的转录激活因子的功能。 试验流程

酵母双系统正是利用GAL4的功能特点，通过两个杂交蛋白在酵母细胞中的相互结合及对报告基因的转录激活来捕获新的蛋白质，其大致步骤为： 1、视已知蛋白的cDNA序列为诱饵(bait)，将其与DNA结合域融合，构建成诱饵质粒。 2、将待筛选蛋白的cDNA序列与转录激活域融合，构建成文库质粒。 3、将这两个质粒共转化于酵母细胞中 4、酵母细胞中，已分离的DNA结合域和转录激活域不会相互作用，但诱饵蛋白若能与待筛选的未知蛋白特异性地相互作用，则可激活报告基因的转录；反之，则不能。利用4种报告基因的表达，便可捕捉到新的蛋白质。 尽管该系统己被证实为一种非常有效的方法，但它也有自身的缺点和问题。 1、它并非对所有蛋白质都适用，这是由其原理所决定的。双杂交系统要求两种杂交体蛋白都是融合蛋白，都必须能进入细胞核内。因为融合蛋白相互作用激活报告基因转录是在细胞核内发生的。 2、假阳性的发生较为频繁。所谓假阳性，即指未能与诱饵蛋白发生作用而被误认为是阳性反应的蛋白。而且部分假阳性原因不清，可能与酵母中其他蛋白质的作用有关。 3、在酵母菌株中大量表达外源蛋白将产生毒性作用，从而影响菌株生长和报告基因的表达。 GST-Pull Down技术 实验原理 利用重组技术将探针蛋白与GST（Glutathione S transferase）融合，融合蛋白通过GST 与固相化在载体上的GTH（Glutathione）亲和结合。因此，当与融合蛋白有相互作用的蛋白通过层析柱时或与此固相复合物混合时就可被吸附而分离.

研究蛋白质的相互作用的方法

研究蛋白质的相互作用的方法 一、酵母双杂交系统 酵母双杂交系统是当前广泛用于蛋白质相互作用组学研究的一种重要方法。其原理是当靶蛋白和诱饵蛋白特异结合后，诱饵蛋白结合于报道基因的启动子，启动报道基因在酵母细胞内的表达，如果检测到报道基因的表达产物，则说明两者之间有相互作用，反之则两者之间没有相互作用。将这种技术微量化、阵列化后则可用于大规模蛋白质之间相互作用的研究。在实际工作中，人们根据需要发展了单杂交系统、三杂交系统和反向杂交系统等。Angermayr等设计了一个SOS蛋白介导的双杂交系统。可以研究膜蛋白的功能，丰富了酵母双杂交系统的功能。此外，酵母双杂交系统的作用也已扩展至对蛋白质的鉴定。 二、噬茵体展示技术 在编码噬菌体外壳蛋白基因上连接一单克隆抗体的DNA序列，当噬菌体生长时，表面就表达出相应的单抗，再将噬菌体过柱，柱上若含目的蛋白，就会与相应抗体特异性结合，这被称为噬菌体展示技术。此技术也主要用于研究蛋白质之间的相互作用，不仅有高通量及简便的特点，还具有直接得到基因、高选择性的筛选复杂混合物、在筛选过程中通过适当改变条件可以直接评价相互结合的特异性等优点。目前，用优化的噬菌体展示技术，已经展示了人和鼠的两种特殊细胞系的cDNA文库，并分离出了人上皮生长因子信号传导途径中的信号分子。 三、等离子共振技术 表面等离子共振技术(Surface Plasmon Resonance，SPR)已成为蛋白质相互作用研究中的新手段。它的原理是利用一种纳米级的薄膜吸附 上“诱饵蛋白”，当待测蛋白与诱饵蛋白结合后，薄膜的共振性质会发生改变，通过检测便可知这两种蛋白的结合情况。SPR技术的优点是不需标记物或染料，反应过程可实时监控。测定快速且安全，还可用于检测蛋白一核酸及其它生物大分子之间的相互作用。 四、荧光能量转移技术 荧光共振能量转移（FRET ）广泛用于研究分子间的距离及其相互作用;与荧光显微镜结合，可定量获取有关生物活体内蛋白质、脂类、DNA 和RNA 的时空信息。随着绿色荧光蛋白（GFP）的发展，FRET 荧光显微镜有可能实时测量活体细胞内分子的动态性质。提出了一种定量测量FRET 效率以及供体与受体间距离的简单方法，仅需使用一组滤光片和测量一个比值，利用供体和受体的发射谱消除光谱间的串扰。该方法简单快速，可实时定量测量FRET 的效率和供体与受体间的距离，尤其适用于基于GFP 的供体受体对。 五、抗体与蛋白质阵列技术

检测蛋白质与蛋白质之间相互作用的实验技术

一、检测蛋白质与蛋白质相互作用 ① FRET技术（in vivo） FRET，Fluorescence resonance energy transfer，即荧光共振能量转移技术。该技术的原理是用一种波长的光激发某种荧光蛋白后，它释放的荧光刚好又能激发另一种荧光蛋白，使其释放另一波长的荧光，如下图所示： 以下图为例，若要利用FRET检测两种蛋白是否有相互作用，需将两种蛋白的基因分别与这两种荧光蛋白的基因融合，并在细胞内表达出两种融合蛋白。然后只需用紫外光对CFP进行激发，并检测GFP是否放出绿色荧光。如果能检测到绿色荧光，那么可以说明这两种蛋白可能有相互作用；反之，则是这两种蛋白没有相互作用。 ②酵母双、三杂交技术（in vivo） 酵母双杂交系统主要用于考察两种蛋白是否有相互作用，其原理是典型的真核生长转录因子，如GAL4、GCN4等都含有二个不同的结构域，即AD和BD。这些转录因子只有同时具有这两个结构域时才能起始转录。由此，设计不同的两个载体，一个含有AD基因（假设为A载体），另一个含有BD基因（假设为B载体）。 一般将一个已知蛋白的基因连在B载体上，作为诱饵(Bait)，将未知蛋白的基因连在A载体上，将这两个载体都转到特定的酵母细胞内，看未知蛋白与已知蛋白是否有相互作用。如果两者有相互作用，那么就可以启动报告基因的转录，从而使这个酵母细胞能在选择培养基上显现出来或者生存下来；如果两者无相互作用，那么报告基因就无法表达，那么这个酵母细胞就无法在择培养基上显现出来或者生存下来，如下图所示：

由于酵母双杂交系统不能鉴定膜蛋白间的相互作用，因此又发展出了分离泛素酵母双杂交系统。该系统的原理如下图所示： 如图所示，将泛素蛋白拆分为两个片段，即C端段(Cub)和N端段(NubG)，并在C端段的N端接上一个LexA-VP16转录因子，此时它并不能激活基因转录（因为它被限制在了C端段上，不能进入细胞核发挥作用）。 将该C端段连到一个膜蛋白上，将N端段连接到另一个膜蛋白上。若两个膜蛋白有相互作用，那么两个膜蛋白在相互靠近时会使泛素蛋白的N端段和C端段靠近结合，形成一个完整的泛素蛋白。此时泛素蛋白酶体会将这一段被泛素标记的片段降解，那么连接C端段的LexA-VP16转录因子掉落，即可进入细胞核启动标记基因的表达。 酵母三杂交的原理与双杂交一样，只是它研究的是两个蛋白和第三个成分间的相互作用，通过第三个成分使两个蛋白相互靠近。第三个成分可以是：蛋白、RNA或小分子，如下图所示： 如上图所示，在加入第三种成分前，蛋白X与蛋白Y之间并无直接相互作用，因此无法使BD和AD靠近，报告基因不能表达；当加入第三种成分后，蛋白X与蛋白Y的距离被拉近，BD和AD靠近，报告基因表达，从而可以被检测到。 ③ Pulldown技术（in vitro） Pulldown，即蛋白沉降技术，它是建立在蛋白质亲和层析的基础上的一种检测蛋白质间相互作用的分析方法。亲和层析的原理如下图所示，不同蛋白对配体的亲和程度不同，因此可以先将非特异结合的蛋白用低浓度缓冲液给清洗出去，只剩目的蛋白与层析柱结合，然后再用洗脱液将目的蛋白洗脱下来，达到纯化目的蛋白的作用。

研究蛋白质与蛋白质相互作用方法总结

一、酵母双杂交系统 酵母双杂交系统是当前广泛用于蛋白质相互作用组学研究的一种重要方法。其原理是当靶蛋白和诱饵蛋白特异结合后，诱饵蛋白结合于报道基因的启动子，启动报道基因在酵母细胞内的表达，如果检测到报道基因的表达产物，则说明两者之间有相互作用，反之则两者之间没有相互作用。将这种技术微量化、阵列化后则可用于大规模蛋白质之间相互作用的研究。在实际工作中，人们根据需要发展了单杂交系统、三杂交系统和反向杂交系统等。Angermayr等设计了一个SOS蛋白介导的双杂交系统。可以研究膜蛋白的功能，丰富了酵母双杂交系统的功能。此外，酵母双杂交系统的作用也已扩展至对蛋白质的鉴定。 二、噬茵体展示技术 在编码噬菌体外壳蛋白基因上连接一单克隆抗体的DNA序列，当噬菌体生长时，表面就表达出相应的单抗，再将噬菌体过柱，柱上若含目的蛋白，就会与相应抗体特异性结合，这被称为噬菌体展示技术。此技术也主要用于研究蛋白质之间的相互作用，不仅有高通量及简便的特点，还具有直接得到基因、高选择性的筛选复杂混合物、在筛选过程中通过适当改变条件可以直接评价相互结合的特异性等优点。目前，用优化的噬菌体展示技术，已经展示了人和鼠的两种特殊细胞系的cDNA文库，并分离出了人上皮生长因子信号传导途径中的信号分子。 三、等离子共振技术 表面等离子共振技术(Surface Plasmon Resonance，SPR)已成为蛋白质相互作用研究中的新手段。它的原理是利用一种纳米级的薄膜吸附上“诱饵蛋白”，当待测蛋白与诱饵蛋白结合后，薄膜的共振性质会发生改变，通过检测便可知这两种蛋白的结合情况。SPR技术的优点是不需标记物或染料，反应过程可实时监控。测定快速且安全，还可用于检测蛋白一核酸及其它生物大分子之间的相互作用。 四、荧光能量转移技术 荧光共振能量转移（FRET ）广泛用于研究分子间的距离及其相互作用; 与荧光显微镜结合，可定量获取有关生物活体内蛋白质、脂类、DNA 和RNA 的时空信息。随着绿色荧光蛋白（GFP）的发展，FRET 荧光显微镜有可能实时测量活体细胞内分子的动态性质。提出了一种定量测量FRET效率以及供体与受体间距离的简单方法，仅需使用一组滤光片和测量一个比值，利用供体和受体的发射谱消除光谱间的串扰。该方法简单快速，可实时定量测量FRET 的效率和供体与受体间的距离，尤其适用于基于GFP 的供体受体对。 五、抗体与蛋白质阵列技术 蛋白芯片技术的出现给蛋白质组学研究带来新的思路。蛋白质组学研究中一个主要的内容就是研究在不同生理状态下蛋白水平的量变，微型化，集成化，高通量化的抗体芯片就是一个非常好的研究工具，他也是芯片中发展最快的芯片，而且在技术上已经日益成熟。这些抗体芯片有的已经在向临床应用上发展，比如肿瘤标志物抗体芯片等，还有很多已经应用再眼就的各个领域里。 六、免疫共沉淀技术 免疫共沉淀主要是用来研究蛋白质与蛋白质相互作用[/url]的一种技术，其基本原理是，在细胞裂解液中加入抗兴趣蛋白的抗体，孵育后再加入与抗体特异结合的结合于Pansobin珠上的金黄色葡萄球菌蛋白A(SPA)，若细胞中有正与兴趣蛋白结合的目的蛋白，就可以形成这样一种复合物：“目的蛋白—兴趣蛋白—抗兴趣蛋白抗体—SPA\|Pansobin”，因为SPA\|Pansobin比较大，这样复合物在离心时就被分离出来。经变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，复合物四组分又被分开。然后经Western blotting法，用抗体检测目的蛋白是什么，是否为预测蛋白。这种方法得到的目的蛋白是在细胞内天然与兴趣蛋白结合的，符合体内实际情况，得到的蛋白可信度高。但这种方法有两个缺陷：一是两种蛋白质的结合可能不是直接结合，而可能有第三

研究蛋白质与DNA相互作用的主要方法

研究蛋白质与DNA相互作用的主要方法 一、引言 在许多的细胞生命活动中，例如DNA复制、mRNA转录与修饰以及病毒的感染等都涉及到DNA与蛋白质之间的相互作用的问题。 重组DNA技术的发展，人们已分离到了许多重要的基因。现在的关键问题是需要揭示环境因子及发育信号究竟是如何控制基因的转录活性。为此需要： a、鉴定分析参与基因表达调控的DNA元件； b、分离并鉴定这些顺式元件特异性结合的蛋白质因子； 这些问题的研究都涉及到DNA与蛋白质之间的相互作用。 研究DNA-蛋白质相互作用的实验方法主要包括： a、凝胶阻滞实验； b、DNase 1 足迹实验； c、甲基化干扰实验； d、体内足迹实验；f、拉下实验。 二、凝胶阻滞实验 1、概念： 凝胶阻滞实验（Gel retardation assay），要叫做DNA迁移率变动试验（DNA mobility shift assay）或条带阻滞实验（Band retardation assay）是在八十年代初期出现的用于在体外研究DNA与蛋白质相互作用的一种特殊的凝胶电泳技术。 2、原理： 在凝胶电泳中，由于电场的作用，裸露的DNA分子向正电极移动距离的大小是同其分子量的对数成反比。如果某种DNA分子结合上一种特殊的蛋白质，那么由于分子量的加大它在凝胶中的迁移作用便会受到阻滞，于是朝正极移动的距离也就相应的缩短，因而在凝胶中出现滞后的条带，这就是凝胶阻滞实验的基本原理。 3、过程: 首先制备细胞蛋白质提取物（理论上其中含有某种特殊的转录因子） 用放射性同位素标记待检测的DNA片段（含有转录因子的结合位点） 这种被标记的探针DNA同细胞蛋白质提取物一起进行温育，于是产生DNA-蛋白质复合物 在控制使DNA-蛋白质保持结合状态的条件下，进行非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳 最后进行放射自显影，分析电泳结果 4、实验结果的分析： a、如果有放射性标记的条带都集中于凝胶的底部，这就表明在细胞提取物中不存在可以同探针DNA相互结合的转录因子蛋白质；

研究蛋白质与蛋白质相互作用方法总结

研究蛋白质与蛋白质相互作用方法总结 蛋白质与蛋白质之间相互作用构成了细胞生化反应网络的一个主要组成部分，蛋白-蛋白互作网络与转录调控网络对调控细胞及其信号有重要意义。 一、酵母双杂交系统 酵母双杂交系统是当前广泛用于蛋白质相互作用组学研究的一种重要方法。其原理是当靶蛋白和诱饵蛋白特异结合后，诱饵蛋白结合于报道基因的启动子，启动报道基因在酵母细胞内的表达，如果检测到报道基因的表达产物，则说明两者之间有相互作用，反之则两者之间没有相互作用。将这种技术微量化、阵列化后则可用于大规模蛋白质之间相互作用的研究。在实际工作中，人们根据需要发展了单杂交系统、三杂交系统和反向杂交系统等。Angermayr等设计了一个SOS蛋白介导的双杂交系统。可以研究膜蛋白的功能，丰富了酵母双杂交系统的功能。此外，酵母双杂交系统的作用也已扩展至对蛋白质的鉴定。 二、噬茵体展示技术 在编码噬菌体外壳蛋白基因上连接一单克隆抗体的DNA序列，当噬菌体生长时，表面就表达出相应的单抗，再将噬菌体过柱，柱上若含目的蛋白，就会与相应抗体特异性结合，这被称为噬菌体展示技术。此技术也主要用于研究蛋白质之间的相互作用，不仅有高通量及简便的特点，还具有直接得到基因、高选择性的筛选复杂混合物、在筛选过程中通过适当改变条件可以直接评价相互结合的特异性等优点。目前，用优化的噬菌体展示技术，已经展示了人和鼠的两种特殊细胞系的cDNA文库，并分离出了人上皮生长因子信号传导途径中的信号分子。 三、等离子共振技术 表面等离子共振技术(Surface Plasmon Resonance，SPR)已成为蛋白质相互作用研究中的新手段。它的原理是利用一种纳米级的薄膜吸附上“诱饵蛋白”，当待测蛋白与诱饵蛋白结合后，薄膜的共振性质会发生改变，通过检测便可知这两种蛋白的结合情况。SPR技术的优点是不需标记物或染料，反应过程可实时监控。测定快速且安全，还可用于检测蛋白一核酸及其它生物大分子之间的相互作用。 四、荧光能量转移技术