梨花柱RNA提取方法
农业生物技术学报Journal of Agricultural Biotechnology 2004,12(6):737~738
·研究简报·
梨花柱RNA 提取方法*
徐义流
张绍铃**
（南京农业大学园艺学院，南京210095）
关键词：梨；花柱;RNA;提取方法
A Method for RNA Isolation from Pear Style
XU Yi-Liu
ZHANG Shao-Ling**
(College of Horticulture,Nanjing Agricultural University,Nanjing 210095,
China)
pear;style;RNA;isolation method
*基金项目：国家自然科学基金（No.30170651）、江苏省高技术研究计划项目（No.BG2002310）及高校博士学科点专项科研基金（No.20010307012）资助。
徐义流：男，1963年生，博士研究生，副研究员。**通讯作者。Author for correspondence.E-mail ：
接受日期:2003-10-22
在一步法和酚-SDS 法两种最基本方法的基础上进行了许多改进，成功地从多种植物的叶、根等组织中提取出高质量的RNA 。然而，不同植物种类、同一植物不同组织、甚至不同基因型植物的同一组织RNA 的提取方法都可能存在差异
[1]
。我们应用这些方法也未能从自交不亲和性（self-incompa-
tibility,SI ）梨花柱中获得可用于进一步实验的RNA 。本实验从富含RNase 和酚类化合物的组织中提取RNA ，探讨简便和有效的总RNA 提取方法，为深入开展相关研究奠定基础。
1材料和方法
1.1
试材丰水梨()花柱，采自江苏省高邮市果树试验场，采集开花前1d 或开放当天的大花蕾，分离出花柱，称量后立即
储存液氮中。1.2
试剂配制
一步法的试剂配制，参照Chomczynski 等
[2]
的方法。Trizol 试剂盒为MDBio 公司生产。酚-SDS 法的试剂配制，参照Xia 等[3]的方法。改良酚-SDS 法的试剂配制,研磨缓冲液成分为0.1mol /L Tris-HCl (pH 8.0)、0.1mol /L LiCl 、10mmol /L EDTA ·2Na 、1%SDS;提取液由研磨缓冲液∶水饱和酚∶β-巯基乙醇以10∶9∶1比例配成；CI 由氯仿∶异戊醇以24∶1比例配成；琥珀酸钠缓冲液（pH 6.0）含0.01mol /L KCl ；LI 为10mol /L LiCl 。1.3
试剂及器具灭菌
双蒸水、NaAc 溶液、LiCl 溶液、改良酚-SDS 方法中的研磨缓冲液、琥珀酸钠缓冲液高压灭菌40min ；玻璃器皿、塑料器皿烘8h 后高压灭菌30min 。
1.4提取方法
一步法参照Chomczynski 等[2]的方法，使用花柱约1.0
g 。Trizol 试剂盒法按照说明书的要求操作,使用花柱约1.0g 。酚-SDS 法参照Xia L-Q 等[5]的方法,使用花柱约1.0g 。改良酚-SDS 法用液氮将研钵充分冷却，从液氮中取出1.0g 左右丰水梨花柱，迅速放入研钵充分研磨，并注意补充液氮。研磨好的花柱快速倒入已盛有5mL 提取液的25mL 离心管，室温下在震荡器上震荡5min ，加入2.5mL CI ，室温下震荡20min ，然后在4℃、12000
条件下离心20min ，取上清液
入新离心管，弃沉淀。向上清液中分别加1/3体积的氯仿和水饱和酚，震荡3min ，与上述相同条件下离心15min ，取上清
液，重复添加1/3体积的氯仿和水饱和酚及离心过程，直至中间无蛋白质层。向最后获得的上清液中加1/4体积的LI ，使LiCI 的终浓度为2mol /L ，将溶液放在4℃条件下沉淀过夜。过夜溶液4℃、15000
离心30min 获RNA 沉淀。用
75%乙醇洗沉淀1次，4℃、12000离心10min ，抽干沉淀，
用50μL 琥珀酸钠缓冲液溶解RNA ，-70℃冷藏。
1.5
检测方法
RNA 样品质量检测与浓度测定：取10μL RNA 溶液，加灭菌水至2.5mL,分别测定
230
、
260
和
280
值,260
/
230
和
260
/
280
值。RNA 浓度（μg/mL ）=
260
×稀释倍数×37，RNA 回收量（μg ）=RNA 浓度（μg/mL ）×琥
珀酸钠缓冲液（mL ）。完整性测定，取20μg RNA 进行2%非
变性琼脂糖凝胶电泳，
分析电泳条带。2结果和分析
2.1
应用一步法提取梨花柱RNA
农业生物技术学报2004年
应用一步法提取的RNA样品，260/280值为1.153，测定的260/230值为0.687（表1），2%非变性琼脂糖凝胶电泳时，没有发现RNA条带（图1,1）。
2.2应用Trizol试剂盒提取梨花柱RNA
与一步法几乎相似，260/280值为1.181,260/280值为0.624（表1），电泳时也没有出现RNA条带（图1,2）。
2.3酚-SDS法提取梨花柱RNA
应用这种方法获得的RNA样品，260/280值为1.720，260/230为1.855，其纯度明显比上述两种方法的高；每克花柱鲜重RNA的得率为224.82μg（表1）。电泳时，28S与18S条带清晰，但400~600bp区域条带模糊（图1,3），表明可能有部分RNA被分解。
2.4改良酚-SDS法提取梨花柱RNA
应用这种方法提取的RNA，260/280值为1.905, 260
/230为2.079，纯度高。RNA得率也高，每克花柱鲜重RNA得率为580.94μg/g，是酚-SDS法的2.58倍（表1）。电泳时，28S和18S条带清晰，28S带比18S的亮，400和500 bp2条带也很清楚（图1,4），表明RNA完整性好。
表1四种方法提取的梨花柱总RNA紫外光比色测定结果Table1Spectrophotometric measurement of total RNA isolated
by4methods from pear style
3讨论
梨花柱中自交不亲和基因产物S-RNase特异地分解与花柱S基因型相同的花粉管RNA，从而抑制花粉管在花柱中生长，不能完成受精和结实过程，表现出SI[4]，而且，S-RNase在37～55℃之间，其活性随温度的升高而增强,这些也许就是一步法和试剂盒法不能从梨花柱中获得RNA的重要原因；也可能是酚-SDS法RNA得率低的原因之一。而本实验提出的改良酚-SDS法却很好地克服了这些不足。
影响RNA提取的另一重要因素是酚类化合物[3]。梨花柱富含酚类化合物，被氧化的酚类化合物（如醌类），影响RNA的分离纯化，降低RNA的得率。改良酚-SDS方法有效地防止了酚类化合物被氧化;未被氧化的酚类化合物，通过苯酚/氯仿反复抽提和Li＋沉淀RNA过程去除。
图1.四种方法提取
的总RNA非变性琼
脂糖凝胶电泳图
Fig.1.Non-denature
agarose gel
electrophoretic
pattern of total RNA
isolated by4methods
1,一步法提取的RNA
样品;2,试剂盒提取的
RNA样品;3,酚-SDS 法提取的RNA样品;4,改良酚-SDS法提取的RNA样品;5,marker。1, RNA sample of single-step;2,RNA sample of Kit;3,RNA sample of
phenol-SDS;4,RNA sample of improved phenol-SDS;5,marker。
在分析RNA样品质量和产量时,通常用260、260
/280和260/2303个比色数值来衡量和计算。然而，我们发现试材内含有的酚类化合物、多糖及次生代谢产物常常干扰比色结果。本实验结果表明,提取的RNA样品越纯，比色结果越可靠；当样品的杂质含量超过一定比率时，比色结果便不能反映RNA样品的浓度和含量。
本实验利用改良酚-SDS方法，从梨花粉和花粉管中有效地提取RNA。然而，由于植物体内存在的影响RNA提取的成分复杂多样，改良酚-SDS方法既不可能适用植物所有组织的RNA提取，也不可能解决RNA提取过程中的所有问题，因此,还需要不断改进，如能否将一步法的快捷与改良酚-SDS法的有效性结合起来等，都还有待于进一步探讨。
参考文献
1Li H(李宏),Wang X-L(王新力).The difficulties in the isolation of RNA from plant tissues and their resolving strategies.Biotechnol Inform(生物技术通报),1999,(1):36~39(in Chinese with English abstract)
2Chomczynski P,Sacchi N.Single-step method of RNA isolation by acidguanidinium thiocyanate-phenol-chloroform extraction.Anal Biochem,1987,162:156~159
3Xia L-Q(夏兰芹)，Guo S-W(郭三堆).A method of RNA fast extracting in cotton tissues.Acta Gossypii Sin(棉花学报),2000,12
(4):205~207(in Chinese with English abstract)
4Hiratsuka S,Zhang S-L,Nakagawa E,et al.Selective inhibition of the growth of incompatible pollen tubes by S-protein in the Japanese pear.Sex Plant Reprod,2001,13:209~215
方法Methods
一步法试剂盒酚-SDS改良酚-SDS
Single-step Kit Phenol-SDS Improved phenol-SDS 230
0.517 1.0470.2550.571
260
0.3550.6530.473 1.187
280
0.3080.5530.2750.623
260
/2300.6870.624 1.855 2.079 260
/280 1.153 1.181 1.720 1.905
RNA得率/μg/gFW224.83580.94
RNA
yield 738