金银花中多酚氧化酶和过氧化物酶的分离纯化及特性研究

摘要

本研究以山东亚特良种金银花为原料，采用硫酸铵分级沉淀、DEAE纤维素-52离子交换柱分离纯化金银花中PPO和POD，并分别对这两种酶的分子量和特性进行了研究，包括温度和pH值对酶活性的影响，酶活性对温度和pH值的稳定性，底物的专一性，金属离子及抑制剂对酶活性的影响，为金银花贮藏和加工过程中的酶促褐变的抑制提供科学依据。通过分析，主要研究结果如下：

1、通过硫酸铵分级沉淀和离子交换层析，金银花PPO纯化倍数为30.76，回收率33.8%，分子量约为49kDa。金银花POD纯化倍数28.95，回收率17.52，变性分子量约为20.4kDa。

2、金银花PPO粗酶液最适反应温度为30℃；20℃、30℃加热60min剩余相对酶活力分别为80%和53%；40℃、50℃加热60min后相对残余酶活力低于40%；60℃处理60min相对残余酶活力为10%；70℃时酶活力几乎完全丧失。金银花PPO最适反应pH值为7.5，在pH值7.5~9.5较稳定，相对残余酶活力大于90%。金银花POD粗酶液最适反应温度为30℃；20℃、30℃加热60min残余酶活力在90%以上，60℃处理60min相对残余酶活力小于10%；金银花POD 最适反应pH值为5.5，在pH值8.0时较稳定。

3、金银花PPO属于双酚氧化酶，可以氧化临位双酚（邻苯二酚、L-dopa、绿原酸），不能氧化单酚（L-tyrosine）和三酚（没食子酸、焦性没食子酸、甲基没食子酸）。金银花POD具有广泛的底物特性，在H2O2条件下可以氧化酚类和芳香胺类化合物（愈创木酚、邻苯二酚、阿魏酸、咖啡酸、绿原酸、焦性没食子酸、邻联茴香胺、联苯胺）。

4、金属离子Na+、K+对金银花PPO酶活力没有影响；Mn2+、Mg2+、Ca2+、Zn2+有激活作用；Cu2+、Co2+表现为抑制作用。SDS对PPO活力有激活作用；亚硫酸钠、柠檬酸、抗坏血酸、曲酸和托酚酮对PPO有不同程度的抑制作用。金属离子Na+对金银花POD酶活力没有影响；Ca2+、Zn2+有激活作用，而K+、Mn2+、Mg2+表现为抑制作用；抑制剂（柠檬酸、抗坏血酸、曲酸、托酚酮、DTT，等）及表面活性剂（SDS、TritonX-100、Tween-80）对金银花POD均有一定的抑制

作用。

关键词：金银花；多酚氧化酶；过氧化物酶；分离纯化；特性

Abstract

Lonicera japonica Thunb.is a kind of important Chinese medicine material,with the effects of antibacterial and anti-inflammatory.At present,severe browning phenomenon easily occurs during storage and processing of Lonicera japonica Thunb. Color is one important judgment standard for its commercial grade provided by the State Administration of traditional Chinese medicine and the health ministry. Therefore,it has the important significance to study the deterioration mechanism of Lonicera japonica Thunb.color and inhibition of degradation phenomena in the storage process.Polyphenol oxidase(PPO,EC.1.14.18.1)a copper oxide reductase, widely exists in microorganisms,plants and animals with complex structure.It plays an important role in the agricultural products browning process.Peroxidase(POD, EC.1.11.1.7)is widespread in a variety of animal,plants and microorganisms,its structure and mechanism of action is not exactly the same kind of heme-containing enzymes,usually containing iron or copper and other metal ions,the enzyme mainly catalyzed by H2O2and oxidized various organic and inorganic compounds.

In this study,flower buds of shandong yate fine variety Lonicera japonica Thunb. are raw material,using ammonium sulfate precipitation,DEAE cellulose-52ion exchange column for separation and purification of PPO and POD.The characteristics of two enzymes were separately investigated,including the effects of temperature and pH value on the stability of enzyme activity,substrate specificity,metal ions and inhibitors on enzyme activity and molecular weight of the purified enzyme.This study could enhance the understanding of PPO and POD in Lonicera japonica Thunb. and provide theoretical foundation and scientific basis for the storage and processing. The main results are as follows:

1,The purification multiple of LjPPO was30.76purified by ammonium sulfate precipitation and ion exchange chromatography,the recovery rate is33.8%and the molecular weight is about49kDa.The purification factor of LjPOD was28.95,the recovery rate is17.52and the molecular weight is about20.4kDa.

2,The optimum temperature of LjPPO was30℃,with general thermal stability.

The residual enzyme activity were80%and53%heating for60min at temperature of 20℃and30℃,the residual enzyme activity was lower than40%at40℃and50℃, heating for60min,the residual enzyme activity was10%heated at60℃for60min, the enzyme activity was almost completely lost at70℃.The optimum pH value of LjPPO is7.5,the enzyme is stable in pH value of7.5~9.5and the residual enzyme activity is greater than90%.The optimum temperature of LjPOD was30℃,with good thermal stability.The residual enzyme activity is more than90%dealing with60 min at20℃and30℃and the residual enzyme activity is less than10%heated at60℃for60min.The optimum pH value of LjPOD is5.5,it is stable at pH8.

3,LjPPO belongs to bisphenol oxidase,can oxidize the neighbor bisphenols (catechol,L-dopa,chlorogenic acid),but not monophenol(L-tyrosine)and hydroxyquinol(gallic acid,pyrogallol,methyl gallate).LjPOD,with wide substrate characteristics,oxidized phenols and aromatic amines(guaiacol,ferulic acid,catechol, coffee acid,chlorogenic acid,pyrogallol,o-dianisidine,benzidine)in the H2O2 conditions.

4,The metal ions Na+and K+had no effect on enzyme activity of LjPPO,Mn2+, Mg2+,Ca2+and Zn2+activated,Cu2+and Co2+showed inhibitory effect.SDS activated PPO activity,sodium sulfite,citric acid,ascorbic acid,kojic acid and tropolone have different degrees of inhibition on PPO activity.Metal ion Na+had no effect on LjPOD enzyme activity,Ca2+and Zn2+activated,K+,Mn2+and Mg2+showed inhibitory effect, inhibitor(citric acid,ascorbic acid,kojic acid,tropolone,DTT,etc.)and surfactants (SDS,TritonX-100,Tween-80)showed inhibition to LjPOD.

Key words:Lonicera japonica Thunb.，polyphenol oxidase，peroxidase，purification，characterization

目录

摘要

Abstract

1文献综述 (1)

1.1金银花 (1)

1.1.1金银花化学成分 (1)

1.1.2金银花的药理作用 (3)

1.1.3金银花的开发利用现状 (5)

1.2酶促褐变的研究 (6)

1.2.1多酚氧化酶综述 (6)

1.2.2过氧化物酶综述 (8)

1.2.3酶促褐变的机理 (11)

2引言 (13)

2.1课题提出的依据及研究意义 (13)

2.2课题研究内容和目标 (13)

2.2.1PPO纯化及部分酶学特性的研究 (13)

2.2.2POD纯化及部分酶学特性的研究 (14)

2.2.3金银花最佳采收期的确定 (14)

3试验材料 (15)

3.1试验材料、仪器与试剂 (15)

3.1.1试验材料 (15)

3.1.2主要化学药品及试剂 (15)

3.1.3主要试验仪器与设备 (15)

4试验内容与方法 (16)

4.1PPO提取纯化与特性研究 (16)

4.1.1PPO的提取 (16)

4.1.2PPO活力测定方法 (16)

4.1.3PPO的纯化步骤 (16)

4.1.4PPO部分酶学特性的研究 (17)

4.2POD提取纯化及特性研究 (18)

4.2.1POD的提取 (18)

4.2.2POD活力测定方法 (18)

4.2.3POD的纯化 (18)

4.2.4POD部分酶学特性的研究 (19)

4.3不同花期活性成分含量测定 (20)

4.3.1PAL活性测定 (20)

4.3.2总酚含量测定 (20)

4.3.3总黄酮含量测定 (21)

4.3.4绿原酸含量测定 (21)

4.3.5总花色苷含量测定 (22)

4.4试验方法 (22)

4.4.1蛋白质含量测定 (22)

4.4.2变性凝胶电泳及非变性凝胶电泳 (23)

4.4.3凝胶过滤色谱 (24)

5结果与分析 (25)

5.1PPO粗酶液的性质及分离纯化 (25)

5.1.1PPO粗酶液的性质 (25)

5.1.2金银花PPO分离纯化 (29)

5.2POD粗酶液的性质及分离纯化 (32)

5.2.1POD粗酶液的性质 (32)

5.2.2金银花POD的分离纯化 (37)

5.3金银花最佳采收期的确定 (40)

5.3.1金银花不同花期百针重 (41)

5.3.2不同花期金银花中酶含量比较 (41)

5.3.3不同花期金银花中活性成分含量比较 (42)

5.3.4金银花不同花期活性成分含量同相关酶活性的相关分析 (43)

6结论与讨论 (45)

6.1结论 (45)

6.1.1金银花PPO纯化及特性 (45)

6.1.2金银花POD纯化及特性 (45)

6.1.3金银花最佳采收期 (46)

6.2讨论 (46)

参考文献 (47)

致谢 (54)

作者简介 (55)

攻读硕士学位期间发表的论文 (55)

1文献综述

1.1金银花

金银花，又名银花、双花、鹭鸶花、二宝花、金藤花、双苞花等，为忍冬科植物忍冬(Lonicera japonica Thunb.)的干燥花蕾或初开的花。金银花为临床常用中药[1],具有清热解毒,凉散风热之功效,主治风热感冒、温病发热、痈肿疔疮、丹毒、喉痹、热毒血痢等症。在我国，金银花主要分布在山东、广东、广西、湖南、河南、安徽、四川、陕西、江西、贵州等地[2]。河南、山东是传统的金银花地道产地和栽培地，以山东产量最大、河南质量最佳。除我国外，金银花在日本和朝鲜也有分布。

1.1.1金银花化学成分

研究表明金银花中含有复杂的化学成分，富含挥发油、黄酮类、有机酸、三萜类等化学成分以及无机元素。

1.1.1.1挥发油类

金银花中挥发油的化学成分复杂，是金银花的有效成分之一，目前金银花中鉴定出的挥发油化学成分近70种，主要包括棕榈酸、双花醇、芳樟醇、辛醇、癸炔、硝基环戊烷、棕榈酸乙酯、二氢香苇醇、十八碳二烯酸乙酯、二十四碳酸甲酯、2-已烯醛、3,7-二甲基1,6-辛二烯醇、α-三甲基-3-环已烯-1-甲醇、3,7-二甲基-2,6-辛二烯醇、4-甲基戊烯等[3]。

在金银花的挥发油成分中，鲜花和干花的成分稍有差异，鲜花主要挥发油成分是芳樟醇，其含量高达14%以上，占挥发油的45.5%以上[4]，而干花挥发油成分以棕榈酸为主，一般占26%以上，芳樟醇含量仅在0.39%以下。

1.1.1.2黄酮类

目前金银花中分离得到的黄酮类化合物有30多种，1949年冲七太郎首次从

金银花中分离出来木犀草素，为金银花中鉴定出的第一个黄酮类化合物，后来他又从金银花中分离鉴定出了忍冬苷。其他还有槲皮素、苜蓿素、芦丁、山柰酚-3-O-β-D-葡萄糖苷、异鼠李素-3-O-β-D-葡萄糖苷、金圣草素-7-O-新橙皮糖苷、苜蓿素-7-O-新橙皮糖苷、苜蓿素-7-O-β-D-葡萄糖苷、木犀草素3-O-α-D-葡萄糖苷、木犀草素-7-O-β-D-半乳糖苷、槲皮素-7-O-β-D-葡萄糖苷、金丝桃苷、5-羟基-3,4,7三甲基黄酮和5-羟基-3,4,5,7-四甲氧基黄酮等[5-6]。

1.1.1.3有机酸类

目前金银花中鉴定出的有机酸类主要包括绿原酸、异绿原酸、咖啡酸和3,5-二咖啡酰奎尼酸[7]等。其中咖啡酸是绿原酸的水解产物；异绿原酸是以3,5-二咖啡酰奎尼酸为其主要成分的一类混合物[8]，有7种异构体，分别为1,3-二咖啡酸酞奎尼酸、3-阿魏酞奎尼酸、3,4-二咖啡酰奎宁酸、3,5-二咖啡酰奎宁酸、4-阿魏酞奎尼酸、4,5-二咖啡酸酞奎尼酸和5-阿魏酞奎尼酸。另外，黄丽瑛等[9]从金银花的氯仿萃取物中分离得到了棕榈酸和肉豆蔻酸，毕跃峰[10]等从金银花中首次分离得到了阿魏酸、原儿茶酸、2(E)-3-乙氧基丙烯酸。

1.1.1.4三萜类

金银花中三萜类化合物目前已鉴定出6种，分别为3-氧-β-D-葡萄吡喃糖基(1→4)-β-D-葡萄吡喃糖基(1→3)-α-L-鼠李吡喃糖基(1→2)α-L-阿拉伯吡喃糖基-常春皂甙元-28-氧-β-D-葡萄吡喃糖基(1→6)-β-D-葡萄吡喃糖基酯、3-氧-α-L-鼠李吡喃糖基(1→2)-α-L-阿拉伯吡喃糖基-常春皂甙元-28-氧-β-D-葡萄吡喃糖基

(1→6)-β-D-葡萄吡喃糖基酯、3-氧-α-L-鼠李吡喃糖基(1→2)-α-L-阿拉伯吡喃糖基-常春皂甙元-28-氧-α-L-鼠李吡喃糖基(1→2)[β-D-吡喃木糖基(1→6)]-β-D-葡萄吡喃糖基酯、3-氧-β-D-葡萄吡喃糖基(1→3)-α-L-鼠李吡喃糖基(1→2)α-L-阿拉伯吡喃糖基-常春皂甙元-28-氧-β-D-葡萄吡喃糖基(1→6)-β-D-葡萄吡喃糖基酯、3-氧-α-L-鼠李吡喃糖基(1→2)-α-L阿拉伯吡喃糖基-常春皂甙元-28-氧-β-D-吡喃木糖基(1→6)-β-D-葡萄吡喃糖基酯、常春皂甙元-3-氧-α-L-鼠李吡喃糖基(1→2)-α-L-阿拉伯吡喃糖甙。

1.1.2金银花的药理作用

金银花性寒、味甘苦、入肺、胃、大肠经等。现代药理研究证明，金银花具有清热解毒、凉散风热的功效，能治疗温病发热，风热感冒、痈肿疖毒、喉痹丹毒，热毒血痢，痔漏便血等症。

1.1.

2.1抗炎解热作用

金银花清热解毒作用颇佳，适用于外感风热、温热病及疮、痈肿等热毒症。与其他药物联合应用时效果更佳，如与荆齐穗、连翘等配伍，可增强其疏散清热之力，治外感风热或温热病初起，发热而微恶风寒者。研究发现，金银花能显著降低致热家兔的肛温，具有显著的解热作用[11]。此外，金银花水煎液对二甲苯导致的小鼠耳廓肿胀有一定程度的抗炎作用，且作用与其剂量成正相关[12-13]。崔晓燕[14]等还运用生化方法检测到金银花提取液通过抑制炎症部位炎症因子的合成或释放而发挥类似非甾体类抗炎药物的抗炎作用。

1.1.

2.2抑菌抗病毒作用

金银花对多种致病菌均有一定的抑制作用，包括金黄色葡萄球菌、伤寒杆菌、副伤寒杆菌、肺炎球菌、溶血性链球菌、大肠杆菌、痢疾杆菌、霍乱弧菌、绿脓杆菌、结核杆菌、脑膜炎双球菌。金银花对产黑色素类杆菌、牙龈类杆菌、变形链球菌、放线粘杆菌及伴放线嗜血菌亦显示了较强的抗菌活性。研究发现[15]，金银花提取物对临床分离肺炎双球菌、乙型链球菌、科代葡萄球菌、表皮葡萄球菌、金黄色葡萄球菌、标准金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、洋葱假单孢杆菌和枯草芽孢杆菌具有较强的抑制作用。康旭[16]等研究表明金银花醇提液对沙门氏菌、金黄色葡萄球菌和巨大芽孢杆菌具有抑制作用，水提液对金黄色葡糖球菌和枯草芽孢杆菌具有抑制作用。

1.1.

2.3抗氧化作用

宫璀璀[17]研究发现金银花水提物可以使血清中丙二醛含量降低，谷胱甘肽含量升高，提高总抗氧化能力。另有研究表明金银花提取物的抗氧化活性与绿原酸

含量密切相关，清除羟基自由基的能力几乎强于维生素C[18]。对中草药的抗氧化活性研究发现金银花的抗氧化活性最高，且其抗氧化活性与总黄酮的含量具有相关性[19]。兰华[20]等研究证明金银花花蕾、叶片和枝条中的超氧化物歧化酶、过氧化物酶和过氧化氢酶的活性变化与清除自由基能力密切相关。马彦芳[21]在菜籽油、花生油、酥油、色拉油和羊油等5种食用油中添加适量的金银花乙醇提取物，结果表明金银花对这5种食用油脂均具有一定的抗氧化作用。另外对金银花抗氧化机理的研究发现，金银花可以通过调节线粒体基质和胞质内关键信号的调控传导途径以及调节抗氧化防御酶体系水平，起到抗氧化作用[22-24]。

1.1.

2.4保肝利胆作用

金银花中的三萜皂苷对小鼠肝损伤有明显的保护作用，黄褐毛忍冬总皂苷能明显减轻肝脏病理损伤的严重程度，使肝脏点状坏死数总和及坏死改变出现率明显降低。实验研究表明金银花所含多种绿原酸类化合物具有显著的利胆作用，可增进大鼠胆汁分泌。胡成穆[25]等研究表明金银花中总黄酮可以降低小鼠已增加的肝脾指数，改善肝脏病理学分级，减轻肝脏炎症反应，对免疫性肝损伤具有保护作用。周春晖[26]等发现金银花提取物及其配方能抑制乙醇引起的小鼠体内谷胱甘肽、丙二醛和甘油三酯含量的升高，对化学性肝损伤有一定的保护作用。另外研究表明，金银花提取物可能减少体内自由基的产生，使细胞膜脂质过氧化被抑制，TNF-α和一氧化氮等炎症介质的释放减少，从而达到保肝的效果[27-29]。

1.1.

2.5免疫作用

冉域辰[30]等研究发现低浓度的金银花水提物可以促进乳酸杆菌、双歧杆菌在体外的生长，高浓度则抑制它们的生长，表明金银花水提物可以在平衡肠道菌群，调节免疫方面发挥一定的作用。朱大胜[31]等发现长白忍冬可以明显提高小鼠腹腔中巨噬细胞对鸡红细胞的吞噬指数和吞噬百分率，显著提高血清凝集素中抗体的积数水平，表明金银花对机体的免疫功能具有调节作用。何保斌[32]等研究发现金银花具有增强免疫作用的功效。

1.1.

2.6止血及降血脂作用

黄艳英[33]等发现金银花炭中绿原酸及鞣质含量明显低于生品金银花，却具有显著的止血作用，证明金银花炭可用于热毒血痢，妇女崩漏。王强[34]等研究发现金银花提取物可以使高血脂症小鼠、大鼠血清及肝组织中甘油三酯水平明显下降，对胆固醇、高密度脂蛋白胆固醇和低密度脂蛋白胆固醇无明显影响，表明金银花提取物具有一定降血脂血糖的作用。

1.1.

2.7抗生育作用

曹采蘋[35-36]等采用金银花乙醇提取物对小鼠、狗、猴进行抗生育试验，结果表明金银花对小鼠、狗、猴等尤其是小鼠和狗有显著的抗早孕作用，能够有效终止小鼠的早、中、晚期妊娠作用，并且通过抗黄体激素的作用降低早孕大鼠外周血孕酮的浓度。

1.1.3金银花的开发利用现状

金银花富含有机酸、黄酮、挥发油等活性成分，具有清热解毒、消炎杀菌的功效，因此金银花作为中药制剂而被广泛的应用。在市场上金银花提取液主要作为金银花冲剂、复方银菊感冒片、银柴合剂、金银花注射剂等药物的配方广泛应用于治疗上呼吸道感染、急性咽炎、流行性感冒或急性扁桃体炎等炎症。金银花还可以与其他药物配伍使用，具有降血糖血脂、抗肿瘤、增强免疫力的作用。金银花能够降低小鼠血清胆固醇、动脉硬化指数，提高高密度脂蛋白-胆固醇含量[37]。金银花水提物中分离得到的三萜皂苷具有对四氯化碳引起的小鼠肝损伤有明显的保护作用[38-39]。

金银花化学成分复杂，功能多样。除了药用，金银花还有其他用途。金银花在保健食品中的应用主要体现在金银花酒和金银花饮料。以金银花代替啤酒花为香料，生产出来的啤酒口味纯正清爽，也具有一定的活血通脉，益气通络的保健功能[40]。金银花经过一定工艺处理可以制成具有清热解毒，降脂减肥作用的金银花茶，金银花做成的饮料不仅具有清凉解渴的作用，还具有保健功能。既方便饮用，又能满足人们的保健需求，深受消费者的青睐。另外以金银花和忍冬茎叶为

主要原料制成的银仙牙膏、忍冬花牙膏、银花露、金银花痱子水等均受到广大消费者的欢迎。

金银花还可以用于化妆品中，通过一定方法萃取的芳香性挥发油和其他有效成分添加到化妆品中可使泡沫丰富并有很好的保湿效果，对某些皮肤炎症还有一定的疗效。金银花在我国某些地区还具有观赏价值。随着对金银花研究的深入，金银花的应用逐渐渗入到更多的领域。

新鲜的金银花含水量约为80%，颜色嫩绿，气味芳香，并且绿原酸含量及药用价值也最高(绿原酸作为金银花主要有效成分之一，其含量的多少与金银花的质量具有直接的相关性，可以作为金银花质量的判定标准[41])，但是新鲜的金银花不利于运输及储藏，因此金银花采摘后需要干燥和加工处理。然而，在金银花干燥和加工过程中产生严重的褐变现象，不仅影响金银花的外观品质，而且会造成活性成分的丢失。褐变包括酶促褐变和非酶褐变两种类型[42]。实践表明，金银花的颜色发暗，主要是由酶促褐变引起的。金银花中PPO和POD是导致其在干燥过程中褐变的关键因素，因此研究PPO和POD的性质以及酶活性的抑制对控制金银花干燥过程中的褐变，提高金银花品质有重要的意义。

1.2酶促褐变的研究

1.2.1多酚氧化酶综述

多酚氧化酶(Polyphenol Oxidase，简称PPO，E.C.1.10.3.1)是一种自然界普遍存在的氧化还原酶，广泛存在于微生物、植物、动物等各种生物中，是一种核基因编码的铜金属酶[43]，能催化酚类物质的氧化。1883年，Yoghid发现日本漆树树汁变硬可能和某种活性物质有关。1894年Betrand首次详细研究了这种物质，研究表明这种物质是一种蛋白酶，他将这种物质命名为laccase即漆酶，并证明该酶可以催化酚类的氧化，是生漆变硬的原因[44]。1938年KeilinD.和MannG.研究了蘑菇PPO的提取和纯化，得到PPO并将这类酶称为polyphenoloxidase[45]。此后，对PPO的研究不断深入。

PPO可以分为三种类型，在真菌、细菌、动物中具有单酚氧化能力时它被称为单酚氧化酶（monophend monooxygenase，E.C.1.14.18.1），亦称酪氨酸酶

（tyrosinase），这种酶催化一元酚氧化成邻基苯酚[46]。具有双酚氧化能力的称为双酚氧化酶（diphenol oxidase，E.C.1.10.3.1），亦称多酚氧化酶（polyphenol oxidase，PPO），O-双酶（O-diphenolase）。这种酶能催化邻位酚氧化，但不能氧化间位酚和对位酚。漆酶（laccase，E.C.1.10.3.2），可以氧化邻位酚和对位酚，不能氧化一元酚和间位酚。现在所说的多酚氧化酶（PPO）一般是指儿茶酚氧化酶和漆酶的统称[47]。

PPO的底物种类较多，包括儿茶酚，绿原酸，酪氨酸，L-多巴等。而且不同来源的PPO底物有所差异，对不同底物的催化效果有较大的差异，故PPO的底物具有复杂性。因此在植物中，不同植物中PPO可能主要催化一些不同的底物而导致酶促褐变。

1.2.1.1多酚氧化酶的生成和存在形式

对PPO生成的研究表明，植物PPO基因在细胞质中合成含转运肽的PPO前体肽，它包括C-端延伸区、催化单元和N-端延伸区，PPO前体肽随后被转运肽(负责前体肽的运输)转运至质体的类囊体膜上，并被分解成熟肽。PPO的催化单元包括了PPO基因中的高度保守区，即两个含铜的高度保守区CuA和CuB。研究表明各种植物PPO基因都具有同源性高的铜保守区，因为PPO蛋白的Cu结合区是此酶发挥催化作用的主要功能区，是维持PPO活性中心所必需的。人们对PPO的定位和存在形式的研究已比较广泛。通过细胞化学和细胞免疫化学研究PPO定位表明，植物中PPO是一种质体酶[48-49]。

植物中，有的PPO是以潜伏态的形式存在的，比如以酶原形式存在。增溶，修饰[50-51](如糖基化)或酶蛋白的水解[52]等作用都可以使酶构象发生变化从而活

化潜伏态的PPO。一些因素的诱导也可以激活PPO基因，而使PPO产生诱导表达。这些诱导因素包括外界病原物感染，机械损伤，化学刺激和昆虫取食等。多酚氧化酶在昆虫中的存在形式多为酶原形式，它可以被蛋白酶等各种因素激活。

1.2.1.2多酚氧化酶在各种生物中的功能

研究认为PPO的一个重要功能是抗病虫害。很多实验都显示PPO与植物抗病相关。植物受伤时，它们的PPO活性和mRNA的表达都会增加；对于抗性品

系的植物来说，它体内的PPO活性较高[53]。

有研究认为植物中PPO还可能与光合作用有关[54-56]。PPO在光合过程中的作用主要是调节叶绿体中有害光氧化反应的速度，PPO是金属氧化还原酶，可能会调节胞质中的氧化还原水平，与氧结合并传递分子氧，参与其中电子传递，起能量转换作用。除此之外，植物中的PPO还可以促进伤口愈合，调节植物的生长发育(如根的形成)以及乙烯的产生等。

植物PPO的防御作用[57]。PPO在昆虫中也起到重要作用，它可以促进昆虫伤口的愈合和外骨骼的形成，在鳌虾等甲壳动物体内PPO具有凝血作用及防御功能，还可以通过形成黑色素包被大型外来物来产生防御作用[58]。

在人等生物中存在的酪氨酸酶是黑色素合成的限速酶，起着重要作用，缺乏时易患白化病，酶活性过高时又可形成黑色素瘤。在真黑色素合成过程中，酪氨酸氧化成多巴(L-DOPA)，多巴(L-DOPA)氧化成多巴醌和5,6-二羟基吲哚(DHI)氧化成吲哚-5,6-醌这三步很关键反应中酪氨酸酶起了重要催化作用[59]。

1.2.2过氧化物酶综述

过氧化物酶（peroxidase，POD，EC1.11.1.7）是一种含血红素、铁或铜等金属离子的氧化酶，广泛存在于各种动物、植物和微生物体内[60]。它主要催化由过氧化氢或有机过氧化物参与的各种还原物质的氧化反应：

RH2+H2O2→2H2O+R。

反应过程可简单描述为[61]：

E+H2O2→Compound I

Compound I+AH2→Compound II+AH-1

Compound II+AH2→E+AH-1

POD在活性氧的代谢过程中起着重要的作用，活性氧包括过氧化氢（H2O2）、自由基（OH*）和超氧阴离子（O2-）三类。

1.2.2.1植物POD的类型划分和组织定位

按不同的标准可将植物POD划分成不同类型。根据酶蛋白等电点的大小可将其分为酸性或阴离子型（pI<7.0）、中性（pI=7.0）和碱性或阳离子型（pI>7.0）

3种POD[62]；根据结合状态可分为可溶态、离子结合态和共价结合态POD（或细胞壁结合态）[63]。根据其催化底物特性可分为谷胱甘肽POD、愈创木酚POD 和抗坏血酸POD等[64]；根据所分离酶的生理功能和催化特性则可分之为抗坏血酸POD、木质素POD、伸展蛋白POD、NADH POD、细胞色素POD、谷胱甘肽POD、IAA氧化酶和酚氧化酶等；

有研究报道不同种类的POD同工酶存在明显的组织和器官特异性，其中木质素POD多存在于细胞壁内。抗坏血酸POD分别存在于叶绿体和细胞质内，二者在氨基酸组成、结构、底物专一性及在纯化过程中的稳定性上均有差异，光合作用中产生的过量的H2O2由抗坏血酸POD清除，从而保护叶绿体。许多POD 还存在于细胞膜、细胞器及细胞质，根据其组织特异性常被称为线粒体POD、叶绿体（类囊体）POD、液泡POD、质外体POD和胞内POD等[65]。

1.2.2.2POD的分离、纯化和鉴定

常规分离和纯化POD的过程包括硫酸铵沉淀或丙酮沉淀、透析、阴离子和阳离子交换柱层析、凝胶过滤、以及各种电泳技术分离和鉴定。抽提用缓冲液多为Tris-HCl、Tris-Mes、磷酸盐或醋酸盐缓冲液；pH值范围在5.5~7.5之间。抽提液中常加入抗坏血酸等抗氧化剂，苯甲磺酰氟（PMSF）抑制蛋白降解，加入不溶性聚乙烯吡咯烷酮可除酚类物质，用牛血清白蛋白（BSA）等稳定蛋白等[66]。但也有研究报道抗坏血酸、2-巯基乙醇和二硫苏糖醇（DTT）能钝化POD和破坏其肽链结构，其中，抗坏血酸和DTT可使韩国分离的HRP裂解产生30kDa、23kDa和18kDa的无活性的片段。实验证明，80%饱和度的硫酸铵已经可以沉淀并提取植物组织中的大部分POD酶蛋白，硫酸铵属于惰性物质，不易与其他生物活性物质发生反应，在纯化过程中能最大程度的保护蛋白活性，另外，硫酸铵的可溶性极好，能形成高盐环境，对于蛋白沉淀与后续的高盐纯化做准备。其次，酮沉淀法对POD酶活性影响也不大，在实验中的应用也是比较广泛的[67]。羧甲基（CM）纤维素等阳离子交换柱和二乙氨乙基（DEAE）纤维素等阴离子交换柱常被用来分离和纯化阳离子和阴离子POD酶蛋白，Sephadex G（交联葡聚糖凝胶，G后面的阿拉伯数为凝胶得水值的10倍，反映凝胶的交联程度、膨胀程度及分部范围。）系列和Sephacryl（葡聚糖与甲叉双丙烯酰胺交联而成）系

列凝胶过滤介质也被广泛用于POD的分离和纯化[68]。

在实验过程中可以采用不同盐浓度的缓冲液分离不同结合态的POD，一般情况下用低浓度的缓冲液（0.02~0.1mmol·L-1）提取游离状态的POD，而采用高浓度缓冲液（1~3mol·L-1NaCl或KCl，或3mol·L-1LiCl，或0.2~0.4mol·L-1CaCl2）抽提离子结合态POD，添加2.5%（P/V）果胶酶和0.5%纤维素酶（P/V）20℃处理植物组织，可抽提与细胞壁共价结合的POD[69]。另有实验证明用高效液相色谱可以纯化POD多肽片段。纯化后的样品可用于酶蛋白的氨基酸组成分析和序列测定及指纹图谱分析[70]。根据含血红素蛋白具有403nm和280nm2个吸收峰的特性，而且不同的同工酶具有不同的RZ值，可根据RZ值（OD403nm/280nm）来判断POD纯度。

各种电泳分离技术已经应用于分离和鉴定POD同工酶，也可鉴定酶蛋白的纯度。等电聚焦（IEF）可用来分离、纯化和鉴定不同等电点的同工酶，而制备IEF（preparative IEF）可用于大量纯化POD。非变性的酸性和碱性聚丙烯酰胺凝胶电泳，可分别用来分析阳离子和阴离子POD同工酶。SDS-PAGE则可用于测定纯化酶蛋白的分子量和鉴定酶纯度[71]。将电泳和免疫技术结合的Western blot 则用于同工酶的免疫特性分析。但值得注意的是，在离体条件下，POD活性并不一定完全代表此酶在原位的情况，分离和纯化酶的过程中会改变酶的活性。许多分离的POD能与多种底物反应，可能已远远超出了此酶在植物体内正常生理功能范围。POD酶活性常用的底物有愈创木酚、联苯胺、邻联茴香胺、抗坏血酸等，特别功能POD酶的鉴定需要更专一化的底物。

1.2.2.3POD的生理功能与环境胁迫的关系

POD是呼吸代谢过程中一种重要的末端氧化酶，在植物生命活动中起重要作用[72]，POD参与活性氧代谢过程，能够氧化分解吲哚乙酸，在调节细胞的伸长、生根、顶端优势、休眠及春化作用等方面有重要作用，IAA氧化酶与POD 的比例对植物的生理作用很关键。木质素是维管组织细胞壁的主要组成成分，POD参与木质素和木栓质的合成，在抵抗病原菌入侵和扩散方面有重要作用[73]。POD与植物体的抗逆性有关，其中主要包括抗盐、抗寒、抗旱、抗病，是植物体中保护酶系的重要保护酶之一。当植物处于逆境条件时，POD可以与超氧化

物歧化酶、过氧化氢酶相互协调配合，清除体内过剩的自由基，使体内自由基维持在正常的动态水平以提高植物的抗逆性[74]。POD还可以参与催化谷胱甘肽、NADH、DTT、草酰乙酸、氢醌、酪氨酸、阿魏酸等酚类化合物的氧化[75]。

POD可氧化酪氨酸形成二酪氨酸，异二酪氨酸和聚酪氨酸，但去掉卟啉和碳水化合物成分的酶蛋白不能氧化酪氨酸。这种氧化作用与细胞壁伸展蛋白的偶联有关，与伸展蛋白相关的POD活性降低可降低细胞壁的强度，促进细胞膨大和植株生长，相反则可能有助于增强对病菌的抗性。大量的胁迫处理试验和在分子水平上的基因调控研究证实，除了与植物正常代谢和生长发育相关的结构型POD外，很大部分POD的合成属于诱导表达型。在POD生理功能中，多数是与某种或多种胁迫作用导致细胞膜的损伤和破坏，细胞的空间结构被打破，以及损伤信号的转导等一系列生理生化变化有关。

1.2.3酶促褐变的机理

酶促褐变的研究始于20世纪40年代，曾先后提出乙醛乙醇毒害学说、氧自由基假说、Vc保护假说、酚-酚酶区域化分布学说等。其中，酚-酚酶区域化分布是目前较易接受的解释酶促褐变的学说[76]。

国内外学者一致认为新鲜果蔬在加工贮藏等过程中会发生酶促褐变，主要是由于其所含的PPO产生的作用。在绝大多数高等植物中PPO定位于叶绿体的类囊体和其它质体的基质中，而它的酚类底物在液泡中，因此在正常组织中它们是空间隔离的，当植物组织受损时这种空间隔离被打破，PPO与底物接触发生作用，单酚被羟化为双酚，双酚被二酚酶氧化为醌，醌自发集合且与细胞内蛋白质的一些氨基酸基团发生反应，产生黑色和褐色物质，从而导致组织酶促褐变[77]。加工过程中因物理损伤等原因而导致酶促褐变是很普遍的。不仅如此，果蔬贮藏时因为失水、低温，运输时碰撞等原因，都会使果皮等细胞中的空间隔离被打破，在氧的参与下发生褐变。

POD是果蔬成熟和衰老的指标，吴振先[78]等对贮藏荔枝果皮多酚氧化酶及POD与褐变进行了研究。研究结果表明荔枝果皮中含有很高的POD活性，在褐变过程中均有同工酶的消失或新同工酶的出现，果皮大部分褐变时，结合态POD 活性有所增加。Huang等认为，果皮POD活性的变化可能是褐变早期的标志。

线粒体与过氧化物酶体小结

第七章线粒体与过氧化物酶体 细胞的生存需要两个基本的要素：构成细胞结构的化学元件和能量。生物从食物中获取能量，根据对氧的需要情况分为两种类型：厌氧、好氧。在真核生物中，需氧的能量转化过程与线粒体有关，并且伴随一系列的化学反应，而在原核生物中，能量转化与细胞质膜相关。 线粒体外膜是线粒体最外的一层全封闭的单位膜结构，是线粒体的界膜，厚6～7nm, 平整光滑。外膜含有孔蛋白, 所以外膜的通透性非常高,使得膜间隙中的环境几乎与胞质溶胶相似。外膜含有一些特殊的酶类，外膜上含有单胺氧化酶,该酶是外膜的标志酶,这种酶能够终止胺神经递质,如降肾上腺素和多巴胺的作用。外膜的主要作用是形成膜间隙，帮助建立电化学梯度，同时能进行一些生化反应，协助线粒体内膜和基质完成能量转换功能。 内膜是位于外膜的内侧包裹线粒体基质的一层单位膜结构，厚5～6nm。内膜的通透性较低，一般不允许离子和大多数带电的小分子通过。内膜的蛋白与脂的比例相当高，并且含有大量的心磷脂，约占磷脂含量的20%，心磷脂与离子的不可渗透性有关。线粒体内膜通常要向基质折褶形成嵴，嵴的形成使内膜的表面积大大增加。线粒体内膜的嵴上有许多排列规则的颗粒称为线粒体基粒，即ATP 合酶，又叫F0 F1 ATP酶复合体，是一个多组分的复合物。内膜的酶类可以粗略地分为三个大类∶运输酶类∶内膜上有许多运输酶类进行各种代谢产物和中间产物的运输；合成酶类∶内膜是线粒体DNA、RNA和蛋白质合成的场所；电子传递和ATP合成的酶类∶这是线粒体内膜的主要成分，参与电子传递和ATP的合成。内膜的标志酶是细胞色素氧化酶。内膜是线粒体进行电子传递和氧化磷酸化的主要部位，含有电子传递链中进行氧化反应的蛋白和酶。在电子传递和氧化磷酸化过程中，线粒体将氧化过程中释放出来的能量转变成ATP。 膜间隙是线粒体内膜和外膜之间的间隙，宽6～8 nm，其中充满无定形的液体，含有可溶性的酶、底物和辅助因子。膜间隙中的化学成分很多，几乎接近胞质溶胶。腺苷酸激酶是膜间隙的标志酶，它的功能是催化ATP分子的末端磷酸基团转移到AMP，生成两分子ADP。膜间隙的功能是建立氢质子梯度。线粒体基质是内膜和嵴包围着的线粒体内部空间是线粒体基质。基质中的酶类最多，与三羧酸循环、脂肪酸氧化、氨基酸降解等有关的酶都存在于基质之中。此外还含有DNA、tRNAs、rRNA、以及线粒体基因表达的各种酶和核糖体。基质中的标志酶是苹果酸脱氢酶。线粒体基质的功能是进行氧化反应，主要是三羧酸循环。 线粒体对许多亲水物质透性低，所以必须具备主动运输系统。线粒体还是钙库，具有储备钙离子的能力，但是钙离子的出入需要运输蛋白。内膜的运输系统主要是运输蛋白和促进运输作用的脂类，此外还有参与电子传递和氢质子传递的复合物。线粒体需要自主完成下列运输作用:①糖酵解产生的NADH必须进入电子传递链参与有氧氧化；②线粒体产生的代谢物质如草酰辅酶A和乙酰辅酶A

甲状腺过氧化物酶超出1000,是什么病

甲状腺过氧化物酶超出1000，是什么病？ 甲状腺过氧化物酶（TPOA）是催化甲状腺激素的重要酶。甲状腺过氧化物酶（TPOA）由甲状腺滤泡细胞合成，它是由933个氨基酸残基组成的分子量为103kD的10%糖化的血色素样蛋白质，在滤泡腔面的微绒毛处分布最为丰富。甲状腺过氧化物酶很常见，服用某些药物也会产生甲状腺过氧化物酶升高的现象，超出三倍以上就可确诊为甲状腺炎，在三倍以下可以观察，看是否甲状腺过氧化物酶恢复正常。 甲状腺专家贾春宝博士指出：甲状腺过氧化物酶（TPOA）是主要的甲状腺组织自身抗体，是甲状腺激素合成过程的关键酶，与甲状腺组织免疫性损伤密切相关。主要包括甲状腺刺激性抗体(TS-Ab)和甲状腺刺激阻滞性抗体(TSB-Ab)。 这项化验结果高说明您患有甲状腺的炎症，一般来说甲状腺功能的检查都会查T3、T4、TSH，所以只有这一项不合格的话，就说明只是单纯的炎症，没有伴随甲亢或甲减的症状，但是并不能肯定炎症是如果引起的，因为引起炎症的因素有很多，所以还要配合其他检查来确定。建议再去做一个甲状腺彩超，看是否有可能是甲状腺的结节或肿大引起的。 对于甲状腺炎的治疗，西医是没有药物治疗的，只有当患者发展为终身性甲减或者甲亢时，医生会开一些激素药，让患者服用，长期服用激素对身体有很大的影响，而且会产生依赖性。 中医中药对于治疗桥本氏甲状腺为具有明显的优势。贾春宝博士说，所谓桥本甲状腺炎在中医里主虚证，由脾肾阳虚引起的，所以患者常常表现为乏力、倦呆，记忆下降等症状。在临床上，我们通过健脾气、温肾阳的方法，可达到扶弱固本，增强后天禀赋的效果，从而使甲状腺过氧化物酶指标恢复正常。

碱性蛋白酶的分离纯化与性质初探

碱性蛋白酶的分离纯化与性质初探 一、综述本课题国内外研究动态，说明选题的依据和意义: 1.国内外研究现状 碱性蛋白酶(Alkaline protease)广泛存在于微生物中,最早发现在猪的胰脏中，1913年Rhom首先将胰蛋白酶作为洗涤浸泡剂使用。1945年瑞士的Dr.Jagg 等发现了微生物碱性蛋白酶,使其成为洗涤剂的主要添加剂之一。碱性蛋白酶在丝绸、制革工业、饲料工业、动物食品加工中也有广泛用途。由于市场的需求，高产、高效、耐高温、耐高碱的四高型碱性蛋白酶成为国内外当前研究的热点之一[1]。 研究结果发现，海洋酶具有作用pH 范围宽，最适pH 和反应温度适中，随反应温度的降低酶活性下降缓慢等特点。海洋酶所具有的独特性质，引起学术界高度重视，日、美等国就此展开了深入的研究。迄今为止，由海洋微生物生产海洋酶的专利已达20 余项。海洋微生物酶的研究正逐渐成为发达国家开发新型酶制剂的重要途径[2,3]。 相比之下，国内在海洋碱性蛋白酶研究方面差距较大。综合多篇文献分析，目前针对海洋细菌产生的碱性蛋白酶，分离提纯的方法大致多采用饱和硫酸铵分级盐析和层级技术。首先是从发酵液取上清制备粗酶液（此酶为一种外分泌蛋白，无需通过溶菌酶溶解或超声波破碎细胞来制备粗酶液），通过超速离心沉淀，饱和硫酸铵分级盐析，透析，凝胶层析或离子交换层析来分离提纯该菌所产生的碱性蛋白酶。其中一些已经对酶的性质、序列等进行了研究[4-7]。 2.选题依据及意义 此毕业设计的课题为《碱性蛋白酶的分离纯化及性质初探》，主要是对海洋细菌进行培养及分离提纯方案的改进，并对其性质进行初步探究。大致是将各种相关参数和实验数据建立正交关系得到最佳培养条件，并对其产生的碱性蛋白酶进行分离提纯，同时得出最佳分离提纯方案。最后对碱性蛋白酶的性质进行初步研究。本设计针对目前研究较少的产碱性蛋白酶的海洋微生物新菌株，研发新型高效的碱性蛋白酶，这对满足人类生活、生产与技术开发的需求至关重要。这种积极采用微生物代替化学法的探究，有利于开发现代生物新产品的工业化生产技术研究，有利于加快现代生物领域产业的发展。 二、研究的基本内容，拟解决的主要问题 1.海水中碱性蛋白酶高产菌株的筛选；

髓过氧化物酶

髓过氧化物酶(myeloperoxidase，MPO)又称过氧化物酶，是一种重要的含 铁溶酶体，存在于髓系细胞(主要是中性粒细胞和单核细胞)的嗜苯胺蓝颗 粒中，是髓细胞的特异性标志，随着对 MPO 研究的深入，人们发现 MPO 基 因多态性导致个体对一些疾病易感性的差异，与人类多种疾病的发生、发 展密切相关，因此越来越受到国内外学者的重视。 髓过氧化物酶 MPO 研究 1.MPO 的结构髓过氧化物酶(MPO)是由中性粒细胞、单核细胞和某些组 织的巨噬细胞分泌的含血红素辅基的血红素蛋白酶，是血红素过氧化物酶 超家族成员之一。MPO 是 I 相代谢酶。每个酶分子有两个铁素基团，顺磁共 振波谱表明血红素中的铁是在甲酰基血红素部分。 MPO 的合成是粒细胞进入 循环之前在骨髓内合成并贮存于嗜天青颗粒内，外界刺激可导致中性粒细 胞聚集，释放髓过氧化物酶(MPO)。在成熟的粒细胞中，MPO 是含量最丰富 的糖蛋白，约占外周血多形核中性粒细胞(PMNs)内总蛋白质含量的 5%，血 液中 95%的 MPO 来源于 PMNs。MPO 的相对分子质量为 150×103，是由 2 个 亚单位聚合而成的二聚体，每个亚单位又由一条重链(α 链,相对分子质量 约 60×103)和一条轻链(β 链,相对分子质量约 15×103)所构成。2 个亚单 位在 α 链处由 1 个二硫键相连。重链具有亚铁卟啉基团，说明 MPO 是铁依 赖性的。MPO 以 3 种亚形存在于髓系细胞中，分别为 MPOⅠ、Ⅱ、Ⅲ。3 种 亚型主要是重链有差异，轻链的差异较小，导致它们在相对分子质量及疏 水性等方面不同，3 种亚型在功能上的差异还不明确，有待进一步研究。 2.MPO 基因及其多态性人髓过氧化物酶基因位于染色体 17q23?q24，含 有 12 个外显子和 11 个内含子，长约 14 638 bp，调控其基因表达的是生长 因子。MPO 的 mRNA 在早幼粒细胞的表达水平最高，其次是原始粒细胞、幼 稚和原始单核细胞；当细胞分化到成熟时期，MPO 基因表达水平迅速下降。 现已知 MPO 基因首先表达的是一条相对分子质量为 89×103 的前体蛋白 (precursor protein)，经过翻译后加工，切割成 α 和 β 两种亚基，再聚 合为成熟的 MPO 分子，加上糖链，最后形成有功能的 MPO。MPO 在基因表达 过程中存在的缺陷，造成 MPO 基因 DNA 序列发生改变，影响其活力。MPO 基 因的多态性影响其基因的转录和表达，对机体的疾病易感性有一定的影响。 Chevrier 等发现了外显子 11 处和启动子区域的 V53F、A332V、I642L 和 IVS11? 2A→C4 个新的基因多态性位点， 它们的作用与功能需要进一步研究。 Piedrafita 等研究发现与疾病有关的位点有 5 个：463G/A，R569W，Y173C， M251T 和外显子 9 的碱基缺失。目前研究最多的是 MPO 基因启动子区第 463 位核苷酸 G/A 的突变，该位点位于 SP1 转录因子识别结合的顺式作用元件 中，内含 4 个 Alu 重复序列。G/A 的突变导致位于 Alu 反应元件的 SP1 转录 因子结合位点消失，从而使 MPO 转录水平显著下降。也有报道发现外显子 10 的密码子 569 存在 C 被 T 替代，使 CGG→TGG，导致遗传性 MPO 缺陷性疾

酶的分离纯化方法介绍

酶的分离纯化方法介绍 酶的分离纯化一般包括三个基本步骤：即抽提、纯化、结晶或制剂。首先将所需的酶从原料中引入溶液，此时不可避免地夹带着一些杂质，然后再将此酶从溶液中选择性地分离出来，或者从此溶液中选择性地除去杂质，然后制成纯化的酶。 关键词：酶抽提纯化结晶制剂细胞破碎cell disruption 盐析亲和沉淀有机溶剂沉淀 生物细胞产生的酶有两类： 一类由细胞内产生后分泌到细胞外进行作用的酶，称为细胞外酶。这类酶大都是水解酶，如酶法生产葡萄糖所用的两种淀粉酶，就是由枯草杆菌和根酶发酵过程中分泌的。这类酶一般含量较高，容易得到； 另一类酶在细胞内产生后并不分泌到细胞外，而在细胞内起催化作用，称为细胞内酶，如柠檬酸、肌苷酸、味精的发酵生产所进行的一系列化学反应，就是在多种酶催化下在细胞内进行的，在类酶在细胞内往往与细胞结构结合，有一定的分布区域，催化的反应具有一定的顺序性，使许多反应能有条不紊地进行。酶的来源多为生物细胞。生物细胞内产生的总的酶量虽然是很高的，但每一种酶的含量却很低，如胰脏中期消化作用的水解酶种类很多，但各种酶的含量却差别很大。 因此，在提取某一种酶时，首先应当根据需要，选择含此酶最丰富的材料，如胰脏是提取胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、淀粉酶和脂酶的好材料。由于从动物内脏或植物果实中提取酶制剂受到原料的限制，如不能综合利用，成本又很大。目前工业上大多采用培养微生物的方法来获得大量的酶制剂。从微生物中来生产酶制剂的优点有很多，既不受气候地理条件限制，而且动植物体内酶大都可以在微生物中找到，微生物繁殖快，产酶量又丰富，还可以通过选育菌种来提高产量，用廉价原料可以大量生产。 由于在生物组织中，除了我们所需要的某一种酶之外，往往还有许多其它酶和一般蛋白质以及其他杂质，因此为制取某酶制剂时，必须经过分纯化的手续。 酶是具有催化活性的蛋白质，蛋白质很容易变性，所以在酶的提纯过程中应避免用强酸强碱，保持在较低的温度下操作。在提纯的过程中通过测定酶的催化活性可以比较容易跟踪酶在分离提纯过程中的去向。酶的催化活性又可以作为选择分离纯化方法和操作条件的指标，在整个酶的分离纯化过程中的每一步骤，始终要测定酶的总活力和比活力，这样才能知道经过某一步骤回收到多少酶，纯度提高了多少，从而决定着一步骤的取舍。 酶的分离纯化一般包括三个基本步骤：即抽提、纯化、结晶或制剂。首先将所需的酶从原料中引入溶液，此时不可避免地夹带着一些杂质，然后再将此酶从溶液中选择性地分离出来，或者从此溶液中选择性地除去杂质，然后制成纯化的酶制剂。下面就酶的分离纯化的常用方法作一综合介绍： 一、预处理及固液分离技术 1.细胞破碎（cell disruption） 高压均质器法：此法可用于破碎酵母菌、大肠菌、假单胞菌、杆菌甚至黑曲霉菌。将细胞悬浮液在高压下通入一个孔径可调的排放孔中，菌体从高压环境转到低压环境，细胞就容易破碎。菌悬液一次通过均质器的细胞破碎率在12%-67%。细胞破碎率与细胞的种类有关。

过氧化物酶peroxidase 简介

过氧化物酶peroxidase 简介 peroxidase 氧化还原酶的一种。 过氧化物酶是由微生物或植物所产生的一类氧化还原酶,它们能催化很多反应. 过氧化物酶是以过氧化氢为电子受体催化底物氧化的酶。主要存在于细胞的过氧化物酶体中,以铁卟啉为辅基,可催化过氧化氢氧化酚类和胺类化合物,具有消除过氧化氢和酚类、胺类毒性的双重作用。 过氧化物酶体是由一层单位膜包裹的囊泡, 直径约为0.5～1.0μm, 通常比线粒体小。普遍存在于真核生物的各类细胞中,在肝细胞和肾细胞中数量特别多。过氧化物酶体的标志酶是过氧化氢酶,它的作用主要是将过氧化氢水解。过氧化氢(H2O2)是氧化酶催化的氧化还原反应中产生的细胞毒性物质,氧化酶和过氧化氢酶都存在于过氧化物酶体中,从而对细胞起保护作用。 植物体中含有大量过氧化物酶，是活性较高的一种酶。它与呼吸作用、光合作用及生长素的氧化等都有关系。在植物生长发育过程中它的活性不断发生变化。一般老化组织中活性较高，幼嫩组织中活性较弱。这是因为过氧化物酶能使组织中所含的某些碳水化合物转化成木质素，增加木质化程度，而且发现早衰减产的水稻根系中过氧化物酶的活性增加，所以过氧化物酶可作为组织老化的一种生理指标。此外，过氧化物同工酶在遗传育种中的重要作用也正在受到重视. 催化从底物移去电子，并转给过氧化氢反应。 即：供体+H2O2→氧化的供体+2H2O，是一种血红素蛋白(hemoprotein)。 如过氧化氢酶便是过氧化物酶的一种。过氧化氢酶可与葡萄糖氧化酶配合使用，脱除蛋清中的葡萄糖，代替了传统的自然发酵的方法，从而提高产品质量，缩短生产周期。 在医学上，也可作为工具酶，用于检验尿糖和血糖。 现代医学上认为机体衰老与氧化有关，例如染色体、酶等的氧化。所以，一些有还原性功能的物质可以在某种程度上抗衰老，如过氧化物酶体，维生素C、E也有抗衰老作用。

蛋白质和酶的分离与纯化培训讲学

蛋白质和酶的分离与 纯化

蛋白质和酶的分离纯化及鉴定 蛋白质是生命体中的重要物质基础之一。从分子水平上认识生命现象，已成为现代生物学发展的主要方向。要研究蛋白质，首先要得到高度纯化的目的蛋白。蛋白质在组织或细胞中一般都是以复杂的混合物形式存在，每种类型的细胞都含有上千种不同的蛋白质。要想从成千上万种蛋白质混合物中纯化出目的蛋白，就要根据蛋白质的理化性质不同设计出合理的分离方法。 目前研究为止酶除核酶外本质都是蛋白质，因此酶的分离纯化方法基本是采用蛋白质的分离纯化方法，但是酶的活性受到多种因素的影响，因此酶的分离纯化比一般的蛋白质要求更高。 一、质分离纯化的一般原则 1. 原料的选择 原则：来源方便，成本低，易操作、安全的原料。 蛋白分布：体液、组织、细胞定位 2. 破碎方法： (1) 机械方法：通过机械运动产生的剪切力的作用，使细胞或组织破碎的方法。 如：捣碎法、研磨、匀桨法 (2) 物理方法：通过温度、压力、声波等各种物理因素的作用，使组织细胞破碎的方法。 如：反复冻融、渗透压、超声破碎 (3) 化学方法：通过各种化学试剂对细胞膜的作用，使细胞破碎的方法. 如：甲苯、丙酮、氯仿和非离子型的表面活性剂（Triton和Tween） (4) 酶促法：溶菌酶、蜗牛酶等 3. 目的蛋白或酶的特异、快速、精确的定性或定量方法 4. 先粗后细，分级分离 粗分：将得到的蛋白溶液先利用简单、快速、易处理的方法除去大部分杂蛋白。如: 盐析、离心、有机溶剂沉淀等。 精制：利用蛋白质性质的差异，采用不同的方法，如:离子交换层析、分子筛、吸附层析、亲和层析、电泳、离心、结晶等方法进一步纯化。 5. 避免蛋白质的变性（pH、适合的温度和缓冲体系等） 二、常用的蛋白质的分离纯化技术

过氧化物酶体Peroxisome

第四节过氧化物酶体（Peroxisome） 1954年，Rhodin在研究大鼠肾小管上皮细胞时发现一种膜结合的颗粒，直径约为0.5～1.0μm。由于不知道这种颗粒的功能，将它称为微体(microbody)。微体有两种主要类型∶过氧化物酶体和乙醛酸循环体(glyoxysomes)，后者只在植物中发现。 一、过氧化物酶体的形态结构和化学组成 过氧化物酶体的形态、大小多样。多为圆形或卵圆形，直径0.01～0.15nm。常含有类核体（类晶体）结构，为尿酸氧化酶，有些含有边缘板，与形态有关（图3-2-7）。 图3-2-7动物细胞中的过氧化物酶体 过氧化物酶体含有丰富的酶类，目前已知的有40余种，主要是氧化酶(oxidase)、过氧化氢酶(catalase)和过氧化物酶。氧化酶作用于不同的底物，其共同特征是氧化底物的同时，将氧还原成过氧化氢:RH2 + O2→ R + H2O2。过氧化氢酶是过氧化物酶体的标志酶，它的作用是使过氧化氢还原成水: 2H2O2→ O2 + 2H2O。过氧化物酶类仅存在于血细胞等少数细胞。 二、过氧化物酶体的功能 1、使毒性物质失活 这种作用是过氧化氢酶利用过氧化氢氧化各种底物，如酚、甲酸、甲醛和乙醇等，氧化的结果使这些有毒性的物质变成无毒性的物质，同时也使H2O2进一步转变成无毒的H2O。这种解毒作用对于肝、肾特别重要，例如人们饮入的乙醇几乎有一半是以这种方式被氧化成乙醛的，从而解除了乙醇对细胞的毒性作用。 2、对氧浓度的调节作用 过氧化物酶体与线粒体对氧的敏感性是不一样的，线粒体氧化所需的最佳氧浓度为2%左右，增加氧浓度，并不提高线粒体的氧化能力。过氧化物酶体的氧化率是随氧张力增强而成正比地提高（图3-2-8）。因此，在低浓度氧的条件下，线粒体利用氧的能力比过氧化物酶体强，但在高浓度氧的情况下，过氧化物酶体的氧化反应占主导地位，这种特性使过氧化物酶体具有使细胞免受高浓度氧的毒性作用。

木瓜蛋白酶的提取

木瓜蛋白酶的提取、分离纯化及其生物学研究综述及实验方法 13生物技术第二大组第二小组 组员：王玓玥（组长）、王子贺、王思瑶、王宇涛、王守鑫、谭国栋一、研究背景： 在经济飞速发展的今天，人们的生活水平已远远不只在于吃饱穿暖，食品的安全和营养问题受到人们越来越多的关注，绿色健康的生活也成为大家共同的追求，木瓜蛋白酶以它自身耐热及特殊结构等特点被广泛的用于食品行业，如何分离纯化得到高纯度低成本的木瓜蛋白酶则是人们现在研究的重点，本小组便也以此为研究主题展开实验。 二、木瓜蛋白酶基本介绍：木瓜蛋白酶，又称木瓜酶，是一 种蛋白水解酶。木瓜蛋白酶是番木瓜中含有的一种低特异性蛋白水解酶，广泛地存在于番木瓜的根、茎、叶和果实内，其中在未成熟的乳汁中含量最丰富。木瓜蛋白酶的活性中心含半胱氨酸，属于巯基蛋白酶，它具有酶活高、热稳定性好、天然卫生安全等特点，这种蛋白水解酶，分子量为23406，由一种单肽链组成，含有212个氨基酸残基。至少有三个氨基酸残基存在于酶的活性中心部位，他们分别是Cys25、His159和Asp158，当Cys25被氧化剂氧化或与金属离子结合时，酶的活力被抑制，而还原剂半胱氨酸（或亚硫酸盐）或EDTA能恢复酶的活力木瓜蛋白酶是一种在酸性、中性、碱性环境下均能分解蛋白质的蛋白酶。它的外观

为白色至浅黄色的粉末，微有吸湿性；木瓜蛋白酶溶于水和甘油，水溶液为无色或淡黄色，有时呈乳白色；几乎不溶于乙醇、氯仿和乙醚等有机溶剂。木瓜蛋白酶是一种含巯基(-SH)肽链内切酶，具有蛋白酶和酯酶 的活性，有较广泛的特异性，对动植物蛋白、多肽、酯、酰胺等有较强的水解能力，但几乎不能分解蛋白胨。木瓜蛋白酶的最适合PH值6～7(一般3～9.5皆可)，在中性或偏酸性时亦有作用，等电点（pI）为8.75；木瓜蛋白酶的最适合温度55～65℃(一般10～85℃皆可)，耐热性强，在90℃时也不会完全失活；受氧化剂抑制，还原性物质激活。。另外六个半胱氨酸残基形成了三对二硫键,且都不在活性部位。纯木瓜蛋白酶制品可含有：（1）木瓜蛋白酶，分子量21000，约占可溶性蛋白质的10%；（2）木瓜凝乳蛋白酶，分子量26000，约占可溶性蛋白质的45%；（3）

髓过氧化物酶MPO的临床应用

髓过氧化物酶指数在57例急性冠状动脉综合征患者的临床应用 髓过氧化物酶(MPO是由中性粒细胞、单核细胞和某些组织的巨噬细胞分泌的含血红素辅基的血红素蛋白酶,是血红素过氧化物酶超家族成员之一。分子量为150KDa。MPO基因位于人第17号染色体,其编码蛋白翻译修饰后形成2条轻链和2条重链,构成四聚体糖基化蛋白。在早期由北京协和洛克和美国克利夫兰医院共同研究发现出来,它具有早期预警和提前筛查心脑血管疾病一个标记物。另一方面血液中95%的MPO来源于多形核白细胞。尽早明确急性冠状动脉综合征(acute coronary syndrome,ACS的诊断、危险分层及正确地评估个体近期发生ACS的危险性,对尽早干预治疗ACS至关重要。有研究表明,血浆髓过氧化物酶(myeloperoxidase,MP0是早期诊断ACS的重要指标,与心肌肌钙蛋白I(cardiac troponin I,cTnI联合应用更能增加ACS诊断的灵敏度[1]。尤其是当cTnI正常时,血浆MPO升高可预测心脏事件的发生[2]。但血浆MPO检测方法繁琐,目前无法自动化,临床应用受到限制。Unionluck全自动血细胞分析仪是一种基于流式细胞分析原

理的仪器,现在广泛应用于大中型医院实验室,在计数全血细胞的同时可根据细胞内MPO染色的情况得出中性粒细胞过氧化物酶活性指数(myeloperoxidase index,MPXI,用于评价炎症状况和白血病[3-4]。现将本院分析MPXI在57例ACS患者的临床应用报道如下。 1资料与方法 1.1一股资料选择2011年5~8月本院收治的ACS患者57例。其中,不稳定型心绞痛(UAP20例为UAP组,其中,男12例,女8例,年龄(70.00±10.10岁。非ST段抬高心肌梗死(NSTEMI20例为NSTEMI组,其中,男12例,女8例,年龄(67.00±18.10岁。ST段抬高型心肌梗死(STEMI17例为STEMI组,其中,男8例,女9例,年龄 (69.90±15.20岁。选取同期本院体检中心健康体检者20例为对照组,其中,男10例,女10例,年龄(63.3±3.0岁。根据病史和辅助检查,ACS的临床诊断标准参照美国心脏病学会(美国心脏病协会制订的标准[5]。排除标准:(1近期罹患感染性疾病或慢性炎症疾病;(2严重血液性疾病;(3骨髓移植术;(4结缔组织病和风湿病;(5应用炎症抑制药物如非固醇类消炎镇痛药、类固醇类药物等;(6创伤、肿瘤;(7严重肝肾功能不全。4组年龄、性别等方面比较差异无统计学意义,具有可比性。

胃蛋白酶提取的分离纯化

胃蛋白酶提取法中分离纯化技术的研究进展 摘要：本文就胃蛋白酶的生物提取法，对其在生产过程中的分离、纯化技术展开综述。其中，分离技术主要介绍了：盐析法、有机溶剂沉淀法、底物亲和法、透析法。纯化技术主要介绍了：凝胶过滤法、透析离子交换法。综合比较各分离纯化方法的特点，得到最优的分离纯化方法有机溶剂与盐析共沉淀法、膜分离技术、等电点沉淀法与底物亲和法。 关键词：胃蛋白酶分离纯化应用 ．生物提取法生产胃蛋白酶 1．1 工艺路线 （自溶、过滤）（脱脂、去杂质） 猪胃黏膜→自溶液→上清液 （浓缩、干燥） →胃蛋白酶成品 工艺过程 （1）原材料的选择和预处理：胃蛋白酶原主要存在于胃粘膜基底部，采集原料时剥取的粘膜直径大小与收率有关。一般取直径10cm、深2-3mm的胃基底部粘膜最适宜，每头猪胃平均剥取粘膜100g左右。（2）自溶、过滤：在夹套锅内预先加水100升及盐酸升，加热至50度时，在搅拌下加入200千克猪胃黏膜，快速搅拌使酸度均匀，保持45—48度，消化3-4小时，得自溶液。用纱布过滤除去未消化的组织尿蛋白，收集滤液。（3）脱脂、去杂质：将滤液降温至30℃以下，加入15-20％氯仿或乙醚，搅匀后转入沉淀脱脂器内，静置24-48小时，使杂质沉淀，分出弃去，得脱脂酶液。（4）浓缩、干燥：取清酶液，在40℃以下减压浓缩至原体积的1／4左右，再将浓缩液真空干燥。球磨过80-100目筛，即得胃蛋白酶粉。 2胃蛋白酶的分离技术 有机溶剂法

可用于胃蛋白酶的初步提取浓缩。通常使用的有机溶剂有甲醇、乙醇、丙酮、异丙酮，其沉淀蛋白质的能力为：丙酮＞异丙酮＞乙醇＞甲醇。当然此顺序也不是一成不变的，因为还要受温度、pH、离子强度等因素的影响。丙酮沉淀能力最好，但挥发损失多，价格较昂贵，所以工业上常采用乙醇作为沉淀剂。 2．2盐析法 盐析法是酶制剂工业中常用方法之一，硫酸镁、硫酸铵、硫酸钠是常用的盐析剂，其中用的最多的是硫酸铵。美国专利（2，701,228）改进后，用锌盐沉淀胃酶。当母液含醇（或酮）在50%--55%、pH在—时几乎全部胃酶可以用醋酸锌沉淀，沉淀物为胃酶的锌盐，然后用金属螯合剂除去锌盐，得15000—16000倍活力的酶，收集率为%%。此法较上述有机溶剂沉淀所得的胃酶活力和得率都高。 底物亲和法 底物亲和法是利用酶（胃蛋白酶）与其底物（酪蛋白）的亲和性，从胃粘膜中提取得到胃蛋白酶。使底物和酶在的乳酸缓冲液中充分结合，然后调pH至4（底物的等电点）沉淀底物和酶的结合物，随后让沉淀物再溶解于乳酸缓冲液中，添加低浓度的SDS将底物和酶分离，得到酶—SDS复合物，再进一步分离纯化。陈躬瑞（2001）成功的应用此法对蛇胃蛋白酶进行了实验室分离，得率大约为30%。与传统的分离方法比较，此法具有简单高效的优点，为后续的纯化工艺避免了昂贵的活化试剂和配基的使用，同时具有较高的特异性。【2】 透析法 胃蛋白酶的分离过程中还经常用到透析法。该法是利用蛋白质大分子对半透膜的不可透过性而与小分子物质及盐分开的。由于透析主要是扩散过程，如果袋内外的盐浓度相等，扩散就会停止，因此要经常换溶剂，一般一天换2—3次。如在冷处透析，则溶剂也要预先冷却，避免样品变性。透析时的盐是否除净，可用化学试剂或电导仪来检测。【1】 3胃蛋白酶的纯化技术 凝胶过滤法

线粒体与过氧化物酶体

1. 线粒体(mi tochondri on) 线粒体是1850年发现的,1898年命名。线粒体由两层膜包被,外膜平滑,内膜向内折叠形成嵴,两层膜之间有腔,线粒体中央是基质。基质内含有与三羧酸循环所需的全部酶类,内膜上具有呼吸链酶系及ATP酶复合体。线粒体是细胞内氧化磷酸化和形成ATP的主要场所,有细胞"动力工厂"(power plant)之称。另外,线粒体有自身的DNA和遗传体系, 但线粒体基因组的基因数量有限,因此,线粒体只是一种半自主性的细胞器。 线粒体的形状多种多样, 一般呈线状,也有粒状或短线状。线粒体的直径一般在0.5～1.0 μm, 在长度上变化很大, 一般为1.5～3μm, 长的可达10μm ,人的成纤维细胞的线粒体则更长,可达40μm。不同组织在不同条件下有时会出现体积异常膨大的线粒体, 称为巨型线粒体(megamitochondria) 在多数细胞中,线粒体均匀分布在整个细胞质中,但在某些些细胞中,线粒体的分布是不均一的,有时线粒体聚集在细胞质的边缘。在细胞质中,线粒体常常集中在代谢活跃的区域,因为这些区域需要较多的ATP,如肌细胞的肌纤维中有很多线粒体。另外, 在精细胞、鞭毛、纤毛和肾小管细胞的基部都是线粒体分布较多的地方。线粒体除了较多分布在需要ATP的区域外,也较为集中的分布在有较多氧化反应底物的区域,如脂肪滴,因为脂肪滴中有许多要被氧化的脂肪。 2. 外膜(o ute r membrane) 包围在线粒体外面的一层单位膜结构。厚6nm, 平整光滑, 上面有较大的孔蛋白, 可允许相对分子质量在5kDa左右的分子通过。外膜上还有一些合成脂的酶以及将脂转变成可进一步在基质中代谢的酶。外膜的标志酶是单胺氧化酶。 3. 内膜(inner memb rane) 位于外膜内层的一层单位膜结构, 厚约6nm。内膜对物质的通透性很低, 只有不带电的小分子物质才能通过。内膜向内折褶形成许多嵴, 大大增加了内膜的表面积。内膜含有三类功能性蛋白:①呼吸链中进行氧化反应的酶; ②ATP合成酶复合物; ③一些特殊的运输蛋白, 调节基质中代谢代谢物的输出和输入。内膜的标志酶是细胞色素氧化酶。 4. 线粒体膜间隙(in ter memb rane space) 线粒体内膜和外膜之间的间隙, 约6～8nm, 其中充满无定形的液体, 含有可溶性的酶、底物和辅助因子。膜间隙的标志酶是腺苷酸激酶。 5. 线粒体基质( ma tr ix) 内膜和嵴包围着的线粒体内部空间, 含有很多蛋白质和脂类,催化三羧酸循环中脂肪酸和丙酮酸氧化的酶类, 也都存在于基质中。此外, 还含有线粒体DNA、线粒体核糖体、tRNAs、rRNAs以及线粒体基因表达的各种酶。基质中的标志酶是苹果酸脱氢酶。 6. 嵴(c ris tae)

过氧化物酶体增殖物激活受体研究的新进展_刘美莲

(niacin),纤维酸类,雌二醇,他汀类。 烟酸是最常用最有效的药物,其代表药物为N-i aspan,可抑制肝脏对Apo -AI 的清除,促进C H 的逆转运,因此能提高血HDL -C H (25%~30%),Apo -AI,HDL2,HDL3水平,降低TG 及LDL,此药安全性好,副作用少,能够被患者较好耐受,也适用于II 型糖尿病患者。 纤维酸主要通过促进Apo -AI,AII 基因表达来提高血浆HDL 浓度;同时,它还可以减轻静脉壁炎症反应,抑制血栓形成。临床实践表明gemfibrozil,bezafibrate 及fenofibrate 可以有效缓解高脂血症及II 型糖尿病患者动脉硬化进展,gemfibrozil 尤其适用于低HDL 正常TG 及LDL 患者 [14] 。 雌二醇促进Apo -AI 基因的转录,因而刺激Apo -AI 的合成,故理论上其与烟酸、纤维酸合用效果更 好,但目前尚未用之于临床。 他汀类(Lovastatin,Pravastatin 及Simvastatin)已广泛用于治疗高脂血症,但提高HDL 效果不如前述药物,因此,临床提倡与前述药物联合应用[15]。4.3 基因疗法 将人Apo -AI,Apo -AIV,Apo -E,LC AT,LPL,SR -BI 基因注入转基因小鼠,可使HDL -C 浓度明显增高,缓解高脂血症;导入CETP 的反义寡聚核苷酸(ODNS),可通过降低LDL 及VLDL 、增高HDL -C 水平,对AS 的发生产生抑制作用。应用基因 疗法提高HDL 治疗高脂血症将是本世纪重点研究课题,而且将由动物实验过度到临床[16,17]。 参 考 文 献 01 Colvi n PL,Parks J S.Curr Opin Lipidol,1999,10(4):309-314.02 Kerry -Anne R,Moira AC,Philip J.Atherosclerosi s,1999,145(2):227-238. 03 Phillips MC,Gillotte KL,Haynes MP et al .Atherosclerosis,1998,137: 13-17. 04 Silver D L,Jiang XC,Arai T,et al .Ann NY Acad Sci,2000,902:103-111. 05 Moes trup SK,Kozyraki R.Curr Opin Lipi dol,2000,11(2):133-140.06 Kas hyap ML.Am J Cardiol,1998,82:42-48. 07 Hargruve G M ,Junc o A,Wong NC.J Mol Endocrinol,1999,22(2):103-111. 08 Chen Hua,Yu Qing -Sheng,Guo Zhao -Gui,et al .Ac ta Physi ol Scand, 2000,52(1).81-84. 09 Boden WE,Pearson TA.Am J Cardiol,2000,85(5):645-650.10 Saffer RS,Cornell MO.Pos tgrad Med,2000,108(7):87-90.11 Bowen PH,Guyton JR.Curr Atheroscler Rep,2000,2(1):58-63.12 De Lorimier AA.Am J Surg,2000,180(5):357-361. 13 Tavintharan S,Kashyap ML.Curr Atheroscler Rep,2001,3(1):74-82.14 Fruchart JC,Staels B,Duriez P,et al .Curr Atheroscler Rep,2001,3 (1):83-92. 15 Stei n EA.Curr Atheroscler Rep,2000,2(1):11-13. 16 Rader DJ,Tie tge UJ.Curr Atheroscler Rep,1999,1(1):58-69.17 Ka washiri M,Maugeais C,Rader DJ,e t al .Curr Atheroscler Rep, 2000,2(5):363-372. 过氧化物酶体增殖物激活受体研究的新进展X 刘美莲 综述 宋惠萍 审校 (中南大学湘雅医学院生物化学教研室,湖南长沙410078) 摘要:过氧化物酶体增殖物激活受体(PPARs)是一种核内受体转录因子,具有多种生物学效应。除能调节脂肪分化和脂代谢外,PPARs,尤其是PPAR C 还能调控细胞因子生成,增强机体对胰岛素的敏感性,具有调节体内糖平衡,控制炎症形成和影响肿瘤生长等作用。 关键词:过氧化物酶体增殖物激活受体(PPARs); PPARs 的配基; 微体; 脂质过氧化作用; PPARr 中图分类号:R34 文献标识码:A 文章编号:1001-1773(2001)05-0413-03 过氧化物酶体增殖物激活受体(PPARs)是调节目标基因表达的核内受体转录因子超家族成员[1]。1990年,PPARs 作为过氧化物酶体增殖的关键分子第一次被发现[2],因具有由过氧化物酶体增殖物激 活而得名。PPARs 具有多种生物学效应,可促进脂肪细胞分化和脂肪生成,增强机体对胰岛素的敏感性[3] ,调节体内糖平衡,抑制炎症因子生成及炎症形成,影响肿瘤生长,对心血管产生保护效应[4]。 413 X 收稿日期:2000-12-06 修回日期:2001-05-09 作者简介:刘美莲(1971-),女,湖南人,中南大学湘雅医学院生化教研室讲师,博士,从事糖尿病及并发症的发病机制方面的研究。 第21卷第5期2001年10月 国外医学#生理、病理科学与临床分册 Foreign M edical Sci ences #Sec tion of Pathophysi ology and Clinical M edici ne Vol.21 No.5 Oct. 2001

胃蛋白酶提取的分离纯化

胃蛋白酶提取的分离纯 化 IMB standardization office【IMB 5AB- IMBK 08- IMB 2C】

胃蛋白酶提取法中分离纯化技术的研究进展 摘要：本文就胃蛋白酶的生物提取法，对其在生产过程中的分离、纯化技术展开综述。其中，分离技术主要介绍了：盐析法、有机溶剂沉淀法、底物亲和法、透析法。纯化技术主要介绍了：凝胶过滤法、透析离子交换法。综合比较各分离纯化方法的特点，得到最优的分离纯化方法有机溶剂与盐析共沉淀法、膜分离技术、等电点沉淀法与底物亲和法。 关键词：胃蛋白酶分离纯化应用 ．生物提取法生产胃蛋白酶 1．1 工艺路线 （自溶、过滤）（脱脂、去杂质） 猪胃黏膜→自溶液→上清液 （浓缩、干燥） →胃蛋白酶成品 工艺过程 （1）原材料的选择和预处理：胃蛋白酶原主要存在于胃粘膜基底部，采集原料时剥取的粘膜直径大小与收率有关。一般取直径10cm、深2-3mm的胃基底部粘膜最适宜，每头猪胃平均剥取粘膜100g左右。（2）自溶、过滤：在夹套锅内预先加水100升及盐酸升，加热至50度时，在搅拌下加入200千克猪胃黏膜，快速搅拌使酸度均匀，保持45—48度，消化3-4小时，得自溶液。用纱布过滤除去未消化的组织尿蛋白，收集滤液。（3）脱脂、去杂质：将滤液降温至30℃以下，加入15-20％氯仿或乙醚，搅匀后转入沉淀脱脂器内，静置24-48小时，使杂质沉淀，分出弃去，得脱脂酶液。（4）浓缩、

干燥：取清酶液，在40℃以下减压浓缩至原体积的1／4左右，再将浓缩液真空干燥。球磨过80-100目筛，即得胃蛋白酶粉。 2胃蛋白酶的分离技术 有机溶剂法 可用于胃蛋白酶的初步提取浓缩。通常使用的有机溶剂有甲醇、乙醇、丙酮、异丙酮，其沉淀蛋白质的能力为：丙酮＞异丙酮＞乙醇＞甲醇。当然此顺序也不是一成不变的，因为还要受温度、pH、离子强度等因素的影响。丙酮沉淀能力最好，但挥发损失多，价格较昂贵，所以工业上常采用乙醇作为沉淀剂。 2．2盐析法 盐析法是酶制剂工业中常用方法之一，硫酸镁、硫酸铵、硫酸钠是常用的盐析剂，其中用的最多的是硫酸铵。美国专利（2，701,228）改进后，用锌盐沉淀胃酶。当母液含醇（或酮）在50%--55%、pH在—时几乎全部胃酶可以用醋酸锌沉淀，沉淀物为胃酶的锌盐，然后用金属螯合剂除去锌盐，得15000—16000倍活力的酶，收集率为%%。此法较上述有机溶剂沉淀所得的胃酶活力和得率都高。 底物亲和法 底物亲和法是利用酶（胃蛋白酶）与其底物（酪蛋白）的亲和性，从胃粘膜中提取得到胃蛋白酶。使底物和酶在的乳酸缓冲液中充分结合，然后调pH至4（底物的等电点）沉淀底物和酶的结合物，随后让沉淀物再溶解于乳酸缓冲液中，添加低浓度的SDS将底物和酶分离，得到酶—SDS复合物，再进一步分离纯化。陈躬瑞（2001）成功的应用此法对蛇胃蛋白酶进行了实验室分离，得率大约为30%。与传统的分离方法比较，此法具有简单高效的优点，为后续的纯化工艺避免了昂贵的活化试剂和配基的使用，同时具有较高的特异性。【2】

酶的分离纯化.

酶的分离纯化 提取原则 a. 相似相溶。 酶提取时首先应根据酶的结构和溶解性质，选择适当的溶剂。一般说来，极性物质易溶于极性溶剂中，非极性物质易溶于非极性的有机溶剂中，酸性物质易溶于碱性溶剂中，碱性物质易溶于酸性溶剂中。 酶都能溶解于水，通常可用水或稀酸、稀碱、稀盐溶液等进行提取，有些酶与脂质结合或含有较多的非极性基团，则可用有机溶剂提取。 b. 远离等电点的pH值，溶解度增加。 酶的提取方法 酶的分离方法 1沉淀分离沉淀分离是通过改变某些条件或添加某种物质，使酶的溶解度降低，而从溶液中沉淀析出，与其它溶质分离的技术过程。 在蛋白质的盐析中，通常采用的中性盐有硫酸铵、硫酸钠、硫酸钾、硫酸镁、氯化钠和磷酸钠等。其中以硫酸铵最为常用。在盐浓度达到某一界限后，酶的溶解度随盐浓度升高而降低，这称为盐析现象。 有机溶剂之所以能使酶沉淀析出。主要是由于有机溶剂的存在会使溶液的介电常数降低。溶液的介电常数降低，就使溶质分子间的静电引力增大，互相吸引而易于凝集，同时，对于具有水膜的分子来说，有机溶剂与水互相作用，使溶质分子表面的水膜破坏，也使其溶解度降低而沉淀析出。常用于酶的沉淀分离的有机溶剂有乙醇、丙酮、异丙醇、甲醇等 2离心分离离心分离是借助于离心机旋转所产生的离心力，使不同大小、不同密度的物质分离的技术过程。在离心分离时，要根据欲分离物质以及杂质的颗粒大小、密度和特性的不同，选择适当的离心机、离心方法和离心条件。 蛋白质分子在离心時，其分子量、分子密度、组成、形状等，均会影响其沉降速率，沉降係系数即用來描述此沉降性质；其单位为S (Svedberg unit)。 每一种的沉降系数与其分子密度或分子量成正比。不同沉降系数的蛋白质，可利用超高速离心法，在密度梯度中作分離。 3、过滤与膜分离 过滤是借助于过滤介质将不同大小、不同形状的物质分离的技术过程。

蛋白质和酶的分离与纯化

蛋白质和酶的分离纯化及鉴定 蛋白质是生命体中的重要物质基础之一。从分子水平上认识生命现象，已成为现代生物学发展的主要方向。要研究蛋白质，首先要得到高度纯化的目的蛋白。蛋白质在组织或细胞中一般都是以复杂的混合物形式存在，每种类型的细胞都含有上千种不同的蛋白质。要想从成千上万种蛋白质混合物中纯化出目的蛋白，就要根据蛋白质的理化性质不同设计出合理的分离方法。 目前研究为止酶除核酶外本质都是蛋白质，因此酶的分离纯化方法基本是采用蛋白质的分离纯化方法，但是酶的活性受到多种因素的影响，因此酶的分离纯化比一般的蛋白质要求更高。 一、质分离纯化的一般原则 1. 原料的选择 原则：来源方便，成本低，易操作、安全的原料。 蛋白分布：体液、组织、细胞定位 2. 破碎方法： (1) 机械方法：通过机械运动产生的剪切力的作用，使细胞或组织破碎的方法。 如：捣碎法、研磨、匀桨法 (2) 物理方法：通过温度、压力、声波等各种物理因素的作用，使组织细胞破碎的方法。 如：反复冻融、渗透压、超声破碎 (3) 化学方法：通过各种化学试剂对细胞膜的作用，使细胞破碎的方法. 如：甲苯、丙酮、氯仿和非离子型的表面活性剂（Triton和Tween） (4) 酶促法：溶菌酶、蜗牛酶等 3. 目的蛋白或酶的特异、快速、精确的定性或定量方法 4. 先粗后细，分级分离 粗分：将得到的蛋白溶液先利用简单、快速、易处理的方法除去大部分杂蛋白。如: 盐析、离心、有机溶剂沉淀等。 精制：利用蛋白质性质的差异，采用不同的方法，如:离子交换层析、分子筛、吸附层析、亲和层析、电泳、离心、结晶等方法进一步纯化。 5. 避免蛋白质的变性（pH、适合的温度和缓冲体系等） 二、常用的蛋白质的分离纯化技术 可以根据各种蛋白质的结构、理化性质不同设计分离方法。 （一）根据蛋白质的溶解度不同进行分离

菠萝蛋白酶的提取、分离纯化及活性测定

菠萝蛋白酶的提取、初步分离纯化及活性测定 15食安（1）班张凯 摘要：本研究运用硫酸铵沉淀法和透析法并结合考马斯亮蓝G520染色法测定菠萝皮中蛋白酶活性及蛋白质含量，得到同一品种及成熟度的菠萝皮经两种不同的纯化方法处理，菠萝皮中的蛋白酶都能被有效纯化，但是蛋白酶活性会损失一部分。 关键词：菠萝蛋白酶；透析法；分离纯化；酶活性； 前言 菠萝蛋白酶(bromelain)是从菠萝植株中提取的一类蛋白水解酶的总称,主要存在于菠萝茎和果实中,根据提取部位的不同,分为茎菠萝蛋白酶和果菠萝蛋白酶。Marcano于1891年研究发现菠萝汁中含有蛋白酶。随后,人们对菠萝蛋白酶展开了一系列研究,发现其在医药和化工领域有很好的利用价值。1957年,Heineche等从菠萝茎中提取得到蛋白质水解酶,从而使菠萝蛋白酶实现商品化生产。目前,菠萝蛋白酶的一些功能成分已得到成功分离,并应用于医药领域。随着提取纯化技术的不断进步,高活性的菠萝蛋白酶将广泛应用于医药、化工和食品领域。[1]利用菠萝皮分离纯化菠萝蛋白酶，不仅可充分利用资源，拓展菠萝蛋白酶的获取途径和应用空间，还可降低菠萝加工废料对环境的污染；随着市场对菠萝加工产品需求量的增大，对于菠萝皮的研究与利用就显得尤为重要，尤其对最主要的功能成分蛋白酶的分离、纯化与性质的研究更有意义。[2] 本文通过对菠萝皮蛋白酶的提取，初步分离纯化及活性测定进行了初步研究，探讨影响菠萝蛋白酶活性的影响因素，并解决实验存在的一些问题。 1实验材料与仪器 1．1实验材料与试剂 新鲜菠萝，透析袋（截留相对分子质量8 000~14 000），0.1mo1/L pH 7.8磷酸缓冲液配制（PBS），0.01mo1/L pH 7.8磷酸缓冲液配制（PBS），1％酪蛋白，激活剂[含20mmo1／L半胱氨酸-盐酸盐、1mmo1/L EDTA-Na2 (乙二胺四乙酸二