山葵黑根病拮抗菌的筛选和应用
禾谷镰刀菌拮抗菌筛选探究方案
由禾谷镰刀菌引起的小麦赤霉病是小麦重要病害之一，也是影响中国小麦生产的重要病害[2]。小麦赤霉病别名红麦头、烂麦头、麦穗枯。在全世界普遍发生，气候湿润多雨的温带地区受害比较严重，在潮湿和半潮湿区域发生率较高。从幼苗到抽穗都可受害，主要引起苗枯、茎基腐、秆腐和穗腐，其中穗腐的危害最为严重。 小麦赤霉病的表现 小麦赤霉病主要引起穗腐、苗腐和杆腐等症状。最常见的是穗腐。初期在颖片和小穗上会出现浅褐色斑，小穗也会慢慢感染，接着蔓延到邻近小穗，导致小穗枯黄。湿度大时，会产生红色霉层；湿度小时，病小穗枯白，没有霉层产生[3]。种子带菌或土壤中病残体侵染小麦会产生苗腐，刚感染小麦会变得瘦小，时间长了可能会病死。穗下第一、二节则容易发生杆腐，叶鞘上会先出现淡褐色斑点，再向节部内部蔓延，严重时不能抽穗。 小麦赤霉病的发病条件 在充足的湿度和空气条件下，赤霉病会形成子囊壳和子囊孢子，最适和的生长温度为24～25℃，最低9～10℃，最高32℃。在适宜的条件下2～3d 即可产生子囊壳，5～10d 形成子囊孢子。在小麦抽穗前后，子囊孢子会随风飘散，飘落在麦穗上，子囊孢子会在颖内花药上腐生，接着整个花器及小穗都会被感染。还会产生分生孢子群，分生孢子会接着随风飘散，接着侵染其它小麦，使病害扩展蔓延[4]。 气象条件对小麦赤霉病的影响较大。当平均气温为9℃以上，3～5d 的雨天时，便形成了子囊孢子。这会十分有利于子囊孢子的释放和侵染，小麦赤霉病很有可能大流行。小麦赤霉病的危害 小麦赤霉病是造成农业损失的主要原因之一[5]，联合国粮农组织（FAO）统计，每年由植物病害引起的减产平均损失为总产量的10%～15%，而其中的80%的损失是由真菌引起的[6]。 小麦赤霉病会严重影响小麦的产量，同时还会降低小麦的品质。该还能产生以脱氧雪腐镰刀菌烯醇为主的真菌毒素，能较大的危害人、畜。当有4%的病麦时就不能使用了，这时小麦已经失去了利用价值。 1950年以来全国赤霉病大流行12年，中度流行17年，流行的频率为46.8%。1985年全国赤霉病又大流行，仅河南省发病面积就达3.0×106 hm2。2000以来赤霉病在中国大流行频率不断增加，发病面积呈明显扩大趋势，有9个年份赤霉病的发生面积就超过了3.3×106 hm2。其中仅河南省就有7年的发病面积超过6.7×105 hm2。在2012年的赤霉病大流行中，山东省南部和西南部较重，河南省整体偏重，豫南更重，安徽和江苏普遍严重[7]。 1
细菌拮抗作用的筛选 - 副本
细菌对几种病害的拮抗作用植物病害拮抗细菌的筛选和应用是植物病害防治的研究热点。拮抗细菌及其代谢产物的开发利用, 以及通过基因工程改造产生新型、高效、稳定、适生性强的拮抗细菌是今后生防菌发展的趋势。拮抗细菌作为生物防治措施的成功例子已经存在。 植物内生菌是一个多样性十分丰富的微生物类群,已受到各国生物学家的高度关注。大量研究结果表明:植物内生菌在体内占据有利于生防的生态位,具有生物防治,植物促长,增强宿主抗逆境、抗病虫害、抗菌、抗病毒和抗肿瘤活性等优点。近年来,对植物内生菌的生态和生理作用及其作为潜在的生防资源和外源基因载体的研究,已逐渐成为国内外研究的热点。关于内生细菌对植物病原菌的拮抗作用,前人研究已证明,植物内生细菌中存在有大量的对植物病原菌具有拮抗作用的菌株,不同植物含有对病原菌具有拮抗作用的内生细菌的种类有所不同。本实验研究了拮抗细菌对几种病害的拮抗作用，进而在病害的生物控制病害方面提供了一个发展趋势。 1 材料及方法 1．1 材料 1．1．1 培养基PDA、NA培养基、金氏培养液 1．1．2 供试菌从植物组织中分离的内生菌 1．1．3 病害种类马铃薯炭疽病菌、枯萎病菌、茎点霉 1．2 方法 1.2.1 内生菌的分离纯化
将植物组织用自来水清洗表面后,晾干称重后用10%的次氯酸钠溶液消毒中10 min, 之后浸入0.1%的升汞中2min，最后用无菌水冲洗3次,用滤纸吸干, 放入研钵中加入质量分数为0.85%Nacl研磨,梯度稀释后涂布于NA培养基, 28℃培养箱中倒置培养3?7 d。同时以最后一次洗涤的水作为对照。根据平板上长出菌落的形态、颜色、大小等挑取不同单菌落, 反复划线纯化后接斜面保藏。 1．2．2 拮抗菌的筛选 1．2．2．1 采用平板对峙法 采用平板对峙法测定抑菌效果，将纯化好并活化的细菌接到NA培养基中制成平板, 28℃恒温培养24h，用直径5 mm的打孔器取致病菌菌块于PDA 平板中央,在其周围4个等距离位置上分别接上4种不同的内生细菌,每处理做3次重复，进行初筛选，培养3～5 d后,观察不同内生细菌是否对致病菌有抑制生长的作用及抑菌圈的大小(取3次重复的平均值)。对抑菌效果好的细菌再进行筛选， 28 ℃下恒温培养至对照长满后，测致病菌菌落的长和宽, 计算拮抗细菌对致病菌的抑菌力。抑菌力= (D-B)/D（100 %)（D : CK 致病菌菌落直径；B : 处理致病菌菌落宽度），每处理重复3 次, 只接致病菌菌饼为对照( CK) 。 1．2．2.2 拮抗细菌对致病菌孢子萌发的影响 在金氏培养液中培养36 h ( 30 ℃ ) 的拮抗细菌用细菌过滤器过滤, 滤液分别稀释0、10、100 倍, 每浓度溶液中加入病菌孢子, 配成孢子悬浮液, 以金氏培养液配成的孢子悬浮液为对照。采用悬滴法
土壤中拮抗放线菌的筛选与鉴定
土壤中拮抗放线菌的筛选与鉴定 一、培养基 1 放线菌培养基 高氏一号液体培养基：可溶性淀粉20g，KNO3 1g，K2HPO4 0.5g，NaCl 0.5g，MgSO4.7H2O 0.5g，FeSO4·7H2O 0.01g，H2O 1000mL，pH 7.2～7.4。 黄豆粉固体培养基：大豆粉20g（沸水煮30min，过滤保留滤液），蔗糖10g，可溶性淀粉5g，蛋白胨2g，酵母膏2g，NaCl 2g，CaCO31g，MgSO4·7H2O 0.5g，KH2PO40.5g，琼脂15g，H2O 1000mL，初始pH7.0。 放线菌发酵培养基：大豆粉20g（沸水煮30min，纱布过滤后保留滤液），蔗糖10g，可溶性淀粉5g，蛋白胨2g，酵母膏2g，NaCl2g，CaCO31g，MgSO4·7H2O 0.5g，KH2PO40.5g，H2O 1000mL，初始pH7.0。 2 放线菌形态及培养特征研究用培养基 察氏培养基（ISP1）：蔗糖30g，NaNO32.0g，K2HPO41.0g，MgSO4.7H2O 0.5g，KCl 0.5g，FeSO4·7H2O 0.01g，H2O 1000mL，pH 7.2～7.4。 麦芽膏－酵母膏培养基(ISP2)：酵母膏4.0g，葡萄糖4.0g，麦芽膏10.0g，微量盐溶液1mL，H2O 1000mL，琼脂20g，pH 7.0～7.4。 燕麦片培养基（ISP3）：燕麦片20g（加1000mL 水煮20 分钟，然后用离心或过滤得澄清滤液并补足1000mL），微量盐溶液1mL，pH 7.2（微量盐溶液：FeSO4.7H2O 0.1g，MnCl2.4H2O 0.1g，ZnSO4.7H2O 0.1g，H2O 100mL）。 甘油-天门冬酰胺培养基（ISP5）：L-天门冬酰胺1.0g，甘油10.0g，K2HPO41g，微量盐溶液1mL，琼脂20g，pH 7.0～7.4。 无机盐淀粉培养基：可溶性淀粉10g，K2HPO41.0g，MgSO4.7H2O 1.0g，CaCO32.0g，(NH4)2SO42.0g，微量盐溶液1mL，H2O 1000mL，pH 7.4。 马铃薯培养基：去皮马铃薯块200g（1000 毫升水，80℃煮１小时，然后离心或过滤得上清液），葡萄糖20g，pH 7.4。 营养琼脂培养基：蛋白胨10g，牛肉膏5.0g，H2O 1000mL，pH 7.4（亦可补加葡萄糖10g）。 葡萄糖-天门冬酰胺培养基：葡萄糖10g，L-天门冬酰胺0.5g，K2HPO40.5g，牛肉膏2g，H2O 1000mL，pH 7.2。 3 测定生理生化特性供试培养基 淀粉水解测定培养基：可溶性淀粉10g，K2HPO45.65g，NaCl 0.5g，KNO31g，MgCO31g，琼脂15g，H2O 1000mL，pH 7.2~7.4。 纤维素水解培养基：MgSO4.7H2O 0.5g，NaCl 0.5g，K2HPO40.5g，KNO31g，H2O1000mL。滤纸条（5cm×0.8cm）灭菌20 分钟。（pH7.0～7.2） 明胶液化培养基：蛋白胨5g，葡萄糖20g，明胶200g，H2O 1000mL，明胶灭菌10min，pH7.0（灭菌3 次，每次20min，灭菌后立即浸入冷水中冷却。） 牛奶凝固与胨化培养基：脱脂牛奶1000mL，CaCO30.02g，pH 7.2~7.4，间歇灭菌三次（脱脂牛奶的制备：取新鲜牛奶，煮沸后冷却，经两次离心（3000r/min，10min）脱脂，除去上层油脂，即得脱脂牛奶）。 石蕊溶液配制：称取2.5g 石蕊浸泡在100ml 蒸馏水中过夜，使石蕊充分溶解，然后过滤备用。石蕊牛奶的制备：2.5％的石蕊液与脱脂牛奶以4：100（V/V）比例混合，牛奶呈紫丁香色，分装于试管中，灭菌备用。接种前抽检灭菌是否彻底。