饲喂纳豆枯草芽胞杆菌对荷斯坦犊牛瘤胃细菌区系的影响
农业生物技术学报，2010年，第18卷，第1期，第108－113页
Journal of Agricultural Biotechnology,2010,Vol.18,No.1,108－113
研究报告
A Letter
饲喂纳豆枯草芽胞杆菌对荷斯坦犊牛瘤胃细菌区系的影响
于萍王加启*刘开朗卜登攀李旦赵圣国邓露芳
中国农业科学院北京畜牧兽医研究所,动物营养学国家重点试验室,北京,100193
*通讯作者,wang-jia-qi@https://www.sodocs.net/doc/139791626.html,
摘要本研究选取8头(60日龄)犊牛随机分为对照组和处理组，对照组犊牛饲喂开食料，处理组在开食料中添加纳豆枯草芽胞杆菌(Bacillus subtilis)(1×106CFU/g日粮)菌液，于断奶后2个月进行屠宰，采集瘤胃食糜构建16S rDNA克隆文库，随机挑取克隆进行测序，对照组16S rDNA克隆文库共有111个克隆，可分为88个操作分类单元；处理组16S rDNA克隆文库中有142个克隆，可分为131个操作分类单元。序列分析和多样性指数分析表明，两组犊牛瘤胃细菌区系多样性存在显著差异。拟杆菌门(Bacteroidetes)和壁厚菌门(Firmicutes)是两克隆文库中主要的代表菌群。对照组和处理组中的拟杆菌门分别占文库中总克隆数的38%和25%，而壁厚菌门分别占47%和57%。与瘤胃球菌相关的克隆在对照组克隆文库中分别占5%，而在处理
7.7/mL)和黄色瘤胃球菌组文库中分别占10%。RT-PCR结果显示，处理组中白色瘤胃球菌(R.albus)(log
10
(R.flavefaciens)(log108.1/mL)的数量比对照组(分别为log107.2/mL和log107.7/mL)分别增加了3倍和2.4倍。研究结果提示，饲喂纳豆枯草芽胞杆菌有助于促进断奶后犊牛瘤胃中细菌区系的建立，促进纤维分解菌群的定植和生长。
关键词犊牛,纳豆枯草芽胞杆菌,瘤胃细菌区系,16S rDNA克隆文库
Effect of Feeding Bacillus subtilis natto on Rumen Bacteria Population of Holstein Calves
Yu Ping Wang Jiaqi*Liu Kailang Bu Dengpan Li Dan Zhao Shengguo Deng Lufang
State Key Laboratory of Animal Nutrition,Institute of Animal Science,Chinese Academy of Agricultural Sciences,Beijing,100193
*Corresponding author,wang-jia-qi@https://www.sodocs.net/doc/139791626.html,
DOI:10.3969/j.issn.1674－7968.2010.01.018
Abstract Eight Holstein calves were randomly assigned into two groups,a control group fed with a starter diet, and a treatment group supplemented with Bacillus subtilis(natto),which was mixed with the starter diet at a concen-tration of1×1010CFU per gram of the average daily feed intake.Sequence analysis of random-chosen clones from the rumen16S rDNA libraries constructed from control and treatment groups showed that there was a significant difference in the bacterial diversity.The111and142clones from the control and treatment library could be as-signed into88and131OTUs,respectively.The majority of the two clone libraries were represented by sequences related to the Bacteroidetes and Firmicutes.Members of Bacteroidetes accounted for about39%and25%of the total clones in control group and treatment group,respectively,while Firmicutes increased from46%in control to 57%in the natto treatment.Clones affiliated to Ruminococcus accounted for5%in control group while10%in the treatment respectively,and these differences were further confirmed by RT-PCR quantification using genus-specif-ic primers.The numbers of R.albus(log107.7per mL)and R.flavefaciens(log108.1per mL)were higher in the ru men contents of the treatment group compared with the control group(log107.2per mL and log107.7per mL,re-
DOI:10.3969/j.issn.1674－7968.2010.01.018
基金项目：本研究由国家自然科学基金(30972117)和动物营养学国家重点实验室(No.2004DA125184(团)0801)共同资助
收稿日期：2009－01－07接受日期：2009－02－26
spectively),demonstrating a3and2.4times increase,respectively.These results indicated that supplementation of Bacillus subtilis(natto)in weaning calves can promote the establishment of a beneficial rumen bacterial communi-ty,especially the colonization and growth of fibrolytic bacteria.
Keywords Calves,Bacillus subtilis natto,Rumen bacteria,16S rDNA clone library
纳豆枯草芽胞杆菌(Bacillus subtilis natto)是枯草芽胞杆菌的一个亚种，是从日本传统发酵豆制品纳豆中分离出来的，被认为具有良好的安全性。体外研究表明，添加纳豆枯草芽胞杆菌能使动物肠道酸化而有利于铁、钙及维生素D等的吸收，促进动物生长，缩短养殖周期，已作为饲用微生物应用于促进仔猪、肉鸡等农畜生长及生产性能(Ozawa et al.,1979; 1981;陈兵等,2003a;2003b;宋国安,2002;周国勤等, 2006)。Goldin等(1998)认为纳豆芽胞杆菌益生作用的主要机理是改善动物胃肠道微生物群落结构及其功能。
反刍动物瘤胃中栖息着数量繁多，种属复杂的细菌、真菌、古细菌和原虫等微生物，这些微生物依赖相互间的作用，将植物纤维类物质转化成挥发性脂肪酸(VFA)，为宿主提供能量(Dehority and Orpin, 1997)。犊牛出生后消化道内为无菌状态，出生后受到母体产道、粪便和环境微生物影响，微生物逐步定植(陈兵等,2003a;2003b)。瘤胃微生物菌群的建立不仅能够促进瘤胃的生长发育，还有助于纤维降解、保护宿主免受病原微生物的感染。日粮是影响新生反刍动物消化道功能菌群建立的重要因素，然而其机制尚不清楚。本实验室曾在犊牛日粮中添加纳豆枯草芽胞杆菌能够显著提高犊牛的生产性能及胴体率(张海涛等,2008)。然而，纳豆枯草芽胞杆菌是如何影响瘤胃微生物菌群结构的机理尚不清楚。本研究的目的是探索饲喂纳豆枯草芽胞杆菌对犊牛瘤胃微生物群落结构的影响。
1结果与分析
1.1犊牛瘤胃微生物总DNA提取结果
分别提取对照组与处理组瘤胃微生物总DNA (图1)，结果表明片段大小在23kb左右，而且条带清晰，符合构建文库与定量等后续工作。
1.2瘤胃微生物16S rDNA文库的构建与分析
对照组和处理组瘤胃细菌16S rDNA文库分别由111和142个阳性克隆组成(表1)，GenBank序列登陆号分别为：FJ032371－FJ032382，FJ032384－FJ032482和FJ032483－FJ032624。以序列相似性97%为阈值，将这些克隆分为88和131个操作分类单元。
将各克隆序列在Ribosome Database ProjectⅡ10.0(https://www.sodocs.net/doc/139791626.html,/)中用Classifier程序分类，结果如图2，细菌各门的分布在对照组和处理组中存在显著的差异。与其他研究相似(Tajima et al., 2007)，两个文库中的优势菌群是拟杆菌门(Bac-teroidetes)和壁厚菌门(Firmicutes)，在对照组和处理组中，拟杆菌分别占38%和25%，壁厚菌门分别占47%和57%。文库中还包括少量螺旋体门(Spirocha-etes)、放线菌门(Actinobacteria)及变形菌门(Proteobac-teria)。未培养细菌分别占对照组和处理组克隆数目的9%和11%。
1.3犊牛瘤胃细菌群落的多样性及文库库容的评定
由表3可知，对照组和处理组文库多样性指数差异显著。本实验利用DOTUR软件计算了Shannon指数、ACE指数及Chao1指数(两者为多样性评估指数)，结果表明两个文库的多样数指数较高，ACE和Chao1曲线没有达到稳定趋势(图3)。从理论上讲，随着取样数量的增加，理论预测的种群数量趋于平稳，则表明文库中可以代表样品微生物的多样性。
1.4犊牛瘤胃微生物群落的比较分析
利用Unifrac在线软件对对照组和处理组文库进行P值检验。本实验中，两个文库之间P≤0.01，这表明对照组和处理组文库之间差异显著，说明添加纳豆枯草芽胞杆菌改变了断奶犊牛瘤胃细菌群落结构。
1.5黄色瘤胃球菌及白色瘤胃球菌的定量
RT-PCR分析可见(表2)，对照组中白色瘤胃球
图1犊牛瘤胃微生物总DNA凝胶电泳
Figure1Gel electrophoresis of the extracted total DNA of calf rumen microorganism
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图216S rDNA 克隆文库细菌门的组成注:A:对照;B:处理
Figure 2Phylogenetic composition of bacterial phylum from two 16S rDNA clone libraries Note:A:Control;B:Treatment
图3采用SACE 和SChaol 指数检验克隆文库库容注:A:对照;B:处理
Figure 3Phylotypes prediction of clone library based on values of SACE and SChaol Note:A:Control;B:Treatment
DOTUR 多样性DOTUR diversity
文库Library CK
Treat 克隆数Clone No.111142
OTU 82131HShannon 4.2(4.0~4.4)4.7(4.65.0)SChao1335(200~897)744(416~1753)SACE 456(258~1127)950(540~1585)表1不同牛瘤胃微生物16S rDNA 文库序列多样性生态学评价Table 1Comparison of ecological and molecular estimates of se-quence diversity for bacterial communities from different cattle species
注:OTU 定义为97%序列相似性;括号内数字标明95%置信
区间范围;HShannon 为Shannon 多样性指数
Note:The OTUs are defined at a DNA distance of 0.03;The numbers in parentheses are the ranges at the 95%confidence in-terval;HShannon:Shannon diversity index
菌和黄色瘤胃球菌的数量(log 107.7/mL 和log 108.1/mL)要高于处理组中白色瘤胃球菌和黄色瘤胃球菌的数量(log 107.2/mL and log 107.7/mL)，分别增加了3倍和2.4倍。
2讨论
本实验将16S rDNA 克隆文库和Real-time PCR 两种技术相结合，首次研究了纳豆枯草芽胞杆菌对犊牛瘤胃微生物区系的影响，表明添加纳豆枯草芽胞杆菌可改变断奶犊牛瘤胃细菌群落结构，纳豆枯草芽胞杆菌能够促进犊牛瘤胃微生物区系、特别是
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纤维降解菌的定植和生长。两个文库中拟杆菌门和厚壁菌门是优势菌群，但细菌各门的分布在对照组和处理组中有显著的差异，说明日粮组成是影响细菌种属分布的主要因素。在本实验中，两个文库的多样性指数偏高，ACE和Chao1曲线没有达到平稳。事实上，这种情况同样存在于其它有关瘤胃微生物研究中(Edwards et al.,2004)。这主要是由于拟杆菌和厚壁菌门是瘤胃的优势菌群，占到了瘤胃微生物总数的90%左右。目前的方法只能检测到瘤胃中优势菌群的变化，对于非优势菌群或种属发生的轻微变化还无法检测。因此，对照组和处理组文库在一定程度上代表了瘤胃微生物群落的多样性，可用于进一步的文库比较分析。
本实验采用的UniFrac软件可以计算各个文库间序列的系统进化距离，能用于同时比较多个文库是否存在显著差异，判断环境物理、化学等因素对微生物群落结构的影响(Lozupone and Knight,2005)。P值检验可以判断文库间是否存在显著差异：当P 值在0.001~0.01之间，则表示样品之间存在着显著差异。
种属特异性实时定量PCR结果显示：在处理组中可以检测到黄色瘤胃球菌，而在对照组中却没有检测到；与对照组相比，处理组中白色瘤胃球菌的数量增加了11.3%。瘤胃球菌是瘤胃中主要的纤维分解菌，黄色瘤胃球菌和白色瘤胃球菌是其中的主要成员(Krause et al.,1999)。利用Real-time PCR定量瘤胃球菌的变化，发现在处理组中可以检测到黄色瘤胃球菌，而在对照组中却没有监测到；与对照组相比，白色瘤胃球菌的数量在处理组中显著增加(表3)。这表明纳豆枯草芽胞杆菌的添加可以促进瘤胃内瘤胃球菌的定植和生长。
本实验首次通过16S rDNA文库与实时定量方法相结合，研究了纳豆菌对犊牛瘤胃微生物区系的影响。研究结果表明纳豆菌对犊牛瘤胃中纤维分解菌的定植与生长存在一定的影响。其可能的机制是：纳豆枯草芽胞杆菌是需氧菌，它们的生长需要消耗瘤胃中的氧，这就会厌氧菌的生长创造适宜的环境。因此，属于厌氧菌的纤维降解菌生长迅速，数量大量增加。而对于犊牛瘤胃中其它菌群的影响还有待进一步研究。
3材料与方法
3.1实验动物的饲养与采样
8头犊牛(60日龄)分为(1)处理组，(2)对照组。处理组犊牛饲喂纳豆枯草芽胞杆菌(Bacillus subtilis)菌液；对照组不饲喂菌液。犊牛断奶后继续饲喂菌液，犊牛饲喂纳豆枯草芽胞杆菌菌液含菌量为1×1010 CFU，犊牛日添加量为10mL/头，每头犊牛固定使用1只小桶，每天早晨7：30饲喂，犊牛以直接舔食菌液的方式采食。于断奶后2个月进行屠宰，每组4头牛的瘤胃内容物分别混合后按10mL/管分装，立即放入液氮罐中冷冻，保存备用。
3.2瘤胃微生物总DNA的提取与16S rDNA文库的构建
将对照组和处理组采集的瘤胃内容物样品分别混合，置灭菌的10mL离心管中，溶于PBS缓冲液中(137mol/L NaCl,2.7mol/L KCl,10mol/L Na
2
HPO4, 2mol/L KH2PO4,pH7.4)，制成15%(W/V)混合液。
瘤胃微生物总基因组DNA提取参考Yu和Morrison(2004)的方法进行。DNA浓度由Beckman DU7500分光光度计在260nm下测定。OD260/280比值在1.8~2.0的DNA用于实验。
PCR扩增体系为25μL，其中10×PCR缓冲液2.5μL，2.5mmol/L的dNTPs2.0μL，20pmol/μL的上、下游引物(通用引物27F/1492R)各1.0μL，EX Taq DNA聚合酶(5U/μL)0.5μL，模板1.0μL，最后用水补足到25μL。扩增条件：95℃预变性4min，(94℃45s, 54℃30s,72℃30s)×10个循环，最后72℃延伸7min。扩增产物用1.0%的琼脂糖凝胶电泳回收，将扩增产物与pMD19－T载体连接，转化大肠杆菌(Escherichia coli)DH－5α感受态细胞，在含有X-gal(20mg/mL)、IPTG(200μg/mL)和Amp(100μg/mL)的琼脂平板培养基上培养，挑选白色菌落，建立瘤胃细菌16S rDNA 克隆文库，克隆文库保存于96孔细胞培养板。
目标菌株
Target Bacterium
黄色瘤胃球菌Ruminococcus albus
白色瘤胃球菌Ruminococcus flavefaciens
Log1016S rRNA拷贝数/Ml
Log1016S rRNA copy number 对照组
Control
7.2
7.7
处理组
Treatment
7.7
8.1
SEM
0.05
0.04
P
<0.003
<0.01
表2RT-PCR定量黄色瘤胃球菌及白色瘤胃球菌
Table2Quantification of Ruminobacter albus and Ruminococcus
flavefaciens by RT-PCR
注:SEM:平均标准差
Note:SEM:Standard error of the mean
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从平板上挑取白色单克隆菌落接种于2mL LB 培养液中，37℃剧烈振荡培养过夜，小量碱法提取质粒，通过pMD19－T 通用引物鉴定阳性重组克隆，并送北京六合华大基因科技股份有限公司测序。3.316S rDNA 基因文库分析
用Chromas V.2123(Technelysium)软件对已测序结果进行扫描和处理，并分别用VecScreen (https://www.sodocs.net/doc/139791626.html,/VecScreen/VecScreen.html)和Mallard 软件去除载体和嵌合体序列。所得序列在Ribosome Database Project Ⅱ10.0(https://www.sodocs.net/doc/139791626.html,/)中用Classifier 程序分类。以序列相似性97%为阈值，采用furthest-neighbor 算法，利用DOTUR 软件(Schloss and Handelsman,2005)计算分类操作单元(Operational taxonomy unit,OTU)。利用DOTUR 软件计算文库的多样性和丰富度评估指数Shannon 指数、
ACE 指数和Chaol 指数，计算公式参考Schlos-sand Handelsman(2005)方法。
利用Unifrac 在线软件(http://bmf2.colorado.e-du/unifrac/index.asp)(Lozupone and Knight,2005)对对照组和处理组文库进行P 值检验，分析文库组成是否存在显出差异。3.4RT-PCR 定量
在GenBank 上查找黄色瘤胃球菌(Ruminococ －cus flavefaciens )和白色瘤胃球菌(R.albus )中不同菌株的16S rDNA 序列，利用DNAStar 中的MegAlign 进行序列比对，寻找种内保守区域和种外特异序列，然后利用Primer express 5.0进行引物设计(李旦等,2008)。目标菌设计的引物见表3。
采用PE7500型荧光定量PCR 仪和SYBR Green I 荧光染料用于定量扩增。根据随机挑选模板的浓度
梯度确定检测效率。PCR 反应体系25μL ：10×缓冲
液2.5μL ，10mmol/L 的dNTP 1.0μL ，10μmol/L 引物
各1.0μL ，模板1.5μL ，Taq DNA 聚合酶2.5U ，ddH 2O 18.0μL 。
反应条件：95℃3min 变性；95℃，30s ；58℃，33s ；72℃延伸1min ，33个循环。荧光检测设在每个循环的最后一步。熔解曲线从65~95℃，每秒增加0.1℃，并收集荧光信号。标准曲线制作和数据分析参考李旦等(2008)。
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A
R.flavefaciens R.albus
B
F:GATGCCGCGTGGAGGAAGAAG
R:CATTTCACCGCTACACCAGGAA
F:GTTTTAGGATTGTAAACCTCTGTCTT R:CCTAATATCTACGCATTTCACCGC
C 5858
D 286
270注:A:目标菌株;B:引物(5'－3');C:Tm;D:产物大小(bp)Note:A:Target strain;B:Primer (5'－3');C:Tm;D:Product size (bp)
表3细菌PCR 反应的引物和模板DNA 反应条件Table 3PCR primers for detection of ruminal bacteria 112
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遗传工程烟叶有望成为生物燃料
GM Tobacco Plants Have More Potential as A Biofuel
美国Thomas Jefferson 大学生物技术基础实验室的研究人员发现一种可以增加烟草叶片中油份含量的新方法，从而使烟叶有可能成为生物燃料的原料。这一成果刊登在《Plant Biotechnology Journal 》上。研究人员介绍说，烟草产生生物燃料的效率比其它作物高，过去人们从烟草中提取的燃油更多来自其种子，种子中的油份含量一般是干重的40%，但是烟草种子的产量很低，美国每英亩的烟草只能生产约600kg 的烟草种子。因此，研究人员试图从烟草叶片中榨出油。
研究人员指出，用烟草叶片提取生物燃料，可避免而“与人争粮”。因为目前提取生物燃料的主要原料是玉米和大豆等农作物。通过生物技术方法使烟叶中油份含量有可能增加20倍。烟叶单位干重(即细胞除去水分后的重量)含油量为1.7%~4.0%，对烟草的DGAT 基因和LEC2基因进行了改造后，含油量增加到5.8%~6.8%，因而有望从烟叶中提取更多的生物燃料。正如研究人员所说，烟草是一个有吸引力的和充满希望的“能源平台”，也可成为其他高生物量植物生产生物燃料的利用模式。编者：Jaylyn Wang,本刊通讯员
本文引用格式：Jaylyn,2010,遗传工程烟叶有望成为生物燃料,农业生物技术学报,18(1):113信息来源:https://www.sodocs.net/doc/139791626.html,/pub_releases/2009－12/tju-etp123009.php
饲喂纳豆枯草芽胞杆菌对荷斯坦犊牛瘤胃细菌区系的影响
Effect of Feeding Bacillus subtilis natto on Rumen Bacteria Population of Holstein Calves
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枯草芽孢杆菌试验方案
枯草芽孢杆菌浓度测定试验方案 一、材料准备 （1）实验仪器 培养皿、烧杯、天平、玻璃棒、移液枪（5ml 1ml 200ul）、枪头（黄、蓝）、电子天平、250ml锥形瓶、15ml试管、涂布棒、酒精灯、记号笔、封口膜、灭菌锅、漩涡震荡仪 （2）实验试剂 NA培养基： 牛肉膏、蛋白胨、琼脂、水、盐酸、氢氧化钠、无菌水 枯草芽孢杆菌（不同浓度梯度）：101、102、103、104、105 （3）培养基配方 牛肉膏（3g）、蛋白胨（5g）、琼脂（20g）、水（1000ml）、无菌水（100ml）、盐酸、氢氧化钠（调节PH7.0-7.2），121°C下灭菌30 min。 二、实验步骤 （1）制备菌液 称取1.0g枯草芽孢杆菌转移至灭菌试管中，用移液枪分别移取9ml无菌水至试管，并用漩涡震荡仪震荡20-30秒保证完全混匀，标记为①； 用移液枪从①中移取1ml混匀菌液至一新试管，用移液枪分别移取9ml 无菌水，并用漩涡震荡仪震荡20-30秒保证完全混匀，标记为②；同理，分别进行稀释，得到③-⑧; （2）进行涂板 向每个培养皿中倒入约12ml50℃左右的灭菌的NA培养基，排除气泡；
待培养基凝固后，用移液枪分别从①-⑧中吸取200ul菌液，加至已灭菌的培养皿中，用涂布棒进行均匀涂抹，并标记； 每个样品做两个处理，每个稀释度重复3次； 将密封后的培养皿倒置于36℃的恒温培养箱内培养18h—24h，观察记录实验结果。 （3）菌落计数 以平板上出现30个——300个菌落数的稀释度平板为记数标准，并确定为稀释倍数： 当只有一个稀释度，其平均菌落数在30个-300个之间时，则以该平均菌落数乘以其稀释倍数； 若有两个稀释度，其平均菌落数30个-300个之间时，应按两者菌落总数之比值来决定。若其比例小于2应计数两者的平均数，若大于2则计数其中稀释较小的菌落总数； 若三个稀释度的平均菌落数大于300个，则应按稀释度最高的平均菌落数乘以稀释倍数； 若三个稀释度的平均菌落数小于300个，则应按稀释度最低的平均菌落数乘以稀释倍数。5.6若三个稀释度的平均菌落数不在30个-300个之间，则以最接近300个或30个的平均菌落数乘以稀释倍数。 （4）结果统计与计算 有效活菌总数按式（1）计算； A=B×C /D (1)
纳豆的发酵及纳豆芽孢杆菌的分离纯化
综合性实验报告 实验项目名称：纳豆的发酵及纳豆芽孢杆菌的分离纯化实验项目性质：综合性实验 所属课程名称：食品微生物 班级： 12食品营养4班 姓名：莫沛伦 学号：201230600816 指导老师：莫美华 2014年05月10日
摘要：成品纳豆的制备及纳豆芽胞杆菌的分离纯化；利用微生物的新陈代谢发酵黄豆制备纳豆制品；革兰氏染色法可将细菌区分为革兰氏阳性细菌和革兰氏阴性性细菌两大类，是由这两类菌的细胞壁结构和成分的不同所决定的。 关键词：纳豆的制备纳豆芽胞杆菌分离纯化革兰氏阳性细菌革兰氏阴性性细菌 前言： 纳豆，大豆经纳豆菌发酵而成，是一种健康食品。几千年间传播全世界各地，尤其是整个东南亚的人们对纳豆的作用高度认可，食用者众多，日本人尤其热衷这种美味保健食品。而纳豆制成的保健产品、生物制剂被人们广泛接受。 G-菌的细胞壁中含有较多易被乙醇溶解的类脂质，而且肽聚糖层较薄、交联度低，故用乙醇或丙酮脱色时溶解了类脂质，增加了细胞壁的通透性，使初染的结晶紫和碘的复合物易于渗出，结果细菌就被脱色，再经蕃红复染后就成红色。G+菌细胞壁中肽聚糖层厚且交联度高，类脂质含量少，经脱色剂处理后反而使肽聚糖层的孔径缩小，通透性降低，因此细菌仍保留初染时的颜色，呈现蓝紫色。 实验材料与方法 1.实验材料 黄豆：50g~100g/组；饭盒（带盖）；接种用纳豆产品、筷子、酱油、芥末 250ml三角瓶（带玻璃珠）、250ml三角瓶、试管、100ml量筒、不锈钢锅、电磁炉、试管架、玻璃棒、电子天平、大塑料筐、称量纸、不锈钢大口盅、纱布、大漏勺、1ml枪头、移液枪、橡皮筋、牛皮纸（报纸）试管塞、三角瓶塞、标签纸、pH5.5-9.0试纸、载玻片、显微镜、酒精灯、接种环、无菌平皿、洗瓶、吸水纸、擦镜纸、废液缸 10%NaOH、5%HCl、肉汤培养基、结晶紫染色液、卢戈碘液、95%乙醇、番红染色液、香柏油、二甲苯、 2.实验流程：
浅谈枯草芽孢杆菌(参考内容)
浅谈枯草芽孢杆菌 1. 抗生作用 抗生作用是指拈抗微生物通过产生代谢产物在低浓度下就能够对病原微生物的生长和代谢产生抑制作用，从而来影响病原微生物的生存和活动。近半个世纪以来，人们从枯草芽孢杆菌不同菌株的代谢产物中分离纯化了多种有效的抗菌物质。 2 溶菌作用 枯草芽孢杆菌的溶菌作用主要表现在是通过吸附在病原菌的菌丝上，并随着菌丝生长而生长，而后产生溶菌物质造成原生质泄露使得菌丝体断裂；或者是产生抗菌物质通过溶解病原菌孢子的细胞壁或细胞膜，致使细胞壁穿孔、畸形等现象从而抑制孢子萌发。 3 诱导植物产生抗性及促进植物生长 诱导植物产生抗性作用是指枯草芽孢杆菌不但能够抑制植
物病原菌，而且还能够诱发植物自身抗病机制从而增强植物的抗病性能的作用。什么是PGPR国际上把土壤中能促进植物生长的根际自生细菌通称为植物促生根圈细菌(Plant growth promoting rhizobaceria)，简称为PGPR。 其中以枯草芽孢杆菌的抗逆性最强、功能最多、适应性最广、效果最稳定。枯草芽孢杆菌能够产生类似细胞分裂素、植物生长激素的物质，促进植物的生长使植物抵抗病原菌的侵害。 4保护环境。 枯草芽孢杆菌大量应用于生物肥料。当作用于作物或土壤时，能够在作物根际或体内定殖，并起到特定肥料效应。目前，微生物肥料在培肥地力，提高化肥利用率，抑制农作物对硝态氮、重金属、农药的吸收，净化和修复土壤，降低农作物病害发生，促进农作物秸秆和城市垃圾的腐熟利用。提高农作物产品品质和食品安全等方面表现出了不可替代的作用。
5 枯草芽孢杆菌对土壤中的菲与苯并芘的吸附及生物降解功能 土壤与其相连的水环境称为土壤-水环境系统，其中存在着大量的土壤固有微生物，并在表面存在生物膜，因为生物膜形成了隔离层，有机污染物在接触到支撑生物膜的固体基底之前，必须首先到达并且穿过这个隔离层，这样就强烈地改变矿物颗粒或基底的吸附行为，对吸附作用有重要的影响，近年的研究表明，由于受污染影响，导致土壤中含有多环芳烃（PAHs），沉积物中PAHs主要为原油污染以及工业或民用煤不完全燃烧所致，枯草芽孢杆菌对菲与苯并芘的吸附及生物降解研究，研究表明以枯草芽孢杆菌为接种微生物，对菲与苯并芘都可进行吸附或生物降解，48h液相PAHs浓度达到平衡时，微生物对菲消除了98％，对苯并芘消除85％；接种的样品48h吸附等温线均呈线形，能较好地符合线性方程；在接种微生物情况下，沉积物与土壤对菲和苯并芘吸附特征均发生较大变化，对菲的吸附量增大约35倍，而对苯并芘的吸附量却降低了2／3左右；未接种微生物的土壤和沉积物对菲解吸率为20％，接种的样品组为2.9％，而对苯并芘的解吸结果与菲相反，未接种
纳豆芽孢杆菌复壮
纳豆芽孢杆菌复壮及相关实验结题报告 08级生物工程2班解制怡 摘要 在前一阶段，我们从食品“丑女人纳豆中”提取出了纳豆芽孢杆菌，并进行了单菌落的分离和菌种保藏。由于保藏期限已到，需进行菌种复壮。为此，我们对纳豆芽孢杆菌进行了菌种复壮、单菌落的分离和斜面保藏，并对该过程中产生的杂菌进行菌种纯化，获得了其相应的单菌落并进行了斜面保藏，建立了菌种档案。 本期成果：我们完成了纳豆芽孢杆菌复壮及单菌落的分离，另外共分离了15种菌株，其中细菌4种，霉菌11种。 关键词:纳豆芽孢杆菌；分离纯化；保藏；革兰氏染色；菌种档案 第一章绪论 1.1纳豆芽孢杆菌 纳豆菌通常为（0.7-0.8）um×(2.0-3.0)um,革兰氏阳性。生长在葡萄糖琼脂的细胞原生质染色均匀。芽孢椭圆形或柱状，中生或偏中生，即使孢囊膨大，也不显著，有鞭毛，能运动。生长温度最高位45-55℃，最低为5-20℃。孢子耐热性强。孢子型纳豆菌是具有耐酸、耐热特性的有益菌,在胃酸下四小时存活率为100%,同时具有强力的病原菌抑制能力,是各种益菌当中,对环境耐受力最好可以直达小肠的菌种之一，口服后可改变人体肠道菌丛生态,帮助消化道机能正常化,以使排便顺畅,维持体内生理环境；可以产酸，调节肠道菌群，增强动物细胞免疫放应；并能生成多种蛋白酶（特别是碱性蛋白酶）、糖化酶、脂肪酶、淀粉酶，降解植物性饲料种某些复杂的碳水化合物，从而提高饲料的转化率。 1.2纳豆生产的改善以及纳豆对人体的好处 芽孢杆菌属纳豆芽孢杆菌种（natto）从纳芽豆制品中或从自然界的稻、谷上面分离得到。日本传统的做法是把煮熟的大豆装在用稻草做成的器皿里，利用稻草上附着的纳豆菌自然发酵而做成的。用这种方法做成的纳豆中，除了纳豆菌以外，还含有其他杂菌，不仅卫生不过关，而且质量也不好。1921年半泽博士培养分离出了纯纳豆菌，使纳豆菌商品化了。 利用纳豆菌可以制造纳豆。因纳豆菌是嗜氧菌,接触空气是很重要的。纳豆菌在通过吞噬大豆蛋白来繁殖的时候,产生出的无数酵素纳豆激酶和维生素K,具有神奇的药效,可以治疗三高（高血糖，高血压，高血脂）和溶解血栓的作用，而且还能产生出氨基酸的美味。 1.3菌种复壮常用的方式 1.3.1纯种分离法 通过纯种分离,可将衰退菌种细胞群体中一部分仍保持原有典型性状的单细胞分离出来,经扩大培养,就可恢复原菌株的典型性状。常用的分离纯化的方法可归纳成两类：一类较粗放，只能达到“菌落纯”的水平，即从种的水平来说是纯的。例如采用稀释平板法、涂布平板法、平板划线法等方法
枯草芽孢杆菌简介及应用
枯草芽孢杆菌简介及应用 枯草芽孢杆菌简介 枯草芽孢杆菌（Bacillaceae）编号为Strain Number ACCC 11060，是芽孢杆菌属的一种。单个细胞0.7～0.8×2～3微米，着色均匀。无荚膜，周生鞭毛，能运动。革兰氏阳性菌，芽孢0.6～0.9×1.0～1.5微米，椭圆到柱状，位于菌体中央或稍偏，芽孢形成后菌体不膨大。菌落表面粗糙不透明，污白色或微黄色，在液体培养基中生长时，常形成皱醭，需氧菌。可利用蛋白质、多种糖及淀粉，分解色氨酸形成吲哚[1]。早在1835 年，Ehrenberg 所描述的“Vibrio subtilis”即是现在大家熟悉的“枯草芽孢杆菌”，它是由Cohn 于1872 年正式命名的，现作为芽孢杆菌科(Bacillaceae) 的模式菌株，芽孢杆菌是人类发现最早的细菌之一。 枯草芽孢杆菌应用 枯草杆菌(B acillus Subtilis) 是一种重要的α-淀粉酶生产菌。同时枯草芽孢杆菌作为一种安全、高效、多功能和极具开发潜力的微生物菌种已广泛应用于工业、农业、医药、卫生、食品、畜牧业、水产及科研诸领域。随着经济的发
展、科研水平的提高，枯草芽孢杆菌与人们的日常生活将更为密切，它也必将作为一种十分重要的工业微生物菌种越来越引起人们的普遍关注和青睐。 ①枯草芽孢杆菌在工业酶生产中的应用 工业酶的生产是工业微生物发酵的重要组成部分。枯草芽孢杆菌是当今工业酶生应用最广泛的菌种之一，据不完全统计，枯草芽孢杆菌所产的酶占整个酶市场的50 %。由于其产酶量高、种类多、安全性好和环保等优点，在现代工业生产中被广泛用作生产菌种，其发酵生产的酶已在食品、饲料、洗涤、纺织、皮革、造纸和医药等领域均发挥着十分重要的作用。 ②枯草芽孢杆菌在生物防治领域中的应用 枯草芽孢杆菌作为植物病害生防细菌之一，具有较强的防病作用美国迄今已有4 株枯草芽孢杆菌生防菌株获得环保局商品化或有限商品化生产应用许可，如美国AgraQuest公司用枯草芽孢杆菌QST713 菌株开发出活菌制剂杀菌剂SerenadeTM，并于2000 年通过美国环保局(EPA) 的登记，用于防治多种作物的白粉病、霜露病、疫病、灰霉病等病害。我国利用枯草芽孢杆菌防治植物病害的应用研究也达到了世界先进水平，现已成功开发并投入生产的商品制剂有亚宝、百抗、麦丰宁、纹曲宁等产品。 ③枯草芽孢杆菌是微生物学与分子生物学研究的良好试验材料 枯草芽孢杆菌作为基因工程受体菌，可表达出近200 种原核和真核生物来源的蛋白基因，并且无论是在生产上还是对基因组及物理图谱的研究上都处于中心位置，对它的研究涉及各个方面。 ④枯草芽孢杆菌在微生物添加剂领域中的应用 枯草芽孢杆菌是我国允许使用的饲料微生物菌种，因其无毒、无害，经常被制成微生物添加剂，用于改善动物肠道功能、促进动物生长和预防疾病。枯草芽孢杆菌在制剂中以内生孢子形式存在，孢子进入动物肠道后，在肠道上部能迅速复活并分泌高活性的蛋白酶、脂肪酶、淀粉酶，有助于降解植物性饲料中复杂的碳水化合物，产生具有拮抗肠道致病菌的多肽类物质等，起到抑菌和预防作用。另外，枯草芽孢杆菌是好氧菌，可通过消耗肠道内的氧气造成厌氧环境，促进肠道内优势菌厌氧菌的繁殖，维持肠道生态平衡。 ⑤枯草芽孢杆菌在医药卫生领域的应用 研究证明，枯草芽孢杆菌的活菌制剂可以作为口服液用于治疗肠炎、支气管炎和腹泻等多种疾病，也用来预防和治疗烧伤面的感染。 ⑥枯草芽孢杆菌在水产养殖领域中的应用 枯草芽孢杆菌在水产养殖中的应用起步较晚，由于它能分泌蛋白酶等多种酶类和抗生素，使池底积累的大量残余饵料、排泄废物、动植物残体及有害气体(氨、硫化氢等) ，使之先分解为小分子(多肽、高级脂肪酸等) ，后分解为更小分子的有机物，最终分解为二氧化碳、硝酸盐和硫酸盐等，有效降低了水中的COD、
枯草芽孢杆菌使用技术
枯草芽孢杆菌使用技术 制剂：1000亿活芽孢/克可湿性粉剂毒性：低毒级 枯草芽孢杆菌特点： 1、绿色环保――对人畜微毒、对环境无污染、对作物安全（本剂虽属细菌活体杀菌剂，但不会侵染作物引起病 害，亦不会对作物产生药害） 2、高效广谱――对水稻稻瘟病，西瓜、黄瓜、草莓、番茄等多种作物白粉病、灰霉病，马铃薯晚疫病，大豆、油菜菌核病，瓜类、谷物、三七等作物根腐病等多种真菌性病 害具有优良防效。 3、增产提质――枯草芽孢杆菌还能够分泌促进作物生长的活性物质，使植株叶片浓绿肥厚，提高作物免疫力，增产提质效果显著，发酵过程中产生多种氨基酸，对作物有生 长调节的作用。 枯草芽孢杆菌防治机理 １、竞争作用：通过生物间争夺氧气、营养物质及竞争
排它性，形成局部生物优势种群，防止其它菌侵入；同时争夺周围菌的营养，抑制病原菌生长―起到疫苗的作用。 ２、溶菌作用：枯草芽孢杆菌吸附于病原菌的菌丝上，随着菌丝生长而生长，从而消耗病原菌的营养，使病原菌菌丝发生断裂、解体、细胞质消解，使病原菌失去进一步侵染 能力―起到寄生作用。 3、生物拮抗作用：枯草芽孢杆菌生长过程中能产生细菌素（枯草菌素、多粘菌素、制霉菌素、短杆菌素）、有机酸、天然脂肽类化合物等，对病原菌抑制其生长或溶解其细胞壁、使细胞穿孔、畸形，最终杀死病原菌，。 ４、杀灭作用诱导作物产生抗病性、促进作物生长，增产提质。据统计，使用枯草芽孢杆菌可有效增产 5.6-20.2%。 枯草芽孢杆菌使用方法 1、稻瘟病、纹枯病、稻曲病。施药方法：水稻孕穗破口期和齐穗期各施药一次。每亩用枯草芽孢杆菌10克均匀 喷雾，喷药药间隔7-12天，
2、枯草芽孢杆菌与咪鲜胺、三环唑、井冈霉素等混用，有明显的相互增效作用。在病害集中、急性暴发时，更能显 示出混用的效果。 枯草芽孢杆菌使用注意事项 1、本品用量少，为减少浪费，兑药时应用小容器将所需用量药剂充分溶解后再倒入喷雾器中，加水至喷雾器最佳 水平线进行喷雾； 2、早上10点前或下午4点后施药，避免阳光直射，杀死芽孢。尤其是4点后用药，夜间潮湿的环境更有利于芽孢 萌发。 3、不能与铜制剂、链霉素等杀菌剂及碱性农药混用； 4、病害初期或发病前施药效果最佳，施药时注意使药 液均匀喷至作物各部位。
枯草芽孢杆菌实验报告
微生物技术综合实验 年级：13级生物工程（专升本）班级：2013011201 学号：1301014026 姓名：徐红贞 指导老师：刘凤霞教授 日期：二零一三十月五号
目录 1实验目的及原理 (1) 1.1实验目的 (1) 1.2实验原理 (1) 2实验材料 (1) 2.1实验仪器 (1) 2.2实验试剂 (1) 2.3培养基 (2) 2.3.1 生长培养基 (2) 2.3.2鉴定培养基 (2) 2.3.3摇瓶培养基 (2) 3试验方法 (2) 3.1仪器的准备 (2) 3.2培养基的配置 (2) 3.3初步筛选及鉴定 (2) 3.3.1采集土样 (3) 3.3.2富集培养 (3) 3.3.3稀释分离、纯化 (3) 3.3.4初筛 (3) 3.4复筛及鉴定 (4) 3.4.1革兰染色 (4) 3.5酶活力的测定 (4) 3.5.1摇瓶培养 (4) 3.5.2酶液稀释 (4) 3.5.3酶液测定 (4) 4结果分析 (5) 4.1平板涂布分离 (5) 4.2平板划线分离 (5) 4.3初筛 (5) 4.4复筛 (5) 4.5摇瓶培养 (6) 4.6酶活力测定 (6) 5参考资料 (7) 6附录 (8)
微生物上游技术综合实验 枯草芽孢杆菌的分离、纯化、筛选及鉴定 1.实验目的及原理 1.1实验目的 （1）学习从土壤中分离、纯化枯草芽孢杆菌的原理和方法。 （2）学习掌握枯草芽孢杆菌的鉴定方法。 （3）掌握微生物的摇瓶培养方法及淀粉酶活力的测定的原理和方法。 （4）培养学生综合应用微生物实验方法的能力。 （5）培养学生自行设计实验流程、综合分析问题解决问题和判断实验结果的能力。 1.2实验原理 选择合适与待分离微生物的生长条件，如营养成分、酸碱度、温度和氧等要求，或加入某种抑制剂造成只利于该微生物生长，而抑制其他微生物的环境，从而淘汰一些不需要的微生物。 将土壤稀释液倒在不同类型的培养基平板上，在适宜的环境中培养几天，细菌或是其他的微生物便能在平板上生长繁殖，形成菌落。将初次筛选得到的微生物接到淀粉培养基上培养，因为只有能够产生淀粉酶的细菌才能够利用培养基中的淀粉成分来完成自身的生命活动，才能够生存。故在淀粉部分不显现蓝色，出现透明圈，可以通过透明圈的大小来初步判断培养物中是否有产淀粉酶微生物及产淀粉酶的能力。 2. 实验材料 2.1实验仪器 无菌玻璃涂棒无菌移液管接种环无菌培养皿土样电子天平三角瓶烧杯试管酒精灯擦镜纸载玻片吸水纸恒温摇床恒温培养箱高压蒸汽灭菌锅玻璃珠显微镜无菌铲胶头滴管记号笔试管架棉塞牛皮纸报纸细绳无菌纸袋电炉搪瓷缸分光光度计恒温水浴锅白瓷皿等。 2.2 实验试剂 ○1碘液储备液：称取22.0g碘化钾溶于约300mL水中，加入11.0g碘，搅拌溶液，移入500mL容量瓶，用水定容，贮于棕色瓶中备用（每月配制一次）。 ○2碘液使用液：称取20.0g碘化钾，溶于约300mL水中，移入500mL容量瓶中，
枯草芽孢杆菌的发酵
枯草芽孢杆菌的发酵学院：化工学院 专业：生物工程 班级：生物10-2 ：霞
摘要 枯草芽孢杆菌是我国农业部允许作为饲料添加剂的15种菌种之一 ,其已被越来越多地制成饲用微生态制剂。因其制剂是无毒、无残留、无污染的“绿色”添加剂，故具有广阔的发展前景，并已在畜牧业、饲料业广泛应用，显示巨大的社会效益和生态效益。通过摇床培养筛选出较适宜于枯草芽孢杆菌发酵的培养基配方，发酵培养基配方确定后，在摇床条件下，通过对温度、初始ｐＨ值、初始接种量、装液量、摇床转速等发酵条件的摸索，确定最佳发酵条件。在摇瓶条件下优化发酵培养基和发酵工艺后，采用发酵罐进行发酵培养，对枯草芽孢杆菌在液体发酵过程中的菌体数量、ｐＨ值、总糖含量和总氮含量四个因素随时间的变化进行了观察。 枯草芽孢杆菌，是芽孢杆菌属的一种。单个细胞 0.7～0.8×2～3微米，着色均匀。无荚膜，周生鞭毛，能运动。革兰氏阳性菌，芽孢0.6～0.9×1.0～1.5微米，椭圆到柱状，位于菌体中央或稍偏，芽孢形成后菌体不膨大。菌落表面粗糙不透明，污白色或微黄色。枯草芽孢杆菌菌体生长过程中产生的枯草菌素、多粘菌素、制霉菌素、短杆菌肽等活性物质，这些物质对致病菌或源性感染的条件致病菌有明显的抑制作用。枯草芽孢杆菌迅速消耗环境中的游离氧，造成肠道低氧，促进有益厌氧菌生长，并产生乳酸等有机酸类，降低肠道pH值，间接抑制其它致病菌生长。枯草芽孢杆菌菌体自身合成α-淀粉酶、蛋白酶、脂肪酶、纤维素酶等酶类，在消化道中与动物体的消化酶类一同发挥作用，能合成维生素 B1、B2、B6、烟酸等多种B族维生素，提高动物体干扰素和巨噬细胞的活性，在饲料中应用广泛。它还可以用来改善水质，应用在污水处理和环境保护中。和其它微生物混合使用，还可以用于生物肥料和土地改良等 关键词：枯草芽孢杆菌生长发酵活菌数
纳豆菌
纳豆菌 纳豆菌 【别名】纳豆菌 【种属名称】枯草芽孢杆菌属纳豆芽孢杆菌种 【来源】从纳豆制品中或从自然界的稻、谷上面分离得到。这种方法除了纳豆菌以外，还含有其他杂菌，不仅卫生不过关，而且质量也不好。1921年半泽博士培养分离出了纯纳豆菌，使纳豆菌商品化了。专业生产纳豆菌的公司可在百度搜索。 【菌种特征】纳豆菌通常为（0.7-0.8）um×(2.0-3.0)um,革兰氏阳性。生长在葡萄糖琼脂的细胞原生质染色均匀。芽孢椭圆形或柱状，中生或偏中生，即使孢囊膨大，也不显著，有鞭毛，能运动。生长温度最高位45-55℃，最低为5-20℃。孢子耐热性强。 【有效成分】活性纳豆芽孢杆菌。 【功效】 孢子型纳豆菌是具有耐酸、耐热特性的有益菌,在胃酸下四小时存活率为100%,同时具有强力的病原菌抑制能力,是各种益菌当中,对环境耐受力最好可以直达小肠的菌种之一,口服后可改变人体肠道菌 丛生态,帮助消化道机能正常化,以使排便顺畅,维持体内生理环保。 产酸，调节肠道菌群，增强动物细胞免疫放应。并能生成多种蛋白酶（特别是碱性蛋白酶）、糖化酶、脂肪酶、淀粉酶，降解植物性饲料种某些复杂的碳水化合物，从而提高饲料的转化率。 【用途】 利用纳豆菌可以制造纳豆。因纳豆菌是嗜氧菌,接触空气是很重要的。纳豆菌在通过吞噬大豆蛋白来繁殖的时候,产生出的无数酵素纳豆激酶和维生素K,具有神奇的药效,可以治疗三高（高血糖，高血压，高血脂）和溶解血栓的作用，而且还能产生出氨基酸的美味。具体制作如下： 纳豆的家庭制作、保存和食用 现在市场上销售的纳豆食品因为保存期过长失去大部分功效或者价格过高，所以目前最行之有效的办法就是模仿日本进行家庭制作，这样既能满足普通人的需求，又能达到鲜纳豆的新鲜度，发挥纳豆的最佳功效。 一、使用器皿和材料 ①大豆500g②纳豆菌5g③高压锅④不锈钢盆⑤泡沫饭盒等浅容器⑥泡沫箱子⑦2立升长方形塑胶瓶子或暖水袋⑧温度计 二、泡豆蒸豆 将大豆充分洗净后，加入3倍量的水浸泡一夜后，倒掉水放进高压锅内蒸到大豆用手捏碎的程度，大约45分钟。如没有高压锅，煮水时一次不要放得太多。为了保持大豆的原汁原味，最好是蒸。 三、接种纳豆菌 将纳豆菌用50ml热水（温度最好38-45℃，温度太高会杀死纳豆菌）溶解后，均匀地加入到热大豆中（温度最好38-45℃，温度太高会杀死纳豆菌），迅速搅拌均匀，分装在7个泡沫饭盒里，厚度大约2cm，上面苫上纱布或者在饭盒与饭盒盖之间架上一双筷子，使其充分接触空气。因纳豆菌是嗜氧菌，接触空气是很重要的。但发酵好以后，要盖好盖，用胶带封住口，避免接触空气利于长期保存。 四、在恒温下发酵14-36小时 在干净的大泡沫箱内放入几瓶装满50℃热水的长方形塑胶瓶子，把已接种上纳豆菌的泡沫饭盒摆在瓶子上，箱内理想温度是42℃。如箱内温度降到38℃时，瓶内重新换入50℃的热水。如此反复更换瓶内热水，发酵14-36小时，大豆表面产生了白膜，有粘丝出现后，大豆就变成了纳豆。如没有泡沫箱子，也可使用大纸盒，四周包上棉被和电褥子，或者箱内插入一只45℃的电灯泡等方法来保持箱内恒温。注意多接触空气。 五、后熟（活菌低温休眠） 在38-42℃的恒温下发酵14-36小时，然后放在冰箱内低温熟成数小时后，做好的纳豆无论是外观还是口感都会更好。因此建议纳豆做好后，先放入冰箱内低温熟成数小时以后再食用或长期保存。
枯草芽孢杆菌母药实用标准
G25 Q 滨生物农化企业标准 Q/320922 BN 032-2014 1000亿cfu/g枯草芽孢杆菌母药 2014-08–18发布 2014-08–30实施
滨生物农化发布
前言 本标准按照 GB/T1.1—2009《标准化工作导则第1部分：标准的结构和编写》和GH/T2467.8—2003《农药母药产品标准编写规》进行编制而成。 本标准附录A为规性附录。 本标准附录B为资料性附录。 本标准由滨生物农化提出并起草。 本标准主要起草人：福兵、许军、文权。 Ⅰ
引言 1000亿cfu/g枯草芽孢杆菌母药是我公司自行研制开发的微生物发酵产品。 1000亿cfu/g枯草芽孢杆菌母药经过加工可以主要用于防治水稻纹枯病、稻曲病。 经测定1000亿cfu/g枯草芽孢杆菌母药对大白鼠的经口毒性LD50雌、雄性均＞4640mg/kg，经皮毒性为LD50雌、雄性均＞2150mg/kg。 Ⅱ
1000亿cfu/g枯草芽孢杆菌母药 本品有效成分的其他名称、结构式和基本物化参数如下： a)枯草芽孢杆菌 中文通用名称：枯草芽孢杆菌—+菌株编号。 拉丁学名：Bacillus subtilis。 分类地位：细菌（Bacteria）；厚壁菌门（Firmicutes）;芽孢杆菌纲（Bacilli）；芽孢杆菌目（Bacillales）；芽孢杆菌科（Bacillaceae）；牙孢杆菌属（Bacillus）。 形态学特征：菌体呈杆状，单个、成对或短链排列，大小为0.7μm～0.8μm×2.0μm～3.0μm，无荚膜，周生鞭毛，能运动；芽孢0.6μm～0.9μm×1.0μm～1.5μm，椭圆到柱状，位于菌体中央或稍偏，芽孢形成后菌体不膨大；革兰氏染色阳性；菌落圆或不规则形，表面粗糙不透明，可以起皱，呈奶油色或污白色。 有效成分主要存在形式：芽孢。 主要生物活性：抑菌（防病）。 培养保存条件：最适生长温度为30℃—37℃；适合培养基为营养琼脂（NA）或营养肉汤（NB）培养基；适宜贮存温度为0℃—4℃。 1 围 本部分规定了细菌微生物农药枯草芽孢杆菌母药的要求、试验方法、检验与验收以及标志、标签、包装、贮运。 本部分适用于以芽孢为主要活性成分的粉状枯草芽孢杆菌母药。 2 规性引用文件 下列文件中对于本文件的应用是必不可少。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T 1601-1993农药pH值的测定方法 GB/T 1604-1995商品农药验收规则 GB/T 1605-2001商品农药采样方法 GB 3796-2006农药包装通则 GB/T 8170-2008 数值修约规则与极限数值的表示和判定 GB/T16150-1995 农药粉剂、可湿性粉剂细度测定方法 3 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。 3.1 枯草芽孢杆菌母药Bacillus subtilis technical concentrates(TK) 由枯草芽杆菌纯菌种经发酵而获得的高含量芽孢菌粉，通常情况下还会包含伴随发酵过程的少量生物组分和化学杂质。 3.2 菌落形成单位 colony forming units（cfu） 是将枯草芽孢杆菌母药用水稀释后得到的菌泫通过涂布的方法，让其单个芽孢分散在琼脂平板上，
枯草芽孢杆菌使用说明
枯草芽孢杆菌(活菌数200亿/400亿) 一、枯草杆菌概述：枯草芽孢杆菌是芽孢杆菌属的一种。单个细胞 0.7～0.8×2～3微米，着色均匀。无荚膜，周生鞭毛，能运动。革兰氏阳性菌，芽孢0.6～0.9×1.0～1.5微米，椭圆到柱状，位于菌体中央或稍偏，芽孢形成后菌体不膨大。菌落表面粗糙不透明，污白色或微黄色，在液体培养基中生长时，常形成皱醭。需氧菌。可利用蛋白质、多种糖及淀粉，分解色氨酸形成吲哚。在遗传学研究中应用广泛，对此菌的嘌呤核苷酸的合成途径与其调节机制研究较清楚。广泛分布在土壤及腐败的有机物中，易在枯草浸汁中繁殖，故名。 二、枯草芽孢杆菌的作用机理：枯草芽孢杆菌大量应用于生物肥料。当作用于作物或土壤时．能够在作物根际或体内定殖，并起到特定肥料效应。目前，微生物肥料在培肥地力，提高化肥利用率，抑制农作物对硝态氮、重金属、农药的吸收，净化和修复土壤，降低农作物病害发生，促进农作物秸秆和城市垃圾的腐熟利用．保护环境。以及提高农作物产品品质和食品安全等方面表现出了不可替代的作用。 三、枯草芽孢杆菌的使用说明： 特点：1.肠道定殖能力强。 2.耐氧化、耐高温、耐酸碱、耐挤压和耐温度变化，满足不同的肥料生产需求。 3.绿色、安全、高效、较少抗生素药物的使用。 成分含量：枯草芽胞杆菌有效活菌数大于200亿/克 用法用量：
贮藏：阴凉、干燥处密封保存。 保质期：密封保存不少于18个月。 四、枯草芽孢杆菌的应用范围：枯草芽孢杆菌不仅在肥料中应用比较广泛，在污水处理及生物肥发酵或发酵床制作中应用也相当广泛，是一种多功能的微生物。 1、市政和工业污水处理，工业循环水处理，腐化槽、化粪池等处理，畜牧养殖动物废料、臭味处理，粪便处理系统，垃圾、粪坑、粪池等处理； 2、畜牧、家禽、特种动物及宠物养殖，水产养殖； 3、可以与多种菌种混配，在农业生产中具有重要作用。
不用纳豆菌自制纳豆
不用纳豆菌自制纳豆 一般在家做枘豆都是用一点纳豆菌然后加一点纳豆引子才更加入味，今天给大家介绍一款不用纳豆菌不需纳豆引子在家制作纳豆的方法，即简单又健康。 不用纳豆菌不需纳豆引子做纳豆的教程： 1、将干黄豆用水完全泡发，黄豆最好选用新鲜非转基因的小粒黄豆。已经试验黑豆、青豆均可，据资料玉米、花生也可以做纳豆，豌豆好像不行 2、把黄豆加水煮熟至手指一捏即碎的状况，把黄豆滤干。 3、趁热将黄豆装盘或者装保鲜盒，上覆保鲜膜，保鲜膜扎透气孔，放温暖处保温2天左右(可放酸奶机，或用热水袋加温，最佳温度是37-38度，比人体温稍高即可) ps.纳豆菌是嗜氧菌，所以黄豆最好装盘，厚度不宜太厚，一般控制在2cm左右。
4、待黄豆之间长满白膜并逐渐变透明即可，将做好的纳豆先放入冰箱内低温熟成数小时以后再食用或冷冻长期保存。长期保存可分包成1次食用的分量放冰箱冷冻，解冻最好冷藏或者室温解冻，不宜微波炉加热以最大保存纳豆菌活性。 5、做好的纳豆可随喜好加入各种调味剂食用，生抽、芥末、辣椒酱、葱姜蒜、香油均可。也可冲成热汤喝。但为保证纳豆酶的活性最好不要加热食用。 6、食用前记得要先多多搅动豆子形成菌丝后再调味，否则纳豆不够粘稠会变得湿哒哒的。 成品图：
不用纳豆菌不需纳豆引子做纳豆的小技巧： 每吃100-200克纳豆可以起到预防血栓类疾病的作用，最好在晚饭时食用，因为血栓类疾病如心肌梗塞往往是在上午发作，纳豆菌中含有一种可以溶解血栓的纳豆激酶，纳豆激酶是第二代溶栓剂，在进入人体2-8小时内血栓溶解的速率比较高，故晚饭时吃它有助于预防次日上午心肌梗塞发作。 天冷用电热热水袋和焖烧锅保温温度低了一些，白膜长得很慢，第2天到第3天每天加热了3次电热热水袋，白膜才稍微见长。 试了几种吃法，加生抽、芥末或者辣酱都很好吃，加醋的有点怪。 纳豆菌是嗜氧菌，所以黄豆最好装盘，厚度不宜太厚，一般控制在2~3层豆子即1cm左右。恒温下2天即有结果，时间长则纳豆菌数量愈多当然臭味也明显，所以最好把保温箱放在开放的阳台为宜。 后熟(活菌低温休眠)在38-42℃的恒温下发酵完成后，然后放在冰箱内低温熟成数小时后，做好的纳豆无论是外观还是口感都会更好。因此建议纳豆做好后，先放入冰箱内低温熟成数小时以后再食用或长期保存。 300g黄豆泡出来有有满满一锅(小汤锅)，首次自制最好分量减半以免失败浪费，150克也有1个小饭盒的量了。
纳豆菌种产品详细说明
产品详细说明： 配料：纳豆、纳豆菌 用法与用量：每次发酵用1粒胶囊，用2ml冷开水溶开，倒入蒸熟的豆子中然后放恒温箱中发酵18小时左右。 保质期：24个月日期更新至2011年3月29号 规格：1瓶(30粒X0.4g)。 附赠：家庭纳豆做法说明书一份。 优势：厂家提供技术支持，帮我们解决制作过程中遇到的问题！ 纳豆是由小粒黄豆,经纳豆菌发酵而成的一种微生态健康食品。 纳豆中富含纳豆菌、优质小分子蛋白质（肽）、纳豆激酶、超氧化物歧化酶、生物多糖、异黄酮、皂甙、卵磷脂、吡啶二羧酸、维生素K2等多种生理活性物质。 这些活性物质对人的心脑血管、骨骼、胃肠道、免疫等四大系统进行全面的调整和改善，以独特的功效全面提升身体机能和免疫力。 纳豆的保健功能主要与其中的纳豆激酶、纳豆异黄酮、皂青素、维生素K2等多种功能因子有关。纳豆中富含皂青素，能改善便秘，降低血脂，预防大肠癌、降低胆固醇、软化血管、预防高血压和动脉硬化，抑制艾滋病病毒等功能；纳豆中含有游离的异黄酮类物质及多种对人体有益的酶类，如过氧化物歧化酶、过氧化氢酶、蛋白酶、淀粉酶、脂酶等，它们可清除体内致癌物质、提高记忆力、护肝美容、延缓衰老等有明显效果，并可提高食物的消化率；摄入活纳豆菌可以调节肠道菌群平衡，预防痢疾、肠炎和便秘，其效果在某些方面优于现在常用的乳酸菌微生态制剂；纳豆发酵产生的粘性物质，被覆胃肠道粘膜表面上，因而可保护胃肠，饮酒时可缓解酒醉的作用。 纳豆源于中国。纳豆类似中国的发酵豆、怪味豆。古书(和汉三才图会)记载有：“纳豆自中国秦汉以来开始制作。”纳豆初始于中国的豆豉。据《食品文化·新鲜市场》(石毛直道著，第101页)一书介绍，两种纳豆都与中国有缘。特别是咸纳豆，大约在奈良、平安时代由禅僧传入日本。日本也曾称纳豆为“豉”，平城京出土的木简中也有“豉”宇。与现代中国人食用的豆豉相同。由于豆豉在僧家寺院的纳所制造后放入瓮或桶中贮藏，所以日本人称其为“唐纳豆”或“咸纳豆”，日本将其作为营养食品和调味品，中国人把豆豉用锅炒后或蒸后作为调味料。 纳豆的保健作用 1、纳豆的抗菌作用：大家对病原性大肠杆菌O-157横虐日本还记忆犹新。那时有小孩的母亲都特别恐惧。后来人们慢慢发现了纳豆针对O-157的独特功效。“纳豆菌具有抑制肠内病原菌生长的作用。”从前，人们就知道纳豆具有优良的抗菌、抗病毒作用。这次再次有力地证明了纳豆的这一功效。 纳豆放在冷藏库一个月也不会变质、生霉。这就是由于纳豆菌能够抑制腐败菌、霉菌的生长。并且，纳豆菌一旦进入大肠，就会发挥与乳酸菌相同的作用，保护肠胃，预防肠病毒。 2、纳豆的降血压作用： 高血压与高胆固醇症一样，是常见的成人病之一。高血压的发生与体质和内脏疾病有关。膳食对血压也有很大的影响。特别是要注意控制盐的摄取。那么，如何注意在膳食中预防高血压呢？实际上纳豆具有预防高血压的作用（当然要注意纳豆中不要放入过多的酱油以免过量摄取盐份）。 从医学上的角度来说，调节血压的物质中，使血压上升的是一种叫作血管紧张素II的物质。纳豆能够阻碍其生成。又加上最近有报告显示纳豆还能预防、治疗癌症，这使人们越来越不能忽视纳豆的功效了。 3、溶解血栓 1982年，日本富崎医科大学的须见洋行教授在比较230多种食品後，赫然发现仅有纳豆菌食品含高
枯草芽孢杆菌常用培养基配方
枯草芽孢杆菌常用培养基配方： 1L蒸馏水+20g葡萄糖+15g蛋白胨+5g氯化钠+0.5g牛肉膏+20g琼脂 枯草芽孢杆菌原生质体的制备 1 培养枯草芽孢杆菌 取亲本菌株T4412、TT2 新鲜斜面分别接一环到装有液体完全培养基(CM)的试管中，36℃振荡培养14 h，各取1 mL 菌液转接入装有20 mL 液体完全培养基的250 mL 锥形瓶中，36℃振荡培养 3 h，使细胞生长进入对数前期，各加入25 u/mL 青霉素，使其终浓度为0.3 u/mL，继续振荡培养2 h。 2. 收集细胞 各取菌液10 mL，4000 r/min 离心10 min，弃上清液，将菌体悬浮于磷酸缓冲液中，离心。如此洗涤两次，将菌体悬浮10 mL SMM 中，每mL 约含108～109 活菌为宜。 3. 总菌数测定 各取菌液0.5 mL，用生理盐水稀释，取10-5、10-6、10-7 各1mL(每稀释度作两个平板)、倾注完全培养基，36℃培养24 h 后计数。此为未经酶处理的总菌数。 4. 脱壁 二株亲本菌株各取5 mL 菌悬液，加入5 mL 溶菌酶溶液，溶菌酶浓度为100 ug/mL，混匀后于36℃水浴保温处理30 min，定时取样，镜检观察原生质体形成情况，当95%以上细胞变成球状原生质体时，用4000 r/min 离心10 min，弃上清液，用高渗缓冲液洗涤除酶，然后将原生质体悬浮于5 mL 高渗缓冲液中。立即进行剩余菌数的测定。 5. 剩余菌数测定 取0.5 mL 上述原生质体悬液，用无菌水稀释，使原生质体裂解死亡，取10-2、10-3、10-4 稀释液各0.1 mL，涂布于完全培养基平板上，36℃培养24～48 h，生长出的菌落应是未被酶裂解的剩余细胞。 计算酶处理后剩余细胞数，并分别计算二亲株的原生质体形成率。原生质体形成率＝未经酶处理的总菌数一酶处理后剩余细胞数。
纳豆菌在纳豆发酵中的应用
纳豆菌在纳豆发酵中的应用 黄迎佳 摘要：纳豆当今日本人餐桌上的常客。纳豆是黄豆经纳豆菌发酵后得到的产品；传统的纳豆制法为自然界接种法，用富含纳豆菌的天然稻草包裹黄豆使其发酵，但制作过程中成品易被其他霉菌污染；现代工厂则将提取的独立纳豆菌接种于经过处理的黄豆上进行批量发酵。具有生理活性的纳豆激酶是发酵的产物之一，因其显著的溶栓能力而备受现代消费者青睐。各类纳豆产品对人体健康都有显著的益处。 一． 技术原理 1. 纳豆菌概况 纳豆菌，别称纳豆芽孢杆菌，属枯草芽孢杆菌纳豆菌亚种，为革兰阳性菌，是一类好氧型、内生抗逆胞子的杆状细菌，有芽孢，因此耐热性强，生长温度最高为45-55℃，最低为5-20℃。 纳豆菌是一类耐酸、耐热性良好的有益菌, 病原菌抑制能力强，环境耐受力好，在胃酸下四小时存活率为100%,可直达小肠，口服后可改变人体肠道菌丛生态,帮助消化道机能正常化。因此食用以纳豆菌制成的纳豆可以帮助人体排便顺畅,维持体内生理环保 2. 原理 纳豆生产是以纳豆菌为主的微生物发酵过程。 纳豆菌大量存在于稻草上。传统制法采用自然接种法，用杀菌后的稻草包裹经浸煮熟的大豆，使纳豆菌得以在大豆表面生长繁殖，进行固态浅层发酵。纳豆菌通过吞噬大豆蛋白繁殖，产生出众多具有生理活性的物质（例如：纳豆激酶，超氧化物歧化酶（SOD ），皂苷类，生育酚，吡啶二羧酸，维生素K2）也大幅提高一些物质的活性，（例如：异黄酮，一种非类固醇芳香环的化合物，具有抗肿瘤作用，能预防和治疗心脑血管疾病）。在此过程中，纳豆菌也抑制了其他腐败菌或致病菌的生长；发酵过程中产生的谷氨酸是纳豆表面粘稠丝状物的主要成分，也是纳豆美味的主要来源。纳豆菌由于有芽孢而耐热度高，发酵过程的温度应控制在40-45℃使菌体活性不受影响。 上图为显微镜下的纳豆菌
枯草芽孢杆菌在肥料中的应用
枯草芽孢杆菌在肥料中的应用 一、枯草杆菌概述： 枯草芽孢杆菌是芽孢杆菌属的一种。单个细胞0.7～0.8×2～3微米，着色均匀。无荚膜，周生鞭毛，能运动。革兰氏阳性菌，芽孢0.6～0.9×1.0～1.5微米，椭圆到柱状，位于菌体中央或稍偏，芽孢形成后菌体不膨大。菌落表面粗糙不透明，污白色或微黄色，在液体培养基中生长时，常形成皱醭。需氧菌。可利用蛋白质、多 种糖及淀粉，分解色氨酸形成吲哚。在遗传学研究中应用广泛，对此菌的嘌呤核苷酸的合成途径与其调节机 制研究较清楚。广泛分布在土壤及腐败的有机物中，易在枯草浸汁中繁殖，故名。 二、枯草芽孢杆菌的作用机理： 枯草芽孢杆菌大量应用于生物肥料。当作用于作物或土壤时．能够在作物根际或体内定殖，并起到特定肥料 效应。目前，微生物肥料在培肥地力，提高化肥利用率，抑制农作物对硝态氮、重金属、农药的吸收，净化 和修复土壤，降低农作物病害发生，促进农作物秸秆和城市垃圾的腐熟利用。保护环境。以及提高农作物产 品品质和食品安全等方面表现出了不可替代的作用。 三、枯草芽孢杆菌的使用说明： 特点：1.肠道定殖能力强。 2.耐氧化、耐高温、耐酸碱、耐挤压和耐温度变化，满足不同的饲料生产需求。 3.绿色、安全、高效、较少抗生素药物的使用。 贮藏：阴凉、干燥处密封保存。 三、枯草芽孢杆菌的应用范围： 枯草芽孢杆菌不仅在肥料中应用比较广泛，在污水处理及生物肥发酵或发酵床制作中应用也相当广泛，是一 种多功能的微生物。 1、市政和工业污水处理，工业循环水处理，腐化槽、化粪池等处理，畜牧养殖动物废料、臭味处理，粪便处理系统，垃圾、粪坑、粪池等处理； 2、畜牧、家禽、特种动物及宠物养殖，水产养殖； 3、可以与多种菌种混配，在农业生产中具有重要作用。
纳豆芽孢杆菌的开发与利用
纳豆芽孢杆菌的开发与利用 摘要 介绍了纳豆芽孢杆菌的起源和特点 , 重点阐述了纳豆及纳豆芽孢杆菌的生理功效及其在食品加工、微生态制剂和纳豆激酶、抗菌素等方面的应用现状 ,并对今后的发展趋势进行了展望。 关键词: 纳豆芽孢杆菌 ; 纳豆激酶 ; 生理功效 ; 天然防腐剂 ; 应用纳豆芽孢杆菌( B aci l l us nat t o) 是从日本传统食品中分离出来的菌种 ,其原始菌株与枯草芽孢杆菌相同 ,是枯草芽孢杆菌的一个亚种 学生姓名王晓东 班级 1301 专业名称生物化工工艺 系部名称制药工程 指导教师孔卫娜 提交日期 答辩日期 河北化工医药职业技术学院
目录 1纳豆芽孢杆菌简介与起源 (2) 1 1简介 (2) 1 2纳豆的起源 (2) 2 纳豆及纳豆菌的生理功效 (3) 2 1 1 防止骨质疏松症 (3) 2 1 2 抗癌作用 (3) 2 1 3 抗氧化及延缓衰老作用 (3) 2 1 4 预防和治疗高血压的作用 (4) 2 1 5 降低胆固醇的作用 (4) 2 1 6 血栓溶解作用 (4) 2 1 7 整肠功效及促消化作用 (5) 2 1 8 抗菌作用 (5) 3 应用 (5) 3 1 1 调味料 (5) 3 1 2 天然防腐剂 (5) 3 1 3 心血管药物 (6) 3 1 4 饲料添加剂 (6)
1纳豆芽孢杆菌简介与起源 1 1简介 [ 1 ] 纳豆芽孢杆菌常称纳豆菌 ,不仅具有分解蛋白质、碳水化合物、脂肪等大分子物质的性能 ,使发酵产品中富含氨基酸、有机酸、寡聚糖等多种易被人体吸收的成分 ,而且在纳豆菌发酵纳豆的过程中在其中还发现了一些生理活性物质而使纳豆具有多种保健功能 ,如抗肿瘤、降血压、抗菌等作用 ,还可预防骨质疏松、提高蛋白质的消化率、抗氧化等 [ 2 - 6 ]纳豆菌能产生具有溶栓活性的纳豆激酶 ,其芽孢能耐酸碱、耐高温 ( 100 ℃ ) 及耐挤压 ,在酸性胃环境中能保持高度的稳定性 ; 纳豆菌在肠道中不增殖 ,只在肠道上段迅速发育转变 成代谢活跃的营养型细胞 [ 7 ]增强以厌氧菌为优势菌群的肠道正常菌群的生长 ,促进对营养物质的吸收 ,增强机体的免疫功能 [ 8 ]近年来 , 世界上许多国家掀起了研究纳豆菌的热潮。除了开发纳豆等多种保健食品外 , 对其代谢产物纳豆激酶的研究也已成为当前重要的研究课题。本文着重阐述了其生理功效及应用前景等内容。 1 2纳豆的起源 1 纳豆、纳豆芽孢杆菌的起源、种类及特点传统制作纳豆是采用稻草作为发酵菌剂的来源 ,将煮熟的黄豆冷却后用稻草包裹后于温湿度比较高的地方自然发酵 1～ 2 天 ,等黄豆表面出现一种白色的黏液状物质即可。目前在日本 , 纳豆食品生产基本实现了工业化、连续化和商品化。1905 年东京大学的村教授是第一个将纳豆中筛选出的杆菌命名纳豆杆菌 ( B aci l l us n at t o S a w a m u r a)的研究学者 , Mut o 后来研究发现纳豆杆菌属于枯草芽孢杆菌属 ,为需氧型革兰氏阳性菌。自从 1934 年北海道大学农学部半洵教授首次成功地将分离的纯种纳豆苗( B aci l l us n at t o N o . 1) 使用于纳豆的工业化生产后 ,至今已知与纳豆生产相关的主要