中间锦鸡儿FAD2基因拷贝数检测及组织表达谱分析

第38卷　第1期2010年1月

西北农林科技大学学报(自然科学版)

Jo urnal of N o rthwest A&F U niver sity(N at.Sci.Ed.)

Vo l.38N o.1

Jan.2010中间锦鸡儿FAD2基因拷贝数检测

及组织表达谱分析＊

林　萍a,汪阳东a,齐力旺b,张守攻b

(中国林业科学研究院a亚热带林业研究所,浙江富阳311400;b林业研究所,北京100091)

[摘　要]　【目的】探索中间锦鸡儿基因组中F AD2基因的拷贝数,分析不同拷贝的表达模式,以期揭示不同拷贝在植物体内的功能分工。【方法】根据中间锦鸡儿(Caragana intermedia)FAD2基因的保守序列设计1对引物SF 和S R,利用该引物对PCR扩增制备114bp的So uther n检测探针,探针进行地高辛标记后,采用罗氏Southe rn杂交试剂盒进行Southe rn检测。根据中间锦鸡儿3个F AD2基因各自的特异差异序列,分别设计定量PCR引物序列,以actin基因为内参,对中间锦鸡儿的根、茎、叶及不同发育时期(发芽15,25,35d)种子的cDN A进行定量PCR分析。

【结果】中间锦鸡儿F AD2基因至少有4个拷贝,且不同拷贝的表达模式不同。F AD2-2A基因在根和发育中期、后期的种子中低水平表达,在幼嫩的茎、叶以及发育早期的种子中高水平表达;F AD2-1A基因在根中的表达量最低,在种子发育早期、中期大量表达,在幼嫩叶子中表达水平也较高;F AD2-1B基因仅在种子发育中期大量表达,在其他组织及种子其他发育阶段的表达量均保持在本底水平。在不同组织以及种子的不同发育时期,F AD2-1A相对表达量的变化幅度最大,达到了近100倍,F AD2-1B次之,FAD2-2A最小。【结论】结合序列比对分析推测:F AD2-2A基因可能主要负责合成膜脂中的亚油酸,F AD2-1A主要负责种子及叶子贮脂中亚油酸的合成,FAD2-1B负责种子贮脂中油酸的去饱和作用。

[关键词]　中间锦鸡儿;F AD2基因;实时定量PC R;表达谱

[中图分类号]　Q786;S793.301[文献标识码]　A[文章编号]　1671-9387(2010)01-0119-06

Copy detection and expression profile analysis of FAD2genes

in Caragana intermedia

LIN Ping a,WA NG Yang-dong a,QI Li-w ang b,ZHANG Shou-gong b

(a Research In stitu te o f S ubtrop ica l Forestry,F uyang,Zhej iang311400,China;

b Res earch Institute o f Forestr y,Chines e Academy o f For estr y,Beijing100091,Ch ina)

A bstract:【Objective】The study w as to detect the F AD2gene copies,analy ze the F AD2gene ex pres-sion profile and pre sum e every copy's function in Caragana intermedia.【Method】The Southern-blo tting pro be w as prepared by PCR w ith the primers desig ned acco rding to the consensus sequence of F AD2genes in C.intermed ia.The probe w as labeled by digo xin and Southern-blotting w as do ne w ith Roche So uthern-blo tting kit.The real-tim e PCR primers w ere designed acco rding to the distinct sequences of every F AD2 copy.The quantity PCR w as do ne fo r roo t,stem,leaves and the young seed of C.intermedia w ith the actin gene as interio r contro l.【Result】Southern-blotting results indicated there w ere four copies of F AD2g ene in C.intermedia.genome at least,and these w ere coincident with the four F AD2genes clo ned.The real-time PCR w as pe rfo rm ed to detect the rela tive expressio n levels of F AD2-2A,F AD2-1A and F AD2-1B

＊[收稿日期]　2009-05-08

[基金项目]　国家“十一五”科技支撑专题(2006BAD01A1606)

[作者简介]　林　萍(1980-),女,山东烟台人,助理研究员,博士,主要从事林木遗传育种研究。E-mail:linping80@https://www.sodocs.net/doc/0b4735115.html,

[通信作者]　张守攻(1949-),男,安徽淮南人,研究员,中国林业科学研究院首席科学家,博士生导师,主要从事林木遗传育种研究。

E-m ail:shougong.zh ang@https://www.sodocs.net/doc/0b4735115.html,

DOI:10.13207/https://www.sodocs.net/doc/0b4735115.html, ki.jn wafu.2010.01.027

mRNA.F AD2-2A transcript show ed a low lev el in the roo t,middle-stage seeds and pre-mature seeds,and F AD2-2A w as ex pressed m ore in the first-stag e seeds and tender leaves than in the o ther tissues.F AD2-1A transcripts show ed the low est level in the roo t and the hig hest lev el in the first-stage and middle-stage seeds,and it was ex pressed abundantly in the tender leaves,to o.F AD2-1B w as expressed abundantly in the middle-stage seeds and its transcript w as v ery low in the other tissues.In all tissues the F AD2-1A tran-script level changed mo st,and that of F AD2-2A changed least.【Conclusio n】Acco rding to all of these,w e deduced that F AD2-2A takes respo nsibility for desaturating oleic acid in the mem brane lipid mainly;

F AD2-1A is in charg e of desaturating o leic acid in the sto re lipid of seeds and leaves;and F AD2-1B is in charge o f desaturating oleic acid in the sto re lipid of seeds,too.

Key words:Caragana intermedia;F AD2gene;Real-time PCR;ex pression profile

Δ12脂肪酸脱氢酶(Δ12fatty acid desaturase,Δ12FAD,也称为FAD2)催化油酸生成亚油酸,是植物体内生成多不饱和脂肪酸的关键酶[1-3]。编码该酶的F AD2基因已经从多种植物中克隆到,在植物中一般有多个拷贝,不同拷贝间在序列特征、表达调控和功能等方面存在显著差异[4-5],如向日葵的基因组中存在3个F AD2基因拷贝,其中1个特异地在种子中高表达,而另外2个在不同组织中均有表达;M artinez-Rivas等[6]认为,前者可能控制贮脂脱饱和,与种子油酸含量直接相关,而后两者与膜脂脱饱和有关。Mikkilineni等[7]研究表明,在玉米植株中存在3个F AD2功能基因,其中2个在胚中表达,另1个在其他组织中表达;N orthern杂交发现,胚中的F AD2基因在授粉后14d表达量最高。在大豆、甘蓝型油菜和橄榄等的基因组中,也发现不同F AD2基因拷贝具有不同的表达模式[8-12]。

中间锦鸡儿(Caragana intermedia)为豆科锦鸡儿属落叶灌木,广泛分布于我国黄河流域以北的干燥地区,其抗干旱、耐盐碱,是沙漠、半沙漠地区重要的防风固沙树种。锦鸡儿属植物茎叶中富含营养,种子产量大,是牲畜的好饲料,但除牲畜采食外,尚未对其进行深度的开发利用。为了对中间锦鸡儿种子油脂成分进行改良,进一步提升中间锦鸡儿的经济价值,本课题组对其F AD2基因进行了初步研究,已经克隆到序列、编码蛋白性质等各不相同的4个F AD2基因(F AD2-2A、F AD2-2B、F AD2-1A 和F AD2-1B)[13],并进行了简单的比较分析[14]。本研究将进一步采用Southern杂交技术,探索中间锦鸡儿基因组中F AD2基因的拷贝数,采用定量PCR技术分析基因不同拷贝的表达模式,以期揭示其中3个基因(F AD2-2B基因的组织表达分析,已由本实验室汪阳东博士进行研究)在植物体内的功能分工,为将来的中间锦鸡儿基因工程改良提供更精确的理论指导。

1　材料与方法

1.1　材　料

1.1.1　植物材料　中间锦鸡儿的幼嫩根、茎、叶及不同发育时期的种子(授粉后15,25和35d),均采自中国林业科学研究院玉泉山苗圃4年生实生苗。

1.1.2　主要试剂　地高辛标记Southern检测试剂盒,购自Roche;限制性内切酶FokⅠ、H aeⅢ、RsaⅠ,购自Promega;Trizol RNA提取试剂盒,购自invitrog en;未成熟种子RNA提取试剂盒,购自北京奥莱博生物技术有限责任公司;M-M LV反转录酶,购自Promega;SYBR?Premix E x Taq TM实时定量试剂盒,购自TaKaRa;所有引物均由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。定量PCR在ABI PRISM7500实时定量PCR系统上进行。

1.2　方　法

1.2.1　中间锦鸡儿基因组DNA的Southern检测　(1)探针制备。根据4个F AD2基因的保守序列设计上、下游引物SF:5′-TGGCC TACC TACTGG-GC TAT-3′和S R:5′-AACAAGATCA TCAAGCC-AT TG-3′,以中间锦鸡儿基因组DNA为模板进行PCR扩增,将获得的PCR产物回收、测序,该片段长114bp,作为So uthe rn检测的探针。(2)South-ern杂交。利用改良C TAB法提取中间锦鸡儿基因组DNA,将基因组DNA进行限制性酶切,从Eco RⅠ、SacⅠ、B am HⅠ、X baⅠ、A paⅠ、PstⅠ、H in cⅡ、FokⅠ、H aeⅢ、RsaⅠ、ClaⅠ等11种限制性内切酶中,筛选能够将基因组DNA酶切充分、形成均匀弥散条带的内切酶。50μL酶切体系为: DNA样品25μL,限制性内切酶3.5μL,10×Buff-er5μL,BSA1μL,无菌水15.5μL。混匀,略微离心,37℃酶切过夜;酶切完全后的样品于10g/L琼

120西北农林科技大学学报(自然科学版)第38卷

脂糖凝胶中以25～30V 稳压电泳12～16h ,使不同长度的DNA 片段在凝胶中较好地分开;采用毛细

管法转膜,后续的杂交显影等步骤按照试剂盒说明书进行。

1.2.2　中间锦鸡儿3个F AD 2基因的荧光定量PCR 中间锦鸡儿未成熟种子及根、茎、叶总RNA 的提取分别按照试剂盒说明书进行;单链cDNA 按照SMA RT 策略合成。根据F AD 2-2A 、F AD 2-1A 和F AD 2-1B 3个基因各自的特异序列,设计定量PCR 引物序列如下:

F AD 2-2A F :5′-CGCCCTCTC TCT TTC TT -GGC -3′,F AD 2-2A R :5′-CTGGA TACCGGTC TTC -T TCT -3′,PCR 产物260bp ;F AD 2-1A F :5′-

G TG -T TTCA TCACA TAACTGA -3′,F AD 2-1A R :5′-A -TCA TCA TCCATGCT TT TCT -3′,PCR 产物256bp ;F AD 2-1B F :5′-CTCCCATA TA TTC TGA -TAGG -3′,F AD 2-1B R :5′-CTCCCCTGAGCCAA T -C TCAT TCC -3′,PC R 产物237bp 。

选择中间锦鸡儿表达量稳定的actin 基因作为内参,设计扩增引物:actF :5′-GAGGCTCCACTCA -ACCCA -3′,actR :5′-CAGCGAGA TCCAAACGAA -3′;2个引物扩增片段长度均为226bp 。定量PC R 的具体操作过程按照SYBR ?

Prem ix E x Taq TM

实

时定量试剂盒说明书进行。

2　结果与分析

2.1　中间锦鸡儿基因组DNA 的So uthe rn 检测

通过筛选,从11个限制性内切酶中,确定了能

够对基因组DNA 充分酶切的3个内切酶:Fok Ⅰ、H ae Ⅲ和Rsa Ⅰ。由图1可知,在R sa Ⅰ和Fok Ⅰ酶切DNA 上各杂交出1条带,在H ae Ⅲ酶切DN A 上杂交出4条带。由于已经从中间锦鸡儿cDNA 中克隆了4个F AD 2基因,而且在探针66bp 处有一个H ae Ⅲ酶切位点,因此从理论上讲,在H ae Ⅲ酶切DNA 上至少应该杂交出5条带。这可能是由于杂交过程中背景过强,掩盖了部分杂交信号。2.2　中间锦鸡儿3个F AD 2基因的荧光定量PCR

F AD 2-2A 、F AD 2-1A 及F AD 2-1B 的融解曲线(图2)显示,在定量PC R 过程中,3个基因均被特异性扩增,说明定量PCR 结果能够代表3个基因在不同组织及种子不同发育时期的表达情况

。

图1　中间锦鸡儿基因组D NA 的So uther n 杂交

1.Rsa Ⅰ;

2.H ae Ⅲ;

3.Fok Ⅰ

Fig .1　Southern -blo tting of g eno me DN A

o f C .intermed

ia

图2　中间锦鸡儿F AD 2-2A 、F AD 2-1A 和F AD 2-1B 基因的融解曲线Fig .2　Dissociation curves of F AD 2-2A ,F AD 2-1A and F AD 2-1B of C .intermedia

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第1期林　萍,等:中间锦鸡儿F AD 2基因拷贝数检测及组织表达谱分析

Real -time PC R 结果(图3)表明,F AD 2-2A 在根、茎、叶以及发育15,25和35d 的种子中均有表

达,且以在发育15d 种子中的表达量最高,在茎中的表达量次之,在发育35d 的种子中表达量最低。以根中的表达量作为标准基数1,在35d 种子中的相对表达量只有0.03,在15d 种子中的相对表达量则高达17.11。

FAD 2-1A 在不同组织以及种子的不同发育时期也均有表达,但在种子发育早期(15d )和中期(25d )的表达量远远高于种子发育后期以及在根、茎、叶等

营养器官中的表达量。以根中的表达量作为标准基数1,发育15d 种子中的相对表达量达到了58.73,发

育25d 种子中的相对表达量达到了94.95。

F AD 2-1B 在不同组织以及种子的不同发育时期也均有表达,但在发育中期种子中的表达量明显高于其他组织及种子的其他发育时期。以根中的表达量作为标准基数1,在发育25d 种子中的相对表达量为22.90,在发育15d 种子中的相对表达量最低,只有0.55,在其他组织中的相对表达量也仅有1～3

。

图3　中间锦鸡儿F AD 2-2A 、F AD 2-1A 和F AD 2-1B 基因在根、茎、叶及种子不同发育时期的表达分析

Fig .3　Ex pression profile o f FAD 2-2A ,F AD 2-1A and F AD 2-1B in r oo t ,stem ,leav es a nd young seeds o f C .intermed ia

3　讨　论

3.1　F AD 2基因的Southern 检测

在本研究的So uthern 杂交结果中,Hae Ⅲ酶切DNA 上杂交出4条带。研究证明,F AD 2基因除在拟南芥等少数植物中只有1个拷贝外,在多数植物

中均有多个拷贝,如棉花[15]、玉米[7]中有3个以上,大豆

[8,16-17]

中已经分离到4个,油橄榄

[10]

中也分离

到2个。3.2　F AD 2基因的表达谱分析

在各种植物中,F AD 2基因的多拷贝之间功能不同。例如,大豆中的4个拷贝有2个在种子中特

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西北农林科技大学学报(自然科学版)第38卷

异性表达,负责种子贮脂中油酸去饱和生成亚油酸;另2个为组成型表达,推测其功能是负责植物膜脂中亚油酸的合成[8,16-17]。油橄榄中的F AD2-1可能是负责幼嫩种子中贮脂的去饱和作用,F AD2-2则可能主要负责成熟种子和中果皮贮脂的去饱和作用[10]。据此推测,中间锦鸡儿的3个F AD2基因的分工可能也各不相同。

本研究中,中间锦鸡儿F AD2-2A基因在根中低水平表达,在幼嫩的茎、叶以及发育早期种子中高水平表达,相对表达量均达到根中表达量的10倍以上,这可能与这些器官活跃的细胞分裂有关;而在主要进行贮脂及其他营养物质合成的种子发育中期,及种子发育基本完成且各种生命活动较弱的种子发育后期,F AD2-2A的表达量非常低。结合该基因的序列比对分析推断:F AD2-2A基因可能主要负责合成膜脂中的多不饱和脂肪酸亚油酸。

F AD2-1A基因在根中的表达水平最低,在叶中的相对表达量是根中表达量的10倍以上,在15d 种子中的相对表达量为根中表达量的58.73倍,而在25d种子中的相对表达量接近根中表达量的100倍。可见,F AD2-1A在种子发育早期和中期大量表达,在幼嫩叶子中表达量也较高。由于锦鸡儿属植物不仅在种子中含有大量油脂,茎叶中也含有油脂,因此推测F AD2-1A主要负责中间锦鸡儿种子及叶子中贮脂的合成。

F AD2-1B基因仅在种子发育中期大量表达,在其余组织及种子的其他发育阶段的相对表达量都保持在本底水平,推测该基因也主要与种子贮脂中油酸的去饱和作用有关。

在中间锦鸡儿各组织以及种子的不同发育时期,都以根中的表达量作为基数1,F AD2-2A的最高表达量为17.11,而F AD2-1A的最高表达量达到了94.95,F AD2-1B的表达量也有22.90,可见, F AD2-1A表达量的变化幅度最大,F AD2-1B次之,F AD2-2A的最小。这可能与其分工不同有关: F AD2-2A主要负责膜脂去饱和,因此各时期表达比较平稳,表达量变化不大;而F AD2-1A和F AD2-1B主要负责种子贮脂的去饱和,由于种子贮脂含量较高,使得这2个基因在种子发育时期的表达量大幅度上升。

大豆、向日葵、玉米等都有只在种子中特异表达的F AD2基因,而中间锦鸡儿的3个F AD2基因在各个组织中都表达,并且通过表达水平的高低调控不同拷贝的分工。因此,在通过基因工程等手段进行中间锦鸡儿油脂成分改良时,要根据不同的改良目的,有针对性地对关键基因进行改良。

4　结　论

中间锦鸡儿F AD2基因至少有4个拷贝,且不同拷贝的表达模式不同。F AD2-2A基因在根和发育中期、后期的种子中低水平表达,在幼嫩的茎、叶以及发育早期的种子中高水平表达。F AD2-1A基因在根中的表达量最低,在种子发育早期、中期大量表达,在幼嫩叶子中的表达水平也较高。F AD2-1B 基因仅在种子发育中期大量表达,在其他组织及种子其他发育阶段的相对表达量都保持在本底水平。在不同组织以及种子的不同发育时期,F AD2-1A 相对表达量的变化幅度最大,达到了近100倍, F AD2-1B次之,F AD2-2A的最小。

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