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不同念珠藻的提取物对酪氨酸酶活性的抑制作用

不同念珠藻的提取物对酪氨酸酶活性的抑制作用

酪氨酸激酶抑制剂类抗肿瘤药物研究方法进展

现代生物医学进展https://www.sodocs.net/doc/108526952.html, Progress in Modern Biomedicine Vol.10NO.16AUG.2010 酪氨酸激酶抑制剂类抗肿瘤药物研究方法进展* 刘振凯1艾 菁2耿美玉1,2△ (1中国海洋大学医药学院山东青岛266003;2中国科学院上海药物研究所上海201203) 摘要:酪氨酸激酶(protein tyrosine kinases,PTKs )在肿瘤细胞的增殖、分化、迁移、侵袭等相关信号通路中起到了关键的调控作用,已经成为肿瘤靶向性治疗的重要靶点。本文对靶向酪氨酸激酶的小分子抑制剂的筛选和评价方法进行综述,以期促进酪氨酸激酶抑制剂类抗肿瘤药物的研究。 关键词:酪氨酸激酶;抗肿瘤药物;小分子抑制剂;抑制剂筛选 中图分类号: R730.5,R915文献标识码:B 文章编号:1673-6273(2010)16-3134-04Advances in Research of Protein-tyrosine Kinases Inhibitors as Anticancer Drug* LIU Zhen-kai 1,AI Jing 2,GENG Mei-yu 1,2△ (1Marine drug and food Institute,Ocean university of China,Qingdao,266003,China;2Shanghai Institute of Materia Medica,Chinese Academy of Sciences,Shanghai,201203,China ) ABSTRACT:Protein tyrosine kinases (PTKs)have long been recognized as promosing therapeutic targets involved in a variety of human diseases and in particular several types of cancer.They play important roles in regulating intracellular signal transduction path-ways closely associated with the invasion,metastasis and angiogenesis of many tumors.An effort towards the development of new and more effective PTK inhibitors represents an attractive therapeutic strategy for cancer therapy.In this paper,we review the screening and evaluation methods of small-molecule inhibitors of PTKs with a view to promote the study of PTKs. Key words:Protein-tyrosine kinases;Antitumordrugs;Small-molecule inhibitors;Inhibitors screening Chinese Library Classification (CLC ):R730.5R915Document code:B Article ID:1673-6273(2010)16-3134-04 *基金项目:国家杰出青年科学基金资助(No 30725046) 作者简介:刘振凯(1983-),男,硕士。研究方向:分子药理学。E-mail :lzkai111@https://www.sodocs.net/doc/108526952.html, △通讯作者:耿美玉(1963-),研究员、博士生导师。E-mail :mygeng@https://www.sodocs.net/doc/108526952.html, (收稿日期:2010-05-07接受日期:2010-06-01) 恶性肿瘤是严重威胁人类生命和健康的疾病。目前,临床上常用的抗肿瘤药物主要是细胞毒类药物,这类药物大多存在难以避免的选择性差、毒副作用强、易产生耐药等缺点[1]。近年来,随着生命科学研究的飞速发展,恶性肿瘤细胞内的信号转导、 细胞周期的调控、细胞凋亡的诱导、血管生成以及细胞与胞外基质的相互作用等各种基本过程正在被逐步阐明,给抗肿瘤药物的研发理念带来了巨大转变。以一些与肿瘤细胞分化增殖相关的细胞信号转导通路的关键酶/蛋白作为药物靶点,筛选发现选择性强、高效、低毒的新型抗癌药物已成为当今抗肿瘤药物研究开发的重要方向[2]。 蛋白酪氨酸激酶是一类具有酪氨酸激酶活性的蛋白质,它们能催化ATP 分子上的γ-磷酸基转移到底物蛋白的酪氨酸残基上,使其发生磷酸化。酪氨酸激酶分为受体型和非受体型两种。受体酪氨酸激酶是一种单次跨膜蛋白,目前至少已有近六十种分属20个家族的受体酪氨酸激酶被识别。不同的受体酪氨酸激酶和配体结合后,受体自身发生二聚化或结构重排,并进一步使受体胞内区特异的酪氨酸残基发生自身磷酸化或交叉磷酸化,从而激活下游的信号转导通路[3]。它们在信号由胞外转导至胞内的过程中发挥重要的作用。而非受体酪氨酸激酶是一种胞浆蛋白,现已经确认的有约30种,分为10大家族。蛋白酪氨酸激酶在细胞信号转导通路中占据了十分重要的地位, 调节细胞生长、分化、死亡等一系列生理生化过程。蛋白酪氨酸激酶功能失调则引发生物体内一系列疾病。大量资料表明,超过50%的原癌基因和癌基因产物都具有蛋白酪氨酸激酶活性,它们的异常激活或过度表达将导致细胞无限增殖,周期紊乱,最终导致肿瘤的发生发展[4]。 同时,酪氨酸激酶调控异常还与肿瘤的侵袭、 转移,肿瘤新生血管生成,肿瘤化疗抗性等密切相关。事实上,以酪氨酸激酶为靶点进行抗肿瘤药物的开发已成为国际研究的前沿。 1酪氨酸激酶抑制剂的开发策略 目前酪氨酸激酶抑制剂的开发策略主要分为胞外、胞浆和核内三个层面:细胞外策略主要是针对于受体型,配体与受体的生物拮抗剂以及特异性抗体,通过拮抗配体和受体的相互作用,抑制酪氨酸激酶的激活[5];胞浆内策略主要分为抑制激酶区的激酶活性和拮抗酪氨酸激酶与其下游信号分子的相互作用两个方面[6];核内策略主要是利用miRNA 降解或者干扰酪氨酸激酶的mRNA ,抑制激酶的蛋白表达而达到抑制激酶活性的目的[7,8]。其中研究最多的是抑制激酶区激酶活性的小分子抑制剂,而本文也主要是针对这部分抑制剂的研究方法进行探讨。酪氨酸激酶的自磷酸化过程和催化下游信号分子磷酸化的过程都涉及到ATP 上磷酸基团的转移,这一反应过程是酪氨酸 3134··

酶活性及酪氨酸酶..

酶催化活性及其影响因素的研究 学院:化学与分子工程学院 班级:应用化学108班 姓名:王文移05 宁家彬06 指导老师:詹天荣

酶催化活性及影响其活性因素的研究 作者:王文移 宁家彬 [摘要]:酶广泛存在与生物体中,对生命的生化反应至关重要,本实验主要探 究不同浓度下催化活性的不同,以及温度,pH 值,抑制剂对于酶活性的影响。 [关键词]:酪氨酸酶,唾液淀粉酶,活性,pH ,温度,抑制剂 Enzyme is widespread and in living organisms, biochemical reactions vital to life, this experiment mainly explore different catalytic activity of different concentrations, as well as temperature, pH value, effect of inhibitor for the enzyme activity. [引言] 认识生物体中酶的存在和催化作用,了解生物体系中在酶存在下的合成或分解与普通的有机合成的不同和相同之处,认识一些生物化学过程的特殊性,是当今对酶的研究不可或缺的话题。通过本次实验能够掌握生物活性物质的提取和保存方法,学会使用仪器分析手段研究催化反应特别是生物化学体系中催化过程的基本思想和方法。 酪氨酸酶是一种氧化还原酶,它广泛存在于动植物和微生物中。土豆的提取液中含有酪氨酸酶。人唾液中的淀粉酶为a-淀粉酶,在唾液腺细胞内合成。酶的活性会受到很多因素的影响,如温度、PH 值、底物浓度以及激活剂抑制剂的影响。本实验目的在于测定各个因素对于酶活性的影响。 1.实验原理 本实验采用唾液淀粉酶及酪氨酸酶来进行反应,主要观察淀粉与试剂的反应颜色,多巴的吸光度。 本实验从土豆中提取酪氨酸酶,并测定其催化活性。当土豆、苹果、香焦等的受损面接触空气后会产生深棕色的现象是人们都见过的,这是这类物质含有酪氨酸和酪氨酸酶,酶存在于物质内部,当暴露在空气中后,在氧气的参与下,会发生一系列反应。以下是主要的反应过程。 由于多巴转变成多巴红的反应速率较快,再转到下一步产物速率则慢得多,故可选择多巴转变为多巴红的反应速率的测定来判断催化反应的活性。因多巴红具有特殊的颜色,故可用分光光度法测定,在不同的时刻测定某特定波长下的吸光度,用吸光度对时间作图,从所得的直线斜率求酶的活性。 酶的活性计算方法:一般定义在优化的条件下(包括pH 值、离子强度、温度等),25℃时在1min 内转化1mol 底物所需要催化剂的量为活性单位。通过 下式可计算酶的活性:610??=ktV A a ,式中,a 为所用溶液的酶的活性,A ?为

酪氨酸激酶小分子抑制剂及其抗瘤作用研究进展

酪氨酸激酶小分子抑制剂抗瘤作用研究进展 小分子抑制剂作为生命科学领域和干细胞研究、药物研究等诸多领域的有效研究工具,其作用越来越被人们认可。现在介绍对抗肿瘤的络氨酸激酶小分子抑制剂的相关研究进展。 与肿瘤相关的酪氨酸激酶主要有位于细胞膜的受体酪氨酸激酶和位于胞浆的非受体酪氨酸激酶,酪氨酸激酶的过度激活与肿瘤发生、发展、预后与转归密切相关。其过度激活,导致其下游信号途径的激活,最终导致细胞的转化、增殖和抵抗细胞凋亡、促进细胞生存。因此,现在科研人员努力致力于酪氨酸激酶抑制剂尤其是从特异性酪氨酸激酶抑制剂角度来研究新的抗肿瘤药物,并且已取得了巨大的突破,如针对Bcr-Abl的Gleevec、针对EGFR 受体酪氨酸激酶Iressa,已被美国FDA批准分别用于慢性粒细胞性白血病和晚期非小细胞肺癌的治疗,效果显著。另外还有许多小分子抑制剂正在临床试验中,有些在HER2/neu和VEGFR受体酪氨酸激酶小分子抑制剂方面进行的一些研究,也取得一些有意义的结果。(在附件中我们已经为您整理出来相关的信息) 不断的反复的实验才能得到需要的结果,陶素生化现可提供诸多不同信号通路的抑制剂、调节剂以及小分子化合物,并附客户评价、产品相关参考文献、技术支持等助力您的实验研究,且保证产品的高纯度和高活性,交货及时并附带完整的谱图信息。 陶素生化能够提供的118种酪氨酸激酶抑制剂的独特集合,可用于高通量筛选和高内涵筛选 ? 通过前期临床研究和临床实验,生物活性和安全性得到验证 ? 其中一些抑制剂已经得到FDA批准 ? 作用于酪氨酸激酶,如EGFR,VEGFR,SRC,c-Met和JAK ? 结构多样,药效显著,可渗透细胞 ? 具有充分详细的结构说明,IC50值,及客户反馈资料 ? NMR和HPLC技术保证产品高纯度 酪氨酸激酶过度激活,从而导致其下游信号的激活,这在肿瘤的发生、发展、转移、治疗和转归等中起着重要的作用。因此,针对其信号转导途径寻找新的抗肿瘤药物具有重要意义。目前,针对Bcr-Abl的STI571、EGFR的ZD1839已被美国FDA批准在临床应用,分别用于治疗慢性粒细胞性白血病和非小细胞肺癌。从而使得科学工作者对研究针对肿瘤特异性癌基因的药物研究更具信心,并已有许多药物在临床试验阶段,如针对VEGFR的SU666,PTK787等。从目前的各方面收集的科研结果来看,这些抑制剂可能还不能将肿瘤完成治愈,但这些抑制剂与常规化疗相结合,会明显地提高肿瘤的治疗效果。以受体酪氨酸激酶信号通路为靶点的抗肿瘤药物,通常只有在该信号通路发生异常的肿瘤细胞上才能取得较好的疗效。但在肿瘤的治疗过程中,仅仅抑制了某些发生异常的信号转导,则其他一些信号通路仍可能会产生代偿而上调,从而影响治疗效果。因此,抑制信号转导的抗肿瘤治疗还应联合其他作用途径的药物以取得更好的疗效。无论如何,这些针对肿瘤特异性基因改变的药物是消除肿瘤而又无系统毒性的希望。 关键词:酪氨酸激酶;抗肿瘤药物;信号通路;小分子抑制剂库 下面整理了络氨酸酶小分子抑制剂的药物研发最热门靶点相关信息供您参考 2000年后肿瘤信号网络被逐渐阐释、完善,大量的分子靶向药物进入临床研究、走上市场,近年针对受体酪氨酸激酶靶点如Bcr-Abl(见1.1)、VEGF/VEGFRs(见1.2)、PDGF/PDGFRs(见1.3)、EGFR/HER2(见1.4)、ALk(见1.5)已有多个药物上市,me-too品种的研发逐渐放缓,但扩展适应症、克服耐药性、优化治疗方案的研究还没有结束。 1.1.Bcr-Abl抑制剂

酪氨酸酶活性抑制实验方案报告

酪氨酸酶活性抑制实验方案报告 1.1 材料: 酪氨酸酶(或用马铃薯制备)、L-酪氨酸、熊果苷、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠 恒温仪、紫外分光光度计、离心机。 1.2 试剂配制 1)磷酸钠缓冲液(1/15 mol/L,pH=6.8) 精确称取1.000 g磷酸二氢钠,1.186 g磷酸氢二钠,加入少量去离子水溶解后,定容至500 mL,4℃冰箱保存备用。 2)L-酪氨酸溶液(7.5 mmol/L) 精确称取L_酪氨酸0.272 g,先加入数滴浓盐酸,加去离子水约50 mL,微热完全溶解后,用氢氧化钠溶液调pH至7左右,加去离子水定容至200mL。 3)受试液 精确称取受试样品0.1g,分别溶于20 mL去离子水,得到5 mg/mL的待测液,再对倍稀释到2.5 mg/mL、1.25 mg/mL、0.625 mg/mL、0.3125 mg/mL。 4)阳性对照(+CK) 精确称取0.1 g熊果苷粉末,溶于20mL的去离子水中,得到5 mg/mL的阳性对照母液,再对倍稀释到2.5 mg/mL、1.25 mg/mL、0.625 mg/mL、0.3125 mg/mL。

5) 酪氨酸酶液的制备 以新鲜完好的马铃薯制取酪氨酸酶液。具体操作为:将马铃薯洗净,于4℃预冷4h左右。去皮,切成约1.0 cm3丁状,于-20℃冷冻过夜。称重,按1: 1( W:V )的比例加入4℃ 预冷的磷酸钠缓冲液,用组织捣碎机制成匀浆,3层纱布过滤,滤液于4000 r/min离心10 min,上清液即为所得的酪氨酸酶粗酶液,4℃保存,2 h内用完。 1.3 检测方法 总反应体系为5mL。具体设计见表l。 在此体系中,受试液,包括阳性对照熊果苷的终浓度(mg/mL)梯度为 0.03l25、0.062 5、0.125,0.25、0.5。 实验时,向试管中依次加入磷酸盐缓冲液、不同浓度梯度的受试液(包括阳性对照)、酶液,于30℃水浴10 min。然后加入底物L-酪氨酸,立即开始计时。测定反应20 min时475 nm波长下的吸光值。测定时,以相应的阴性对照为参比,用下列公式计算受试液(包括阳性对照)对酪氨酸酶的抑制率,并依据浓度一酶抑制率曲线估计半数抑制浓度(IC50)的近似值。 抑制率=[(A-B)/A]×l00% 其中,“A”为标准对照的吸光值,“B”为受试液(或阳性对照)的吸光值。每个实验做3个平行。抑制率高表明其对酪氨酸酶活性的抑制强度高。 表1 5mL试验体系设计

酪氨酸酶抑制率测定方法

1. 4念珠藻甲醇提取物对酪氨酸酶活性的抑制 1. 4. 1念珠藻甲醇提取物对酪氨酸酶活力的影响 提取物对酪氨酸酶的抑制参照Masuda和Kubo的方 法[ 6, 7] , 并略作修改。待测样品用DMSO 进行浓度 梯度稀释, 浓度分别为1、05、025、0125 mg / mL; 换算成反应体系中的终浓度分别为333、1665、8325、4 3 g /mL。反应在96孔细胞板上 进行, 每组8孔, 分别是: A. 不含样品, 但含酪氨酸 酶的阴性对照, 3孔重复; B. 不含样品及酪氨酸酶的 空白对照, 1孔; C. 包含样品及酪氨酸酶, 3孔重复, D. 含样品但不含酪氨酸酶的空白对照, 1 孔。A 孔 中加入190 L pH 68、0 1 mo l/L 磷酸缓冲液, 10 L 1380 U /mL酪氨酸酶; B 孔中加入200 L 相 同的磷酸缓冲液; C 孔中加入180 L磷酸缓冲液, 10 L 1380 U /mL酪氨酸酶, 10 L样品; D 孔中加 入190 L磷酸缓冲液, 10 L样品。然后将细胞板 在30条件下放置5 m in, 再在每孔中加入100 L 2 5 mmo l/L L-酪氨酸( 见表1 )。在30反应 10m in后, 立即置于Tecan Sunrise 酶标仪中测量在475 nm下的吸光值。提取物对酪氨酸酶活性的抑 制按公式计算: 抑制率=( A - B ) - ( C- D)*100% A – B

参照文献方法〔3〕在数支干燥的试管中 各加入1.oml0.03%左旋多巴溶液,再加上维 生素E一日环糊精溶液,(加入量按表所列体积) 最后的磷酸钠缓冲液加至5.Oml,25℃恒温10 min后,加入0.4ml酶提取液,立即计时并迅速置于恒温槽内,待反应1min,用BaCRman DV一70型分光原度计在475nm处测定吸收度,以缓冲液为参比,然后根据多巴色素的消光系数“=3700求出Vi,把无维生素E一日环糊精溶液存在时速度定为100%,求出不同浓度维生 素E一日环糊精存在时酶的相对活性以及对酶的抑制率 抑制率二V。空白一V抑制V。空白x100%

酪氨酸酶活性抑制实验方法

酪氨酸酶活性抑制实验方法 一、试剂:酪氨酸酶、酪氨酸、磷酸二氢钠、磷酸氢二钠、阳性对照(熊果苷粉末)、样品、去离子水 二、试剂配制: 1、磷酸盐缓冲溶液(PH=6.8):先分别配制0.2M的磷酸二氢钠和0.2M的磷酸氢二钠。 0.2M磷酸二氢钠:称取 71.6g Na2HPO4-12H2O,溶于 1000ml 去离子水; 0.2M磷酸氢二钠:称取 31.2g NaH2PO4-2H2O,溶于1000ml 去离子水; 取51ML磷酸二氢钠+49ML磷酸氢二钠即得0.2M、PH=6.8的磷酸缓冲液。 2、L-酪氨酸溶液:称取L-酪氨酸25.6 g,用磷酸缓冲液定容于50mL容量瓶 中,即得L-酪氨酸溶液。 3、酪氨酸酶溶液:将马铃薯洗净,于4℃预冷4h左右。去皮,切成约1.0 cm3丁状,于-20℃冷冻过夜。称重,按1:1(W:V )的比例加入4℃预冷的磷酸钠缓冲液,用组织捣碎机制成匀浆,3层纱布过滤,滤液于4000 r/min离心10min,上清液即为所得的酪氨酸酶粗酶液,4℃保存,2h内用完。 4、受试液的配制:将原先所配5mg/ml的溶液用甲醇稀释到1mg/ml.。 5、阳性对照:取熊果苷粉末0.01g,溶于10ml的甲醇溶液,即得1mg/ml的 对照品溶液。 三、实验方法: 依下表所示向试管中依次加入磷酸盐缓冲溶液、样品溶液、酪氨酸溶液,于35℃水浴10分钟。然后加入酪氨酸酶液,混匀,再在35 ℃下孵育30min,迅速转移至比色皿中,在475nm处测定吸光值。

受试组用空白对照组1调零,阴性对照组用空白对照组2调零,阳性对照组用空白对照组3调零。 受试组吸光值为A1,阴性对照组吸光值为A2,阳性对照组吸光值为A3。 抑制率=1-[(A1-A2)/(A3-A2)]×100%=(A3-A1)/(A3-A2)×100% 注:受试液组共四种样品

酪氨酸激酶抑制剂在抗肿瘤治疗中的应用

第24卷第2期菏泽医学专科学校学报VOL.24NO.2 2012年JOURNAL OF HEZE MEDICAL COLLEGE2012 oi:10.3969/j.issn.1008-4118.2012.02.41 酪氨酸激酶抑制剂在抗肿瘤治疗中的应用 刘聪,纪晓 (莒南县人民医院,山东莒南276600) 关键词:酪氨酸激酶抑制;分子靶向;药物疗法 中图分类号:R730.54文献标识码:A文章编号:1008-4118(2012)02-0072-02 酪氨酸激酶抑制剂以肿瘤细胞生长因子为靶点,有针对性的阻断这些因子的信号转导通路,从而达到抑制肿瘤生长、转移的目的,已在胃肠间质瘤、慢性粒细胞性白血病(CML)、乳腺癌、非小细胞肺癌(NSCLC)等治疗中显示出高效、低毒等特点[1]。本文旨在对近年来应用较频繁且疗效确切的酪氨酸激酶抑制剂从理论到临床应用综述如下。 蛋白酪氨酸激酶(protein tyrosine kinase,PTK)是一类催化ATP上γ-磷酸转移到蛋白酪氨酸残基上的激酶,能催化多种底物蛋白质酪氨酸残基磷酸化,在细胞生长、增殖、分化中具有重要作用。酪氨酸激酶抑制剂,抑制细胞内与靶点相关联的酪氨酸激酶的磷酸化作用,从而阻止靶点功能。常见的有生长因子受体酪氨酸激酶抑制剂、Bcr-Abl酪氨酸激酶抑制剂。 1生长因子受体 表皮生长因子受体(EGFR),是一种糖蛋白的跨膜受体,也称HER,共四个,分别叫HER-1、HER-2、HER-3、HER-4、一旦特异性配体(EGF)结合上去,就能通过相应的酪氨酸激酶的自身磷酸化作用而激活受体,从而激发了细胞内的信号转导连锁反应使DNA合成、细胞生长和存活。EGFR在相当一部分肿瘤中都有不同程度表达,其中HER-2为人类表皮生长因子受体,其过度表达见于20%~30%乳腺癌[2],还可见于卵巢癌、肺腺癌[3]、胰腺癌、胃癌[4]、大肠癌。其他如血管内皮生长因子(VEGF)、血小板源性生长因子(PDGF)等。 2Bcr-Abl染色体 慢性粒细胞白血病患者95%左右均有第9号染色体ab1和22号染色体bcr长臂的异位,被称之为Ph1染色体。两种染色体的基因重组在一起,产生融合蛋白p-210,定位于细胞膜,为具有较高酪氨酸激酶活性的致癌蛋白,从而刺激白细胞增值,导致白血病的形成,而这一改变早于血液和骨髓的改变。所以Ph1染色体已经是慢性粒细胞白血病诊断和治疗的重要指标[5]。 3主要几种酪氨酸激酶抑制剂 1)伊马替尼是酪氨酸激酶抑制剂,靶向治疗最成功的范例,还可抑制血小板衍化生长因子(PDGF)和干细胞因子(SCF)受体的酪氨酸激酶,用于CML的慢性期、进展期、急变期。慢性期疗效优于进展期及急变期[6]。另外用于表达c-kit阳性的晚期、转移性胃肠间质瘤(GIST)[7]。2)吉非替尼Gefinib-易瑞沙-IR-ESSA-为强有力EGFR酪氨酸激酶抑制剂,用于晚期NSCLC一线或铂类失败后二、三线治疗,疗效确切[8]。本品在女性、亚洲、非吸烟、腺癌及肺泡癌患者中由于EGFR基因突变较多,因此疗效也较好[9]。本品联合化疗,优势明显[10]。3)埃罗(厄洛)替尼erlotinib-特罗凯-TARCEVA-(HER1/EGFR)受体酪氨酸激酶抑制剂,在EGFR阳性和不吸烟的患者中疗效明显。用于局部晚期或转移的非小细胞肺癌的二、三线治疗[11],同时治疗吉非替尼失败后晚期非小细胞肺癌[12],和吉西他滨健择联合作为晚期胰腺癌一线治疗标准方案[13]。4)索拉非尼-多吉美-Nexevar具有双重抗肿瘤作用:一方面通过抑制RAF/MEK/ERK信号传导通路直接抑制肿瘤生长,另一方面通过抑制VEGF和PDGF受体而阻断肿瘤新生血管的形成,间接抑制肿瘤细胞生长。用于治疗晚期肾细胞癌、晚期肝癌可获益[14]。5)舒尼替尼Sunitinib-sutent-多靶点酪氨酸激酶抑制剂,抑制VEGF-R1,-R2,-R3及血小板衍生生长因子(PDGFR-β)、KIT、FLT-3和RET的酪氨酸激酶活性,通过特异性阻断这些信号PDGFR、VEGF 传导途径达到抗肿瘤效应。用于肾细胞癌,与干扰素相比能显著提高PFS(11>6月)及OS[15]。用于格列卫治疗失败的GIST,能显著延长PFS(27.3>6.4周) [16]。6)拉帕替尼(Lapatinib)-Tykerb是一种能同时抑制EGFR(ErbB-1)和HER-2(ErbB-2)酪氨酸激酶活性的小分子酶抑制剂。Lapatinib可同时作用于 72

酪氨酸酶活性抑制实验方案

酪氨酸酶活性抑制实验方案 1.1 材料: 酪氨酸酶(或用马铃薯制备)、L-酪氨酸、熊果苷、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠 恒温仪、紫外分光光度计、离心机。 1.2 试剂配制 1)磷酸钠缓冲液(1/15 mol/L,pH=6.8) 精确称取1.000 g磷酸二氢钠,1.186 g磷酸氢二钠,加入少量去离子水溶解后,定容至500 mL,4℃冰箱保存备用。 2)L-酪氨酸溶液(7.5 mmol/L) 精确称取L_酪氨酸0.272 g,先加入数滴浓盐酸,加去离子水约50 mL,微热完全溶解后,用氢氧化钠溶液调pH至7左右,加去离子水定容至200mL。 3)受试液 精确称取受试样品0.1g,分别溶于20 mL去离子水,得到5 mg/mL的待测液,再对倍稀释到2.5 mg/mL、1.25 mg/mL、0.625 mg/mL、0.3125 mg/mL。 4)阳性对照(+CK) 精确称取0.1 g熊果苷粉末,溶于20mL的去离子水中,得到5 mg/mL的阳性对照母液,再对倍稀释到2.5 mg/mL、1.25 mg/mL、0.625 mg/mL、0.3125 mg/mL。 5) 酪氨酸酶液的制备 以新鲜完好的马铃薯制取酪氨酸酶液。具体操作为:将马铃薯洗净,于4℃预冷4h左右。去皮,切成约1.0 cm3丁状,于-20℃冷冻过夜。称重,按1:1( W:V )的比例加入4℃预冷的磷酸钠缓冲液,用组织捣碎机制成匀浆,3层纱布过滤,滤液于4000 r/min离心10 min,上清液即为所得的酪氨酸酶粗酶液,4℃保存,2 h内用完。 1.3 检测方法 总反应体系为5mL。具体设计见表l。 在此体系中,受试液,包括阳性对照熊果苷的终浓度(mg/mL)梯度为0.03l25、0.062 5、0.125,0.25、0.5。 实验时,向试管中依次加入磷酸盐缓冲液、不同浓度梯度的受试液(包括阳性对照)、酶液,于30℃水浴10 min。然后加入底物L-酪氨酸,立即开始计时。测定反应20 min时475 nm 波长下的吸光值。测定时,以相应的阴性对照为参比,用下列公式计算受试液(包括阳性对

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