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protein A磁珠免疫沉淀DynabeadsProteinA_man

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免疫磁珠分离技术及应用

免疫磁珠分离技术及应用 一、前沿 免疫磁珠分离技术(Immunomagnetic beads sep—aration techniques,IMB) 是将免疫学反应的高度特异性与磁珠特有的磁响应性相结合的一种新的免疫学技术;是一种特异性强、灵质纯化敏度高的免疫学检测方法和抗原纯化手段。是近年来国内外研究较多的一种新的免疫学技术。 目前该项技术在细胞分离、蛋白、免疫学及微生物学检测等方面均取得了较大的进展,是目前最有推广价值的技术之一。 二、免疫磁珠分离技术介绍 1、免疫磁珠分离技术原理 利用人工合成的内含铁成分,可被磁铁磁力所吸引,外有功能基团,可结合活性蛋白质(抗体)的磁珠,作为抗体的载体。当磁珠上的抗体与相应的微生物或特异性抗原物质结合后,则形成抗原-抗体-磁珠免疫复合物,这种复合物具有较高的磁响应性,在磁铁磁力的作用下定向移动,使复合物与其他物质分离,而达到分离、浓缩、纯化微生物或特异性抗原物质的目的。 2、免疫磁珠法分类 ⑴、阳性分离法 磁珠结合的细胞就是所要分离获得的细胞 ⑵、阴性分离法 磁珠结合不需要的细胞,游离于磁场的细胞为所需细胞。一般而言,阴性分离法的磁珠用量比阳性分离法的大,阳性分离法用的更多。磁性微珠是以金属离子为核心,外层均匀包裹高分子聚合体的固相颗粒。磁性微珠上既可标记针对某种细胞表面抗原的特异性抗体(直接法); 也可标记羊抗鼠IgG抗体(间接法),使分离细胞的范围大大扩大。 3、免疫磁性微球的制备 基本技术路线:制成磁性材料的微球,再在微球表面引入活性基团,通过载体表面偶联反应可将抗体结合到载体上,形成免疫磁性微球。 优质微载体的性能:合适且均一的磁响应强度,较小且均一的粒径,稳定均一、特异吸附的表面性能。 4、该技术的主要优点 ⑴、细小而均一的微球为配基与受体的反应提供了较大的接触面积 ⑵、磁珠的磁性使其可以用磁力收集器方便快速地获得分离,且对被分离物无损伤 ⑶、检测复杂的生物样本和食品样本等时受到颗粒性杂质等的影响较小

常用蛋白质沉淀方法有哪些

P13三、5 、常用蛋白质沉淀方法有哪些?列举沉淀应用的实例 蛋白质分子凝聚从溶液中析出的现象称为蛋白质沉淀(precipitation),变性蛋白质一般易于沉淀,但也可不变性而使蛋白质沉淀,在一定条件下,变性的蛋白质也可不发生沉淀。 常用蛋白质沉淀的方法有: (一)盐析(Salting Out) 在蛋白质溶液中加入大量的中性盐以破坏蛋白质的胶体稳定性而使其析出,这种方法称为盐析。常用的中性盐有硫酸铵、硫酸钠、氯化钠等。例如用半饱和的硫酸铵来沉淀出血清中的球蛋白,饱和硫酸铵可以使血清中的白蛋白、球蛋白都沉淀出来,盐析沉淀的蛋白质,经透析除盐,仍保证蛋白质的活性。 (二)重金属盐沉淀蛋白质 蛋白质可以与重金属离子如汞、铅、铜、银等结合成盐沉淀。重金属沉淀的蛋白质常是变性的,但若在低温条件下,并控制重金属离子浓度,也可用于分离制备不变性的蛋白质。如临床上利用蛋白质能与重金属盐结合的这种性质,抢救误服重金属盐中毒的病人,给病人口服大量蛋白质,然后用催吐剂将结合的重金属盐呕吐出来解毒。 (三)生物碱试剂以及某些酸类沉淀蛋白质 蛋白质又可与生物碱试剂(如苦味酸、钨酸、鞣酸)以及某些酸(如三氯醋酸、过氯酸、硝酸)结合成不溶性的盐沉淀。如临床血液化学分析时常利用此原理除去血液中的蛋白质,此类沉淀反应也可用于检验尿中蛋白质。 (四)有机溶剂沉淀蛋白质 可与水混合的有机溶剂,如酒精、甲醇、丙酮等,对水的亲和力很大,能破坏蛋白质颗粒的水化膜,在等电点时使蛋白质沉淀。在常温下,有机溶剂沉淀蛋白质往往引起变性。例如酒精消毒灭菌就是如此,但若在低温条件下,则变性进行较缓慢,可用于分离制备各种血浆蛋白质。

盐析的操作方法

③盐析的操作方法:最常用的是固体硫酸铵加入法。欲从较大体积的粗提取液中沉淀蛋白质时,往往使用固体硫酸铵,加入之前要先将其研成细粉不能有块,要在搅拌下缓慢均匀少量多次地加入,尤其到接近计划饱和度时,加盐的速度更要慢一些,尽量避免局部硫酸铵浓度过大而造成不应有的蛋白质沉淀。盐析后要在冰浴中放置一段时间,待沉淀完全后再离心与过滤。在低浓度硫酸铵中盐析可采用离心分离,高浓度硫酸铵常用过滤方法,因为高浓度硫酸铵密度太大,要使蛋白质完全沉降下来需要较高的离心速度和 较长的离心时间。 各种饱和度需加入固体硫酸铵的量可由附录中查出。硫酸铵浓度的表示方法是以饱和溶液的百分数表示,称为百分饱和度,而不用实际的克数,这是由于当固体硫酸铵加到水溶液中去时,会出现相当大的非线性体积变化,计算浓度相当麻烦,为了克服这一困难,有人经过精心测量,确定出1L纯水提高到不同浓度所需加入硫酸铵的量,附录中的实验数据以饱和浓度的百分数表示,使用时十分方便。 ④盐析曲线的制作:如果要分离一种新的蛋白质和酶,没有文献数据可以借鉴,则应先确定沉淀该物质的硫酸铵饱和度。具体操作方法如下:取已定量测定蛋白质或酶的活性与浓度的待分离样品溶液,冷至0~5℃,调至该蛋白质稳定的pH值,分6~10次分别加入不同量的硫酸铵,第一次加硫酸铵至蛋白质溶液刚开始出现沉淀时,记下所加硫酸铵的量,这是盐析曲线的起点。继续加硫酸铵至溶液微微混浊时,静止一段时间,离心得到第一个沉淀级分,然后取上清再加至混浊,离心得到第二个级分,如此连续可得到6~10个级分,按照每次加入硫酸铵的量,查出相应的硫酸铵饱和度。将每一级分沉淀物分别溶解在一定体积的适宜的pH值缓冲液中,测定其蛋白质含量和酶活力。以每个级分的蛋白质含量和酶活力对硫酸铵饱和度作图,即可得到盐析曲线。 ⑤盐析的影响因素 (1)蛋白质的浓度:中性盐沉淀蛋白质时,溶液中蛋白质的实际浓度对分离的效果有较大的影响。通常高浓度的蛋白质用稍低的硫酸铵饱和度即可将其沉淀下来,但若蛋白质浓度过高,则易产生各种蛋白质的共沉淀作用,除杂蛋白的效果会明显下降。对低浓度的蛋白质,要使用更大的硫酸铵饱和度,但共沉淀作用小,分离纯化效果较好,但回收率会降低。通常认为比较适中的蛋白质浓度是2.5%~3.0%(质量分数),相当于25~30mg/ml。 (2)pH值对盐析的影响:蛋白质所带净电荷越多,它的溶解度就越大。改变pH值可改变蛋白质的带电性质,因而就改变了蛋白质的溶解度。远离等电点处溶解度大,在等电点处溶解度小,因此用中性盐沉淀蛋白质时,pH值常选在该蛋白质的等电点附近。

蛋白质沉淀反应实验

蛋白质沉淀反应实验集团企业公司编码:(LL3698-KKI1269-TM2483-LUI12689-ITT289-

蛋白质的沉淀反应 一、目的和要求 1、加深对蛋白质胶体溶液稳定因素的认识 2、掌握几种沉淀蛋白质的方法 3、了解蛋白质变性与沉淀的关系 二、沉淀反应 (一)原理 在水溶液中,蛋白质分子的表面上由于有水化层和同性电荷的作用,所以成为稳定的胶体颗粒。但这种稳定的状态是有条件的。在某些理化因素的作用下,蛋白质分子表面带电性质发生变化、脱水甚至变性,则会以固态形式从溶液中析出,这个过程就称为蛋白质的沉淀反应。蛋白质的沉淀反应可分为以下两种类型: 1、可逆沉淀反应 沉淀反应发生后,蛋白质分子内部结构并没有发生大的或者显着变化。在沉淀因素去除后,又可恢复其亲水性,这种沉淀反应就是可逆沉淀反应,也叫做不变性沉淀反应。属于这类沉淀反应的有盐析作用、等电点沉淀以及在低温下短时间的有机溶剂沉淀法等。 2、不可逆沉淀反应 蛋白质在沉淀的同时,其空间结构发生大的改变,许多副键发生断裂,即使除去沉淀因素,蛋白质也不会恢复其亲水性,并丧失生物活性,这种沉

淀反应就是不可逆沉淀反应。重金属盐、生物碱试剂、强酸、强碱、加热、强烈震荡、有机溶剂等都能使蛋白质发生不可逆沉淀反应。 (二)盐析 1、材料与试剂 (1)10%的卵清蛋白溶液(要求新鲜配制)、浓蛋白溶液(2)饱和硫酸铵溶液(3)固体硫酸铵(4)滤纸、玻棒 2、操作方法 (1)取试管一支,加入浓蛋白溶液2ml,再加等量的饱和硫酸铵溶液,混匀后静置10分钟将出现沉淀。此沉淀物为球蛋白。 (2)取上清液于另一支试管。 (3)向上清液液中加入硫酸铵粉末,边加边用玻棒搅拌,直至粉末不再溶解为止。静置数分钟后,沉淀析出的是清蛋白。 (4)向两支试管中分别加水,观察其沉淀是否溶解。 (三)重金属盐沉淀 重金属离子如Pb2+、Cu2+、Hg2+、Ag2+等可与蛋白质分子上的羟基结合生成不溶性金属盐而沉淀: 重金属盐类沉淀蛋白质的反应通常很完全,特别是在碱金属盐类存在时。因此,生化分析中,常用重金属盐除去体液中的蛋白质;临床上用蛋白质解除重金属盐引起的食物中毒。 1、材料与试剂 (1)10%的卵清蛋白溶液(2)0.1mol/L氢氧化钠溶液 (3)3%硝酸银溶液(4)0.1%硫酸铜溶液(6)试管3支

盐析法

盐析法综述 摘要:沉淀法是利用沉淀反应,将被测组分转化为难溶物,以沉淀形式从溶液中分离出来,并转化为称量形式,最后称定其重量进行测定的方法。盐析法是其中的一种,盐析法是在中药水提液中,加入无机盐至一定浓度,或达饱和状态,可使某些成分在水中溶解度降低,从而与水溶性大的杂质分离。常作盐析的无机盐有氯化钠、硫酸钠、硫酸镁、硫酸铵等。 关键词:沉淀法;盐析;原理;方法评价;蛋白质盐析 沉淀法 沉淀法是利用沉淀反应,将被测组分转化为难溶物,以沉淀形式从溶液中分离出来,并转化为称量形式,最后称定其重量进行测定的方法。 有机溶剂沉淀法多用于生物小分子、多糖及核酸产品的分离纯化,有时也用于蛋白质沉淀。有机溶剂的沉淀机理是降低水的介电常数,导致具有表面水层的生物大分子脱水,相互聚集,最后析出。等电点沉淀法用于氨基酸、蛋白质及其它两性物质的沉淀。但此法单独应用较少,多与其它方法结合使用。两性电解质分子上的净电荷为零时溶解度最低,不同的两性电解质具有不同的等电点,以此为基础可进行分离。、非离子多聚体沉淀法用于分离生物大分子非离子多聚物是六十年代发展起来的一类重要沉淀剂,最早用于提纯免疫球蛋白、沉淀一些细菌和病毒,近年来逐渐广泛应用于核酸和酶的分离提纯。最常用的是铅盐法,可以用于除去杂质,也可用于沉淀有效成分。沉淀法通常是在溶液状态下将不同化学成分的物质混合,在混合液中加人适当的沉淀剂制备前驱体沉淀物,再将沉淀物进行干燥或锻烧,从而制得相应的粉体颗粒。一般来说,所有固体溶质都可以在溶液中加入中性盐而沉淀析出,这一过程叫盐析。在生化制备中,许多物质都可以用盐析法进行沉淀分离,如蛋白质、多肽、多糖、核酸等,其中以蛋白质沉淀最为常见,特别是在粗提阶段。 对沉淀形式的要求 (1)沉淀的溶解度要小,以保证被测组分能沉淀完全。 (2)沉淀要纯净,不应带入沉淀剂和其他杂质。 (3)沉淀易于过滤和洗涤,以便于操作和提高沉淀的纯度。 (4)沉淀易于转化为称量形式。 盐析法 胶体的盐析 胶体的盐析是加盐而使胶粒的溶解度降低,形成沉底析出的

磁珠分离技术

磁珠分离技术 摘要:主要介绍了磁珠分离技术的基本概念,基本原理还有它的特点。磁珠分离技术中应用最广泛的是免疫磁珠分离技术,这里详细说明了免疫磁珠分离技术的结构以及有由它的结构决定的它的一些重要特性,以及免疫磁珠分离技术的制备原理和方法。并且详细说明了免疫磁珠分离技术的重要应用,为帮助同学了解记忆,例举了一些该技术的应用实例。 基本概念:磁珠是一种包被有生物活性基团的功能化载体, 可分散于基液中形成磁性液体材料, 它兼有液体的流动性和固体磁性颗粒材料的双重特点, 从而使固一液相的分离变得十分方便快捷。磁珠法的出现和应用,给生命科学的研究提供了一种新式的手段和武器, 也给大、中学生对的直观认识提供了一个简捷、客观的实验途径。其中最常用的事免疫磁珠技术。 原理:利用人工合成的内含铁成分,可被磁铁磁力所吸引,外有功能基团,可结合活性蛋白质(抗体)的磁珠,作为抗体的载体。当磁珠上的抗体与相应的微生物或特异性抗原物质结合后,则形成抗原-抗体-磁珠免疫复合物,这种复合物具有较高的磁响应性,在磁铁磁力的作用下定向移动,使复合物与其他物质分离,而达到分离、浓缩、纯化微生物或特异性抗原物质的目的。 特点:应用于磁分离技术的磁性载体微球应具备以下特点: 粒径比较小, 比表面积较大, 具有较大的吸附容量; 物理和化学性能稳定, 具有较高的机械强度, 使用寿命长; 具有可活化的反应基团, 以用于亲和配基的固定化; 粒径均一, 能形成单分散体系; 悬浮性好, 便于反应的有效进行。载体微球有纳米级、微粒级的, 纳米级的载体微球与微粒级的载体微球相比具有以下优点: 尺寸小, 扩散速度快, 悬浮稳定性好; 比表面积大, 偶联容量大; 超顺磁性, 能快速实现磁性粒子的分散与回收。 免疫磁珠(Immonumagnetic beads,IMB简称磁珠),由载体微球和免疫配基结合而成。载体微球的核心部分为金属小颗粒(Fe304,Fe203),是一种磁性高且较稳定的磁性材料,核心外包裹一层高分子材料(如聚氯乙烯,聚苯乙烯,聚乙烯亚胺),最外层是功能基层,如羟基(.OH),氨基(.NH2),醛基(-CHO),羧基(一COOH)。

免疫磁珠说明书

Contents 1. Description 1.1 Principle of the MACS? Separation 1.2 Background information 1.3 Applications 1.4 Reagent and instrument requirements试剂和仪器的要求 2. Protocol 2.1 Sample preparation样品制备 2.2 Magnetic labeling磁性标记 2.3 Magnetic separation磁性分离 3. Example of a separation using the CD133 MicroBead Kit 4. References 1. Description Components 2 mL CD133 MicroBeads, human:MicroBeads conjugated to monoclonal antihuman CD133 antibodies (isotype: mouse IgG1,clone AC133).2 mL FcR Blocking Reagent, human Specificity CD133 antigen, epitope (CD133/1)1.Capacity For 2亊10?total cells, up to 100 separations.Product format CD133 MicroBeads are supplied in buffercontaining stabilizer and 0.05% sodium azide.Storage Store protected from light at 2?8 °C. Do not freeze. The expiration date is indicated on the vial label. 1.1 Principle of the MACS? Separation First, the CD133+ cells are magnetically labeled with CD133 MicroBeads. Then, the cell suspension is loaded onto a MACS? Column, which is placed in the magnetic field of a MACS Separator. The magnetically labeled CD133+ cells are retained within the column. The unlabeled cells run through; this cell fraction is thus depleted of CD133+ cells. After removing the column from the magnetic field, the magnetically retained CD133+ cells can be eluted as the positively selected cell fraction. To increase the purity, the positively selected cell fraction containing the CD133+ cells is separated over a second column. 1.2 Background information The CD133 MicroBead Kit is a magnetic labeling system designed for the positive selection of CD133+ cells. It allows the single-step isolation of nonhematopoietic and early hematopoietic progenitors and stem cells. The CD133 molecule is a 5-transmembrane cell surface antigen with a molecular weight of 117 kD.2 The CD133/1 (clone AC133) antibody recognizes epitope 1 of the CD133 antigen.1 In the hematopoietic system, CD133 expression is restricted to a subset of CD34bright stem and progenitor cells in human fetal liver, bone marrow, cord blood, and peripheral blood.3 Isolated from hematopoietic sources, CD133+ cells can become adherent and are reported to become CD133–during culture?. The CD34+CD133+ cell population, which includes CD34+CD38–cells, was shown to be capable of repopulating NOD/SCID mice.?Recently, CD133 has also been found to be expressed on circulating endothelial progenitor cells?,?and fetal neural stem cells?,?as well as on other tissue-specific stem cells, such as renal1?and prostate11 stem cells. Lately, when isolated from tumor tissue, the CD133+ population

实验三 蛋白质的颜色反应和沉淀反应

实验三蛋白质的颜色反应和沉淀反应 一、目的: 1.熟悉蛋白质的沉淀反应、颜色反应及其机理。 二、原理: (一)蛋白质的颜色反应原理 蛋白质分子中的某些基团与显色剂作用,可产生特定的颜色反应,不同蛋白质所含氨基酸不完全相同,颜色反应亦不同。颜色反应不是蛋白质的专一反应,一些非蛋白物质亦可产生相同颜色反应,因此不能仅根据颜色反应的结果决定被测物是否是蛋白质。颜色反应是一些常用的蛋白质定量测定的依据。 (二)蛋白质的沉淀反应原理 蛋白质的水溶液是一种比较稳定的亲水胶体,这是因为蛋白质颗粒表面带有很多极性基团,如—NH3+,—COO-,—SH,—CONH2等和水有高度亲和性,当蛋白质与水相遇时,就很容易被蛋白质吸住,在蛋白质颗粒外面形成一层水膜(又称水化层)。水膜的存在使蛋白颗粒相互隔开,颗粒之间不会碰撞而聚成大颗粒。因此蛋白质在溶液中比较稳定而不会沉淀。蛋白质能形成较稳定的亲水胶体的另一个原因,是因为蛋白质颗粒在非等电状态时带有相同电荷,使蛋白质颗粒之间相互排斥,保持一定距离,不致相互凝集沉淀。 蛋白质由于带有电荷和水膜,因此在水溶液中形成稳定的胶体。当某些物理化学因素破坏了蛋白质的水膜或中和了蛋白质的电荷,则蛋白质胶体溶液就不稳定而出现沉淀现象。 三、仪器、试剂和材料 1. 卵清蛋白液:将鸡蛋白用蒸馏水稀释20~40倍,2~3层纱布过滤,滤液冷藏备用。 2. 饱和硫酸铵溶液:称硫酸铵850g 加于1000mL 蒸馏水中,在70~80℃下搅拌促溶,室温中放置过夜,瓶底析出白色结晶,上清液即为饱和硫酸铵溶液。 3. 1%醋酸铅溶液 4. 1%硫酸铜溶液 5. 0.1%茚三酮溶液:0.1g 茚三酮溶于95%乙醇并稀释至100mL。 6. 浓硝酸:比重1.42。 7.试管及试管架、吸管、量筒、布氏漏斗。

盐析法沉淀蛋白质的原理

盐析法沉淀蛋白质的原理 1 中性盐沉淀(盐析法) 在溶液中加入中性盐使生物大分子沉淀析出的过程称为“盐析”。除了蛋白质和酶以外,多肽、多糖和核酸等都可以用盐析法进行沉淀分离。 盐析法应用最广的还是在蛋白质领域,已有八十多年的历史,其突出的优点是: ①成本低,不需要特别昂贵的设备。 ②操作简单、安全。 ③对许多生物活性物质具有稳定作用。 ⑴中性盐沉淀蛋白质的基本原理 蛋白质和酶均易溶于水,因为该分子的-COOH、-NH2和-OH都是亲水基团,这些基团与极性水分子相互作用形成水化层,包围于蛋白质分子周围形成1nm~100nm颗粒的亲水胶体,削弱了蛋白质分子之间的作用力,蛋白质分子表面极性基团越多,水化层越厚,蛋白质分子与溶剂分子之间的亲和力越大,因而溶解度也越大。亲水胶体在水中的稳定因素有两个:即电荷和水膜。因为中性盐的亲水性大于蛋白质和酶分子的亲水性,所以加入大量中性盐后,夺走了水分子,破坏了水膜,暴露出疏水区域,同时又中和了电荷,破坏了亲水胶体,蛋白质分子即形成沉淀。

⑵中性盐的选择 常用的中性盐中最重要的是(NH4)2SO4,因为它与其他常用盐类相比有十分突出的优点: 1) 溶解度大:尤其是在低温时仍有相当高的溶解度,这是其他盐类所不具备的。由于酶和各种蛋白质通常是在低温下稳定,因而盐析操作也要求在低温下(0~4℃)进行。 2) 分离效果好:有的提取液加入适量硫酸铵 盐析,一步就可以除去75%的杂蛋白,纯 度提高了四倍。 3) 不易引起变性,有稳定酶与蛋白质结构的 作用。有的酶或蛋白质用2~3mol/L浓度的 (NH4)2SO4保存可达数年之久。 4) 价格便宜,废液不污染环境。 ⑶盐析的操作方法 最常用的是固体硫酸铵加入法。将其研成细粉,在搅拌下缓慢均匀少量多次地加入,接近计划饱和度时,加盐的速度更要慢一些,尽量避免局部硫酸铵浓度过大而造成不应有的蛋白质沉淀。盐析后要在冰浴中放置一段时间,待沉淀完全后再离心与过滤。 在低浓度硫酸铵中盐析可采用离心分离,高浓度硫酸铵常用过滤方法。

免疫磁珠分离技术

磁珠分离技术 一、原理 免疫磁珠法分离细胞基于细胞表面抗原能与连接在磁珠上的特异性单抗相结合,在外磁场中,通过抗体与磁珠相连的细胞被吸附而滞留在磁场中,无该种表面抗原的细胞由于不能与相连着磁珠的特异性单抗结合而没有磁性,不在磁场中停留,从而使细胞得以分离。免疫磁珠法分正选法和负选法,也称阳性分选法和阴性分选法。正选法-磁珠结合的细胞就是所要分离获得的细胞;负选法-磁珠结合的细胞为不需要细胞。一般负选法分选较为常见,因为此方法获得的所需要的细胞表面不含有抗体及磁珠的干扰。现以两步法分选小鼠CD4+ CD25+ T细胞的分选为例分别介绍负选法、正选法如下。 1、材料试剂: <1>、生物素化的,小鼠CD4阴性分选抗体混合物[cocktail,内含抗B细胞(CD45R,B220)、CD8+T细胞(CD8a,Ly-2)、造血细胞(CD11b,Mac-1),NK细胞(CD49b,DX5)等非CD4+T 细胞表面标志的抗体]。 <2>、结合有磁珠的抗生物素抗体(Scimall科学在线提供);含0.5%BSA(或0.5%FCS)及2mmol/L EDTA的PBS缓冲液;抗小鼠CD25-PE抗体;结合有磁珠的抗PE抗体(Scimall科学在线提供);磁珠分离器或分离柱。 2、实验步骤 <1>、负性分选小鼠CD4+T细胞 <2>、阳性分选小鼠CD25+ T细胞 收取上述分选的CD4+T细胞,制成单细胞悬液加入PE标记的抗CD25 直接加结合有磁珠的抗PE抗体 用MACS仪器,选择适当的分选程 序,收取阳性部分,即为CD25+ CD25+ T细胞 PBS洗涤、重悬 PBS洗涤、重悬 4℃孵育15-20min 4℃孵育15-20min PBS洗涤、重悬 取小鼠脾细胞,制成单细胞悬液 加入生物素化的、不针对 CD4的抗小鼠抗体混合物 加入PBS缓冲液及结合 有磁珠的抗生物素抗体 用MACS仪器,选择适当的分 选程序,取阴性部分,即为 CD4+ T细胞 PBS洗涤、重悬PBS洗涤、重悬4℃孵育15min 4℃孵育10min PBS缓冲液洗涤两次,重悬

实验---蛋白质的沉淀反应与颜色反应

实验蛋白质的沉淀反应与颜色反应 一、实验目的 掌握鉴定蛋白质的原理和方法。熟悉蛋白质的沉淀反应,进一步熟悉蛋白质的有关反应。 二、实验原理 蛋白质分子中某种或某些集团可与显色剂作用,产生颜色。不同的蛋白质由于所含的氨基酸不完全相同,颜色反应亦不完全相同。颜色反应不是蛋白质的专一反应,一些非蛋白物质也可产生同样的颜色反应,因此不能根据颜色反应的结果来决定被测物是否为蛋白质。另外,颜色反应也可作为一些常用蛋白质定量测定的依据。蛋白质是亲水性胶体,在溶液中的稳定性与质点大小、电荷、水化作用有关,但其稳定性是有条件的,相对的。如果条件发生了变化,破坏了蛋白质的稳定性,蛋白质就会从溶液中沉淀出来。 三、实验仪器 1、吸管 2、滴管 3、试管 4、电炉 5、pH试纸 6、水浴锅 7、移液管 四、实验试剂 1、卵清蛋白液:鸡蛋清用蒸馏水稀释10-20倍,3-4层纱布过滤,滤液放在冰箱里冷藏备用。 2、0.5%苯酚:1g苯酚加蒸馏水稀释至200ml。

3、Millon’s试剂:40g汞溶于60ml浓硝酸(水浴加温助溶)溶解后,冷却,加二倍体积的蒸馏水,混匀,取上清夜备用。此试剂可长期保存。 4、尿素晶体 5、1%CuSO 4:1g CuSO 4 晶体溶于蒸馏水,稀释至100ml 6、10%NaOH:10g NaOH溶于蒸馏水,稀释至100ml 7、浓硝酸 8、0.1%茚三酮溶液:0.1g茚三酮溶于95%的乙醇并稀释至100ml. 9、冰醋酸 10、浓硫酸 11、饱和硫酸铵溶液:100ml蒸馏水中加硫酸铵至饱和。 12、硫酸铵晶体:用研钵研成碎末。 13、95%乙醇。 14、醋酸铅溶液:1g醋酸铅溶于蒸馏水并稀释至100ml 15、氯化钠晶体 16、10%三氯乙酸溶液:10g三氯乙酸溶于蒸馏水中并稀释至100ml 17、饱和苦味酸溶液:100ml蒸馏水中加苦味酸至饱和。 18、1%醋酸溶液。 五、实验步骤 蛋白质的颜色反应 (一)米伦(Millon’s)反应

盐析

盐析 主要内容: 1.盐析原理 2.盐析的优缺点 3.盐析实验步骤 4.分段盐析 5.盐析曲线的制作 6.盐析注意事项 7.盐析的影响因素 8.盐析法应用 9.盐析常见问题分析 盐析原理 一般是指溶液中加入无机盐类而使溶解的物质析出的过程。如:加浓(NH 4)2SO 4使蛋白质凝聚的过程。 蛋白质在水溶液中的溶解度是由蛋白质周围亲水基团与水形成水化膜的程度,以及蛋白质分子带有电荷的情况决定的。当用中性盐加入蛋白质溶液,中性盐对水分子的亲和力大于蛋白质,于是蛋白质分子周围的水化膜层减弱乃至消失。同时,中性盐加入蛋白质溶液后,由于离子强度发生改变,蛋白质表面电荷大量被中和,更加导致蛋白溶解度降低,使蛋白质分子之间聚集而沉淀。 盐析的优缺点 1. 成本低,不需要特别昂贵的设备。2. 操作简单、安全。3. 不会引起蛋白质变性,经透析去盐后,能得到保持生物活性的纯化蛋白质。4.效果不理想,通常只是作为初步的分离纯化,还需要结合其它的纯化。 盐析实验步骤 蛋白质盐析常用的中性盐,主要有硫酸铵、硫酸镁、硫酸钠、氯化钠、磷酸钠等。其中应用最多的硫酸铵,由下表可以看出:它的优点是温度系数小而溶解度大(20℃时饱和溶液为754克/升;0℃时饱和溶解度为706克/升),在这一溶解度范围内,许多蛋白质和酶都可以盐析出来;另外硫酸铵分段盐析效果也比其他盐好,不易引起蛋白质变性。硫酸铵溶液的pH 常在4.5-5.5之间,当用其他pH 值进行盐析时,需用硫酸或氨水调节。表1几种盐在不同温度下的溶解度(克/100毫升水) 饱和硫酸铵法 1.取x ml 血清加x ml 生理盐水,于搅拌下逐滴加入2xml 饱和硫酸铵,硫酸铵的终饱和度为50%。 ℃ 20℃80℃100℃(NH 4)2SO 470.675.4 95.3103Na 2SO 4 4.918.9 43.342.2NaH 2PO 4 1.67.893.8101

沉淀蛋白质地常用方法

沉淀蛋白质的常用方法(TCA、乙醇、丙酮沉淀蛋白操作步骤) 2010-08-18 15:19 TCA-DOC For precipitation of very low protein concentration 1) To one volume of protein solution, add 1/100 vol. of 2% DOC (Na deoxy cholate, detergent). 2) Vortex and let sit for 30min at 4oC. 3) Add 1/10 of Trichloroacetic acid (TCA) 100% vortex and let sit ON at 4oC (preparation of 100% TCA: 454ml H2O/kg TCA. Maintain in dark bottle at 4oC.Be careful, use gloves!!!). 4) Spin 15min 4oC in microfuge at maximum speed (15000g). Carefully discharge supernatant and retain the pellet: dry tube by inversion on tissue paper (pellet may be difficult to see). [OPTION: Wash pellet twice repellet samples 5min at full speed between washes]. 5) Dry samples under vaccum (speed vac) or dry air. For PAGE-SDS, resuspend samples in a minimal volume of sample buffer. (The presence of some TCA can give a yellow colour as a consequence of the acidification of the sample buffer ; titrate with 1N NaOH or 1M TrisHCl pH8.5 to obtain the normal blue sample buffer colour.) Normal TCA To eliminate TCA soluble interferences and protein concentration 1) To a sample of protein solution add Trichloroacetic acid (TCA) 100% to get 13% final concentration. Mix and keep 5min –20oC and then 15min 4oC; or longer time at 4oC without the –20oC step for lower protein concentration. Suggestion: leave ON if the protein concentration is very low. (preparation of 100% TCA: 454ml H2O/kg TCA. Maintain in dark bottle at 4oC.Be careful, use gloves!!!). 2) Spin 15min 4oC in microfuge at maximum speed (15000g). Carefully discharge supernatant and retain the pellet: dry tube by inversion on tissue paper (pellet may be difficult to see). 3) For PAGE-SDS, resuspend samples in a minimal volume of sample buffer. (The presence of some TCA can give a yellow colour as a consequence of the acidification of the sample buffer ; titrate with 1N NaOH or 1M TrisHCl pH8.5 to obtain the normal blue sample buffer colour.) Acetone Precipitation To eliminate acetone soluble interferences and protein concentration

蛋白纯化硫酸铵沉淀盐析法

蛋白纯化硫酸铵沉淀盐析 还能想起那些在荧屏中曾经震撼过我们,具有超能力的英雄么? 蜘蛛侠,敏捷,灵活迅速飞流直下,忽闪直冲高楼; 绿巨人浩克,力量,速度,耐力,在我们的想象力中膨胀; 还有,我们随身携带星形盾牌,品格高尚的美国队长…… 幻想里中的人物形象存在我们的记忆力,然而生物背景出身的我们,总归要锻炼出属于自己的实验技能,即便是相同的实验步骤,每个人做出来的结果也不尽相同,差别在哪?反复练习,用心总结出属于自己的心得,转化为自己的实验“超能力”吧。本文总结了蛋白纯化硫酸铵沉淀详细的实验原理、步骤,供大家参考。 -------锻炼属于我们自己的实验“超能力”之一 我是超级蜘蛛精 看我有劲儿不? 冲啊,我是美国队长 而我是一只冷静的科研小蜗牛 这次,我们所要分享的便是一种很常见,但是也很重要的蛋白质纯化方法:硫酸铵沉淀蛋白法,一起走进实验室吧。 硫酸铵沉淀法是粗分离蛋白时常用的纯化和浓缩蛋白的技术。蛋白质的溶解度和盐浓度密切相关,在低浓度的条件下,随着盐浓度的增加,蛋白质的溶解度

增加;但在高浓度的盐溶液里,盐离子竞争性的

结合蛋白表面的水分子,破坏蛋白表面的水化膜,溶解度降低,蛋白质在疏水作用下聚集形成沉淀。每种蛋白质的溶解度不同,因此可以用不同浓度的盐溶液来沉淀不同的蛋白质。硫酸铵的溶解度大,解离形成大量的NH4+、SO42-离子,会结合大量的水分子,使蛋白质的溶解度下降,另外,其温度系数小,不易使蛋白质变性,因此,蛋白质粗分离时硫酸铵沉淀法是很重要的一种技术,后续可采用层析技术进一步纯化蛋白,效率更高。硫酸铵沉淀法是常用的分离免疫球蛋白的方法。 各种不同蛋白质盐析需要不同浓度的硫酸铵溶液。在实验中建议配置不同梯度浓度的硫酸铵溶液来确定蛋白质沉淀所需的最佳浓度。 (1)参照如下表格配置不同浓度的硫酸铵溶液; 例如,在25 ℃条件下,配置饱和度为100 %的硫酸铵溶液,称取767 g的硫酸铵固体,边搅拌边加入到1 L的蒸馏水中,完全溶解后,用氨水或者硫酸调节pH 到7.0。 (2)沉淀蛋白 将样品离心,去除沉淀,保留上清液并测量体积;一边搅拌一边慢慢的加入硫酸

蛋白质的盐析

蛋白质的盐析 SANY GROUP system office room 【SANYUA16H-

蛋白质的盐析(验证型) 一、实验目的 了解在工业化生产过程中使用(NH4)2SO4的情况,及(NH4)2SO4使用时的注意事项。 二、实验原理 用高浓度中性盐使蛋白质从溶液中沉淀出来的方法称盐析。常用的中性盐有(NH4)2SO4、NaCl 等。高`浓度中性盐能使蛋白质沉淀是因为它具有脱水性,能脱去蛋白质胶粒水膜,又有中和蛋白质胶粒外双电层电荷的作用。不同蛋白质盐析时所需盐浓度不同,故调节盐浓度,可适当地将蛋白质分开。如球蛋白在半饱和硫酸铵溶液中沉淀,清蛋白在饱和硫酸铵溶液中沉淀,用盐析法沉淀的蛋白质并未变性,用稀释的方法或透析的方法可使之复溶。 三、器材与试剂 1、发酵溶液 2、10%的三氯醋酸溶液 3、饱和(NH4)2SO4溶液 4、(NH4)2SO4粉末 四、实验步骤 (1)取发酵溶液5ml,加饱和(NH4)2SO4溶液1ml2ml3ml4ml5ml,混匀,静止数分钟,即有白色沉淀析出,应为何物?过滤至清,除去沉淀,滤液备用。取少量沉淀,加H2O看是否复溶? (2)取滤液0.5ml,加10%的三氯醋酸数滴,有白色沉淀产生,应为何物?然后在721分光光度计OD600下进行透光率的检测,检测时必须在倒入比色皿以后10秒内读取(为什么?)。(在进行检测时应注意将721分光光度计调整到OD600;在测量前应把机器预热半小时左右。在检测时应注意有效的检测范围是T值15%以上到70%以下)。 (3)另外,取滤液2.5ml于小烧杯中,加(NH4)2SO4粉末,随加随搅拌,直至(NH4)2SO4不能溶解为止,有白色沉淀产生,应为何物?然后过滤至清,除去沉淀,过滤备用。 (4)将(1)-(3)做的滤液中加10%三氯醋酸数滴观察有无沉淀产生。找到没有沉淀的加饱和(NH4)2SO4溶液的点。然后在721分光光度计OD600下进行透光率的检测。并且作出曲线。 (5)对大量的发酵液进行处理,在滤液中加10%三氯醋酸数滴观察有无沉淀产生。 (6)盐析曲线的制作方法:如果要分离一种新的蛋白质和酶,没有文献数据可以借鉴,则应先确定沉淀该物质的硫酸铵饱和度。具体操作方法如下:取已定量测定蛋白质或酶的活性与浓度的待分离样品溶液,冷至0℃~5℃,调至该蛋白质稳定的pH值,分6~10次分别加入不同量的硫酸铵,第一次加硫酸铵至蛋白质溶液刚开始出现沉淀时,记下所加硫酸铵的量,这是盐析曲线的起点。继续加硫酸铵至溶液微微混浊时,静止一段时间,离心得到第一个沉淀级分,然后取上清再加至混浊,离心得到第二个级分,如此连续可得到6~10个级分,按照每次加入硫酸铵的量,查出相应的硫酸铵饱和度。将每一级分沉淀物分别溶解在一定体积的适宜的pH缓冲液中,测定其蛋白质含量和酶活力。以每个级分的蛋白质含量和酶活力对硫酸铵饱和度作图,即可得到盐析曲线。 五、盐析注意事项: 1.盐析的成败决定于溶液的pH值与离子强度,溶液pH值越接近蛋白的等电点,蛋白质越容易沉淀。 2.盐析一般用的硫酸铵,容易吸潮,因而在使用前,一般先磨碎,平铺放入烤箱内60℃烘干后再称量,这样更准确。 3.在加入盐时应该缓慢均匀,搅拌也要缓慢,越到后来速度应该更注意缓慢,如果出现一些未溶解的盐,应该等其完全溶解后再加盐,以免引起局部的盐浓度过高,导致酶失活。

蛋白质的沉淀与变性反应

實驗3 蛋白質的沉澱與變性反應 目的 (1)瞭解蛋白質的沉澱反應、變性作用和凝固作用的原理及它們的相互關係。 (2)學習鹽析和透析等生物化學的操作技術。 原理 在水溶液中,蛋白質分子的表面,由於形成水化層和雙電層而成為穩定 的膠體顆粒,所以蛋白質溶液和其他親水膠體溶液相類似。但是,蛋白質膠 體顆粒的穩定性是有條件的,相對的。在一定的物理化學因素影響下,蛋白 質顆粒失去電荷,脫水,甚至變性,則以固態形式從溶液中析出,這個過程 稱為蛋白質的沉澱反應。這種反應可分為以下兩種類型: 一、可逆澱汲反應 在發生沉澱反應時,蛋白質雖已沉澱析出,但它的分子內部結構並未發 生顯著變化,基本上保持原有的性質,沉澱因素除去後,能再溶於原來的溶 劑中。這種作用稱為可逆沉澱反應,又叫作不變性沉澱反應。屬於這一類的 反應有鹽析作用; 在低溫下,乙醇、丙酮對蛋白質的短時間作用以及利用等 電點的沉澱等。 二、不可逆沉澱反應

在發生沉澱反應時,蛋白質分子內部結構、空間構象遭到破壞,失去原來的天然性質,這時蛋白質已發生變性。這種變性蛋白質的沉澱不能再溶解於原來溶劑中的作用叫作不可逆沉澱反應。重金屬鹽、植物鹼試劑、過酸、過鹼、加熱、震盪、超聲波,有機溶劑等都能使蛋白質發生不可逆沉澱反應。試劑和器材 一、試劑 1.蛋白質溶液 取5m1雞蛋蛋白蛋清,用蒸餾水稀釋至100ml,攪拌均勻後用4-8層紗布過濾,新鮮配製。 2.蛋白質氯化鈉溶液 取20ml蛋清,加蒸餾水200ml和飽和氯化鈉溶液100ml,充分攪勻 後,以紗布濾去不溶物(加入氯化鈉的目的是溶解球蛋白)。 硫酸銨粉末,飽和硫酸銨溶液,3%硝酸銀,0.5% 醋酸鉛,10% 三氯醋酸,濃鹽酸,濃硫酸,濃硝酸,5% 磺基水楊酸(sulfosalicyclic acid),0.1% 硫酸銅,飽和硫酸銅溶液,0.1% 醋酸,10% 醋酸,飽和氯化鈉溶液,10% 氫氧化鈉溶液。 二、器材 試管,試管架,小玻璃漏斗,濾紙,玻璃紙,玻璃棒,500ml 燒杯,10 ml量筒。

盐析法沉淀蛋白质的原理

“盐析沉淀蛋白质的原理实际上就是通过降低蛋白质的溶解度,从而使得蛋白质凝聚,最终从溶液中析出。蛋白质的沉淀其实就是将蛋白质分子聚集,使得它从溶液中析出的一种现象。” 各种蛋白纯化分离大集合! 一、沉淀法 1、盐析 实验原理:中和蛋白质表面电荷并破坏水化膜。 蛋白质易溶于水,因为其分子的-COOH -NH2和-OH都是亲水基团,这些基团与极性水分子相互作用形成水化层,包围于蛋白质分子周围形成1~100 nm大小的亲水胶体,从而削弱了蛋白质分子之间的作用力。当大量盐加到蛋白质溶液中,高浓度的盐离子(如硫酸铵的SO42- 和NH4+)有很强的水化力,可夺取蛋白质分子的水化层,使之"失水",于是蛋白质胶粒凝结并沉淀析出。 2、等电点沉淀法: 实验原理:利用蛋白质在等电点时溶解度最低而各种蛋白质又具有不同等电点的特点进行分离的方法。 在等电点时,蛋白质分子以两性离子形式存在,其分子净电荷为零(即正负电荷相等),此时蛋白质分子颗粒在溶液中因没有相同电荷的相

互排斥,分子相互之间的作用力减弱,其颗粒极易碰撞、凝聚而产生沉淀,所以蛋白质在等电点时,其溶解度最小,最易形成沉淀物。 注意点:不同的蛋白质,具有不同的等电点。同一种蛋白质在不同条件下,等电点不同。 3、有机溶剂沉淀法 实验原理:加入有机溶剂使水溶液的介电常数降低,因而增加了两个相反电荷基团之间的吸引力,促进了蛋白质分子的聚集和沉淀。 有机溶剂引起蛋白质沉淀的另一种解释认为与盐析相似,有机溶剂与蛋白质争夺水化水,致使蛋白质脱除水化膜,而易于聚集形成沉淀。 影响因素:(一)有机溶剂的选择(二)温度的控制(三)pH值(四)离子强度 用此法析出的沉淀一般比盐析法易过滤或离心沉降,分离后的蛋白质沉淀应立即用水或者缓冲液溶解,以达到降低有机溶剂的浓度的目的。此法在血液制品的制备过程中较多使用。

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