丙氨瑞林降低人卵巢癌CoC1_cDDP细胞线粒体膜电位并诱导其凋亡的研究

?论著?基础研究·

丙氨瑞林降低人卵巢癌CoC1/cDDP细胞线粒体膜电位

并诱导其凋亡的研究*

江苏省南通大学附属医院(南通226001)

仲建新　曹新平　王　迪　张　弘　丁润生　姜胜华　江　枫　黄　华　姚　微　史锦云

摘　要　目的:研究丙氨瑞林降低人卵巢癌CoC1/cDDP细胞线粒体膜电位( m)与诱导其凋亡的关系。方法:用不同浓度的丙氨瑞林与Co C1/cDDP细胞一起培养48h,并设对照组。

经瑞士-姬姆萨染色进行细胞凋亡形态学观察;流式细胞仪检测亚G1期细胞、Annex in V+/PI-细胞的百分率及线粒体膜电位( m)的变化;半定量RT-PCR法检测作用前后CoC1/cDDP细胞Caspase-3mRNA的表达。结果:Co C1/cDDP细胞经丙氨瑞林作用后亚G1期细胞及Annex in V+/PI-细胞的百分率较对照组明显升高(P<0.01),并且出现明显的凋亡细胞形态的改变,而线粒体膜电位( m)降低的细胞数百分率显著增加(P<0.01),两者间呈正相关关系(r=0.

950,r=0.924,P<0.05);Caspase-3m RNA的表达较对照组明显增强(P<0.01),并且与亚G1期细胞、Annex in V+/PI-细胞及 m降低的细胞数均呈正相关关系(r=0.909,r=0.897,r=

0.909,P<0.05);并且上述变化均与丙氨瑞林的剂量有关(P<0.01)。结论:丙氨瑞林可通过降

低人卵巢癌CoC1/cDDP细胞线粒体膜电位( m),从而诱导其凋亡。

主题词　线粒体　膜电位　细胞凋亡　@丙氨瑞林　@CoC1/cDDP细胞　@Caspase-3mRNA

Alarelin decreased the cell mitochondrial membrane potential and

induced CoC1/cDDP Cell apoptosis

Affiliated Hospital o f Nantong University(Nanto ng226001)

Zhong Jianx in　Cao Xinping　Wang Di　et al

ABSTRACT　objective:T o st udy t he r elatio nship betw een Co C1/cD DP Cell a po pt osis,w hich w ere induced by A larelin and t he cell mito cho ndr ial m em br ane pot ent ial( m).M etho ds:T he different co ncentr ations o f A larelin wer e used t o trea t Co C1/cDD P Cell,blank was used as contr ol in exper iment.T he mor opholog ic chang e of Co C1/cD DP cells w as o bser ved by W r ight staining.T he sub-G1、Annex in V+/PI-cell co ntent and the cell mitochondrial membra ne potentia l( m)stained w ith R h123wer e analy zed by flo w cy tom etry(F CM).T he ex pressio n of Ca spase-3mRN A w as measured by semi-quantitat ive RT-PCR.R esults: Aft er tr eated by A lar elin CoC1/cDDP cell a ppeared the classical apo pt otic mo r pho lo gy,the percentag es o f sub-G1a nd Annex in V+/PI-cells wer e incr eased(P<0.01);the per cent ages of Rh123-cells wer e incr eased(P<0.

01),a nd had a po sitiv e co rr ela tio n w ith the sub-G1and A nnex in V+/P I-cells(r=0.950r=0.924,P<0.05);

the Caspase-3mRN A expr ession w as incr eased and had a positive cor relation with t he apopto tic rat e(r=0.909, r=0.897,P<0.05)and Rh123-cells(r=0.909,P<0.05);these var io usness wer e in a do se-dependent manner.Co nclusion T he anti-tumo r effects o f A lar elin on Co C1/cDDP Cells ar e r elated to decr easing the m and then inducing the apo ptosis o f the Co C1/cD DP Cells.

KEY WORDS　M itochondria　M em br ane po tentials　A poptosis　@Alar elin　@CoC1/cDDP　@Ca spase-3mRN A

*南通市科学技术局社会发展指导性计划 虽然促性腺激素释放激素类似物(GnRHa)已应用于激素依赖性肿瘤如乳腺癌、卵巢癌、前列腺癌及子

宫内膜癌等的治疗,但其生物学机制仍不明了。细胞凋亡已成为研究抗癌药物对肿瘤治疗作用的非常重要的一项措施。本实验利用人卵巢浆液性腺癌耐药的细胞亚株CoC1/cDDP,研究丙氨瑞林诱导CoC1/cDDP细胞凋亡与线粒体膜电位的关系,为丙氨瑞林抗癌作用提供实验依据。

材料与方法

1　卵巢癌耐药细胞系　人卵巢癌顺铂耐药细胞株CoC1/DDP购自中国典型培养物保藏中心,耐药株在实验前无药培养2周后使用,接种于含10%胎牛血清的RPM I1640培养体系中,在37℃、体积分数为5%的CO2、饱和湿度培养箱中培养,2～3d细胞传代一次。取处于对数生长期的细胞用于实验。

2　药品与试剂　丙氨瑞林为安徽丰源药业股份有限公司产品;罗单明123(Rhodam ine123,Rh123)及碘化丙啶(PI)均为Sigm a公司产品;RPM I1640培养液为Hyclo ne公司产品;胎牛血清为Gibco公司产品; Tr izol为上海华舜生物工程有限公司产品;Annex in V-FIT C细胞凋亡检测试剂盒、Ro bus TIRT-PCR试剂盒均为晶美生物工程有限公司产品。

3　细胞培养和药物处理　取对数生长期的细胞,接种各瓶,培养24h后,将丙氨瑞林分组加入,终浓度为10-7mol/L及10-5mol/L各一组;并设一空白对照组(不加药组)。继续培养48h,离心、PBS洗涤收集细胞,待用。

4　流式细胞仪检测　取各组细胞置离心管加PBS洗涤2次,1000rpm离心10min,去上清,吸干后,加入70%冷乙醇2m l固定于EP管中,-20℃保存,测定前将标本用PBS洗涤2次,1000rpm,离心5m in,加入浓度为0.01%的RN A酶37℃消化30min,再加入100g/ml碘化丙啶(PI)100l,避光孵育30min,300目尼龙网过滤后流式细胞仪检测,CellQuest软件获取10000个细胞,M odFit软件分析计算亚G1期细胞。

Annexin V FIT C标记,流式细胞仪检测细胞早期凋亡:取各组细胞离心,去上清;加PBS调整细胞浓度为5×105/ml,取200l,离心,去上清;加入195l缓冲液(buffer)及5l FIT C-A nnex in-V,避光孵育10m in,离心去上清;加100l buffer洗涤细胞一次,离心,去上清;加入buffer190l及PI10l,避光避光孵育10m in,上机检测Annex inV+/PI-细胞百分率。细胞膜不对称丧失导致磷脂酰丝氨酸(PS)外翻是细胞凋亡的早期事件,AnnexinV可以特征性与PS结合,而被用来检测暴露在细胞表面的PS,PS外翻也可以发生在细胞坏死过程中,两者差别是在凋亡初期细胞膜是完好的,而在细胞坏死的早期阶段,细胞膜的完整性就被破坏了,用碘化丙啶(PI)可以区分膜的完整性。在双变量散点图上,可见三群细胞,即活细胞群(Annexin V-/PI-)、凋亡细胞群(Annex in V+/PI-)、和死细胞群(Annexin V+/PI+)。

细胞线立体膜电位( m)检测:收集各组细胞1×106,PBS洗2次;细胞重悬于500k Rh123(10l/ m l)中,37℃水浴30m in;PBS洗2次,重悬于500l PBS 之中;流式细胞仪检测Rh123-细胞数。Rh123是亲脂阴离子染料,细胞内的摄取量与线粒体膜电位呈正相关,经Rh123染色后,流式细胞仪分析,以Rh123荧光强度做横坐标,在散点图上可见两群细胞,右半象限Rh123+的细胞为线粒体膜电位正常的细胞,左半象限Rh123-的细胞为线粒体膜电位降低的细胞。

5　RT-PCR检测细胞株Caspase-3mRNA表达　采用T rizol一步法抽提总RNA,按说明书操作,并于紫外分光光度计上检测其吸光度A260及A260/ A280比值,以测定提取总RNA量及检定RNA的纯度良好。基因引物序列采用Primer5软件设计,!-actin上游序列:5’-AAGT ACTCCGTGTGGATCGG-3’,下游序列:5’-ATGCTAT CACCT CCCCT GT G-3’; Caspase-3上游序列:5’-GT CGAT GCAGCAAACCT CGG-3’,下游序列:5’-CCT GACACCGTAA CT CTG AC-3’。RT-PCR采用Robus TI RT-PCR试剂盒,按说明书操作。逆转录反应条件:56℃、45min逆转录合成cDNA。PCR反应条件:预变性94℃、3min;变性94℃30s,退火55℃30s,延伸72℃30s,循环40次;最后72℃延伸5m in,得到反应终产物;取10l扩增产物经用1.5%琼脂糖凝胶电泳,溴化乙锭染色,紫外线灯下观察,Caspase-3呈现出317bp条带,!-actin呈现出495bp 条带,与100bp ladder比较;并用凝胶图像分析仪分析,Caspase-3表达指数=Caspase-3值/!-actin值。实验重复3遍,取平均值。

6　细胞形态观察　取加丙氨瑞林(10-5mo l/L)培养48h的CoC1/cDDP细胞,离心、涂片、瑞士-姬姆萨染色,在光镜下观察细胞形态的改变。

7　统计学处理　实验数据以均数±标准差表示;数值统计均用SPSS11.0软件对数据进行方差分析、均数的t检验及相关分析。

结　果

1　流式细胞仪检测丙氨瑞林对CoC1/cDDP细胞凋亡作用的影响　见附表。经丙氨瑞林作用后的CoC1/cDDP细胞亚G1期细胞百分率明显高于对照组,并且与丙氨瑞林的浓度相关(P<0.05)。丙氨瑞林组的Annex inV+/PI-细胞百分率较对照组显著增加(P<0.01),并且随着丙氨瑞林浓度的增大而升高(P

<0.01)。这一结果与亚G1期细胞相类似。

附表　丙氨瑞林对CoC1/cDDP细胞增殖、细胞

周期及凋亡的影响

组别 对照组　

丙氨瑞林组

10-7mol/l10-5mol/l 亚G1 2.85±0.14　16.94±2.50*30.69±1.55** AnnexinV+/PI-4.04±1.16　20.05±1.95*35.12±2.95** Cas pas e-30.233±0.004　0.278±0.004*0.291±0.002**

m 3.13±0.21　20.19±2.78*33.02±2.16** *P<0.01(v s对照组)**P<0.05(vs对照组及10-7 mol/L组)

2　丙氨瑞林对CoC1/cDDP细胞表达Caspase-3 mRNA的影响　见附表。Caspase-3mRNA在丙氨瑞林作用后表达增强,加大丙氨瑞林的浓度,Caspase-3mRNA的表达进一步增强(P<0.01),并且与亚G1期(r=0.909,P<0.05)、Annexin V+/PI-(r=0. 897,P<0.05)呈正相关关系。

3　细胞形态学观察(瑞士-姬姆萨染色)　CoC1/cDDP细胞经10-5m ol/L的丙氨瑞林作用48h 后,离心沉渣涂片,瑞士-姬姆萨染色后,光学显微镜下观察发现细胞出现明显的凋亡细胞形态学改变:细胞胞体变小,胞膜皱缩和泡状突起及不规则凹陷,胞核染色质浓聚、固缩,聚集在核膜周边等。

4　丙氨瑞林对CoC1/cDDP细胞线立体膜电位( m)影响　见附表。研究发现未加丙氨瑞林的对照组中绝大部分细胞为Rh123+,经10-7mo l/l丙氨瑞林处理48h后,Rh123-的细胞数较对照组显著增加(P <0.01),增加丙氨瑞林浓度Rh123-的细胞数进一步减少,并且与Caspase-3m RNA表达(r=0.909,P<0.

05)、亚G1期(r=0.950,P<0.01)、A nnex in V+/ PI-(r=0.924,P<0.01)呈正相关关系。

讨　论

研究表明促性腺激素释放激素类似物(GnRHa)除通过抑制下丘脑-垂体-性腺轴而发挥抗肿瘤作用外,GnRHa还通过诱导卵巢癌细胞的凋亡,发挥抗肿瘤作用[1]。

本研究采用不同浓度的丙氨瑞林与Co C1/cDDP 细胞作用后,发现Annex in V+/P I-百分率随丙氨瑞林浓度增加而升高,并显著高于对照组;亚G1期细胞百分率也有类似的变化,呈明显的剂量效应关系。CoC1/ cDDP细胞经丙氨瑞林作用后,光学显微镜下细胞出现明显的细胞凋亡形态学改变:细胞胞体变小,胞膜皱缩和泡状突起及不规则凹陷,胞核染色质浓聚、固缩,聚集在核膜周边等。以上结果提示,丙氨瑞林可诱导CoC1/cDDP细胞凋亡,并且剂量越大作用越强。

随着细胞凋亡分子机制的研究不断深入,人们发现细胞凋亡信号通路主要有两条:即细胞凋亡的线粒体依赖途径和死亡受体途径。近年来细胞凋亡机制研究的一重大突破就是对线粒体重要性的认识,大量实验证实许多因素诱导的细胞凋亡都存在线粒体功能紊乱。已证实,线粒体膜上通透性转运孔(Per meability transition por e,PTP)开放是细胞凋亡的重要环节。正常情况下,PTP只允许相对分子量小于1500的分子通过,质子可自由通过线粒体膜,形成稳定的 m。细胞在致凋亡因子的作用下PT P开放, m降低或丧失,线粒体基质中释放出致凋亡的活性物质如细胞色素C等,这些物质进入胞质,可激活Caspase级联反应,最终导致细胞凋亡[2]。Rho damine123对线粒体膜电位很敏感,其荧光减弱说明线粒体膜电位发生去极化,细胞线粒体膜电位降低[3]。本研究显示,Co C1/ cDDP细胞经丙氨瑞林作用后, m下降(Rh123-)的细胞数显著增加,流式细胞仪直方图左移,随着丙氨瑞林浓度的增加, m下降(Rh123-)的细胞数进一步增加,并且与Annexin V+/P I-细胞、亚G1期细胞百分率呈正相关关系。这些结果表明丙氨瑞林诱导CoC1/cDDP细胞凋亡与 m下降有着密切关系。近年来陆续有报道说明线粒体膜电位的耗散早于核酸酶的激活,也早于磷酯酰丝氨酸暴露于细胞表面。而一旦线粒体膜电位耗散,细胞就会进入不可逆的凋亡过程[4]。线粒体膜电位改变在丙氨瑞林诱导CoC1/cDDP 细胞凋亡过程中起关键作用。

肿瘤细胞凋亡的信号转导过程中,线粒体在促进凋亡信号和Caspase激活之间起不可替代的作用[5]。有研究表明, m降低主要是由于线粒体膜通透性转运孔(Perm eability transition pore,PTP)的开放,线粒体基质中释放出致凋亡的活性物质,可激活Caspase 级联反应[2],其中Caspase-3作为关键的执行分子在凋亡信号传导的多种途径中发挥功能[6]。本研究发现CoC1/cDDP细胞经丙氨瑞林作用后Caspase-3mRNA 的表达较对照组明显增强,并且与亚G1期细胞、Annex in V+/PI-细胞及 m降低的细胞数均呈正相关关系。综上所述,丙氨瑞林通过降低线粒体膜电位,而线粒体膜电位的降低,表明线粒体膜通透性转运孔(PT P)的开放,从而释放Caspase的活化物,如细胞色素C、凋亡诱导因子(AIF)等,活化Caspase其中主要Caspase-3,引起细胞凋亡,因此,降低线粒体膜电位,活化Caspase-3可能是丙氨瑞林诱导CoC1/cDDP细胞凋亡的机制之一。

参考文献

(下转第662页)

调节亚单位,决定HIF-1的活性。在许多实体肿瘤的研究中,发现HIF-1呈高度表达[2],Wong等[3]对37例卵巢上皮癌患者癌组织及16例正常卵巢组织中的HIF-1?和VEGF基因表达水平进行分析,发现卵巢上皮癌组织中HIF-1?的表达水平较正常卵巢组织明显增高,而且还发现HIF-1?的表达水平与肿瘤分期呈正相关。本实验结果表明,用免疫组化检测H IF-1?蛋白表达水平,正常卵巢组织、卵巢浆液性囊腺瘤、卵巢交界性浆液性囊腺瘤及卵巢浆液性癌高表达率为分别为0、10%、44.4%和65.4%,呈上升趋势。可见HIF-Ia在卵巢肿瘤由良性向恶性转化发展过程中可能起着某种重要的作用。

目前与卵巢浆液性癌预后有关的确定因素包括临床分期、病理分级、组织类型、残留病灶大小和对化疗的敏感性,临床分期是卵巢浆液性癌的独立预后因子。Nakayama等[4]报道HIF-1?表达既与VEGF和M VD无关,也与卵巢癌患者的预后无关。在52例晚期卵巢癌中Hidekatsu等[5]检测HIF-1?蛋白的表达率为69.2%,HIF-1?表达与临床分期、病理分级及组织学类型无关,对术后铂类和紫素的联合化疗有较好的反应率。在本研究中,低分化、III期+IV期和腹水阳性HIF-1?蛋白高表达,而且HIF-1?蛋白高表达者的复发或转移率明显高于低表达者,说明肿瘤生长迅速往往导致组织的血液供应不足而发生缺氧坏死,诱导HIF-Ia蛋白的表达。但HIF-1?不是卵巢浆液性癌的独立预后因素。Kitada等[6]发现在胰腺癌组织中, HIF-Ia表达与细胞增殖相关。Ravi等[7]提出,人类肿瘤组织中HIF-Ia升高与肿瘤血管生成和肿瘤进展相关。抑制肿瘤HIF-Ia的表达可降低肿瘤组织中M VD,抑制肿瘤生长。

综上所述,HIF-1a表达水平在卵巢浆液性癌形成的早期阶段就有升高,并随着肿瘤的进展、病理分级和临床分期的增加、腹水的形成而明显升高,而且HIF-1a 蛋白是卵巢浆液性癌预后不良的因素之一。由于HIF-1a在肿瘤增殖和血管生成中的重要作用,以HIF-1a为靶点的治疗将为卵巢浆液性癌的治疗开辟一条新途径。

参考文献

[1]　Har ris A L.Hy po x ia-a key reg ulato ry factor in tumo ur

g ro w th.N at R ev Cancer,2002,2(2):38-47.

[2]　Zhong H,D e-M ar zo A M,L aug hner E,et al.

O ver ex pr ession o f hy po xia-inducible factor1alpha in

co mmon hum an cancers and t heir m etastases.Cancer

R es,1999,59(22):5830-5835.

[3]　Wo ng C,Wellman T L,L ounsbury KM.V EGF and

HIF-1alpha expr ession are increa sed in adv anced st ages

o f epit helia l ov ar ian cancer.Gy neco l O nco l,2003,91

(3):513-517.

[4]　N akay ama K,K anzaki A,Hata K,et al.Hypox ia-

inducible facto r1alpha(HIF-1alpha)gene ex pr ession in

human ov arian carcino ma.Cancer L ett,2002,176(2):

215-223.

[5]　Hidekatsu N,Y oh W,Haruhiko U,et al.Hy po x ia

inducible fact or1-?ex pression as a fact or predictive o f

efficacy of tax ane/platinum chemo ther apy in adv anced

pr imar y epithelial ov ar ian cancer.Cancer L ett,2007,

251(1):164-167.

[6]　K it ada T,Seki S,Sakaguchi H,et al.

Clinicopatho lo gical sig nificance o f hy pox ia inducible

facto r-1alpha ex pr ession in hum an pancr eatic

car cinoma.Histopatho lo gy,2003,43(6):550-555. [7]　Rav i R,M o okerjee B,Bhujw alla Z M,et al.Reg ulation

o f tumo r angiog enesis by p53-induced deg ra dation o f

hy po xia-inducible facto r1alpha.G ene Dev,2000,14(1):

34-44.

(收稿:2007-09-03)

(上接第650页)

[1]　K im K Y,Choi KC,Par k SH,et al.T ype II

go nado tr opin-r eleasing ho rmo ne stimulates p38

mito gen-act iva ted pro tein kinase and apopto sis in

ov arian cancer cells.J Clin Endocr inol M etab,2004,

89(6):3020-6.

[2]　Jia P,Chen G,Huang X,et al.A rsenic triox ide induced

multiple my elo ma cell a po pt osis v ia disruptio n of

mito chondr ial tr ansmembrane pot ent ial and activ atio n

of caspase-3.Chin M ed J(Engl),2001,114:19-24 [3]　L i XY,W ang G Q,Ge HL,et al.Isolation of a g ene

r elated to tricho santhin-induced a po pt osis(G RET A).

Shi Yan Sheng W u X ue Bao,2000,33(1):81-84. [4]　Zamzami N,Hir sch T,Dallapor ta B,et al.

M ito cho ndr ial implication in accidental and

pr og rammed cell death:apo pto sis a nd necr osis.J

Bio ener g etics&Biomem br anes,1997,29:185-193.

[5]　张晓晖,姚天明,黄　高,等.细胞凋亡的最新研究进

展.第四军医大学学报,2002,23(Suppl):42-44.

[6]　Z hivo tov sky B.Caspases:t he enzymes o f deat h.

Essays Bio chem,2003,39:25-40.

(收稿:2007-10-09)

细胞凋亡的信号通路

山东农业大学学报(自然科学版),2015,46(4):514-518VOL.46N0.42015 Journal of Shandong Agricultural University(Natural Science Edition)doi:10.3969/j.issn.1000-2324.2015.04.007 细胞凋亡的信号通路 谢昆,李兴权 红河学院生命科学与技术学院,云南蒙自661199 摘要:细胞凋亡是细胞程序性死亡的一种方式，与自噬和坏死有明显的区别。细胞凋亡的信号途径比较复杂，在凋亡诱导因子的刺激下经历不同的信号途径。本文就细胞凋亡的三条信号通路——线粒体途径、内质网途径和死亡受体途径做一综述，以便为人们进一步了解细胞凋亡发生的机制，从而对癌症及其他一些相关疾病的治疗奠定基础。关键词:细胞凋亡;信号通路;线粒体途径;内质网途径;死亡受体途径 中图法分类号:R329.2+8文献标识码:A文章编号:1000-2324(2015)04-0514-05 The Signal Pathway of Apoptosis XIE Kun,LI Xing-quan Department of Life Science and Technology/Honghe University,Mengzi661199,China Abstract:Apoptosis is a process of programmed cell death which distinguishes from autophagy and necrosis.The signal pathways of apoptosis are complex and different under apoptosis induced factor stimulating.Three kinds of signal pathways of apoptosis including Mitochondrial pathway,Endoplasmic Reticulum pathway and Death Receptor pathway were summarized in this review in order to make people further comprehend the mechanism of apoptosis，so that it should make a basis for us all to treat cancer and other related diseases. Keywords:Apoptosis;signal pathway;Mitochondrial pathway;Endoplasmic Reticulum pathway;Death Receptor pathway 细胞凋亡是细胞程序性死亡（Program cell death，PCD）中特有的一种细胞死亡方式，是细胞在一系列内源性基因调控下发生的自然或生理性死亡过程。Kerr等1972年最早提出了凋亡（apoptosis）和坏死（necrosis）的概念[1]，随后Paweletz等对其进行了详细的描述[2,3]。在形态学上，凋亡表现为核浓缩、细胞质密度增高、染色质凝聚、核膜破裂、核内DNA断裂、细胞集聚成团、形成凋亡小体(Apoptosome)等特征，这些凋亡小体最终被巨噬细胞清除，但不会引起周围细胞的炎症反应，另外，凋亡发生在单个细胞之间[4,5]。坏死，通常是由相邻的多个细胞之间发生细胞肿胀，细胞核溶解，细胞膜破裂，细胞质流入到细胞间质中，并伴发一系列的炎症反应，从而与凋亡表现为本质性区别[6,7]。 目前认为，凋亡发生的途径分为三种。第一种是线粒体途径，也称为内源性途径，该途径包括两类，第一类需要通过激活Caspase通路促进凋亡，在一序列凋亡诱导因素刺激下，线粒体中的Cyt C（细胞色素C）释放至细胞质中，从而与Apaf-1(Apoptosis protease activating factor1，凋亡蛋白酶活化因子1)结合形成多聚体，形成的多聚体再进一步与凋亡起始分子Caspase-9结合形成凋亡小体，凋亡小体激活Caspase-9，从而激活下游的凋亡执行分子Caspase-3，Caspase-6和Caspase-7等诱导细胞凋亡的级联反应；第二类是不依赖于Caspase途径的，通过线粒体释放AIF（Apoptosis induce factor，凋亡诱导因子）直接诱导凋亡的发生。但是在细胞内，直接检测AIF比较困难，而且AIF的变化不一定能代表凋亡发生的程度，因为引起凋亡发生的途径不一。第二种是死亡受体途径（也称为外源性途径），经由死亡受体（如TNF，Fas等）与FADD的结合而激活Caspase-8和caspase-10，进一步激活凋亡执行者caspase-3,6,7，从而促进凋亡的发生；第三条途径是内质网途径，内质网应激（蛋白质错误折叠或未折叠、内质网胁迫）会导致细胞内钙超载或钙离子稳态失衡一方面激活caspase-12，caspase-12进一步激活caspase-9而促进凋亡的发生，另一方面诱导Bcl-2(B细胞淋巴瘤蛋白)家族中促凋亡蛋白Bax和Bak的激活诱导凋亡[8]。 1凋亡的线粒体途径 在哺乳动物中，由于凋亡的激活需要线粒体中细胞色素C（CytC）的释放，因此CytC由线粒体膜间隙释放到细胞质中的多少可以作为判断凋亡发生强弱的指标之一。有研究认为，CytC的释放是通过Bcl-2家族调控线粒体膜透化（Mitochondrial outer membrane permeabilization，MOMP），科学 收稿日期:2013-03-07修回日期:2014-09-11 基金项目:云南省科技厅应用基础研究面上项目(2010ZC151) 作者简介:谢昆(1975-),男,云南富民人,博士研究生,研究方向为动物生物化学与分子生物学.E-mail:xk_biology2@https://www.sodocs.net/doc/119547351.html, 数字优先出版:2015-06-03https://www.sodocs.net/doc/119547351.html,

线粒体与细胞凋亡

万方数据

万方数据

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线粒体与细胞凋亡 作者：周艺群， 谷志远， ZHOU Yi-qun， GU Zhi-yuan 作者单位：浙江大学医学院附属口腔医院口腔颌面外科,浙江,杭州,310006 刊名： 解剖科学进展 英文刊名：PROGRESS OF ANATOMICAL SCIENCES 年，卷(期)：2006,12(1) 被引用次数：14次 参考文献(17条) 1.樊廷俊;夏兰;韩贻仁线粒体与细胞凋亡[期刊论文]-生物化学与生物物理学报 2001(01) 2.赵云罡;徐建兴线粒体,活性氧和细胞凋亡[期刊论文]-生物化学与生物物理进展 2001(02) 3.蔡循;陈国强;陈竺线粒体跨膜电位与细胞凋亡[期刊论文]-生物化学与生物物理进展 2001(01) 4.Hortelano S;Dallaporte B;Zamzami N Nitric oxide induces apoptosis via triggering mitochondrial permeability transition[外文期刊] 1997(2-3) 5.Marchetti P;Hirsch T;Zamzami N Mitochondrial permeability transition triggers lymphocyte apoptosis 1996(11) 6.Marchetti P;Castodo M;Susin SA Mitochondrial permeability transition is a central coordinating event of apoptosis[外文期刊] 1996(03) 7.Susin SA;Zamzami N;Castedo M Bcl-2 inhibits the mitochondrial release of an apoptogenic protease [外文期刊] 1996(04) 8.Chou JJ;Li H;Salvesen GS Solution structure of BID,an intracellular amplifier of apoptotic signaling[外文期刊] 1999 9.Ji HB;Zhai QW;Liu XY Transcription regulation of bcl-2gene 2000(02) 10.Tsujimoto Y;Shimizu S Bcl-2 family:Life or death switch 2000(01) 11.Zamzami N;Susin SA;Marchetti P Mitochondrial control of nuclear apoptosis 1996(04) 12.Ruth MK;Ella BW;Douglas RG The release of cytochrome c from apoptosis[外文期刊] 1997(5303) 13.Narita M;Shimizu S;ItoT Bax interacts with the permeability transition pore to induce permeability transition and cytochrome c release in isolated mitochondrial 1998(25) 14.Cosulich SC;Savory PJ;Clarke PR Bcl-2 regulates amplification of caspase activation by cytochrome C[外文期刊] 1999(03) 15.Bossy-Wetzel E;Green DR Caspases induce cytochrome C release from mitochondria by activating cytosolic factors[外文期刊] 1999(25) 16.Sutton VR;Davis JE;Cancilla M Initiation of apoptosis by granzyme B requires direct cleavage of bid,but not direct granzyme B-mediated caspase activation[外文期刊] 2000(10) 17.Stoka V;Turk B;Schendel SL Lysosomal protease pathways to apoptosis.Cleavage of bid,not pro-caspases,is the most likely route[外文期刊] 2001(05) 本文读者也读过(10条) 1.杨胜细胞凋亡机制简述[期刊论文]-科技信息（学术版）2007(26) 2.冯俊奇.李秀兰.白人骁.FENG Jun-qi.LI Xiu-lan.BAI Ren-xiao细胞凋亡机制研究进展[期刊论文]-国际生物医学工程杂志2006,29(1)

卵巢癌

卵巢癌 卵巢癌是卵巢肿瘤的一种恶性肿瘤，是指生长在卵巢上的恶性肿瘤，其中90%～95%为卵巢原发性的癌，另外5%～10%为其它部位原发的癌转移到卵巢。由于卵巢癌早期缺少症状，即使有症状也不特异，筛查的作用又有限，因此早期诊断比较困难，就诊时60%～70%已为晚期，而晚期病例又疗效不佳。因此，虽然卵巢癌的发病率低于宫颈癌和子宫内膜癌居妇科恶性肿瘤的第三位，但死亡率却超过宫颈癌及子宫内膜癌之和，高居妇科癌症首位，是严重威胁妇女健康的最大疾患。 组织学分类 卵巢由于组织学的特点，其癌的组织学类型之多居全身各器官首位。根据世界卫生组织（WHO）制定的国际统一分类法，卵巢肿瘤主要的组织学类型如下： 上皮来源的肿瘤 来源于卵巢的生发上皮，具体类型包括浆液性瘤、粘液性瘤、子宫内膜样瘤、透明细胞瘤、纤维上皮瘤(又称勃勒纳瘤)、混合型上皮瘤等。这些肿瘤既有良性，也有交界恶性和恶性 生殖细胞来源的肿瘤 来源于卵巢的生殖细胞。主要类型有畸胎瘤、无性细胞瘤、胚胎性癌、内胚窦瘤、绒毛膜癌、混合性生殖细胞瘤。其中畸胎瘤有良性的成熟性畸胎瘤及恶性的末成熟畸胎瘤，另外还有比较少见的单胚性和高度特异性畸胎瘤，包括卵巢甲状腺瘤和卵巢类癌。良性的成熟性畸胎瘤可发生癌变。这些肿瘤中除了成熟性畸胎瘤及甲状腺瘤外，其它肿瘤虽然也称为瘤，但实际上都是恶性肿瘤即癌。 特异性性索间质来源的肿瘤 来源于卵巢的特异性性索间质，包括颗粒细胞瘤、卵泡膜细胞瘤、纤维瘤、卵巢睾九母细胞瘤、两性母细胞瘤等。一般情况下，卵泡膜细胞瘤和纤维瘤为良性肿瘤，其它为低度恶性肿瘤。 转移性肿瘤 来源于原发在其它器官的恶性肿瘤，常见的包括消化道和妇科其它器官。 发病原因 如同大多数癌症一样，卵巢癌的发病原因并不明确。经研究及流行病学调查，一般认为卵巢癌的发生可能与下列高危因素有关。 持续排卵 持续排卵使卵巢表面上皮不断损伤与修复, 可能导致卵巢癌的发生。流行病学调查发现卵巢癌危险因素有未产、不孕,而多次妊娠哺乳和口服避孕药有保护作用。应用促排卵药物可增加发生卵巢肿瘤的危险性。 环境及其他因素 流行病学证据表明, 工业的各种物理或化学产物可能与卵巢癌的发病相关。卵巢癌的发病是否与饮食习惯或成分(胆固醇含量高)相关,目前还无定论。 遗传因素 上皮性卵巢癌的发生与遗传因素有密切的关系。5%~10%的卵巢上皮癌具有遗传异常。上皮性卵巢癌的发生与三个遗传性癌综合征有关,即遗传性乳腺癌-卵巢癌综合征(HBOC),遗传性位点特异性卵巢癌综合征(HSSOC),和遗传性非

TRAIL诱导Hela细胞凋亡的线粒体信号通路

2011年10月第31卷第10期 基础医学与临床Basic ＆Clinical Medicine October 2011Vol．31No．10 收稿日期：2010－11－02 修回日期：2011－03－16 基金项目：扬州环境资源职业技术学院基金（07001） * 通信作者（corresponding author ）：yejilin126yejilin@126．com 文章编号：1001-6325（2011）10-1120-04 研究论文 TRAIL 诱导Hela 细胞凋亡的线粒体信号通路 叶记林1*，刘永春2，于有江1，刘延庆 3 （1.扬州环境资源职业技术学院医学系，江苏扬州225127；2.江苏省苏北人民医院，江苏扬州225000； 3.扬州大学医学院，江苏扬州225001） 摘要：目的探讨TRAIL 诱导人宫颈癌Hela 细胞凋亡的线粒体通路。方法琼脂糖凝胶电泳判断细胞凋亡；激光共 聚焦、Western blot 、荧光免疫和caspase-3活性检测测定细胞线粒体膜电位（MMP ）、BCL-2蛋白、细胞色素c （Cyt c ）和凋亡诱导因子（AIF ）蛋白在细胞中的定位以及caspase-3活性。结果TRAIL 能诱导Hela 细胞凋亡，有凋亡细胞特有的DNA 梯状条带。同时， TRAIL 具有时间依赖性致MMP （P ＜0.05，P ＜0.01）减小和BCL-2蛋白含量明显下降，线粒体Cyt c 蛋白释放，AIF 蛋白向细胞质、细胞核转移，caspase-3活性增强（作用10h 后达到2.25?0.20倍，P ＜0.05）。结论TRAIL 诱导Hela 细胞凋亡途径之一是通过线粒体信号通路进行的。 关键词：TRAIL ；Hela 细胞；细胞凋亡；线粒体 中图分类号：R 737.33 文献标志码：A TRAIL induced apoptosis in Hela cells by mitochondrial signal pathway YE Ji-lin 1*，LIU Yong-chun 2，YU You-jiang 1，LIU Yan-qing 3 （1.Medical Science Department ，Yangzhou Vocational College of Environment and Resources ，Yangzhou 225127；2.Subei People's Hospital of Jiangsu Province ，Yangzhou 225000；3.Medical Academy ，Yangzhou University ，Yangzhou 225001，China ） Abstract ：Objective To explore the mitochondrial pathway in the apoptosis of Hela cells induced by TRAIL． Methods Apoptotic cells were detected by DNA electrophoresis．The mitochondria membrane potential （MMP ）， the expressions of BCL-2，the location of Cyt c and AIF ，the caspase-3activity were tested by confocal laser mi-croscopy ，western blot ，immunofluorescence and caspase-3activity assay．Results TRAIL can induce apoptosis in Hela cells．DNA ladders were showed on agarose gel electrophoresis．At the same time ，TRAIL induced the de-crease of MMP （P ＜0.05，P ＜0.01）and BCL-2，the release of Cyt c ，the translocation of mitochondrial AIF to cytoplasm and nuclei ，the increase of caspase-3activity （the activity increased to 2.25?0.20fold in 10h treated cells ，P ＜0.05）in the time-dependent manner．Conclusions TRAIL induce the apoptosis of Hela cells through involves mitochondrial signal pathway． Key words ：TRAIL ；hela cel1s ；apoptosis ；mitochondria 肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体（tumor necro-sis factor related apoptosis inducing ligand ，TRAIL ）是 肿瘤坏死因子配体超家族中的一个新成员。它能够选择性地诱导肿瘤细胞凋亡而对正常细胞无毒性作

胸腔积液的细胞学检查进展(一)

胸腔积液的细胞学检查进展(一) 积液是临床常见症状之一。正确鉴别积液的性质对疾病的诊治预后有重要意义。随着实验室诊断技术的提高，近年来胸腔积液的检测在细胞形态学、细胞染色体及免疫细胞化学等方面都有着较大的进展，为临床提供了更可靠的依据。本文对此作一简要综述。 一、沉渣涂片瑞吉氏染色瑞吉氏染色能清楚地显示细胞浆成份和细胞核染色质结构，易于良恶性细胞的判别。 1.恶性细胞见到典型恶性瘤细胞即可确诊为恶性胸液。王东钢〔1〕报道该法瘤细胞检出率38.8％。若用脑脊液细胞玻片离心沉淀器收集细胞，由于细胞收集高达80.4％，故敏感性大大提高，阳性预测值达93.5％。李亚红〔2〕报道积液送检量增至250ml，取新鲜下层积液离心涂片染色，瘤细胞首次检出率为83.3％，三次以上送检检出率达100％。我们通过对胸液标本（5～10ml）两次离心浓集细胞涂片瑞吉氏染色，先低倍镜扫描全片，遇有可疑细胞时再转油镜鉴定细胞性质，恶性细胞检出率达78％，特异性为94.3％〔3〕。 2.血细胞粘附肿瘤细胞花环〔3〕在含恶性肿瘤细胞的胸腹水或心包积液的涂片中，将≥3个白细胞（淋巴、粒细胞、巨噬细胞）或红细胞粘附于瘤细胞胞浆边缘周围，形成花环样，称之为血细胞粘附肿瘤细胞花环。我室在查见恶性细胞的179例胸腹水涂片中，79例查见血细胞粘附肿瘤细胞花环，每份涂片约5～6cm2，平均花环数9.6±5.7个。追踪随访，有16例在首次查见血细胞粘附肿瘤细胞花环后的15～51天内病故。由此可见，血细胞粘附肿瘤细胞花环的出现可能提示部分肿瘤的恶性发展〔4〕。 3.免疫岛巨噬细胞与周围已转化和未转化的淋巴细胞的堆积团称为免疫岛。免疫岛可能是由于肿瘤抗原及病原微生物刺激机体免疫反应所致。在120例患者的胸腹液涂片中发现52例（43.3％）患者的胸腹液中存在免疫岛。结核和肿瘤患者，占77％。14例结核性胸腹液中11例查见免疫岛，每份涂片面积（2.0cm×2.5cm），平均免疫岛数59.6±12.8个；60例恶性胸腹液中29例查见免疫岛，每份涂片面积同上，平均免疫岛数39.2±18.9个〔3、5〕。 4.其他胸腹液涂片瑞吉氏染色镜检还可见到分叶核细胞包裹杆菌现象〔3〕，提示细菌或结核杆菌感染；化脓性炎症所致胸水的中性粒细胞明显升高，并可见分叶核细胞噬菌现象；在并发真菌感染的胸水涂片中可见噬真菌细胞或分叶核细胞包裹真菌。若同时做抗酸染色、革兰氏染色及培养可进一步鉴定病原。 二、沉渣涂片细胞化学染色王应〔6〕等对胸水中的瘤细胞进行多种化学染色，结果显示瘤细胞的过氧化物酶染色（POX）、苏丹黑B染色（SB）均呈阴性；而糖原染色（PAS）、碱性磷酸酶染色（ALP）、特异性脂酶染色（ASD-CE）、非特异性脂酶染色（α-NAE）、酸性磷酸酶染色（ACP）等呈不同程度的阳性反应。 三、荧光染色用吖啶橙荧光染色，由于肿瘤细胞增生旺盛，细胞浆及核仁内有大量的RNA，染色后呈桔红或火焰色荧光；细胞核中有大量的DNA则呈黄绿色荧光。该法检测恶性胸水阳性率达78.3％，假阳性率14.3％〔7〕。 四、核仁组成区嗜银蛋白染色（AgNOR）陈丽珠〔8〕等用Croker染色方法对150例胸腹水中的良恶性细胞进行分析，结果表明：良性组中的淋巴细胞、间皮细胞及非典型增生间皮细胞的AgNOR核颗粒均数都小于1.98个／细胞核，且87％的颗粒为规则小圆形，三种细胞间也无明显差异（P＞0.05）。恶性组中瘤细胞AgNOR颗粒都超过4.98个／细胞核，82％以上的颗粒为不规则型及弥散型分布，与良性组比较有显著差异（P＜0.05)小莉〔9〕等以类似方法分析60例恶性胸腹水细胞和70例良性胸腹水细胞，前者细胞AgNOR颗粒数平均为每核4.35±2.18个，后者平均为1.80±0.79个，若以良性组AgNOR颗粒均值加一个标准差（即2.59）为判断良恶性的阈值，对恶性胸腹水诊断的敏感性为75％，特异性为86.5％。我室浆膜腔积液涂片的AgNOR颗粒分布形态分为四种：核仁型、核仁内型、聚集型及弥散型。AgNOR颗粒数，恶性细胞16.7±3.8个／核、异型间皮细胞6.9±3.5个／核、巨噬细胞2.1±0.8

(完整word版)胸腹水常规检查

胸腹水检查 正常胸腔与腹腔内都存在少量液体,起润滑作用.如胸腔液<200ML,腹腔液<50ML,在病理情况下液体大量潴留于胸,腹腔就形成胸腹水. 一般分漏出液与渗出液,漏出液是通过毛细血管滤出积聚于组织间的非炎症性组织液.常见于引起毛细管流体静压升高,血浆胶体渗透压降低,淋巴回流受阻,钠水潴留等的疾症.渗出液多是炎症积液,由于微生物的毒素,缺氧,炎性介质的作用使血管内皮细胞受损,血管通透性增高以致液体与大分子物质外渗形成积液.浆膜腔液检查的目的在于鉴别积液的性质,及找出引起积液的原因.腹腔积液的主要原因有肝硬化,肿瘤,结核性腹膜炎.胸腔积液有结核性胸膜炎.恶性肿瘤等. 一、标本要求: 1.常规检查要留二管,一管不抗凝,一管抗凝,抗凝剂可用EDTA-2K 2.要及时送检防止细胞变性 二、理学检查： 1.外观 颜色一般是淡黄色 (1)红色: 穿刺损伤,出血性疾病,内脏损伤.肿瘤,结核等. (2)白色: 胸导管阻塞/破裂,化脓性感染 (3)绿色: 绿脓杆菌感染 (4)黑色: 曲霉菌感染 (5)棕色: 阿米巴脓肿破溃进入胸腹腔 (6)黄色: 各种原因的黄疸 透明度清亮或微浊 2.凝固性正常胸腹水不自凝,漏出液一般不易凝固或出现凝块,渗出液因含较 多纤维蛋白原,凝血活酶可产生凝块.粘稠样积液多见于恶性间皮瘤,含碎屑样物积液多见于类风湿性病. 3.比重漏出液一般少于1.018,渗出液大于1.018.标本量多时可用比重计法, 量少不测. 三化学检查 1. 李凡他(粘蛋白定性试验)当浆膜上皮细胞发生炎症时,其分泌的粘蛋白增加,这种粘蛋白是一种酸性糖蛋白,在弱酸性环境下会产生白色沉淀. 操作: 取一干燥试管加1%冰醋酸4ML左右,滴1—2滴标本在黑色背景下观察.注意若为血性标本应离心后取上清液做. 阴性: 晰不显雾状 +/-: 黑色背景下见白色雾状沉淀 +:白雾状 ++ :白色薄云雾状

生精细胞凋亡及其可能的信号通路.doc

生精细胞凋亡及其相关内容 细胞凋亡又叫程序性细胞死亡,是细胞在一系列内源性基因的调控下发生的自然或生理性死亡的过程。细胞凋亡过程是受基因的精确调控而完成的,其具体的过程机制尚不明确,Bcl-2 是一种细胞膜蛋白,主要存在于线粒体膜、滑面内质网和核膜上,高水平的Bcl-2 蛋白有抑制细胞死亡等作用,是细胞凋亡调控机制中的一个关键蛋白。Tanaka等证实Bcl-2 能抑制睾丸生精细胞的凋亡和分化。CytC 是一个线粒体起源的细胞凋亡信号,Bcl-2可通过抑制CytC从线粒体的释放入细胞质,而Bax、Bak可与Bcl-2结合,止其对CytC释放孔道的抑制作用,从而促进CytC从线粒体释放,引起凋亡。CytC通过接头分子使caspase（胱冬肽酶）分子募集并相互酶解活化,进而诱导细胞凋亡。caspase-3是介导细胞凋亡的关键效应酶,是凋亡执行的重要效应分子。正常情况下,caspase-3以酶原的形式存在于细胞质中,无活性,当细胞接受凋亡刺激时,其被激活,而诱导凋亡。caspase-3是多种凋亡刺激信号传递的汇聚点,它的活化是细胞凋亡进入不可逆阶段的标志。 检测生精细胞凋亡的技术 4．1 形态学检测 透射电镜检测：处死大鼠,取出睾丸。取出左侧睾丸少量组织,迅速在冰浴上切成1mm×1mm×2mm小块,置于预冷的2%戊二醛溶液中固定,标本经锇酸固定、脱水、树脂包埋、超薄切片和醋酸双氧铀染色后,在透射电镜下观察。可见细胞质空泡化,核膜增厚,核周隙增宽；染色质浓缩,附着于核边缘呈新月形；严重者染色质固缩、断裂, 出现凋亡小体。 4．2 琼脂糖凝胶电泳 通过观察DNA梯状电泳带或定量检测DNA片段,可测定凋亡。凋亡细胞DNA 在核小体连接处规律性降解,形成以180 bp一200 bp为最小单位的寡聚体片段,琼脂糖凝胶电泳时呈典型的“梯状带”。但Singh等琼脂糖凝胶电泳检测到青年人生精细胞DNA迁移呈圆形,老年人凋亡生精细胞DNA迁移呈彗星状。 4．3 DNA缺口原位标记法 处死大鼠,取出睾丸。置于10%中性福尔马林溶液中固定24ｈ,常规石蜡包埋、切片（4μm）,用于原位末端标记法（TUNEL）检测。主要以精原细胞凋亡为主。可见曲细精小管中各级生精细胞大量凋亡,管腔变薄,管腔中可见大量凋亡的分裂晚期的精子细胞。DNA缺口原位标记(TUNEL)法可用于检测凋亡细胞。此方法是将细胞的外源性核苷酸(dUTP)结合到单股断链的3′粘性未端上,标记的DNA 再用荧光或显色法检出。该法可检测早期细胞凋亡,特异性和敏感性都很高。E renpreisa等用甲苯胺蓝(tolui di ne blue,TB)、吖啶橙(acridine orange,A0)和TUNEL法检测人生精细胞DNA的完整性,证实这3种方法具有一致性。 4．4 流式细胞术 流式细胞(flow cytometry, FCM)可进DNA 、RNA含量分析,细胞周期、细胞表面标志和细胞受体分析。凋亡细胞的DNA裂解,FCM的DNA图上呈亚二倍体核型峰特点。应用DNA 染色剂穿透正常和凋亡细胞膜的能力,及其与凋亡细胞DNA 结合能力不同以区分正常细胞、凋亡细胞。FCM 还可定量检测凋亡标记蛋白的表达。吞噬凋亡细胞和未吞噬凋亡细胞的巨噬细胞群可利用带有荧光染料反应物的FCM 区分。 4．5 免疫组化法 利用抗原抗体特异性结合测定凋亡相关物质以检测凋亡。凋亡蛋白抗体或抗单链DNA 抗体标记观察凋亡细胞可检测凋亡标记蛋白Fas／FasL、Bc1-2／Bax、p53、p2l、caspases等以鉴定细胞凋亡。 死亡受体途径 Fas/FasL系统：现已有多种证据表明Fas/FasL信号系统启动生精细胞的凋亡：①在混合培养的支持细胞和生精细胞中加入FasL的反义核苷酸(阻断FasL的翻译), 能明显观察到生精细胞凋亡数目的减少；②Fas和Fas L的mRNA表达量随动物年龄的不同而不同。大鼠在16~ 33 d最多, 此时刚好是大鼠生精细胞凋亡的高峰期；③加入模拟FasL效用的Fas激动剂Jo-2(一种抗Fas的抗体), 生精细胞的数目大大减少；④在环境内分泌干扰物邻苯二甲酸-2-乙基已基酯(DEHP)的代谢产物邻苯二甲酸-单-乙基已基酯(MEHP)等一些有害化合物引起的睾丸损伤中, 随着生精细胞凋亡数目的增多, Fas和FasL的表达量也相应提高并逐渐达到峰值。 Bcl一2 家族成员引发的线粒体途径 在细胞凋亡中, 死亡信号通过Bcl-2 家族或直接诱导线粒体膜通透性增加, 释放细胞色素c ( Cyt c) , 激活半胱氨酸蛋白酶, 继而使细胞发生凋亡。 Bcl-2 家族的凋亡前体成员,一组BH3亚蛋白家族引发线粒体途径。胞外因素促使这些蛋白与另一组Bcl-2家族的凋亡前体成员——Bcl-2相关X蛋白(Bcl-2-associated x protein,Bax)亚蛋白家族结合。Bax为可溶性蛋白,存在于生精细胞质,受诱导向细胞核移动,定位于核旁聚合的线粒体外膜,以诱导生精细胞凋亡。Olderid 等在凋亡生精细胞中检测剑p53、p21、Bcl-2 和Bax的表达。Zhang等恒河猴隐睾症模型检测凋亡生精细胞,检测出Bax 转移剑细胞核附近及Bcl-2 表达增加,反映Bc1-2、Bax参与生精细胞凋亡。Bc1-2 和Bax的相互作用使Bax 聚合并横跨线粒体内外膜。 Bax的变化使原位于线粒体内膜caspases活化蛋白、Cyt—C从线粒体内移入胞质。释放的Cyt-C与胞质凋亡蛋白酶激活因子—1(apoptotic protease activating factor-1,Apaf-1)结合并诱导Apaf-1聚合,聚合Apaf-1 募集并活化procaspase-9。第二个caspases的线粒体激活因子(second mitochon—dria—derived activator of caspases,Smac) 同时从线粒体进入胞质, S ma c与APaf-1结合并促进procaspase一9活化。Caspase一9募集并活procaspase-3,最终引发生精细胞凋亡。 Procaspase-3活化引发Bcl一2作用促死亡蛋白(Bc1-2-interacting death agonist,Bid)裂解,Bid为Bcl-2连接蛋白,可诱导Cyt— C从线粒体释放,从而与Bcl一2／Bax途径相联系。Yu等观察到大鼠凋亡生精细胞内存在Bc1-2／Bax及Fas／FasL,显示这2条途径有相关性。 Bcl-2基因是线粒体途径的初始信号 Bcl- 2基因(B细胞淋巴瘤/白血病-2基因)是人B淋巴细胞的染色体易位激活的原癌基因, 该基因编码一种细胞质膜蛋白, 能够抑制细胞的程序性死亡。 Bcl-2原癌基因存在于多种动物的许多正常组织内, 对凋亡具有抑制作用。它不能促进细胞增殖,但能延长细胞的生命期限。Bcl -2蛋白之间常常以同源二聚体形式存在。用免疫组化法检测正常人体睾丸内Bcl-2蛋白表达时发现,精子细胞呈现中度到高度染色阳性(2+～4+) ,而精原细胞、初、次级精母细胞、支持细胞及间质细胞绝大多数染色呈阴性。Bcl-2蛋白主要分布在生精细胞线粒体,可能通过阻止细胞内Ca2 +的流动,干扰过氧化物的产生和脂膜的过氧化而抑制细胞凋亡。Ba x则可能通过插入线粒体膜, 引起细胞色素C (Cyt C )释放入细胞质而诱导生精细胞的凋亡。无细胞系统实验发现,外源性Bcl-2防止Cyt c释放与线粒体效用有关。在其他死亡信号不存在时, Bax 异位表达可以触发Cyt c的释放。Bax直接加入分离的线粒体环境中, 可以诱导Cyt c释放。但这种效应可被临近细胞Bcl-xl过表达或通过直接加入重组的Bcl-xl 而阻断。但是, caspase抑制剂虽不影响Cyt c的释放, 但却可以有效地阻断caspase激活和延缓细胞凋亡。 通过研究基因敲除和转基因小鼠发现：Bcl- 2基因家族在精子发生中有重要作用, Bax过量表达可诱导细胞凋亡, Bcl- 2过量表达可抑制细胞凋亡, Bax敲除小鼠不能产生成熟精子, 曲细精管中有大量不正常精原细胞的累积, 最终导致不育；Bcl-2和Bcl-Xs表达水平高的小鼠精子发生不正常时同样可引起不育。还有人对鸡睾丸的发育过程进行了研究。结果发现,在鸡胚胎期的睾丸中几乎检测不到Bca- XL, 而在未成熟和成熟的睾丸中均可检测到。由于在成熟睾丸中处于减数分裂及减数分裂后的细胞占大多数, 因此说明Bcl-2和Bcl- XL在鸡精原细胞减数分裂及减数分裂后细胞凋亡过程中的调节作用有所不同。 细胞色素C /Cyt— C是线粒体途径的关键节点 生精细胞DNA 受损引起p53表达,p53诱导Bax产生,引发Cyt C释放入胞质,进而发生caspases级联反应。在细胞凋亡中, 死亡信号通过Bcl-2家族或直接诱导线粒体膜通透性增加, 释放细胞色素c (Cyt c) , 激活半胱氨酸蛋白酶, 继而使细胞发生凋亡。CytC是一个线粒体起源的细胞凋亡信号,Bcl-2可通过抑制CytC从线粒体的释放入细胞质, 而Bax、Bak可与Bcl-2结合,阻止其CytC 释放孔道的抑制作用,从而促进CytC 从线粒体释放,引起凋亡。CytC通过接头分子使caspase（胱冬肽酶）分子募集并相互酶解活化,进而诱导细胞凋亡。 Caspase-3 是线粒体途径的最终执行者 caspase-3 是介导细胞凋亡的关键效应酶,是凋亡执行的重要效应分子。正常情况下,caspase-3 以酶原的形式存在于细胞质中,无活性,当细胞接受凋亡刺激时,其被激活,而诱导凋亡。caspase-3 是多种凋亡刺激信号传递的汇聚点,它的活化是细胞凋亡进入不可逆阶段的标志。 天冬氨酸特异性的半胱氨酸蛋白酶(cysteinylaspartate- specific protease,Caspase)是执行细胞凋亡的蛋白酶家族,通过各种不同信号传导途径激活后降解或失活某些关键的细胞蛋白,并与凋亡的形态学特征密切相关。Caspase-3酶原能够被caspase- 8、- 9、- 10以及颗粒酶B所激活,是细胞凋亡的主要执行者。有证据表明,细胞凋亡的某些特征性标志,如染色体凝聚和DNA 片断化等均与caspase- 3 有直接关系。Caspase介导的细胞凋亡信号传导通路上,线粒体通路和死亡受体通路的交汇点也在caspase-3。Caspase-3对睾丸各级生精细胞凋亡的作用：潘连军等对睾丸静脉曲张大鼠各级生精细胞进行免疫组化检测,发现正常精原细胞及精母细胞胞质中均有少量caspase- 3表

卵巢癌晚期大量腹水怎么办

卵巢癌对于人们并不陌生，是临床高发的妇科肿瘤疾病，腹水就是卵巢癌晚期病人常见的并发症之一，很多病人以为当出现大量腹水时，患者的生命也将随之终结，从而轻易地放弃治疗，放弃生命。那么，卵巢癌晚期出现大量腹水，真的只能等死吗？ 卵巢癌晚期大量腹水怎么办？郑州希福中医肿瘤医院的袁希福教授指出，卵巢癌发展到晚期，由于病情的恶化，或前期的治疗方法不当，会导致患者出现多种并发症，这些并发症的出现，不仅会给患者带去痛苦折磨，还会增加治疗难度，降低晚期的存活率。 然而，出现腹水之类的并发症，并不意味着无法治疗，选择科学合理的办法，仍然是可以减轻痛苦，延长生命的。卵巢癌发展到晚期，可有不同程度的腹水形成，少量腹水使患者有腹胀感，进食后明显；随着病情发展腹水不断增多，大量腹水可使膈肌抬高从而影响心肺功能，出现心悸、呼吸因难等症。因此，患者如果出现腹水，需要及时治疗。 那么，治疗措施都有哪些呢？ 临床上，如果腹水过于多，患者首先可以进行腹腔穿刺手术抽放腹水，通过手术来达到控制腹水增加的效果。但是手术治疗，具有治标不治本的弊端，患者在术后的一段时间内，容易反复。因此，建议患者进行标本兼治的中医治疗。俗话说，事实胜于雄辩，我们通过一位卵巢癌晚期患者，真实的治疗病例具体了解一下： 王凤枝，卵巢腺癌和并腹腔转移，女，68岁，新乡市人。2011年7月检查确诊为卵巢腺癌合并腹腔转移。后开始进行化疗治疗，于8月15日找到袁希福教授就诊，到诊时腹部膨隆长大，纳少等症状明显，袁希福教授遂以“三联平衡疗法”为原则进行中药治疗。8月26日，腹胀较前减轻，腹水减少，9月16日，纳食好转，腹水基本消退。由于减轻了患者痛苦，延长了患者生命，家属对其治疗效果非常满意！ 临床上，在众多的中医药疗法中，很多患者首选汲取中医药精华的“三联平衡疗法”。 该疗法是由出身于中医药世家的袁希福教授创立，具有不手术、不放化疗、不住院、无痛苦、无风险、无毒副反应，花费少等特点。在治疗过程中，采用天然中草药，从病人整体入手，对待病人辩证施治，通过对病人机体内环境的调节，有效实现减轻痛苦，提供生活质量，延长生命的效果。 以上就是对“卵巢癌晚期大量腹水怎么办？”的详细介绍，希望对卵巢内癌患者有所帮助。当卵巢癌发展到晚期，出现大量腹水等诸多并发症时，患者切勿以为无法治疗，就轻易地放弃生命，树立积极乐观的心态，选择科学合理的治疗方法，能够有效地减轻患者痛苦，延长患者存活期。

线粒体与细胞凋亡

线粒体与细胞凋亡 苑金香(潍坊学院生物系山东潍坊261043) 摘要 细胞凋亡是一种由基因控制的自主性死亡过程。近年来研究发现,线粒体在细胞凋亡过程中起重要作用,它可以通过改变膜通透性、释放凋亡活性物质等介导细胞凋亡。 关键词 线粒体 细胞凋亡 线粒体作为真核细胞能量代谢中心已为人熟知,然而近年来的研究发现,线粒体在细胞的另一重要生理活动 细胞凋亡中还扮演着重要角色。细胞凋亡即细胞程序性死亡(programmed cell death),是一种由基因编程调控的细胞主动自杀过程,细胞凋亡在胚胎发育、机体内环境的稳定、细菌和病毒感染细胞的清除过程中起重要作用,许多疾病的发生与细胞凋亡失控有关,而线粒体在细胞凋亡过程中起着重要作用。 1 线粒体膜的通透性改变与细胞凋亡 线粒体起着启动细胞凋亡的重要作用,其主要机制与线粒体渗透性转换孔(mitochondrial permeability transi tion pore,mtPTP)开放有关,mtPTP位于线粒体内膜和外膜的交界处,是一种由多种蛋白组成的复合体。mtPTP参与调节线粒体基质中的Ca2+、pH值电荷等,维持线粒体内环境的稳定性,保持氧化还原通路的畅通。mtPTP平时允许不大于0.15 104的小分子物质通过。当线粒体内Ca2+超载、自由基对线粒体膜造成氧化损伤,或者是能量产生下降时,均可引起mtPTP开放。在细胞凋亡发生早期,线粒体膜mtPTP打开,线粒体内膜电位( m)降低,一方面使得线粒体内的死亡促进因子(deathe-promoting factor,DPF)释放出来,促进凋亡的进行;另一方面,又使得细胞质进入线粒体基质,由此引起膜质子的转运异常,导致线粒体处于高渗状态,线粒体基质扩张,细胞骨架蛋白受压,直接导致细胞凋亡。 2 线粒体释放物与细胞凋亡 研究发现,线粒体内含有许多促死亡因子,包括细胞色素C,凋亡诱导因子(apoptosis-inducing factor,AIF),胱冬酶原及其他线粒体蛋白等。这些因子从线粒体中释放出来以后,以不同的方式参与到细胞凋亡的过程,影响细胞凋亡的进程。 2.1 细胞色素C的释放与细胞凋亡 1996年德克萨斯西南医学院研究中心王晓东研究小组发现细胞色素C参与细胞凋亡的过程。当细胞受凋亡信号刺激后,细胞色素C能迅速从线粒体释放到胞浆中,在细胞色素C含量丰富的细胞中,细胞将进入快速凋亡机制,释放出来的细胞色素C参与激活凋亡的酶通路,细胞内仍有许多未释放的细胞色素C,它们维持电子传递和有氧呼吸,从而产生足够的ATP,为细胞凋亡提供足够的能量。而在细胞色素C含量较少的细胞中,由于细胞色素C的大量释放,使电子传递链受阻,ATP产量骤减,无法提供足够的能量,因而使细胞走向与凋亡完全不同的坏死过程。 72h,凋亡细胞数从6.65%增加到16.42%;若处理96h 后,凋亡细胞数从4.71%增加到21.94%,这说明染料木黄酮可诱导前裂腺癌细胞的凋亡,通过这种办法可预防前列腺癌的发生。 另外,许多不同种类的化学物质(如亚硝胺类、杂环胺类、多环氮氢化物和糖醛核呋喃等)、外界微生物的侵袭、高温和放射线等化学的、物理的和生物的因素是影响癌细胞的生长和凋亡的外源性调节因素。还有一些常规使用的肿瘤化疗药物(如顺铂、维甲酸、羟基脲等)和 射线都可诱导多种肿瘤细胞凋亡。 4 结论 在正常机体内,细胞增殖和细胞凋亡处于一种动态平衡。故癌的发生和细胞的生与死密切相关。一方面,细胞的过度增殖导致了癌的发生,一些化学预防剂抑制癌发生的一个重要机制就是抑制细胞增殖;另一方面,细胞凋亡过程的失调也是癌发生的另一原因。研究细胞凋亡与癌发生的关系,进而诱导细胞凋亡对癌的预防具有重要的意义。 参考文献 1 Davis JN et al.Nutr Cancer,1998,32:123 131. 2 Li M et al.Cancer Epidemiol Biom Prev,2000,9(6):545 550. 3 方福德等.分子生物学前沿技术.北京医科大学、中国协 和医科大学联合出版社,1998,76 174. 4 贾旭东.细胞增殖和细胞凋亡和癌的发生和预防.国外 医学卫生学分册,2001,28(2):65 68. (B H) 17 2003年第38卷第5期 生 物 学 通 报

细胞凋亡的途径

按照起始caspase的不同，可将哺乳细胞的凋亡分为三种基本的途径。 一种称为外在途径（extrinsic pathway），由细胞表面的死亡受体如Fas和肿瘤坏死因 子受体家族（tumour necrosis factor receptor，TNF-R）引发; 另一种称为内在途径（intrinsic pathway）或线粒体途径（mitochondrial pathway），由许多应激条件、化学治疗试剂和药物所起始（Nicholson, 1999；Denault和Salvesen，2003）; 第三种途径是内质网应激所导致的caspase-12的活化，从而导致凋亡。 细胞凋亡的途径 摘要细胞凋亡是机体维持自身稳定的一种基本生理机制，是有许多基因产物及细胞因子参与的一种有序的细胞自我消亡形式。通过细胞凋亡，机体可消除损伤、衰老与突变的细胞来维持自身的稳态平衡和各种器官及系统的正常功能。由于细胞凋亡是一种复杂的生理及病理现象，所以在其发生的3个阶段中涉及不同的信号转导途径及其调控。 关键词细胞凋亡线粒体内质网caspase家族NO 疾病 细胞凋亡（apoptosis）是一种有序的或程序性的细胞死亡方式，是受基因调控的细胞主动性死亡过程，是细胞核受某些特定信号刺激后进行的正常生理应答反应，然后凋亡的细胞将被吞噬细胞吞噬。经研究发现，不管是单细胞生物还是多细胞生物，细胞凋亡被称为细胞程序性死亡（programmed cell death，PCD）[1]。是因为细胞死亡往往受到细胞内的某种遗传机制决定的“死亡程序”控制的。也会因为它的失调，机体也会失去稳定性，引发人类疾病如肿瘤、免疫系统等疾病[2]。由于它保证多细胞生物的健康生存过程中的重要性，引起了人们对其途径的广泛深入的研究，成为目前生命科学研究的热点之一。但其凋亡的途径不是很清楚，本文从多个方面概述了细胞凋亡途径。 1 细胞凋亡形态学上的特征 细胞凋亡（apoptosis）是1972年由Kerr教授根据形态学特征最先提出的[3],主要强调的是这种细胞凋亡是自然界中的生理学过程，是受基因调控的主动的生理性细胞自杀行为。