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2019慢病毒载体包装构建过程

2019慢病毒载体包装构建过程
2019慢病毒载体包装构建过程

原理:慢病毒载体可以将外源基因或外源的shRNA有效地整合到宿主染色体上,从而达到持久性表达目的序列的效果。在感染能力方面可有效地感染神经元细胞、肝细胞、心肌细胞、肿瘤细胞、内皮细胞、干细胞等多种类型的细胞,从而达到良好的的基因治疗效果。对于一些较难转染的细胞,如原代细胞、干细胞、不分化的细胞等,使用慢病毒载体,能大大提高目的基因或目的shRNA的转导效率,且目的基因或目的shRNA整合到宿主细胞基因组的几率大大增加,能够比较方便快捷地实现目的基因或目的shRNA的长期、稳定表达。

概念:慢病毒载体是指以人类免疫缺陷病毒-1 (H IV-1) 来源的一种病毒载体,慢病毒载体包含了包装、转染、稳定整合所需要的遗传信息,是慢病毒载体系统的主要组成部分。携带有外源基因的慢病毒载体在慢病毒包装质粒、细胞系的辅助下,经过病毒包装成为有感染力的病毒颗粒,通过感染细胞或活体组织,实现外源基因在细胞或活体组织中表

达。

辅助成分:慢病毒载体辅助成分包括:慢病毒包装质粒和可产生病毒颗粒的细胞系。

慢病毒载体包含了包装、转染、稳定整合所需要的遗传信息。慢病毒包装质粒可提供所有的转录并包装RNA 到重组的假病毒载体所需要的所有辅助蛋白。为产生高滴度的病毒颗粒,需要利用表达载体和包装质粒同时共转染细胞,在细胞中进行病毒的包装,包装好的假病毒颗粒分泌到细胞外的培养基中,离心取得上清液后,可以直接用于宿主细胞的感染,目的基因进入到宿主细胞之后,经过反转录,整合到基因组,从而高水平的表达效应分子。

基本原理:慢病毒载体系统由两部分组成,即包装成分和载体成分。

包装成分:由HIV-1基因组去除了包装、逆转录和整合所需的顺式作用序列而构建,能够反式提供产生病毒颗粒所必需的蛋白。包装成分通常被分开构建到两个质粒上,一个质粒表达Gag和Pol蛋白,另一个质粒表达Env蛋白,其目的也是降低恢复成野生型病毒的可能。将包装成分与载体成分的3个质粒共转染细胞(如人肾293T细胞),即可在细胞上清中收获只有一次性感染能力而无复制能力的、携带目的基因的HIV-1载体颗粒。

载体成分:与包装成分互补,即含有包装、逆转录和整合所需的HIV顺式作用序列,同时具有异源启动子控制下的多

克隆位点及在此位点插入的目的基因。

为降低两种成分同源重组恢复成野生型病毒的可能,需尽量减少二者的同源性,如将包装成分上5′LTR换成巨细胞

病毒(CMV)立即早期启动子、3′LTR换成SV40 polyA等。

一、实验流程(1和2为并列步骤)

1.慢病毒过表达质粒载体的构建

设计上下游特异性扩增引物,同时引入酶切位点,PCR(采用高保真KOD酶,3K内突变率为0%)从模板中(CDNA质粒或者文库)调取目的基因CDS区(coding sequence)连入T载体。将CDS区从T载体上切下,装入慢病毒过表达

质粒载体。

2.慢病毒干扰质粒载体的构建

合成siRNA对应的DNA颈环结构,退火后连入慢病毒干扰质粒载体

3. 慢病毒载体的包装与浓缩纯化

制备慢病毒穿梭质粒及其辅助包装原件载体质粒,三种质粒载体分别进行高纯度无内毒素抽提,共转染293T细胞,转染后6 h 更换为完全培养基,培养24和48h后,分别收集富含慢病毒颗粒的细胞上清液,病毒上清液通过超离心浓

缩病毒。

二、实验材料

2.1慢病毒载体、包装细胞和菌株

该病毒包装系统为三质粒系统,组成为pspax2, pMD2G, pLVX-IRES-ZsGreen1/pLVX-shRNA2。其中质粒上的ZsGreen1

表达框能表达绿色荧光蛋白(GFP)。

载体信息

1)慢病毒克隆载体图谱如下:

2)包装质粒信息如下:

PMD2G载体图谱和序列信息

PSPAX2载体图谱和序列信息:

细胞株293T,慢病毒的包装细胞,为贴壁依赖型成上皮样细胞,生长培养基为DMEM(含10% FBS)。贴壁细胞经培养生长增殖形成单层细胞。菌株大肠杆菌菌株DH5α。用于扩增慢病毒载体和辅助包装载体质粒。

三、流程图

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