定点突变试剂盒手册 QuikChange Site-directed Mutagenesis kit

清洗机 电气操作手册

操作说明书 目录： 1 投产使用 (3) 1.1 设备开机 (4) 1.2 设备关机 (5) 2 模式操作 (6) 2.1 操作台（人机界面） (6) 2.2 运行方式 (7) 2.2.1 手动运行模式( 单动) (8) 2.2.2 自动运行模式(联动运行) (9) 2.2.3 原位（基准位） (11) 2.2.4 循环结束后停止 (12) 3 操作区图面 (13) 3.1 操作画面转换 (13) 3．2 设备操作画面组成及操作 (14) 3．3 设备手动操作（即单步模式） (14) 3．3 ．1 手动操作画面组成元素及其含义 (14) 3.3.2 上料输送滚道画面 (15) (16) 3.3.3 下料输送滚道画面 (17) (17) 3.3.4 机床上下料插门画面 (18) 3.3.5 升降清洗工位画面 (19) (19) 3.3.6 升降清洗工位画面 (20) (20) 3.3.7 升降清洗工位画面 (21) (21) 3.3.8 浪涌清洗工位画面 (22) (22) 3.3.9 浪涌清洗工位画面 (23)

(23) 3.3.10 浪涌清洗工位画面 (24) 3.3.11 升降吹干工位画面 (25) 3.3.12 升降吹干工位画面 (26) 3.3.13 辅助电磁阀画面 (27) 3.3.14 清洗水泵画面 (28) 3.3.15 磁辊排屑水泵画面 (29) 3.3.16 排屑吸雾画面 (30) 3.3.17 清洗加热器画面 (31) 3．4设备自动监控主画面 (32) 3．5 工件位置调整 (33) 3．6 功能切除画面 (34) 3．7 报警显示 (35) 3．8 IQ状态显示 (36) 3.9 故障诊断 (37) 3.10 加热画面 (37) 4 简要说明 (38) 4.1 设备开机 (39) 4.2 三色灯定义 (39) 4.3 密码发放和管理 (40)

人类K-ras基因突变检测试剂盒说明书

人类K-ras基因突变检测试剂盒（PCR-熔解曲线法）说明书 【产品名称】 通用名：人类K-ras基因突变检测试剂盒（PCR-熔解曲线法） 英文名：Diagnostic kit for Mutations of Human K-ras Gene (PCR-Melting Curve Analysis) 【包装规格】 20测试/盒 【预期用途】 K-ras基因位于12号染色体短臂上，是重要的癌基因之一，编码一种21kD 的kras蛋白，参与细胞内的信号传递，主要包括PI3K/PTEN/AKT 和 RAF/MEK/ERK信号转导途径，这些转导途径是当前肿瘤靶向药物研究的热点，靶向药物通过抑制这些途径发生药理作用。K-ras基因第12和13密码子发生突变，将导致kras蛋白变异并处于持续激活状态，使药物失效。。据中国2010版《肿瘤学临床实践指南》，在一项包含101例肺腺癌亚型细支气管肺泡癌患者的回顾性研究中，所有患者均接受厄洛替尼单药一线治疗。K-ras突变者无一例缓解（0/18），而无K-ras突变者则有20例缓解（20/62，32%），差别有统计学意义（P <0.01）。因此，指南建议，非小细胞肺癌和结直肠癌患者使用靶向药物前应进行K-ras基因突变状态的检测。 本试剂盒以人非小细胞肺癌、结直肠癌肿瘤组织切片提取的基因组DNA为检测样本，用于检测肿瘤组织K-ras基因第12，13密码子的12种体细胞突变（表1），提供突变状态的定性结果。为临床肿瘤靶向药物的个体化用药提供辅助诊断依据，本品适用于进入个体化靶向治疗疗程前的患者使用。 【检验原理】 本试剂盒基于实时PCR平台，结合了特异引物、荧光探针和熔解曲线技术，定性检测DNA样品中K-ras基因12，13密码子是否存在突变。用一对K-ras基因特异引物，该引物可

最新构建点突变质粒步骤资料

基因定点突变 一、定点突变的目的 把目的基因上面的一个碱基换成另外一个碱基。 二、定点突变的原理 通过设计引物，并利用PCR将模板扩增出来，然后去掉模板，剩下来的就是我们的PCR 产物，在PCR产物上就已经把这个点变过来了，然后再转化，筛选阳性克隆，再测序确定就行了。 三、引物设计原则 引物设计的一般原则不再重复。 突变引物设计的特殊原则： （1）通常引物长度为25~45 bp，我们建议引物长度为30~35 bp。一般都是以要突变的碱基为中心，加上两边的一段序列，两边长度至少为11-12 bp。若两边引物太短了，很可能会造成突变实验失败，因为引物至少要11-12个bp才能与模板搭上，而这种突变PCR要求两边都能与引物搭上，所以两边最好各设至少12个bp，并且合成多一条反向互补的引物。 （2）如果设定的引物长度为30 bp，接下来需要计算引物的Tm值，看是否达到78℃（GC含量应大于40%）。 （3）如果Tm值低于78℃，则适当改变引物的长度以使其Tm值达到78℃（GC含量应大于40%）。 （4）设计上下游引物时确保突变点在引物的中央位置。 （5）最好使用经过纯化的引物。 Tm值计算公式：Tm=0.41×(% of GC)–675/L+81.5 注：L：引物碱基数；% of GC：引物GC含量。 四、引物设计实例 以G CG→A CG为例： 5’-CCTCCTTCAGTA TGTAG G CGACTTACTTATTGCGG-3’ （1）首先设计30 bp长的上下游引物，并将A (T)设计在引物的中央位置。 Primer #1: 5’-CCTTCAGTATGTAG A CGACTTACTTATTGC-3’ Primer #2: 5’-GCAATAAGTAAGTCG T CTACATACTGAAGG-3’

ADP含量试剂盒使用说明

ADP含量试剂盒使用说明 产品简介： ADP广泛存在于动物、植物、、微生物和培养细胞中，是描述细胞能量代谢状态的主要参数。测定ADP含量并且计算能荷，能够反映能量代谢状态。 ADP在254nm下有吸收峰，可以利用高效液相色谱法测定其含量。 试验中所需的仪器和试剂： 高效液相色谱仪、低速离心机、溶剂抽滤装置、针头式过滤器（水系，50个，0.22μm）、滤膜（水系和有机系各1个，0.45μm）、C18柱（4.6×150mm）、可调式移液器、样品瓶（50个，2mL）、甲醇（色谱级，300mL）、甲醇（色谱级，300mL）、蒸馏水 产品内容： 试剂一：液体60mL×1瓶，4℃保存； 试剂二：液体60mL×1瓶，4℃保存； 试剂三：粉剂1×1瓶，粉剂2×1瓶，4℃保存；临用前用少量蒸馏水将粉剂1和粉剂2溶解后倒入1000mL容量瓶中，用蒸馏水定容至1000mL，形成流动相缓冲液基质（注：试剂瓶中的粉剂要冲洗干净）,4℃可保存1周； 试剂四：ADP标准品5mg×1支，-20℃保存。临用前加入1mL双蒸水，配成5mg/mL溶液，配好后-20℃可保存1周； 操作步骤： 一、实验前的准备工作： 1、将双蒸水1000mL、流动相缓冲液基质1000mL和甲醇300mL用0.45μm的滤膜抽滤，以除去溶剂中的杂质，防止堵塞色谱柱。（注：双蒸水和缓冲液基质用水系滤膜抽滤，甲醇用有机系滤膜抽滤）。 2、流动相的配制：将抽滤完毕的流动相缓冲液基质1000mL与甲醇配比为99.9：0.1（v/v），即取999mL缓冲液基质与1mL甲醇混合。

3、将抽滤完毕的甲醇和双蒸水配比成100%的甲醇，10%的甲醇，双蒸水各250mL。将2和3中的溶剂超声30分钟，以脱去溶剂中的气泡，防止堵塞色谱柱。 二、ADP的提取： 1、组织的处理：准确称取组织重量0.1g，加入1mL试剂一，提取ADP，4000g常温离心15min，取上清液，加入等体积的试剂二，混匀，4000g常温离心15min，取上清，0.22μm水系微孔滤膜过滤后冰上放置，待测。 2、细胞处理：收集约30mL细胞，离心菌体经干燥后，加入1mL试剂一，超声破壁细胞(950 W，30%，15min，工作1s间隔2s)，4000g常温离心15min，取上清液，加入等体积的试剂二，混匀，4000g常温离心15min，取上清，0.22μm水系微孔滤膜过滤后冰上放置，待测。 三、ADP含量测定操作步骤： 1.开启电脑、检测器和泵，安装上色谱柱，打开empower软件，在方法组中设置进样量20μL，流速1mL/min，保留时间10min，检测波长254nm,设置完毕保存方法组。 2.用100%的甲醇、10%的甲醇、双蒸水按甲醇浓度从大到小的顺序洗色谱柱30min。 3.用流动相洗柱子，待基线稳定后开始加样。 4.加入标准品20μL，在10min内可分离ADP，ADP的保留时间在4min左右（柱子不同，保留时间有差异），计算不同浓度的ADP标准品的峰面积。 5.加入样品20μL，在相应保留时间处检测ADP的峰面积。 ADP含量的计算： 将5mg/ml的ADP标准品用双蒸水分别稀释成100μg/ml、80μg/ml、60μg/ml、40μg/ml和20μg/ml的ADP标准品溶液，以标准品浓度（μg/ml）为横坐标，峰面积为纵坐标分别计算ADP标准曲线。 注：标准品的稀释倍数要根据样品中ADP浓度确定，样品中ADP的峰面积必须落在不同浓度的ADP标准品的峰面积之内，该标准品稀释倍数只是一个参考。

定点突变技术——从单点突变到多点突变

定点突变技术——从单点突变到多点突变 体外定点突变技术是研究蛋白质结构和功能之间的复杂关系的有力工具，也是我们在实验室中改造/优化基因常用的手段。蛋白质的结构决定其功能，二者之间的关系是蛋白质组研究的重点之一。对某个已知基因的特定碱基进行定点改变、缺失或者插入，可以改变对应的氨基酸序列和蛋白质结构，对突变基因的表达产物进行研究有助于我们了解蛋白质结构和功能的关系，探讨蛋白质的结构/结构域。而利用定点突变技术改造基因，相信大家也非常熟悉：比如野生型的绿色荧光蛋白（wtGFP）是在紫外光激发下能够发出微弱的绿色荧光，经过对其发光结构域的特定氨基酸定点改造，现在的GFP能在可见光的波长范围被激发（吸收区红移），而且发光强度比原来强上百倍，甚至还出现了黄色荧光蛋白，蓝色荧光蛋白等等。定点突变技术的潜在应用领域很广，比如研究蛋白质相互作用位点的结构、改造酶的不同活性或者动力学特性，改造启动子或者DNA作用元件，提高蛋白的抗原性或者是稳定性、活性、研究蛋白的晶体结构，以及药物研发、基因治疗等等方面。 对于单点突变，Stratagene公司的QuikChange Site-directed Mutagenesis kit是不错的选择，通过巧妙设计，将质粒定点突变技术变得简单有效。准备突变的质粒必须是从常规E.coli 中经纯化试剂盒(Miniprep)或者氯化铯纯化抽提的质粒。设计一对包含突变位点的引物（正、反向），和模版质粒退火后用PfuTurbo聚合酶“循环延伸”，(所谓的循环延伸是指聚合酶按照模版延伸引物，一圈后回到引物5’端终止，再经过反复加热褪火延伸的循环，这个反应区别于滚环扩增，不会形成多个串联拷贝。)正反向引物的延伸产物退火后配对成为带缺刻的开环质粒。DpnI酶切延伸产物，由于原来的模版质粒来源于常规大肠杆菌，是经dam甲基化修饰的，对DpnI敏感而被切碎（DpnI识别序列为甲基化的GATC，GATC在几乎各种质粒中都会出现，而且不止一次），而体外合成的带突变序列的质粒由于没有甲基化而不被切开，因此在随后的转化中得以成功转化，即可得到突变质粒的克隆。这个试剂盒非常巧妙的利用甲基化的模版质粒对DpnI敏感而合成的突变质粒对DpnI酶切不敏感，利用酶切除去模版质粒，得到突变质粒，使得操作简单有效。另外由于Pfu聚合酶是公认的最好的高保真聚合酶之一，堪称高保真聚合酶的“黄金标准”，是Stratagene的看家之宝，能够有效避免延伸过程中不需要的错配。试剂盒采用的是低次数的循环延伸而非PCR，有助于减少无意错配。只需要一次酶切和转化，实验可以在一天完成。这个试剂盒适用于质粒大小不超过 8Kb的质粒。后来推出的QuikChange XL site-directed mutagenesis kit则是针对大于8Kb的质

电气手册

前言 电力工程建设的质量与安全是电力系统整体质量与安全的基础，是保证电力工业可持续健康稳定发展的基础。电力工程建设标准强制性条文，是贯彻落实《建设工程质量管理条例》等法律法规的具体体现，是电力建设过程中参与建设活动各方应强制执行的技术法规性条文，是从源头上、技术上保证电力工程安全与质量的关键所在。贯彻工程建设标准强制性条文是电力行业落实科学发展观、构建和谐社会的一项重要工作。参与电力工程建设的各责任主体必须认真学习与贯彻落实强制性条文,以确保工程建设质量与安全。 工程建设标准强制性条文的执行与否关系到工程建设建筑、设备的质量安全和人民的生命安全，不论是否造成后果，都必须严格执行，在《建设工程质量管理条例》中，国家首次以法规形式，明确了强制性条文的法律地位，不执行工程建设强制性技术标准就是违法，并根据违反强制性技术标准所造成后果的严重程度，规定了相应的行政处罚措施。 为进一步增强对《强制性条文》的认识，提高贯彻实施强制性条文的自觉性，建立执行《强制性条文》的长效机制，保障电力工程质量和安全。我们编制了这套火力发电工程建设强制性条文执行表格。 本套表格贯彻强制性条文，强制性执行的指导思想，体现强制性条文执行完整性、系统性、可操作性和事前、事中、事后全过程控制的原则。从执行计划、执行记录、执行检查到验收汇总作了统一规定，编制了相应表格。分别用于施工、设计、监理、建设单位的执行检查、验收监督管理，形成了执行强制性条文事前、事中和事后全过程控制的管理体系。 本套表格涉及相关专业较多，如有错漏，敬请同行提出宝贵意见，以便及时改正。

目录 前言 概述 填写说明 规范性引用文件 强制性条文执行计划表 强制性条文执行记录表 强制性条文执行检查表 强制性条文执行汇总表 附录省火力发电工程建设标准强制性条文执行管理办法

B-raf基因突变检测试剂盒(PCR-毛细管电泳法)标准化操作流程

B-raf基因突变检测试剂盒(荧光PCR-毛细管电泳法) 标准化操作流程 1、预期用途 该产品用于定性检测确诊的结直肠癌患者石蜡包埋病理组织切片DNA的B-rafV600E 基因突变。B-raf 基因是一种癌基因，编码一种丝/ 苏氨酸特异性激酶，是RAS/RAF/MEK/ERK/MAPK 通路重要的转导因子，参与调控细胞内多种生物学事件，如细胞生长、分化和凋亡等。B-raf 基因位于7p34，长约190kb，转录mRNA 长2.5kb，编码783 氨基酸的蛋白，相对分子质量为94000-95000 Da。 研究表明，在多种人类恶性肿瘤中，如恶性黑色素瘤、结直肠癌、肺癌、甲状腺癌、肝癌及胰腺癌等均存在不同比例的B-raf 突变，B-raf 突变主要发生在Exon15 上的激活区的第1799 氨基酸上(T 突变为A)，导致编码的氨基酸由谷氨酸变成缬氨酸(V600E)，该突变能使B-raf 激酶活性提高，V600E 突变能模拟T598 和S601 两个位点磷酸化作用，使BRAF 蛋白激活。近来研究表明，对于野生型Kras、但存在B-raf 基因V600E 突变患者，抗EGFR 单抗治疗无效。2010 年版《NCCN 结直肠癌临床实践指南》中已明确指出“如K-ras 基因无突变时，需检测B-raf 基因突变，如果后者存在V600E突变，则不应该给予抗EGFR 单抗治疗。” 2、仪器配置要求 移液器，振荡器，微型离心机，生物安全柜，高速冷冻离心机，定性PCR仪，荧光定量PCR仪（ABI7500，LightCycler? 480，MX3000P，CFX-96等），微量紫外分光光度计，基因分析仪（ABI3130，ABI3500DX）。 3、耗材要求 无菌带滤芯吸头、吸水纸，离心管（1.5ml，0.5ml，0.2ml）、PCR反应管（配套荧光定量PCR仪型号）及无粉一次性乳胶手套，基因分析板。 4、责任人 基因扩增实验室室长负责技术指导和质量监督。 5、执行人 操作人员应经过专业培训，具有合格的操作技能的检验专业技术人员。 6、检测原理 本产品选取人类基因组B-raf 基因Exon 15 上设计特异性引物和探针，对扩增后的PCR 产物片段进行测序分析。使用尿苷酶(UNG)防污染体系，经加热可以选择性地降解U-DNA，以防止先前PCR 扩增产物的污染。 7、试剂来源 北京鑫诺美迪基因检测技术有限公司 8、样本要求 8.1用量：每例标本切5张(10μm)白片，连续切片，不漂洗脱蜡，直接封存于1.5ml EP管中； 8.2质量：为确保DNA提取成功率，必须选择2年以内的石蜡标本； 8.3标本收集方法：石蜡包埋病理切片样品应确定含有肿瘤病变细胞，为了保证切片组织中

土壤试剂盒操作手册和常见问题

FastDNA Spin Kit for Soil实验步骤 1.Add up to 500 mg of soil sample to a Lysing Matrix E tube. 在裂解介质管E中最多加入500mg土壤样品。 注意：推荐最多加入500mg土壤样品，含水量比较多的土壤或者碎屑多的土壤可适量减少样品量。 2.Add 978 μL Solution Phosphate Buffer to sample in Lysing Matrix E tube. 在裂解介质管E中加入978μl Sodium Phosphate Buffer 3.Add 122 μL MT Buffer. What’s happening: Begin to solubilize membrane proteins with detergents as well as extra-cellular proteins and contaminations in soil. 加入122μl MT Buffer 发生的反应：用洗涤剂溶解细胞膜蛋白以及细胞外蛋白和土壤中的污染物。 注意：为了得到更好的样品处理效果，加入土壤样品及两个缓冲液后，在裂解介质管中仍能保留有250-500μl空间。 4.Homogenize in the FastPrep Instrument for 40 seconds at a speed setting of 6.0 What’s happening: mechanical disruption of cell walls of soil organisms and releasing nucleic acids into the protective buffer. 将样品置于FastPrep?仪器上匀浆40s，速度为6.0m/s 发生的反应：机械破碎土壤微生物的细胞壁，将核酸释放入保护缓冲液中。 5.Centrifuge at 14,000×g for 5-10 minutes to pellet debris. 14,000 x g离心5-10min至沉渣 注意：如果把离心时间延长到15min，可以更好地使样品量较大的，或者细胞壁结构较复杂的细胞碎片沉降到管底。 6.Transfer supernatant to a clean 2.0 ml microcentrifuge tube. Add 250μL PPS (Protein Precipitation Solution) and mix by inverting the tube 10 times. What's happening: Separate the solubilized nucleic acids from the cellular debris and lysing matrix. Flocculation of protein-containing micelles 将上清液转移至一个干净的2.0ml离心管中。加入250μL的PPS溶液（蛋白质沉淀溶液），用手颠倒10次，使之充分混合。 发生的反应：将溶解的核酸与细胞沉渣以及裂解介质分离。产生絮状蛋白。

AGV电气操作手册20130801

AGV操作手册 (SIASUN-AGV-L1400) 沈阳新松机器人自动化股份有限公司

目录 第一章 AGV介绍3 1.1 AGV外观结构及系统构成3 1.1.1 AGV电气系统构成 3 1.2 操作面板上的开关4 1.3 功能键5 1.4图标状态显示6 1.4.1系统正常图标 6 1.4.2急停图标 6 1.4.3软件错误图标 6 1.4.4位置不详图标 6 1.4.5位置确定图标7 1.4.6充电图标7 第二章AGV运行、停车和下线操作方法8 2.1 AGV的操作方法及运行方式的选择8 2.1.1AGV手控盒功能介绍8 2.1.2 在线自动运行方式10 2.1.3 离线自动运行方式10 2.1.4 手动运行方式10 2.2 AGV暂停的操作方法11 2.2.1 AGV手动暂停11 2.2.2 AGV的急停操作11 2.2.3 非接触式停车11 2.2.4接触式停车12 2.3 AGV从系统中的退出（下线）12 2.4 安全下线（撤消登陆）12第三章AGV传感器、声音、灯光定义12 3.1AGV各传感器的定义12 3.1.1PLS区域激光防碰传感器12 3.1.2直线激光防碰传感器13 3.2AGV声音定义13

3.3AGV灯光定义13第四章操作面板的基本操作14 4.1 操作面板的文字显示14 4.2面板功能操作15第五章 AGV的手动操作17 5.1AGV的行走与转舵17 5.2货叉的操作18

第一章 AGV介绍 本章主要介绍AGV的外观结构及系统组成、操作面板、操作控制器的多种开关和按键，同时介绍操作面板和液晶显示屏上的多种显示功能。 1.1 AGV外观结构及系统构成 AGV是由机械部分和电子部分组成。机械部分包括AGV本体、货叉、控制箱、驱动轮、从动轮、保险杠、电池箱和充电连接器。电子部分包括AGV控制器（CVC600），伺服驱动器，位置控制及输入/输出单元（VMC20），驱动单元，电源和传感器。 1.1.1 AGV电气系统构成 图1-1为AGV电气系统的简单系统结构图。下面简单介绍各部分的主要功能： 图1-1 ●电源：由于AGV供电系统为24伏电池组，AGV的电源采用DC-DC转换器，把24伏电池电源转换为稳定的24V电源供电。 ●伺服系统：用于驱动AGV车轮电机、转舵电机及举升电机。 ●传感器：激光定位传感器——用于测量AGV运行时的方位；激光防碰传感器——用以探测运行路线上的障碍物；接近传感器——检测举升装置的上限位、下限位。 ●VMC20：用于控制器与伺服、传感器、报警信号、电源间I/O信

Braf基因突变检测试剂盒说明书

人类B-raf基因V600E突变检测试剂盒（荧光PCR法）说明书 【产品名称】 通用名：人类B-raf基因V600E突变检测试剂盒（荧光PCR法） 英文名：Diagnostic kit for V600E Mutation of Human B-raf Gene(Fluorescence PCR Analysis) 【包装规格】 20测试/盒 【预期用途】 B-raf基因位于7号染色体长臂上，是一种癌基因，属RAF基因家族，有18个外显子，编码一种含783个氨基酸的B-raf蛋白，是EGFR通路RAS/RAF/MEK/MRK/MAPK中重要的转导因子，参与调控细胞生长、分化和凋亡等多种生理过程。 针对EGFR的肿瘤靶向药物通过抑制该途径发生药理作用。研究表明在非小细胞肺癌、结直肠癌等多种恶性肿瘤中存在B-raf基因突变，其中第15外显子上V600E点突变最常见，约占所有突变的90%以上，该突变导致B-raf蛋白被异常激活，从而使患者接受EGFR-TKI药物和EGFR单抗类药物治疗失效。据中国2010版《肿瘤学临床实践指南》建议，对K-raf基因检测正常的非小细胞肺癌和结直肠癌患者，应进一步检查B-raf基因的突变状态，以指导靶向药物治疗方案。 本试剂盒以人非小细胞肺癌、结直肠癌肿瘤组织切片提取的基因组DNA为检测样本，用于肿瘤组织B-raf 基因V600E点突变的定性检测，为临床肿瘤靶向药物的个体化用药提供依据。本公司尚无临床实例证实B-raf 基因突变与靶向药物的相关性，其相关性主要来自文献报道，因此本试剂盒检测结果仅用于辅助临床医生对肿瘤患者制定用药方案。 【检验原理】 本试剂盒基于实时荧光PCR平台，结合等位基因特异性扩增（ARMS）技术、野生型基因扩增抑制技术和多重PCR技术检测B-raf基因V600E突变。ARMS技术是指PCR引物的3’端末位碱基必须与其模板DNA互补才能有效扩增，通过设计特异性ARMS引物，对存在V600E突变的B-raf基因靶序列进行PCR扩增放大，并利用FAM基团标记的Taqman 探针对扩增产物进行检测。因为采用了野生型基因扩增抑制剂，使ARMS体系能够耐受更高浓度的背景野生型B-raf基因，降低了试剂盒对基因组样本的DNA浓度要求，提高了检测灵敏度。 为质控扩增体系的有效性，试剂盒设置了内质控和外质控，内质控基因是人类基因组的一个保守片段，长

定点诱变技术

第三章DNA突变技术

基因突变包括单个碱基或片断的替换，基因片断的插入与删除等。 根据其特点可将基因突变技术分两大类： 1.位点特异性突变定点突变 2.随机突变表型筛选

随机突变 易错PCR法(Error-prone PCR) 降低一种dNTP的量（降至5％-10％） 加入dITP来代替被减少的dNTP 缓冲液中另加0.5mmol/L Mn2+ DNA Shuffling 外显子、单基因和基因家族的重组装 随机引物延伸法 交错延伸法 定点突变 点突变——碱基删除、增补和替换

易错PCR(epPCR)

How DNA shuffling is done in the tube Random fragmentation of a pool of related genes; Self-priming polymerase reaction and template switching (causing crossovers); PCR amplification with primers of reassembled products How DNA shuffling works

Similar mutants generated by error-prone PCR, random and site-directed mutagenesis . ... .. ... ..Single gene shuffling library of point mutants Family gene shuffling library of chimeras Generating chimeras with crossovers of large blocks of sequences 一、单基因和基因家族的重组装

TPPA试剂盒说明书

T P P A试剂盒说明书-CAL-FENGHAI.-(YICAI)-Company One1

梅毒TPPA试书剂盒说明书 1、试验原理： 梅毒抗体检测是采用抗原抗体凝集反应中的抗原抗体凝集反应。其原理如下：将梅毒 (Nichols 株)的精制菌体成分包被在人载体明胶粒子上。这种致敏粒子和样品中的梅毒螺旋体（TP）抗体进行反应发生凝集，产生粒子凝集反应（TP）抗体，并且可用来测定抗体效价。 2、样本收集和贮存： 血清或血浆1ml，标本应无溶血，无脂血，无微生物污染。不满足上述要求的标本拒收，标本的采集应使用清洁，无菌的一次性的干燥管。 标本用量最少50ul，七天内检测的标本应在2-8℃保存，贮存在-20℃可保存4W，同时避免反复冻融血清。 3、安全防范： 3．1此试剂盒内含人血成分。尽管所有的对照及定点对照都已经过试验验证并且发现对于乙型肝炎表面抗原，丙型肝炎抗体，HIV抗体均为阴性；但仍认为它们具有潜在的感染性。 3．2移液过程禁止用口。 3．3 在处理试剂和标本的地方禁止吸烟，饮食。 3．4使用试剂盒和标本时，必须戴一次性手套，穿试验服。使用后请彻底洗手清洁。 3．5患者样本及其他潜在感染材料试验后应放入医用垃圾桶内。 3．6试剂的溶解液，血清稀释液和阳性对照血清含有叠氮钠作为防腐剂,叠氮钠可以和铅铜反应形成爆炸的金属叠氮化合物.为防止金属叠氮化合物的形成,应用大量的水冲洗以免其堆积. 4、试剂： 4．1 储存与稳定性： 试剂应在2-10℃保存。 冻干试剂必须在复溶后的当天使用，如果保存在2-10℃最多可使用7天。 4．2 试剂盒组成：（由富士瑞士欧公司出产） （1）溶解液（液体） 8mL×1瓶 用于调制致敏粒子和未致敏粒子。 （2）血清稀释液 29mL×1瓶 用于样品的稀释。 （3）致敏粒子（冷冻干燥）

基因定点突变全攻略

基因定点突变全攻略 一、定点突变的目的 把目的基因上面的一个碱基换成另外一个碱基。 二、定点突变的原理 定点突变是指通过聚合酶链式反应（PCR）等方法向目的DNA片段（可以是基因组，也 可以是质粒）中引入所需变化（通常是表征有利方向的变化），包括碱基的添加、删除、点 突变等。定点突变能迅速、高效的提高DNA所表达的目的蛋白的性状及表征，是基因研究工作中一种非常有用的手段。 体外定点突变技术是研究蛋白质结构和功能之间的复杂关系的有力工具，也是实验室中改造/优化基因常用的手段。蛋白质的结构决定其功能，二者之间的关系是蛋白质组研究的重 点之一。对某个已知基因的特定碱基进行定点改变、缺失或者插入，可以改变对应的氨基酸 序列和蛋白质结构，对突变基因的表达产物进行研究有助于人类了解蛋白质结构和功能的关 系，探讨蛋白质的结构/结构域。而利用定点突变技术改造基因：比如野生型的绿色荧光蛋 白（wtGFP）是在紫外光激发下能够发出微弱的绿色荧光，经过对其发光结构域的特定氨基 酸定点改造，现在的GFP能在可见光的波长范围被激发（吸收区红移），而且发光强度比原 来强上百倍，甚至还出现了黄色荧光蛋白，蓝色荧光蛋白等等。定点突变技术的潜在应用领 域很广，比如研究蛋白质相互作用位点的结构、改造酶的不同活性或者动力学特性，改造启动子或者DNA作用元件，提高蛋白的抗原性或者是稳定性、活性、研究蛋白的晶体结构，以 及药物研发、基因治疗等等方面。 通过设计引物，并利用PCR将模板扩增出来，然后去掉模板，剩下来的就是我们的PCR 产物，在PCR产物上就已经把这个点变过来了，然后再转化，筛选阳性克隆，再测序确定就 行了。 三、引物设计原则 引物设计的一般原则不再重复。 突变引物设计的特殊原则： （1）通常引物长度为25~45 bp，我们建议引物长度为30~35 bp。一般都是以要突变的 碱基为中心，加上两边的一段序列，两边长度至少为11-12 bp。若两边引物太短了，很可 能会造成突变实验失败，因为引物至少要11-12个bp才能与模板搭上，而这种突变PCR要求两边都能与引物搭上，所以两边最好各设至少12个bp，并且合成多一条反向互补的引物。 （2）如果设定的引物长度为30 bp，接下来需要计算引物的Tm值，看是否达到78℃（GC 含量应大于40%）。 （3）如果Tm值低于78℃，则适当改变引物的长度以使其Tm值达到78℃（GC含量应大于40%）。 （4）设计上下游引物时确保突变点在引物的中央位置。

人类EGFR基因突变荧光PCR检测试剂盒说明书

人类EGFR基因突变荧光PCR检测试剂盒说明书 【产品名称】 通用名称：人类EGFR基因突变荧光PCR检测试剂盒 英文名称：Shuwen? Human EGFR Gene Mutation Detection Kit for Real-Time PCR 【包装规格】 7测试/盒 【预期用途】 EGFR是一种细胞膜表面的糖蛋白受体，具有酪氨酸激酶（Tyrosine Kinase，TK）活性，是原癌基因c-erbB-1（HER-1）的表达产物。EGFR 的主要信号转导途径有：PI3K-PDK 通路，RAS-RAF-MEK-ERK-MAPK 通路，PLC-γ 通路，JAK-STAT 通路。通过这些途径，将胞外信号转化为胞内信号，从而有效应对外界的信号刺激，调节细胞的生长、增殖、分化，抑制细胞的凋亡。EGFR异常调节通过多种机制促进细胞恶性转化，包括受体的过度表达、突变、生长因子-受体自分泌环的活化以及特定的磷酸酶失活，其中涉及肿瘤发生和进展的机制中最常见的是EGFR的基因突变和过度表达。 EGFR基因位于7号染色体短臂7pl2-14区，由28个外显子组成。其突变主要发生在EGFR酪氨酸激酶的ATP结合位点的编码区（第18-20外显子），研究表明，EGFR酪氨酸激酶抑制剂（例如吉非替尼、厄洛替尼和埃可替尼等）疗效与EGFR基因的突变有密切的相关性。目前已经报道大约有30种突变与吉非替尼的药物反应相关，主要是19外显子上的缺失突变和21外显子上的L858R的点突变。外显子19上747-750位氨基酸的大约20种缺失约占所有突变的45%，其中以两种delE746-A750(2235_2249del15和 2236_2250del15)最为常见，占到外显子19缺失总数的75%；外显子21上L858R的点突变占所有突变的45%左右；外显子18的3种点突变（G719X）约占5%；外显子20的突变占1%左右。另外研究发现外显子20上的T790M突变与酪氨酸激酶抑制剂药物的耐药性相关。 本试剂盒以肿瘤DNA为检测样本，提供EGFR基因突变的定性检测。本试剂盒仅为临床医生肿瘤靶向治疗药物的选择提供参考，具体临床应用时须结合实际情况进行判断，不能以本试剂盒检测结果作为临床诊断的唯一依据。 【检测原理】 本试剂盒结合特异性引物和TaqMan探针技术，用实时荧光PCR方法检测DNA样品中的EGFR突变基因。利用特异性引物对突变靶序列进行扩增，同时阻滞野生型的扩增，通过TaqMan探针对扩增产物进行检测，使得突变基因得到扩增而野生型基本不扩增，从而达到高检测特异性和高灵敏度。 【主要组成成分】 本试剂盒具体包含组分如表1 表1

定点突变protocol

基因定点突变试剂盒 产品简介： 碧云天生产的基因定点突变试剂盒(Site-directed Gene Mutagenesis Kit)可 以用于点突变，多个邻近密码子的突变，单个或多个邻近密码子的缺失 (deletion)或插入(insertion)。 本试剂盒是一个利用目前最新的基因点突变技术设计而成的试剂盒。只 需通过基于PCR的突变质粒的合成，和基于Dpn I的模板质粒的消化，转 化培养以及后续的酶切或测序鉴定，即可得到预期的突变质粒(参考图 1)。累计操作时间不足2小时即可完成基因的定点突变。 参考图1，使用本试剂盒时需要先设计长度通常为30个碱基以上的互补的 两个引物，在引物中含有预期的突变位点。然后以待突变的质粒为模 板，用这两个引物进行PCR扩增反应。这样可以产生含有预期的突变位 点的双链质粒，但这个双链质粒中有两个nick位点。待突变的质粒通常来 源于大肠杆菌等细菌，在细菌中会被甲基化修饰，而在体外通过PCR扩 增得到的质粒不会被甲基化。这样用甲基化酶Dpn I处理，可以消化掉待 突变的质粒模板，而使通过PCR扩增出来的含有突变位点的质粒被选择 性地保留下来。这样把Dpn I处理过的产物转化细菌后，质粒中有两个 nick位点可以被大肠杆菌修复，得到的克隆就会含有预期的突变质粒了。 本试剂盒提供了DH5α甘油菌，可用于感受态细菌的制备。 本试剂盒共可以进行十次基因定点突变反应。图1. 基因定点突变试剂盒原理图 保存条件： -20℃保存，一年有效。 注意事项： 需自行配制LB液体培养基和LB平板以用于细菌的培养。 需自行设计和合成用于基因定点突变的引物。需自备用于细菌转化的试剂。 使用本试剂盒前请先阅读后面的常见问题。 为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。 使用说明： 1. 引物设计： 用于特定基因突变的引物需要单独设计，请参考如下一些基本原则进行设计： (1) 共需设计两条互补的引物。可以先集中设计一条，然后就可以得到互补的另一条引物。 (2) 引物的长度通常为25-45个碱基。 (3) 引物中突变位点任何一侧都必需满足 4X(GC碱基数)＋2X(AT碱基数) ≥45。但引物也不宜过长，否则通常会形成非常 稳定的二级结构。通常把突变位点两侧的碱基数控制在15个左右，且使两侧按照上述计算得到的数值相近。 例如引物为agtcaggccaattcg aag cagtcgaattgccaag，其中蓝色的aag为突变位点，则

stratagene品牌的点突变试剂盒的Protocol

Hieff Clone TM One Step Pcr Cloning Kit一步法（快速/无缝）克隆试剂盒是一款简单、快速、高效的DNA定向克隆产品，该试剂盒可以将PCR产物定向克隆至任意载体的任意位点，可高效克隆50 bp～10 kp 片段。将载体在克隆位点进行线性化，并在插入片段PCR引物5’端引入线性化克隆载体末端序列，使得插入片段PCR产物5’和3’最末端分别带有和线性化克隆载体两末端对应的完全一致的序列(15 bp～20 bp)。将这种两端带有载体末端序列的PCR产物和线性化克隆载体按一定比例混合，在重组酶Exnase的催化下，仅需反应30 min即可进行转化，完成定向克隆。克隆阳性率可达95%以上。克隆载体酶切产物或PCR产物和插入片段PCR产物可以不进行DNA纯化直接用于重组克隆，极大的简化了实验步骤。 试剂盒中包含有重组反应所需缓冲液和重组酶Exnase，Exnase中添加了独特的重组增强因子，显著提高重组克隆效率，即便使用低效率感受态细胞 (107 cfu/μg)也可实现高效克隆 (100 cfu/ng Vector)，而且Exnase还兼容常规酶切、PCR反应体系。 一步法（快速/无缝）克隆试剂盒可用于快速克隆、高通量克隆、无缝克隆和DNA定点突变。 产品组分 运输与保存方法 冰袋（wet ice）运输。产品-20 oC保存。 实验流程 实验流程概览 1)线性化克隆载体制备； 2)插入片段扩增引物设计； 3)插入片段PCR扩增； 4)进行重组反应； 5)反应产物转化、涂板； 6)克隆鉴定。 图一实验流程概览 注：插入片段PCR扩增时，引物5’端引入线性化克隆载体末端同源序列 (图中以蓝色和橙色标记)，使得扩增产物5’和3’最末端序列分别和线性化克隆载体两末端序列完全一致。

加A试剂盒使用说明书

编码品名规格单位 北京华越洋生物 加A试剂盒50次盒GX9133 北京华越洋生物 加A试剂盒100次盒GX9133 产品及特点本产品利用Taq DNA polymerase的不依赖于模板的末端转 移酶活性，在只有dATP存在的情况下，在平末端的DNA片段加 上一个dA尾巴，使平末端片段也能被T载体克隆。 1.简单, 2X Tailing Buffer 中含有所需要的所有成分,不需要 单独准备。 2.适用于任何平末端的DNA片段，包括Pfu DNA polymerase等酶合成的DNA片段。 3.产物可以直接用于与T载体的连接。 规格及成分成份50 次包装 2 X Tailing Buffer 1.25 mL Taq DNA olymerase(5U/uL) 50 uL 使用手册1份运输及保存低温运输，-20℃保存，保存期限为一年。 自备试剂PCR片段 使用方法一：反应前纯化处理： 用Vent, Deep Vent, Pfu, Pwo等具有3到5外切活性的 DNA聚合酶扩增得到的DNA片段，必须经过彻底的去除残留的酶 的处理过程（如酚/氯仿抽提或Proteinase K处理），否则它们将 在加A反应时，切除掉加上的A尾巴，干扰反应。可以采取胶回收 和酚/氯仿抽提法等常规方法纯化，最后溶解在水或TE中，终浓度 以0.1 ug/uL为宜。 二：加A反应

在干净的0.5 mL或1.5 mL离心管中，分别加入下列成分： 回收的DNA片段(0.2-2 ug) 25 uL 2 X dA Tailing Buffer 1 uL Taq DNA polymerase（5 U/uL） 补水到50 uL 72℃保温2小时 三：反应后处理 加A反应后，Taq DNA polymerase将与DNA末端紧密结合，所以必须酚/氯仿抽提去除。如果使用Proteinase K处理后再 用酚/氯仿抽提效果会更好。得到的DNA溶于适量水和TE中后即 可用于T载体的连接反应。 疑难解答Q：Taq DNA polymerase加尾有特异性吗？ A：在有四种核苷酸存在的反应体系中，Taq DNA polymerase加 尾特异性跟DNA的3’末端的核苷酸有关。如果要加T，要加尾的 DNA片段最好末位为T。如果要加A，要加尾的DNA片段最好末 位为C。其关系具体见下表： 3’末端核苷酸加尾核苷酸 A A,但效率极低 C A>C G G>A>C T T>A --DNA & Cell Biol. 12:763, 1993 关联产品加T试剂盒（dT Tailing Kit）、一站式T载体制备套装

电气操作说明书

电气操作说明书 安装和使用本设备时，请详细阅读说明书，熟悉电气线路及各按钮的功能。线路图参见附图。 1 安装说明：本设备的电源为380V三相5线制(包括火线、零线和地线)，整机额定功率为48KW，接入电源线要求不低于10mm2,最好用16 mm2，务必将火线L1/L2/L3接到380V主电源空气开关上，零线接到零线位置上，地线接到地线排上，工厂应在接入电源侧安装额定电流100A以上的漏电保护断路器，加强用电安全。 2 参数设定：根据用户需要，水温最高不超过55°，实际设定值建议为50-55°。 当水温温度低于设定值时，在水位处于“满水”和开启加热的情况下，系统加热启动，在达到设定值时，停止加热，当水温低于设定值3°时，再次加热，如此循环。 当设定温度为50°时，如当前水温为48°或者高于47°时，启动加热后，系统不会立即加热，要等到水温低于设定值3度（也即37°）时，才会加热。 当水箱水位处于低位时，为保护水泵和加热管，系统将自动停止水泵和加热，请注意保持水箱的水位。 磕蛋和清洗频率的设定，磕蛋频率最高为35HZ，清洗频率最高为18HZ，用户可根据使用情况，调整参数。磕蛋和清洗状态相互切换。 用户设定的设备参数，在设备通电状态下，可以持续保存和使用，在设备完全断电的情况下，PLC的保存期为4-5天，超过时间后，数据会丢失，在数据

丢失后，系统将使用默认的开机参数，每次开机前请注意核对开机参数，及时调整到工厂需要的设定值。系统默认值为水温50°，磕蛋频率为25HZ，清洗频率为15HZ。 水温设定的围是最高55°，磕蛋频率的最高设定值为35，清洗频率的最高设定值为18。 3 页面设置： 开机进入“首页”画面如下：点击：“进入”，进入选择画面。 在此页可以选择“首页”、“流程”、“参数”、“操作”画面。

蛋白质工程的定点突变

20世纪80年代以来，基因克隆技术与DNA化学合成方法相结合，建立和发展了定点突变技术。可以按照预定设计，在已知的DNA序列中增删或转换核苷酸，精确地是靶基因在特定位点发生碱基序列的变化，进而使基因表达及调控，基因产物发生相应改变。这种快速精确的基因突变已经被广泛地应用与基因工程和蛋白质工程之中。定点突变有多种方法，有的改变特定核苷酸，有的则是对一段最可能影响蛋白质功能的基因序列进行随机突变，产生一系列突变蛋白质。 寡核苷酸诱导的定点突变基本上分两类：一类是用单链噬菌体M13作载体的寡核苷酸介导的单链模板定点突变；另一类用双链质粒作载体，双引物法定点突变。为了在体外导入特定的点突变，小的限制性片段可以切除，并被包含所需要突变的合成接头所替代（称为盒式诱变）。如果不行，插入片段可以克隆到产生单链DNA的噬菌粒载体中，由所设计的错配引物知道DNA复制，产生异源双链的复制型，并在下面的复制循环中产生野生型和突变的复制型。 (图） 单链噬菌体作载体的定点突变的基本原理是，用已知序列的环状DNA变性后为模板，人工合成一段引物，将所要设计的定点突变寡核苷酸置于引物中，也就是说人工所合成的引

物不是完全和模板互补，而是在某个位点有意识地让碱基突变，和模板上的碱基不能配对，由于其他的碱基是互补的，所以任然可以通过复性，使引物和模板特异性结合。在M13单链环状模板上杂交一段寡核苷酸引物，利用DNA聚合酶和连接酶的作用，从引物延伸合成链，得到一个闭合环状的异源双链分子。由于预先在寡核苷酸引物中人为地引入碱基的错配对，插入或缺失，然后在将杂合双环DNA转化到细菌中，因此异源双链DNA经转化和筛选就可以分离到带有相应突变的DNA克隆。由于复制是半保留复制，经克隆后将有一半的后代环状DNA产生了定点突变，另一半和正常的亲代链一样。 环状双链质粒DNA作为载体进行基因的改造有它的优点。待改造基因中如有两个适当的限制性内切酶切点，可以用人工合成双链DNA片段置换两切点之间原有序列，在人工合成的双链DNA片段中包含有突变的序列。但是这种置换方法收到限制酶酶切位点的限制。 1.用M13DNA进行的寡核苷酸引物介导的定点突变：寡核苷酸引物介导的定点突变的步骤是用含有突变碱基的寡核苷酸片段作引物，在聚合酶的作用下启动DNA分子进行复制。主要过程是：（1）将待突变基因克隆到突变载体上； 2.制备含突变基因的M13DNA单链模板； 3.引物与模板与模